CN115197322B - 用于慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶检测的抗体组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于慢性淋巴细胞白血病免疫分型治疗后微小残留病灶检测的抗体组合物及其应用，抗体组合物包括一组8种抗体组合。本发明优化抗体组合和对应抗体的荧光标记组合以及结果判读方法，只需要使用一管8种抗体一次上样，既可以全面、高效的对CLL治疗后微小残留病灶(MRD)进行检测，判断CLL的预后和治疗效果，具有极高的敏感性和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及抗体医药领域，尤其是涉及一种用于慢性淋巴细胞白血病免疫分型治疗后微小残留病灶检测的抗体组合物及其应用。
背景技术
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种具有特征性免疫表型的高度异质性的成熟小B细胞淋巴瘤/白血病。近年来，随着新型靶向药物的不断研发和临床使用，CLL的疗效及预后取得了极大改善，但患者体内存在的微小残留病灶(MRD)仍然是导致疾病复发的根源。因此，临床需要灵敏精准且易于推广的MRD检测手段作为CLL疗效评估的重要指标。由于多参数流式细胞术(MFC)具有快速、经济、结果可靠、可以准确定量以及适用于几乎所有CLL患者的优点，已经成为目前CLL最常用的MRD检测方法。为了最大程度获取精确的结果且避免多余抗体导致的仪器补偿难以调节以及结果难以判断，抗体组合应尽可能满足获取足够的信息量且不冗余。
目前，国际尚无标准化检测方案，临床上完成上述检测目主要参考欧洲慢性淋巴细胞白血病研究中心(ERIC)发布的方案。2007年和2012年ERIC分别发布四色四管方案(Kappa/lambda/CD5/CD19、CD20/CD38/CD5/CD19、CD81/CD22/CD19/CD5和CD79b/CD43/CD19/CD5)和六色两管方案(CD19/CD5/CD20/+CD3/CD38/CD79b和CD19/CD5/CD20/+CD81/CD22/CD43)，而在2016年ERIC发布8色单管抗体组合方案(CD81/CD20/CD22/CD43/CD5/CD79b/CD19/CD3),认为8色单管抗体组合方案相较多管四色和六色的多管组合，在CLL的MRD检测中体现出更好的敏感性和特异性，其优势在于不仅能一次获得更多抗原间的表达信息，而且能有效降低多管检测造成的细胞分布不均所导致的结果偏差，检测后首先通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)进行双参数设门圈出所有细胞，再利用CLL典型的免疫表型特点找出残留CLL肿瘤细胞(即CD20(-/dim)CD22(dim)CD79b(dim)CD5+CD19+CD43+CD81-CD3-),用CLL残留肿瘤细胞数除以所有细胞数即为CLL-MRD。
在随后的临床应用中，发现该组合依然存在缺陷，一方面CD22和CD79b在CLL中表达特点一致，均为弱表达，因此同时选择两种明显冗余；另一方面，CD3加入的目的是为了去除和B细胞发生粘黏的T淋巴细胞，但利用CD81/CD43两个标记可去除T细胞(T细胞高表达CD43和CD81,CLL肿瘤细胞表达CD43但不表达CD81),因此CD3也非CLL-MRD检测的必要抗体。
目前存在的问题是：(1)样本储存时间长短、处理制备过程和细胞碎片均会影响最终结果计算，如果仅凭FSC/SCS散射光特点设门圈出有核细胞作为计算MRD的分母，很难保证结果的准确性和一致性,这在多中心临床药物试验比对的结果差异尤为突出。(2)少部分CLL免疫表型不典型，例如肿瘤细胞可以不表达CD5和CD43,也可以强表达CD20和CD79b,这导致ERIC方案无法完全适用于这部分患者的MRD检测。
因此，目前迫切需要设计一种在常用的流式细胞仪上能应用和推广的抗体组合物解决上述技术问题。该组合物应尽可能减少室间和室内差异且同时对典型和不典型免疫表型CLL进行精准检测。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种在临床常规使用的流式细胞仪上检测的慢性淋巴细胞白血病的抗体组合物，具体包括一管8色抗体的组合物，主要用慢性淋巴细胞白血病微小残留病的精准检测。并提供上述抗体组合物应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶检测的抗体组合物，由以下抗体组成：抗CD19抗体、抗CD5抗体、抗CD20抗体、抗CD45抗体、抗CD79b抗体、抗ROR1抗体、抗CD43抗体和抗CD 81抗体。
进一步的，抗体标记不同的荧光标记。
进一步的，荧光标记按照抗体抗CD81、抗CD43、抗CD79b、抗CD5、抗CD19、抗CD20、抗ROR1、抗CD45的顺序分别为：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-A750、BV421和KO。
一种用于流式细胞术检测慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶的试剂盒，包括上述任一所述的抗体组合物。
进一步的，试剂盒还包括上述所述的荧光标记。
进一步的，试剂盒还包括：红细胞裂解液。
一种上述任一所述抗体组合物在制备用于检测慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶的试剂盒中的应用。
进一步的，检测慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶的过程包括以下步骤：
(1)将待测样本加入到流式管中，将细胞浓度调整为5～10x106/mL；所述待测样本为外周血或骨髓液；
(2)在流式管中加入权利要求1至3任一所述的已被相应荧光素标记的抗体组合物充分混匀，室温避光孵育15min；
(3)向步骤(2)孵育后的流式管中加入1×FACS溶血素，混匀后室温避光静置8～10min；300g离心洗涤5min，弃去上清；
(4)向步骤(3)的流式管中加入PBS洗液，300g离心洗涤5min，弃去上清。加入PBS重悬细胞；
(5)对步骤(4)中的重悬细胞进行流式细胞上机检测，利用Time/CD45、FSC INT/FSC PEAK和/或FSC INT/SSC INT散点图，圈出液流稳定区间、去除黏连体和细胞碎片；通过CD45联合SSC圈出所有白细胞群，在所有白细胞门中通过CD45/SSC设门圈出淋巴细胞，圈出CD19+B淋巴细胞；通过CD5/CD19双参数图圈出CD5+CD19+细胞；利用CD20/CD79b圈出CD20(-/dim)CD79b(dim)CD5+CD19+细胞；通过CD43/CD81设门圈出CD20(-/dim)CD79b(dim)CD5+CD19+CD43(strong+)CD81-细胞群；通过ROR1/CD19设门圈出ROR1+CD19+细胞群，即为CLL-MRD细胞，用图中最终确定的CLL细胞数除以白细胞总数，即CLL-MRD占白细胞百分比。
一种用于检测慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶的装置，包括：检测单元和分析单元；所述检测单元包括用于通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的试剂材料，用于获得样本的检测结果；所述试剂材料包括上述任一项所述的抗体组合物；
所述分析单元用于分析检测单元的检测结果。
进一步的，所述通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的过程包括：利用权利要求1至3任一项所述的抗体组合物对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样品；进行流式细胞上机检测；其中流式细胞上机检测时按照以下方式设门：利用Time/CD45、FSC INT/FSC PEAK和/或FSC INT/SSC INT散点图，圈出液流稳定区间、去除黏连体和细胞碎片；通过CD45(人类白细胞共同抗原)联合侧向散射光SSC圈出所有白细胞群；在所有白细胞门中通过CD45/SSC设门圈出淋巴细胞；圈出CD19+B淋巴细胞；通过CD5/CD19双参数图圈出CD5+CD19+细胞；利用CD20/CD79b圈出CD20(-/dim)CD79b(dim)CD5+CD19+细胞；通过CD43/CD81设门圈出CD20(-/dim)CD79b(dim)CD5+CD19+CD43(strong+)CD81-细胞群；通过ROR1/CD19设门圈出ROR1+CD19+细胞群；
所述分析单元分析检测单元的检测结果时，将圈出的ROR1+CD19+细胞群设为CLL-MRD细胞，用图中最终确定的CLL-MRD细胞数除以白细胞总数，即MRD占白细胞百分比。
8种抗体组合物的抗体种类及配伍的荧光素见表1。抗体均为单克隆抗体。
表1
本发明具有以下有益效果：利用一组单管抗体组合，用于CLL-MRD的检测。与目前临床普遍采用4-6色抗体组合对CLL-MRD进行传统流式细胞仪免疫分型检测，每种疾病均需要检测多管抗体组合，本发明仅使用1管抗体组合(8个抗体)，并对抗体组合物进行了优化，建立了数据采集和分析流程，可对CLL-MRD进行精准检测。因此，本发明不仅减少了对标本量的需求及操作数量，节省了操作时间，同时减少了设门抗体的重复应用，增加了有效抗体的使用数量，能同时观察8种抗体是否同时表达，分析所述抗体相互组合的表型关系，增加对CLL-MRD检测的准确性、特异性和敏感性。本发明首创利用Time/CD45、FSC INT/PEAK和FSC INT/SSC INT散点图，圈出液流稳定区间细胞，能首先有效去除黏连体和细胞碎片。本发明公开了使用新的CLL特异性标记物ROR1联合经典核心抗体进行MRD分析方法，该标记物在CLL肿瘤细胞中普偏高表达，包括在不典型免疫表型的CLL中。另外，本发明采用CD45联合侧向散射光SSC设门圈取白细胞作为计算分母，有效降低了以往采用散射光信号FSC联合SSC设门作为计算分母无法导致的室内和室间差异的产生。
附图说明
图1是实施例1CLL患者采用MFC检测MRD分析流程图。
图2是实施例2采用FSC/SSC和CD45/SSC设门后的结果差异图。
图3是实施例3MRD检测结果(显示一例CLL患者治疗后所送外周血样本分别在24小时(A)、48小时(B)和72小时(C)几个时间点采用本发明技术进行MRD检测,结果具有高度一致性)。
图4是对比例1采用ERIC方案进行MRD检测结果(显示一例CLL患者治疗后所送外周血样本分别在24小时(A)、48小时(B)和72小时(C)几个时间点采用ERIC方案进行MRD检测,结果显示较大的差异性)。
图4是对比例1采用ERIC方案进行MRD检测结果(显示一例CLL患者治疗后所送外周血样本分别在24小时(A)、48小时(B)和72小时(C)几个时间点采用ERIC方案进行MRD检测,结果显示较大的差异性)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例说明书中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明采用流式细胞术对临床CLL患者的骨髓和外周血标本进行免疫表型分析。
试剂的配制
一种CLL-MRD检测适应症的抗体组合：按照表1中的组合配置抗体组合。将上述抗体按照配比方式分别混合装于1个容器内，用于确定CLL的所有标本MRD的免疫表型标记。上述抗体均可直接商业购买获得，抗体均为单克隆抗体。本发明实施例的抗体从BD公司，Biolegend、贝克曼公司购买。8种抗体组合物的抗体种类、荧光素及容量配伍见表1。
表1
将上述抗体组合分别制备CLL-MRD检测试剂盒。
试剂盒还包括红细胞溶解液，红细胞溶解液可以自行配置也可以商业购买(如BD公司)。8种抗体组合流式细胞术检测CLL-MRD。
一、实验主要材料及仪器
1.材料：10×PBS缓冲液(实验室自配)、流式细胞仪专用溶血素(BD公司)；
2.仪器：Navios型号10色流式细胞仪，配备405nm，488nm、635nm三根激光，10个荧光检测器。台式低速离心机、漩涡混匀器。
二、方法
1.样本采集：
将取材到的人外周血或骨髓液1～2mL立即置于肝素抗凝管并迅速颠倒数次以防止标本凝固，采集后应尽快送往实验室，常温保存，必须在48小时内检测完成流式细胞术(FCM)检测，按说明书操作。
2.样本制备过程：
(1)细胞计数：计数每微升白细胞数，根据检测结果，将细胞浓度调整为5～10x106/100mL，取200～400μL细胞液加入流式管中。
(2)抗原染色：
a)每管分别加入表1中相应荧光素标记的单克隆抗体预混液和标本充分混匀，室温避光孵育15min；
b)溶血：加入1×FACS溶血素2mL，低速涡流混匀，室温避光静置8～10min。300g离心洗涤5min，弃去上清。
c)洗涤：加入1mL含有0.1％NaN3和1％～2％BSA的PBS洗液，300g离心洗涤5min，弃去上清。加入PBS 200μL悬浮细胞，待上机检测。如不能及时上机检测，则加入0.5mL 1％多聚甲醛，混匀后置于4℃冰箱内保存，24小时内完成检测。
(3)上机检测和数据分析：
a)确定最适电压和补偿：按照流式细胞仪的常规操作方法设定电压和补偿。
b)上机检测和数据采集。
按照设定好的仪器条件，每管获取CD45阳性的白细胞至少20万个，使用Kluza软件分析数据。
实施例1
图1显示一例CLL患者MRD分析方法和检测结果。
图1中A-C分别是利用Time/CD45、FSC INT/PEAK和FSC INT/SSC INT散点图，圈出液流稳定区间、去除黏连体和细胞碎片；D:通过人类白血病共同抗原CD45联合SS圈出所有白细胞群；E:在所有白细胞门中通过CD45/SSC设门圈出淋巴细胞；F:圈出CD19+B淋巴细胞；G-H:通过CD5/CD19双参数图圈出CD5+CD19+细胞和CD5-CD19+细胞；I:利用CD20/CD79b圈出CD20(-/dim)CD79b(dim)CD5+CD19+细胞群；J:通过CD43/CD81设门圈出CD20(-/dim)CD79b(dim)CD5+CD19+CD43(strong+)CD81-细胞群；K:通过ROR1/CD19设门圈出ROR1+CD19+细胞群，即为CLL-MRD细胞，计算MRD结果用“K”图中最终确定的CLL细胞数(1215个)除以“D”图中的白细胞总数(399847万个)，即MRD占白细胞的0.3％。
实施例2
图2显示一例CLL患者治疗后所送骨髓样本因溶血不佳或聚集细胞高,对比ERIC的FSC/SSC设门策略和本发明的CD45/SSC设门策略分析的结果差异。左图：采用FSC/SSC设门策略仅能去除细胞碎片，无法去除混在淋巴细胞群中的聚集粘连细胞，导致最终结果计算误差产生；右图：采用FSC/SSC设门去除细胞碎片后再采用CD45/SSC有效将白细胞与死亡以及聚集粘连细胞分离，通过圈取CD45阳性的白细胞群作为计算分母，能有效避免室间差异和室内差异的产生，确保最终计算结果的精确性和一致性。
实施例3
图3显示一例CLL患者治疗后所送外周血样本分别在24小时(A)、48小时(B)和72小时(C)几个时间点采用本发明进行MRD检测,结果具有高度一致性。计算均采用“K”图中最终确定的CLL细胞数除以“D”图中的白细胞总数，即MRD占白细胞百分比。上图MRD＝6370/483482＝1.31％，中图MRD＝6499/504065＝1.30％，下图MRD＝4816/371435＝1.30％。
对比例1
图4显示一例CLL患者治疗后所送外周血样本分别在24小时(A)、48小时(B)和72小时(C)几个时间点采用ERIC方案进行MRD检测,结果显示较大的差异性。计算均采用“J”图中最终确定的CLL细胞数除以“C”图中的细胞总数，即MRD占所有细胞百分比。图A中MRD＝157/234604＝0.07％，B中MRD＝47/139909＝0.03％，C中MRD＝16/225766＝0.007％。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种检测慢性淋巴细胞白血病微小残留病灶的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
（1）将待测样本加入到流式管中，将细胞浓度调整为5～10x106/mL；所述待测样本为外周血或骨髓液；
（2）在流式管中加入已被相应荧光素标记的抗体组合物充分混匀，室温避光孵育15min；
（3）向步骤（2）孵育后的流式管中加入1× FACS溶血素，混匀后室温避光静置8～10min；300g离心洗涤5min，弃去上清；
（4）向步骤（3）的流式管中加入PBS洗液，300g离心洗涤5min，弃去上清，加入PBS重悬细胞；
（5）对步骤（4）中的重悬细胞进行流式细胞上机检测，利用Time/CD45、FSC INT/FSCPEAK和/或FSC INT/SSC INT散点图，圈出液流稳定区间、去除黏连体和细胞碎片；通过CD45联合SSC圈出所有白细胞群，在所有白细胞门中通过CD45/SSC设门圈出淋巴细胞，圈出CD19+B淋巴细胞；通过CD5/CD19双参数图圈出CD5+CD19+细胞；利用CD20/CD79b圈出CD20(-/dim)CD79b(dim) CD5+CD19+细胞； 通过CD43/CD81设门圈出CD20(-/dim)CD79b(dim) CD5+CD19+CD43（strong+）CD81- 细胞群；通过ROR1/CD19设门圈出ROR1+CD19+ 细胞群，即为CLL-MRD细胞；用图中最终确定的CLL细胞数除以白细胞总数，即CLL-MRD占白细胞百分比；
所述抗体组合物由下述抗体组成：抗CD19抗体、抗CD5抗体、抗CD20抗体、抗CD45抗体、抗CD79b抗体、抗ROR1抗体、抗CD43抗体和抗CD81抗体；
上述方法为非疾病的诊断和治疗方法。
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