CN116482370B - 一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合及其应用 - Google Patents

一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合及其应用，属于抗体医药技术领域；所述抗体组合包括第一组合和/或第二组合。本发明利用第一组合，可以用于所有浆细胞肿瘤初诊时靶点抗原和诊断抗原的筛查，有助于疾病诊断、建立MRD检测的LAIP及选择靶向治疗；第二组合可以用于检测所有已明确浆细胞肿瘤的初诊患者及治疗后患者的肿瘤性浆细胞，根据有无初诊表型及初诊时阳性表达的抗原灵活配置合适的抗体数量，用于评估浆细胞比例、表型并确定是否为肿瘤性。本发明的抗体组合物减少了设门抗体的重复应用，增加了有效抗体的使用数量，能同时观察多种抗原是否同时表达。

Description

一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型 的抗体组合及其应用
技术领域
本发明属于抗体医药技术领域，具体涉及一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合及其应用。
背景技术
浆细胞肿瘤是由于骨髓或其它部位存在克隆性浆细胞，导致单克隆免疫球蛋白或其片段（M蛋白）分泌增多的一系列疾病。浆细胞肿瘤表现形式多样，从无症状到相关器官或组织损伤，甚至危及生命。
浆细胞肿瘤最常见的是浆细胞骨髓瘤（Plasma cell myeloma，PCM）又称多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM），是血液系统的第二大常见恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的1%，年发病率约0.006%。除MM外，克隆性浆细胞肿瘤还包括以下疾病：意义未明的单克隆免疫球蛋白病（MGUS）、浆细胞骨髓瘤变异型包括冒烟型浆细胞骨髓瘤（SPCM）、非分泌型骨髓瘤和浆细胞白血病、浆细胞瘤和浆细胞肿瘤伴相关副肿瘤综合征等。
浆细胞肿瘤的诊断首先需要识别异常及克隆性浆细胞，再结合临床做出不同的浆细胞疾病的诊断。流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是检测异常及克隆性浆细胞最好的工具。FCM通过检测浆细胞的免疫标志识别抗原表达异常的浆细胞，同时，通过对浆细胞内胞浆轻链的检测，确定其是否为限制性表达。轻链的限制性表达即为克隆性浆细胞，是诊断浆细胞肿瘤的金标准。虽然WHO淋巴造血肿瘤分类将浆细胞肿瘤归在B细胞淋巴增殖性疾病和肿瘤中，但由于用于识别浆细胞肿瘤的抗原与成熟B细胞肿瘤不同，所以检测的抗体组合亦不同。
浆细胞是循环中成熟B淋巴细胞受到抗原刺激再返回骨髓中分化增殖而成的终末细胞。骨髓中大部分正常浆细胞前向角光散射（Forward Scatter，FSC）和侧向角光散射（Side Scatter，SSC）略大于淋巴细胞，与成熟B淋巴细胞共有的免疫标志有CD19和cCD79a，不同之处在于CD45表达稍弱，表达CD138，强表达CD38，但不表达CD20、CD22和CD79b，一般不表达膜表面免疫球蛋白（surface membrane immunoglobulins，smIg）轻链，非限制性表达胞浆免疫球蛋白轻链cKappa与cLambda，两者比值在0.3~3.0之间。由于浆细胞表达的抗原谱与B细胞有很大不同，因此，需要构建相应的抗体组合对其进行检测。
关于浆细胞胞膜抗原的表达，许多研究证实，肿瘤性浆细胞的典型表型为：①CD19、CD27、CD38、CD45和CD138表达下调，90%以上克隆性浆细胞甚至不表达CD19；②过表达CD28、CD33、CD56、CD117和CD200；③非同步表达CD20和smIg。除CD117几乎从不表达在正常浆细胞外，大部分上述肿瘤性浆细胞表型都可以表达在正常浆细胞的小部分细胞亚群上。这时仅依靠单个或少数抗原，很难确定肿瘤性浆细胞。原则上胞膜抗原异常表达的数目越多，越容易确定浆细胞的异常性。不少初诊尤其是治疗后患者常同时存在正常浆细胞和少量肿瘤性浆细胞，当肿瘤细胞比例较低时，粗略的分析总体浆细胞cKappa与cLambda的表达，此时cKappa与cLambda的比值往往在正常范围，不能判断出数量较低的克隆性浆细胞。另外，虽然绝大多数浆细胞肿瘤只有一个克隆，但少数情况下有两种克隆并存，如果这两个克隆分别表达不同的轻链，也可能使轻链的比值在正常范围内。此时，通过多个胞膜抗原的精确设门就显得尤为重要。
首先根据多种胞膜抗原检测，找到膜标志表达不同的浆细胞，一系列连续精确设门后再精细分析其他各胞膜抗原的表达情况、并特异性分析cKappa与cLambda的表达，明确不同亚群浆细胞的克隆性。利用此方法可以检测出0.1%以下的克隆性浆细胞，大大提高检测的准确性和敏感性。
虽然蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂的广泛应用大大提高了浆细胞肿瘤的疗效，但绝大多数患者仍然难以治愈。为了提高生存率，近十年来，涌现出许多新的靶向药物，为患者带来新的生机。目前针对浆细胞肿瘤的靶点，包括CD38，CD138，BCMA(CD269)，CD279(PD-1)，GPRC5D，CD47，CD319(SLAMF7)和CD307e(FcRL5)等。为了选择更多的治疗机会，需要全面筛查患者骨髓瘤细胞的靶点。目前，除CD38，CD138和CD269外，针对其他靶点的靶向药物尚处于起步阶段，靶点检测的也较少。另外，针对CD38和/或CD138的靶向药物应用较多，靶向治疗后极容易出现抗原逃逸，即CD38和/或CD138抗原减弱或缺失，这时使用CD38+CD138+经典的设门浆细胞方法受到限制，可能会低估浆细胞比例或无法设门，此时需要探索新的浆细胞设门标志。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合及其应用，本发明的抗体组合可以全面评估初诊时靶点抗原表达情况，为患者选择治疗机会，也可用于检测靶向治疗后靶点抗原的表达变化。
本发明提供了一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合，包括第一组合和/或第二组合；
所述第一组合包括：抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD45抗体、抗CD279抗体、抗CD56抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD319抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD307e抗体、抗CD38抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗 CD27抗体；
所述第二组合包括必选抗体和备选抗体；
所述必选抗体包括：抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗cLambda抗体和抗cKappa抗体；
所述备选抗体选自抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD279抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD117抗体、抗CD319抗体、抗CD307e抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗 CD27抗体中的一种或几种；
所述第一组合和第二组合在检测时分别用于1个流式管中。
优选的，所述备选抗体的选择标准包括1）~3）所述标准中的一种或几种：
1）选择与正常浆细胞表达不同的抗原对应的抗体；
2）选择表达阳性的靶点抗原对应的抗体并根据临床对靶点筛查需求进行灵活配置；
3）对使用CD38和/或CD138靶向药物治疗后标本，选择正常浆细胞和异常浆细胞均表达的抗体。
优选的，所述抗体组合中的抗体为荧光素标记的抗体；
所述第一组合中，抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD45抗体、抗CD279抗体、抗CD56抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD319抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD307e抗体、抗CD38抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗CD27抗体的荧光素标记按顺序分别为：cFluor V420、BV421、cFluor V450、BV510、cFluor V547、BV605、BV711、BV785、FITC、PE、PE-Dazzle594、cFluor BYG710、PE-Cy7、APC、cFluor R668、Alexa Fluor 700、APC/Fire750和APC/Fire810；
所述必选抗体中，抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗cLambda抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体和抗cKappa抗体的荧光素标记按顺序分别为：cFluor V547、BV711、PE-Dazzle594、cFluor BYG710、PE-Cy7、cFluor R668和cFluor R720；
所述备选抗体中，抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD279抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD117抗体、抗CD319抗体、抗CD307e抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗CD27抗体的荧光素标记按顺序分别为：cFluor V420、BV421、cFluor V450、BV510、BV605、BV785、FITC、PE、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、APC、Alexa Fluor 700、APC/Fire750和APC/Fire810。
优选的，所述抗体还包括第三组合；
所述第三组合包括抗细胞膜抗原抗体和抗细胞胞内抗原抗体；
所述抗细胞膜抗原抗体由抗CD38、抗CD3、抗CD10、抗CD33、抗CD5、抗CD19、抗CD45、抗CD7、抗CD117、抗CD34、抗CD56和抗TRBC1抗体组成；
所述抗细胞胞内抗原抗体由抗cCD79a、抗cLambda、抗cKappa、抗cCD22、抗cCD3、抗cMPO抗体和抗nTdT抗体组成。
本发明还提供了上述方案所述抗体组合在制备浆细胞肿瘤检测相关产品中的应用；
所述浆细胞肿瘤检测包括（1）~（3）中的一个或几个方面：
（1）筛查浆细胞治疗靶点和/或异常表型；
（2）浆细胞肿瘤诊断；
（3）浆细胞肿瘤治疗后残留肿瘤性浆细胞检测。
本发明还提供了一种用于流式细胞检测浆细胞肿瘤和/或浆细胞肿瘤治疗后残留肿瘤性浆细胞的试剂盒，包括上述方案所述的抗体组合；当所述抗体组合包括第一组合和第二组合时，所述第一组合和第二组合独立包装。
优选的，所述试剂盒还包括：红细胞裂解液、破膜剂和缓冲液PBS。
本发明还提供了一种用于筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型或者用于检测浆细胞肿瘤或者用于检测治疗后残留肿瘤性浆细胞的系统，包括检测部分和分析部分；
所述检测部分包括上述方案所述的抗体组合或者所述试剂盒，用于通过流式细胞术检测待测个体的抗原表达水平；
分析部分，用于分析检测部分的检测结果。
优选的，利用上述方案所述的抗体组合或者所述试剂盒对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样品；进行流式细胞上机检测；
其中流式细胞上机检测时按照以下方式设门：
使用FSC的面积和高度设置去双连体细胞门A，使用SSC-A/SSC-B继续去黏连设门B，使用FSC-A/ SSC-A设置活细胞门R1，去除碎片和死细胞；R1门内常规使用CD45/SSC散点图设置血细胞门；所述血细胞门包括淋巴细胞门、粒细胞门、单核细胞门和有核红细胞门。
本发明还提供了上述方案所述的试剂盒或者所述的系统在制备筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型或者检测浆细胞肿瘤或者检测治疗后残留肿瘤性浆细胞的检测产品中的应用。
本发明提供了一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合，包括第一组合和/或第二组合。本发明利用第一组合，可以用于所有浆细胞肿瘤初诊时靶点抗原和诊断抗原的筛查，有助于疾病诊断、建立MRD检测的LAIP及选择靶向治疗；第二组合可以用于检测所有已明确浆细胞肿瘤的初诊患者及治疗后患者的肿瘤性浆细胞，根据有无初诊表型及初诊时阳性表达的抗原灵活配置合适的抗体数量，用于评估浆细胞比例、表型并确定是否为肿瘤性。本发明的抗体组合物减少了设门抗体的重复应用，增加了有效抗体的使用数量，能同时观察多种抗原是否同时表达。
附图说明
图1显示浆细胞连续设门方法及作用；
图2显示1例多发性骨髓瘤患者利用第一组合检测结果及利用非CD38/CD138设门方法；A图显示利用CD38/CD138和CD45/SSC设门浆细胞（PC）利用CD19/CD56和CD56/CD38对PC精确设门后抗原的表达结果（R1门）；B图显示此例患者如果应用了针对CD38和CD138的靶向治疗，不能应用CD38/CD138设门时的设门方法；
图3显示1例患者使用第二组合精细设门方法；
图4为经图3设门后显示抗原表达结果及非CD38/CD138设门方法；
图5显示采用不同靶点抗原的设门方法及与CD38/CD138设门的比较；
图6显示1例三系减低的患者，临床怀疑骨髓增生异常综合征（MDS）并未考虑浆细胞疾病；A图显示利用申请号为202111067074.3专利中的抗体组合筛选出的检测结果；B图是本发明第一组合检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合，包括第一组合和/或第二组合；所述第一组合包括：抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184（CXCR4）抗体、抗CD45抗体、抗CD279（PD-1）抗体、抗CD56抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269（BCMA）抗体、抗CD319（SLAMF7）抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD307e（FcRL5）抗体、抗CD38抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗 CD27抗体；所述第二组合包括必选抗体和备选抗体；所述必选抗体包括：抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗cLambda抗体和抗cKappa抗体；所述备选抗体选自抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184（CXCR4）抗体、抗CD279（PD-1）抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269（BCMA）抗体、抗CD117抗体、抗CD319（SLAMF7）抗体、抗CD307e（FcRL5）抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗 CD27抗体中的一种或几种；所述第一组合和第二组合在检测时分别用于1个流式管中。
本发明设计了2种单管的抗体组合：第一组合和第二组合，分别包括18种抗体和21种抗体。通过单管检测技术，主要分析浆细胞的免疫表型以确定白血病相关免疫表型（LAIP）及筛查治疗靶点，为微小残留病（minimal residual disease，MRD）监测及应用靶向药物提供依据，为靶向治疗后设门抗原CD38和CD138减弱或缺失的患者寻找新的浆细胞设门标志，同时可以灵活运用多种检测抗原纯化浆细胞并精确设门，评估真正的肿瘤性浆细胞比例。
在本发明中，所述第一组合优选的由以下抗体组成：抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD45抗体、抗CD279抗体、抗CD56抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD319抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD307e抗体、抗CD38抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗 CD27抗体。在本发明中，所述第一组合仅包括膜抗体，省去用于胞浆抗原cKappa和cLambda检测的胞内抗体染色，简化了操作步骤，包括了多个靶点抗原在内的18色胞膜抗体组合。对怀疑血液系统疾病的初诊患者，经过初筛组合的全面检测，明确存在异常克隆性浆细胞的标本，进行进一步LAIP及治疗靶点的筛查。
在本发明中，所述第二组合物优选的由必选抗体和备选抗体组成；所述必选组合优选的由以下抗体组成：抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗cLambda抗体和抗cKappa抗体；所述备选抗体的选择标准优选的包括1）~3）中的一种或几种：1）选择与正常浆细胞表达不同的抗原对应的抗体；所述表达不同包括：表达增强，减弱或异常阴性；2）选择表达阳性的靶点抗原对应的抗体并根据临床对靶点筛查需求进行灵活配置；3）对使用CD38和/或CD138靶向药物治疗后标本，选择正常浆细胞和异常浆细胞均表达的抗原标志以帮助设门。
在本发明中，所述第二组合包括21种抗体（7+X），其中，7是2个胞浆轻链及5个骨架胞膜抗体，2个胞浆轻链抗体为抗cLambda抗体和抗cKappa抗体，5个骨架胞膜抗体为抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体。
本发明的第二组合包括全套第二组合，在全套第二组合中，X是全部14个抗体，检测抗体总数为21个（7+14），即全套的第二组合中备选抗体由抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD279抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD117抗体、抗CD319抗体、抗CD307e抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗CD27抗体组成。在本发明中，当已经明确为浆细胞肿瘤，但缺乏详细的免疫表型结果，需要筛查LAIP及治疗靶点的患者，应用全套的第二组合进行筛查。
本发明的第二组合还包括精简第二组合，精简第二组合中X是根据需求在0~14个抗体之间进行灵活配置的抗体数。X选择的举例：经第一组合或全套第二组合检测，结果CD20,CD81,CD9,CD27没有出现异常表达，在精简的第二组合抗体选择时可以省去这4个抗体。对靶点的选择原则为，阳性靶点为针对该靶点治疗提供依据，在应用针对该靶点特异性的靶向药物治疗后可继续检测，如阳性表达CD269并应用针对此靶点的靶向药物，则对这个靶点进行继续检测；如同时应用了CD138单抗治疗，该患者初诊时表达较强的CD319，则选择CD319用于浆细胞共同设门，不再选择其他四个靶点抗体GPRC5D、CD279、CD307e和CD47。这样共去掉了8个抗体，X等于6个抗体，此时精简第二组合总的抗体数为6+7=13个。对阴性表达抗原或未用针对性药物的靶点，一般不需连续检测，如果需要检测可以随时加减。虽然，利用5个膜标记骨架抗体可以分辨多数标本中异常浆细胞，但治疗后肿瘤细胞可能出现抗原表达的变化，适当增加异常表达的标志，可以增加对异常细胞检测的特异性，减少假阴性结果，因此MRD检测时一般建议多选择一些阳性肿瘤标志进行随访，有必要在5个骨架抗体的基础上再选择几个特异性标志。当在第一组合或者全套的第二组合检测后，对第二组合进行7+X精简，用于治疗后MRD连续检测。本发明的精简第二组合以较少的抗体，有针对性的抗体组合进行MRD连续监测，既减轻患者的经济负担又不降低检测的准确性。
本发明利用第一组合，可以用于所有浆细胞肿瘤初诊时靶点抗原和诊断抗原的筛查，有助于疾病诊断、建立MRD检测的LAIP及选择靶向治疗；第二组合可以用于检测所有已明确浆细胞肿瘤的初诊患者及治疗后患者的肿瘤性浆细胞，根据有无初诊表型及初诊时阳性表达的抗原灵活配置合适的抗体数量，用于评估浆细胞比例、表型并确定是否为肿瘤性。本发明的抗体组合物减少了设门抗体的重复应用，增加了有效抗体的使用数量，能同时观察多种抗原是否同时表达。
本发明的抗体组合具有以下优势：
1.按照传统流式细胞仪8~10色抗体组合，想要获得18~21种抗原的表达结果，至少需要检测3管。本发明使用的抗体组合能够实现单管检测18和21种抗原，可以实现对浆细胞进行全面检测，弥补了以往多管检测的缺陷，无需重复使用设门抗体，可以全面分析18~21种抗原表达的相互关系，极大提高了分析能力及检测的准确性，减少了对标本的需求量及操作数量，有助于节省细胞、节约成本、减轻劳力、简化操作；
2.本发明的抗体组合中含有多种针对靶点抗原的抗体，可以全面评估初诊时靶点抗原表达情况，为患者选择治疗机会；也可用于检测靶向治疗后靶点抗原的表达变化。
3.本发明的抗体组合能够精确定量肿瘤性浆细胞：首先是可以根据膜抗原表达纯化浆细胞，再根据不同膜抗原的表达情况，对浆细胞进行一系列连续精确设门，再精细分析其他抗原及胞浆轻链表达，精确识别肿瘤性浆细胞。
4.18及21种抗原中只要在检测标本中的浆细胞上表达与正常浆细胞明显不同的，都可以作为分群和设门浆细胞的标志；本发明可以根据多种靶点抗原的阳性表达，选择相应的靶向治疗进行追踪监测，观察靶点抗原治疗前后的变化；对于使用了针对CD38和/或CD138靶向药物，有可能导致CD38和/或CD138逃逸的患者，可以根据初筛时检测抗原和靶点抗原的表达情况，选择表达强且与其他系别细胞重叠较少的抗原作为设门抗原，对浆细胞进行识别，有效避免由于免疫逃逸导致浆细胞无法识别而造成漏诊；同时可灵活应用多个较特异、表达较强的靶点抗原对浆细胞进行设门，打破了CD38和CD138抗体设门的门槛，解决了靶向治疗（如应用针对CD38,CD138的靶向药物）后靶点缺失难以对浆细胞进行设门的问题，大大提高了浆细胞检测的准确性和特异性。
5.第二组合为灵活配置的7+X个抗体，既可用于LAIP和靶点筛查也可用于治疗后MRD监测，适用于所有浆细胞肿瘤患者，不受初诊表型限制；全套第二组合适用于已明确为浆细胞肿瘤、无需排查其他血液系统肿瘤的患者。
6.本发明根据不同胞膜抗原对浆细胞连续设门和纯化，有助于精确分群并判断其单克隆性，增加了肿瘤性浆细胞检测的敏感性，大大提高了分析能力和特异性。
在本发明中，所述抗体优选的还包括第三组合；所述第三组合优选的包括抗细胞膜抗原抗体和抗细胞胞内抗原抗体；所述抗细胞膜抗原抗体优选的由抗CD38、抗CD3、抗CD10、抗CD33、抗CD5、抗CD19、抗CD45、抗CD7、抗CD117、抗CD34、抗CD56和抗TRBC1抗体组成；所述抗细胞胞内抗原抗体优选的由抗cCD79a、抗cLambda、抗cKappa、抗cCD22、抗cCD3、抗cMPO抗体和抗nTdT抗体组成。
在本发明中，所述第三组合是专利202111067074.3公开的用于流式细胞检测白血病/淋巴瘤分型的试剂组合物，用于筛查血液肿瘤的所有初诊患者，可以筛查出浆细胞肿瘤，尤其是可筛查出初期症状不明显的隐匿型患者及合并浆细胞肿瘤的患者。通过专利202111067074.3的筛查，当筛查出克隆性浆细胞时，进一步采用本发明的第一组合进行第二步检测，明确浆以完成对患者进行全面的免疫分型检测。
在本发明中，所述抗体组合中的抗体优选为单克隆抗体。
在本发明中，所述抗体组合中的抗体优选为荧光素标记的抗体；所述第一组合中，抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD45抗体、抗CD279抗体、抗CD56抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD319抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD307e抗体、抗CD38抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗CD27抗体的荧光素标记按顺序分别优选为：cFluor V420、BV421、cFluor V450、BV510、cFluor V547、BV605、BV711、BV785、FITC、PE、PE-Dazzle594、cFluor BYG710、PE-Cy7、APC、cFluor R668、Alexa Fluor 700、APC/Fire750和APC/Fire810；所述第二组合必选抗体中，抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗cLambda抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体和抗cKappa抗体的荧光素标记按顺序分别优选为：cFluor V547、BV711、PE-Dazzle594、cFluor BYG710、PE-Cy7、cFluor R668和cFluor R720；备选抗体中，抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD279抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD26抗体、抗CD117抗体、抗CD319抗体、抗CD307e抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗CD27抗体的荧光素标记按顺序分别优选为：cFluor V420、BV421、cFluor V450、BV510、BV605、BV785、FITC、PE、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、APC、AlexaFluor 700、APC/Fire750和APC/Fire810。
在本发明中，所述试剂组合物的抗体及配伍的荧光素见表1：
表1 抗体组合信息
本发明的抗体组合中，各抗体组分均可商购获得。各抗体应符合相关行业标准要求。
本发明还提供了上述方案所述抗体组合在制备浆细胞肿瘤检测相关产品中的应用；
所述浆细胞肿瘤检测包括（1）~（3）中的一个或几个方面：
（1）筛查浆细胞治疗靶点和/或异常表型；
（2）浆细胞肿瘤诊断；
（3）浆细胞肿瘤治疗后残留肿瘤性浆细胞检测。
本发明还提供了一种用于流式细胞检测浆细胞肿瘤和/或浆细胞肿瘤治疗后残留肿瘤性浆细胞的试剂盒，包括上述方案所述的抗体组合；当所述抗体组合包括第一组合和第二组合时，所述第一组合和第二组合独立包装。
在本发明中，所述试剂盒优选的包括第一容器和第二容器；所述第一容器和第二容器分别容置本发明的抗体组合物中的第一组合和第二组合。
在本发明中，所述组合物优选的还包括：红细胞裂解液、破膜剂和缓冲液PBS；所述破膜剂优选为包括A液、B液的破膜剂。本发明的试剂盒中的试剂和耗材均可商购获得。各试剂材料可分别容置于不同的容器中。
本发明还提供了一种用于筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型或者用于检测浆细胞肿瘤或者用于检测治疗后残留肿瘤性浆细胞的系统，包括检测部分和分析部分；所述检测部分包括上述方案所述的抗体组合或者所述试剂盒，用于通过流式细胞术检测待测个体的抗原表达水平；分析部分，用于分析检测部分的检测结果。
在本发明中，利用上述方案所述的抗体组合或者所述试剂盒对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样品；进行流式细胞上机检测；
其中流式细胞上机检测时按照以下方式设门：
使用FSC的面积（area ，A）和高度（height，H）设置去双连体细胞门A，使用SSC-A/SSC-B继续去黏连设门B，使用FSC-A/ SSC-A设置活细胞门R1，去除碎片和死细胞；R1门内常规使用CD45/SSC散点图设置血细胞门；所述血细胞门包括淋巴细胞门、粒细胞门、单核细胞门和有核红细胞门。
在本发明的具体实施过程中，本发明的系统主要用于识别浆细胞，分析检测部分的检测结果时，R1门内，首先根据CD38/CD138对浆细胞设门，然后根据CD45/SSC进一步纯化浆细胞，根据胞膜抗原如CD19/CD56区分正常和异常浆细胞，对比分析其他膜抗原表达是否异常，同时筛选靶点抗原是否表达，阳性表达率及表达强度；第一组合与初筛组合联合判断正常及异常浆细胞的胞浆轻链表达情况，第二组合直接计算免疫球蛋白轻链cKappa和cLambda的比值，根据抗原表达和轻链比值判断浆细胞是否为肿瘤性。
本发明的系统用于分析治疗后残留肿瘤性浆细胞时，如果使用了针对CD38和/或CD138的靶向药物，需要根据初诊筛查，选择能将正常和/或异常浆细胞与其他血细胞在流式图上分开，独立成群的抗原或靶点抗原（表达较强）对浆细胞进行设门，比如CD200/CD45/SSC、CD27/CD45/SSC、GPRC5D/CD45/SSC、CD319/CD45/SSC或CD307e/CD45/SSC等，作为CD38/CD138设门浆细胞的补充；接着，根据不同的膜抗原表达区分正常和异常浆细胞亚群，再观察其他膜抗原和胞浆轻链的表达情况，以明确肿瘤性浆细胞的比例。
在本发明中，对未用CD38和CD138靶向药物的患者，利用CD38/CD138/CD45/SSC联合对浆细胞设门，再结合CD19-CD56+CD38dim+CD45dim+及其他LAIP标志确定异常浆细胞。对使用CD38和/或CD138靶向药物治疗后标本，选择在正常和/或异常浆细胞中阳性表达明显强于其他系别血细胞的抗原标志用于设门，包括靶点抗原。
本发明还提供了上述方案所述的试剂盒或者所述的系统在制备筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型或者检测浆细胞肿瘤或者检测治疗后残留肿瘤性浆细胞的检测产品中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例采用流式细胞术对临床患者的骨髓、胸腹水、外周血等标本进行免疫表型分析，对经初筛可疑浆细胞异常的标本应用本发明的第一组合进行第二步全面的表型检测。所述初筛使用的19种抗体组合记载在申请号为202111067074.3专利中。对已明确浆细胞肿瘤和治疗后检测浆细胞的标本应用本发明的第二组合灵活配置，进行浆细胞数量、克隆性及靶点抗原变化的评估。
实施例1 试剂的配制
本发明提供了抗体组合，第一组合共18种抗体，按照表1中的组合配置抗体及配伍的荧光素，包括：抗CD9 cFluor V420、抗CD81 BV421、抗CD20 cFluor V450、抗CD184（CXCR4）BV510、抗CD45 cFluor V547、抗CD279（PD-1） BV605、抗CD56 BV711、抗CD28BV785、抗GPRC5D FITC、抗CD269（BCMA）PE、抗CD319（SLAMF7）PE-Dazzle594、抗CD138 PE-Cy7、抗CD19 cFluor BYG710、抗CD307e（FcRL5） APC、抗CD38 cFluor R668、抗CD47 AlexaFluor700、抗CD200 APC/Fire750和抗CD27 APC/Fire810。第二组合共7个骨架抗体+14个备选抗体，按照表1中的组合配置抗体及配伍的荧光素，7个骨架抗体包括：抗CD45 cFluorV547、抗CD56 BV711、抗CD19 cFluor BYG710、抗CD138 PE-Cy7、抗CD38 cFluor R668、抗cLambda PE-Dazzle59和抗cKappa cFluor R720；14个备选抗体包括：抗CD9 cFluor V420、抗CD81 BV421、抗CD20 cFluor V450、抗CD184（CXCR4）BV510、抗CD279（PD-1） BV605、抗CD28 BV785、抗GPRC5D FITC、抗CD269（BCMA）PE、CD117 PE-Cy5、抗CD319（SLAMF7）PerCP-Cy5.5、抗CD307e（FcRL5）APC、抗CD47 Alexa Fluor700、抗CD200 APC/Fire750和抗CD27APC/Fire810。
配置抗体组合：取上述两组抗体，按照预实验确定的每次用量，混合置于2个容器内，用于浆细胞表型标记。
上述抗体均可直接商业购买获得，本发明实施例的抗体从BD公司，Biolegend和Cytek公司购买。
将上述抗体组合在一起制备用于筛查浆细胞治疗靶点和异常表型的检测试剂盒。所述试剂盒还包括红细胞溶解液、破膜剂和缓冲液PBS，所述红细胞溶解液可自行配置也可以商业购买。
实施例2 流式细胞仪检测分析浆细胞的免疫表型
一、实验主要材料及仪器
1. 材料：10×PBS缓冲液PBS、流式细胞仪专用红细胞裂解液（FACS溶血素，BD公司）；
2. 仪器：CytekNL-3000型号全光谱流式细胞仪，配备405nm，488nm、635nm三根激光，38个荧光检测器。台式低速离心机、漩涡混匀器。
二、方法
1. 样本采集：
将取材到的人骨髓液1~3mL立即置于肝素抗凝管并迅速颠倒数次以防止标本凝固，胸腹水、灌洗液等各种细胞，采集后应尽快送往实验室，标本放置于4℃冷藏保存。必须在48h内检测完成流式细胞仪检测，按说明书操作。
2. 样本制备过程：
（1）细胞计数：取骨髓10μl加入150μl PBS，混匀，利用迈瑞FCM计数每微升细胞数，根据检测结果，将细胞浓度调整为10×106/100µl，初诊及治疗后患者分别取50µl、100µl细胞加入流式管中。
（2）膜表面抗原染色：
a) 每管分别加入表1中相应的荧光素标记的用于膜标记的抗体预混液和骨髓标本充分混匀，室温避光孵育15 min；
b) 固定（胞浆抗原染色需要）：加入透膜剂A液100µl，震荡混匀，室温作用5min。
c) 溶血：加入1×FACS溶血素2ml，低速涡流混匀，室温避光静置8~10min。300g离心洗涤5min，弃去上清。
d) 胞浆抗原染色（胞膜抗原染色无需此步骤）：加入透膜剂B液50µl使细胞膜通透，同时加入相应的荧光素标记胞浆抗体，混匀后室温避光孵育15min。
e) 洗涤：加入1ml含有0.1% NaN3和1%-2% BSA的1×PBS缓冲液，300g离心洗涤5min，弃去上清。加入PBS 200μl悬浮细胞，待上机检测。
（3）上机检测：
a) 确定最适电压和补偿：按照光谱流式细胞仪的常规操作方法设定电压，参照本试剂盒的荧光配色制备单染样本，用于仪器设定。
b) 仪器设置、校正和质控：CytekNL-3000开机预热机器20min以上并上去离子水冲洗，检测质控品，保证各检测值在控制范围内。分别建立抗体组合模板，每次调取上样，采集数据。
c) 上机检测：按照设定好的仪器条件，初诊患者每管获取10万个细胞，治疗后患者每管获取100万个细胞。如不能及时上机检测，则加入0.5ml 1%多聚甲醛，混匀后置于4℃冰箱内保存，24小时内完成检测。
三、数据分析：使用Kaluza软件分析数据
1. 首先使用FSC-A/FSC-H设置去双连体细胞门A，SSC-A/SSC-B继续设置门B去黏连，FSC-A/SSC-A图去除碎片及死细胞，将活的单个细胞设门R1。
2. 显示R1门细胞，建立CD45/SSC图，根据CD45和SSC的分布不同，淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、有核红细胞进行设门并设定不同颜色。淋巴细胞（R2）：CD45最高/SSC最低，单核细胞（R4）：CD45比淋巴细胞低/SSC比淋巴细胞高比粒细胞低，粒细胞（R4）：CD45比单核细胞低/SSC最大，有核红细胞（R6）：CD45阴性/SSC低与淋巴细胞相同。正常骨髓中，各群细胞具有正常比例范围：淋巴细胞20%~40%，单核细胞2%~8%，粒细胞40%~60%，有核红细胞2%~15%。观察各群细胞比例是否正常。
3. 浆细胞设门分析：R1门内，为保证浆细胞设门的纯度，去除非特异细胞，可以利用多个标志多种方法连续精确设门。
（1）采用经典的CD38/CD138对浆细胞初步设门，再根据CD45/SSC进一步去除非特异，根据CD19/CD56二维点图区分正常浆细胞（nPC）和异常浆细胞（aPC），分别计算不同亚群cKappa与cLambda的比值，nPC可以作为cKappa与cLambda表达的正常对照，aPC中出现单克隆cKappa或cLambda表达，可以确定为限制性表达，从而判断为肿瘤性；再次根据CD56/CD38进一步确定cPC（图1）。建立一系列2个抗原的二维点图，观察这些图中膜抗原和靶点抗原的表达及与正常浆细胞的区别（图2）；
（2）通过抗原表达进一步纯化浆细胞，按照图3显示方法对1例患者使用第二组合精细设门。图3显示的方法具体是：采用CD38/CD138/CD45/SSC联合设门浆细胞（PC1）后，分析PC1门内细胞，发现4.37%细胞（AA门）CD81的表达在浆细胞分布范围外，CD38和 CD138表达较低，均处于阴性边界位置，在CD56/CD19,CD269/CD184,CD117/CD307e图中为斜角分布，均提示为非特异性细胞。因此设PC2门，将非特异性细胞（AA门）去除。将PC2门细胞显示在CD19/CD56图中，对CD19+和CD19-细胞设门nPC和aPC2,分析两群细胞cKappa和cLambda表达，结果nPC为多克隆性，aPC2为单克隆，表达cLambda。如图3所示，根据CD38/CD138/CD45/SSC初步设门后，发现CD56/CD19,CD269/CD184,CD117/CD307e二维点图中均有斜角分布的细胞群，而CD81的表达在浆细胞分布范围外，提示非特异性细胞，可以根据CD81/CD38图将非特异细胞（AA门）去除后再分析抗原及轻链表达。
（3）当浆细胞肿瘤患者接受了针对CD38和/或CD138的靶向治疗后，无法再根据CD38/CD138对浆细胞常规设门，这时需要寻找其他阳性表达的抗原区分浆细胞。图2显示MM患者初诊高表达CD20。图4与图3为同例患者，经图3设门后显示抗原表达结果及非CD38/CD138设门方法。异常浆细胞表型为CD45-CD56-CD19-CD200+CD20+CD27+CD81-CD28st+CD184+CD9+，LAIP为CD45-CD19-CD81-CD200+CD20+CD28st+CD184均一+，靶点抗原表达：CD319+CD307edim+ CD269part+CD47dim+CD279-。第三排显示如果应用了针对CD38和CD138靶向治疗后的设门方法，此例患者CD27st+，因此首先利用CD45/CD27对CD27+细胞设门Q,再利用CD200/CD56,对CD200+CD56-细胞设门T,在CD81/CD20图中显示T门细胞，对CD81+CD20-设门AB,CD20+CD81-设门AC,分析两群细胞cKappa和cLambda表达，结果AB为多克隆性，AC为cLambda单克隆。精简第二组合X可以选择：CD200,CD20,CD81,CD28,此例患者除去CD38和CD138外，其余靶点抗原表达较弱或不表达，因此如果不应用这些靶点药物，可以不必连续检测，则X=4,精简第二组合总体抗体数是11。最下面一排显示利用这些LAIP可以清除地区分正常浆细胞和异常浆细胞。
4. 图4患者高表达CD27，可以分别根据较强表达的抗原用于CD38/CD138设门的补充。另外，如患者初诊时有表达较强的靶点抗原，也可以作为比较不错的设门浆细胞的标志。图5显示采用不同靶点抗原的设门方法及与CD38/CD138设门的比较。此例MM患者的浆细胞CD38st+CD138part+，采用CD38+CD138+对浆细胞设门会低估浆细胞比例，只能先根据CD38/CD138图对CD38st+细胞设门，但这种设门方式会将其他细胞包括在内，CD45/SSC图可以看出包含了部分SSC较大的粒细胞和淋巴细胞，需要再根据CD45/SSC图去掉SSC偏大的粒细胞和SSC偏小的淋巴细胞，从而设门浆细胞（PC1）。此外，根据不同靶点抗原的阳性表达特点，还可以选择多种靶点抗原设门方法：（1）该患者强表达靶点抗原GPRC5D，可以先根据GPRC5D/SSC图选择GPRC5D+细胞，再通过CD45/SSC去除SSC偏小CD45强的淋巴细胞，进一步设门浆细胞PC2，这样设门的浆细胞比较纯（第二排）。（2）该患者还强表达靶点抗原CD319，可以先根据CD319/SSC图选择CD319+细胞，会包括部分淋巴细胞，需要通过CD45/CD319进一步设门浆细胞PC3，从CD45/SSC图可以看出，这样设门的浆细胞也比较纯（第三排）。（3）根据患者高表达CD200、表达CD307e的特点，先设门CD307e+CD200+细胞,再根据CD45/CD307e设门C，最后根据CD45/SSC图去除其他细胞，从而得到浆细胞PC4（第四排）。（3）患者高表达CD47，根据CD47/CD269图对CD47+CD269+细胞设门，显示CD45/CD47去除淋巴细胞并设门D，最后根据SSC/CD269图去除SSC偏大的粒细胞，从而得到浆细胞PC5（第五排）。如图5所示，患者高表达GPRC5D，CD319和CD307e，可以分别选择GPRC5D+，CD319+和CD307e+的细胞进行设门，同时联合其他标志去除其他系别细胞的干扰。（4）对于精简第二组合治疗后浆细胞的分析，根据初诊抗原的表达及靶点药物进行抗体选择，确定X的个数，如图3所示。
5. 不同抗原在正常浆细胞、异常浆细胞和其他细胞的表达见表2。
表2 不同抗原在正常浆细胞和异常浆细胞上的表达
6. 与浆细胞的正常发育模式进行比较：
建立正常浆细胞的抗原表达图，通过申请号为202111067074.3专利中的抗体组合筛选出浆细胞有问题的患者，继续利用本发明的第一组合或全套第二组合检测初诊患者浆细胞的胞膜抗原和靶点抗原，使用上面所述的分析方法，与正常浆细胞的抗原表达进行比对。
7. 筛查治疗靶点相关的标志：
目前，针对骨髓瘤细胞的免疫治疗是研究的热点。大部分的免疫治疗都会利用肿瘤特异性抗原，目前用于浆细胞肿瘤的靶点包括，CD38、CD138、BCMA、CS1、GPRC5D、 SLAMF7、FcRL5、CD47、免疫球蛋白轻链和ICAM1等。利用本发明两种组合，均可以筛查靶点抗原。
8. 追踪检测治疗后患者残留的浆细胞并确定其是否为单克隆：
即便无初诊表型，也可以利用本发明第二组合检测治疗后患者的浆细胞，与正常浆细胞的发育模式进行比较，判断表型是否异常；再根据胞膜抗原表达，对不同亚群的浆细胞进行连续精确设门，进一步计算免疫球蛋白轻链cKappa和cLambda比值，根据比值判断浆细胞是否为单克隆，从而确定肿瘤性浆细胞的数量，为临床提供疗效评估。
9. 追踪检测靶向治疗后浆细胞的数量及靶点抗原表达变化：
利用本发明精简的第二组合检测靶向治疗后患者是否存在克隆性浆细胞及评估治疗前后靶点抗原的表达变化。对于CD38和/或CD138靶向治疗后患者，可以使用初诊时较高表达的检测或靶点抗原标志，用于浆细胞设门，避免由于出现CD38和/或CD138抗原逃逸，无法识别浆细胞而造成漏诊。
10. 筛查隐匿型浆细胞肿瘤患者或明确其他血液肿瘤同时合并浆细胞疾病的患者：
配合初筛组合，对诊断不明的患者进行筛查。可以筛查出临床症状隐匿的浆细胞肿瘤患者和临床怀疑其他血液肿瘤，未发现同时合并浆细胞疾病的患者，最终明确肿瘤性浆细胞。如图6所示临床怀疑MDS患者，经初筛组合发现克隆性浆细胞，通过本发明第一组合，对浆细胞的表型及克隆性进行精确诊断，为临床提供全面可靠的检测支撑，也让患者及时发现疾病、及时得到全方位治疗争取到时间。
四、结果：
1.患者构成：利用本发明第一组合共检测了17例骨髓样本，男11例，女6例，中位年龄66（42-79）岁。经检测，4例骨髓为正常浆细胞，表型正常，临床诊断为1例ALL-B，2例MDS，1例白细胞减低；12例均检测到异常浆细胞，临床诊断多发性骨髓瘤（MM）；1例浆细胞中同时存在正常浆细胞和异常浆细胞，临床诊断意义未明单克隆免疫球蛋白血症（MGUS）。
2.诊断抗原的表达：
前期我们共收集58例多发性骨髓瘤和8例正常骨髓进行了预实验，结果发现，正常浆细胞和所有MM患者均高表达CD38，仅1例患者CD138阴性，其余中位阳性表达比例为97.00(68.73-100.00)%，是适用范围最广的设门抗原；而且由于表达强度较强，与其他系别细胞重叠较少，适用于浆细胞设门。
从表3可以看出，异常表达比例最高的抗原是CD19和CD45，正常浆细胞多表达阳性，但异常浆细胞以阴性表达为主，是非常适合区分正常和异常浆细胞的LAIP。其次，CXCR4、CD200和CD9在MM患者的阳性表达率较高，患者多出现均一表达阳性（图2），为LAIP。由于正常浆细胞也有部分表达，仅依靠阳性表达比例很难区分，需要借助表达强度来判断。CD81-和CD27-在MM患者的发生率也较高，均高于65%，而且与正常浆细胞表达明显不同；CD117+、CD56+和CD28+也是较好的、特异性的区分正常和异常浆的标志，且异常表达率均在50%上下；这几个标志是仅次于CD19和CD45、适用于区分正常和异常浆细胞的抗原。
表3 诊断抗原在正常浆细胞和异常浆细胞上的表达
所有利用本发明第一组合筛查出的异常浆细胞，其LAIP包括的抗原异常表达数量为2-9个，其中≥5个的患者高达69.2%（9/13），抗原异常数目越多，凭其判断克隆性浆细胞的可靠性越强。本发明组合避免了设门抗体的重复应用，可以全面分析多种诊断检测抗原的表达，同时获得多个标志两两组合的抗原表达图（图2），有利于与正常浆细胞鉴别。
3.胞浆轻链的表达：
第一组合配合初筛管组合，以及第二组合的优势之一是，均可以首先利用膜标记，鉴别表型大致正常和异常表型浆细胞，并对表型不同的细胞进行精细设门，再计算胞浆轻链cKappa和cLambda比值，从而判断克隆性，检测出真正的肿瘤性浆细胞。结果参见图1，图1显示浆细胞连续设门方法及作用。首先根据FSC-A/FSC-H，SSC-A/SSC-B，FSC-A/SSC-A，设门A、B、R1,去除双连体及碎片，设立CD45/SSC图，对R1门细胞进行淋巴细胞，粒细胞，单核细胞和有核红细胞设门（第一排）。再利用CD38/CD138，CD45/SSC对CD38+CD138+和SSC大CD38+浆细胞进行连续设门PC1和PC2。显示PC2门内细胞，分析其cKappa和cLambda表达，比值为0.01，明显低于正常，为克隆性（第二排）。但PC2中CD38表达存在CD38st+和CD38dim+两群细胞，显示PC2门细胞于CD19/CD56图中，存在3群细胞：CD19+CD56-,CD19-CD56-和CD19-CD56+,分别命名为nPC1,nPC2和aPC,分别分析三群细胞cKappa和cLambda表达，结果显示nPC1,nPC2细胞cKappa和cLambda比值在正常范围，均为多克隆性；aPC为单克隆性。继续设门后证明，只有cPC是真正单克隆性细胞，其余均为多克隆性浆细胞。图1说明，首先利用膜标记，鉴别表型大致正常和异常表型浆细胞，并对表型不同的细胞进行精细设门，才可能检测出真正的肿瘤性浆细胞。如图1所示，对CD38+CD138+浆细胞进行初步设门后，根据CD19/CD56分为3群细胞：CD19+CD56-（nPC1）,CD19-CD56-（nPC2）和CD19-CD56+（aPC），结果显示，nPC1和nPC2细胞的cKappa和cLambda比值在正常范围，为多克隆性，而aPC为单克隆。继续根据CD56/CD38设门后证明，CD56+CD38st+（nPC3）细胞仍是多克隆，只有CD56+CD38dim+（cPC）才是真正的肿瘤性浆细胞。
结果证实，MM患者异常浆细胞均限制性表达胞浆免疫球蛋白轻链，仅具有正常浆细胞的4例骨髓和1例MGUS样本，浆细胞中胞浆免疫球蛋白轻链比值正常，为非限制性表达（表3,4）。
本组合另一个设门优势是，由于检测抗原数多，并且在一管内，可以灵活应用多种抗原标志对浆细胞进行设门，纯化浆细胞以去除非特异，不必固定设门抗体。如图3所示，去除非特异后再根据膜标志区分正常和异常浆细胞群，分别计算cKappa和cLambda比值。
4.靶点抗原的表达：
本发明抗体组合第一次将多数浆细胞较热门的靶点抗原纳入，除常规CD38和CD138外，还包括CD269（BCMA）、GPRC5D、CD319（SLAMF7）、CD307e（FcRL5）、CD47和CD279（PD-1），为后期靶向治疗提供了选择机会。
表4 靶点抗原在正常浆和异常浆细胞上的阳性表达比例
通过检测发现（表4），以＞20%作为抗原表达阳性的标准，计算患者的阳性比例。除CD279外，其他5种靶点抗原在正常与异常浆细胞的阳性率均为100%。正常浆细胞高表达CD319，CD307e和CD47，阳性表达细胞的比例均高于95%，GPRC5D的阳性比例高于80%，CD269的阳性表达比例稍低，为64.30%~92.30%。正常与异常浆细胞的阳性表达比例均无明显区别，13例具有异常克隆性浆细胞的患者中，全部患者均表达CD319、GPRC5D和CD307e，中位阳性细胞比例分别为99.08%（66.90%~100%），95.54%（86.76%~98.55%）和94.18%（82.10%~100%），且表达强度较强；CD47也均为阳性表达，中位阳性表达细胞比例为92.97%（60.10%~99.92%），其中4例患者在60.10%-84.45%之间，其余9例阳性表达比例均高于85%；所有患者也都表达CD269，但阳性表达比例略低，8例患者阳性表达比例在25.09%~83.22%之间，其余5例患者高于85%，中位阳性比例为82.95%。从上述结果可以看出，这4种抗原是较理想的适用于浆细胞肿瘤的靶点抗原。
CD279在异常浆细胞中的阳性表达率为76.92%(10/13)，但中位阳性表达比例仅57.81%，且表达强度普遍较弱，不是较好的靶点抗原。
5.可替代CD38/CD138设门浆细胞的方法：
对于CD38和/或CD138靶向治疗后患者，可能会出现CD38和/或CD138减弱或缺失的情况，影响浆细胞设门，需要寻找其他的设门抗原。
在初诊异常浆细胞上表达阳性、表达强度较强、且与其他系别细胞重叠较少的检测抗原都可以用来设浆细胞，结果参见图2，图2显示1例多发性骨髓瘤患者利用第一组合检测结果（A）及利用非CD38/CD138设门方法(B)。病例同图1，A图显示利用CD38/CD138和CD45/SSC设门浆细胞（PC）,利用CD19/CD56和CD56/CD38对PC精确设门（方法同图1）后抗原的表达结果（R1门）。R1同时显示浆细胞及其他系列细胞。cPC是真正单克隆性浆细胞，该群细胞表型为CD56+CD19-CD20-CD22-CD27+CD81+CD28+CD184+CD9+CD200+,LAIP为CD56+CD19-CD45-CD200st+CD184均一+，靶点抗原表达：CD319+CD307e+CD269+CD47+CD279dim+。B图显示此例患者如果应用了针对CD38和CD138的靶向治疗，不能应用CD38/CD138设门时的设门方法。此例患者由于CD200st+CD319+CD27+,且与其他系细胞基本没有重叠，因此，首先利用CD200/CD319对浆细胞设门C,利用CD45/CD27设门D除去C门内非浆细胞，再利用CD200/SSC进一步设门浆细胞PC1，PC1门图（B图中右侧2图）显示抗原表达与PC门一致。此例精简第二组合X可以选择CD200,CD184,根据靶点药物应用选择靶点抗原，如应用CD307e和CD47，则需要选择，这时X应为4，精简第二组合总抗体数为11个；如果应用CD38和CD138的靶向治疗，则不需要检测CD307e和CD47，但需要另外设门抗体，如CD319,CD27,X仍然为4，总体第二组合抗体数为11。如图2患者浆细胞高表达CD200，图4患者高表达CD27，均可以用作浆细胞的设门抗原。
靶点抗原GPRC5D、CD319和CD307e由于在浆细胞上的阳性表达率高、表达强、覆盖面广，也适用于浆细胞设门，如图5患者浆细胞强表达GPRC5D、CD319和CD307e，靶点抗原CD47的表达强度一般，但由于患者浆细胞CD47的阳性表达率也较高、特异性较高，也可以用来设门浆细胞。CD269在浆细胞上的表达偏弱，最好联合其他标志辅助设门浆细胞。
6.与8-10色免疫分型结果的比较：
17例标本均同时进行了常规的8-10色4管抗体组合免疫分型检测，抗体组合见表5，第一管为筛查管，2-4管为MM检测管。如果经第一管检测发现有较多CD38st+CD19-CD56+/-细胞，会检测2-4管。缺点是第一管不能确定浆细胞是否为克隆性，尤其是浆细胞比例较低时。经常经2-4管检测后，发现浆细胞为多克隆。利用本发明第一组合和初筛管组合共使用36种抗体，常规8-10色组合使用38种抗体，由于多检测2管组合，多使用设门抗体CD38,CD138,CD45,CD19共8次，有效抗体数为38-8=30，低于本发明的第一组合和初筛管组合。两种方法对克隆性浆细胞的判断一致，但利用本发明组合，使用的抗体总数比常规法少，由于减少了设门抗原的重复使用，多检测了7种其他抗原。同时，对浆细胞的进一步检测，由3管变为1管21种抗原，可以充分地分析管内21种抗原表达两两组合的大量信息；还可以根据21色组合中任何在浆细胞上表达较强的膜标志抗原对浆细胞进行设门，再结合浆细胞上表达异常的标志对异常浆细胞进行精确设门，提高了对肿瘤性浆细胞检测的灵敏度和特异性，可以作为CD38/CD138设门的替代补充（图2和图4）。
7.明确隐匿型及合并其他血液肿瘤的浆细胞肿瘤患者：
对症状不明显的隐匿型患者、及合并其他血液肿瘤的浆细胞疾病的患者，配合前一个专利202111067074.3的筛查，可以发现这些患者。图6显示1例三系减低的患者，临床怀疑骨髓增生异常综合征（MDS）并未考虑浆细胞疾病。A图显示利用前一个专利的初筛组合检测结果，CD34+CD117+髓系幼稚细胞比例为4.97%，大于正常值（1.0%），CD34+细胞中CD19+B祖细胞占1.97%，比例低于正常（5.0%），支持MDS诊断。但同时发现CD38st+浆细胞占1.45%，利用CD19/CD56对CD19+和CD19-浆细胞设门，分别显示两群细胞胞浆轻链的表达，可见CD19-浆细胞为ckappa单克隆，占95.59%，ckappa与clambda比值大于3。CD19+浆细胞ckappa与clambda比值等于0.93，比值正常，为多克隆性正常浆细胞。B图是本发明第一组合检测结果，克隆浆细胞的LAIP为CD45-CD19-CD81-CD9均一+；弱表达靶点抗原CD269,不表达CD279。此例患者说明结合初筛管及A管检测，可以全面检测出隐匿性的浆细胞疾病患者及浆细胞疾病合并其他血液肿瘤的患者。图6显示1例三系减低的69岁女性患者，临床怀疑MDS进行骨髓检查，通过图6中的A初筛组合（申请号为202111067074.3专利）检测，患者CD34+CD117+幼稚髓细胞在有核细胞中占4.97%，比例增高且存在表型异常，支持MDS诊断。但同时发现，患者浆细胞比例占1.45%，且86.88%细胞CD19阴性，表达单克隆cKappa，继续本发明组合A对浆细胞进行进一步全面检测（图6中的B），克隆浆细胞的LAIP为CD45-CD19-CD81-CD9均一+；弱表达靶点抗原CD269,不表达CD279。此例诊断应该为MDS合并单克隆性浆细胞疾病，而不是最初的单纯MDS。
表5 用于浆细胞检测的常规8-10色4管抗体组合
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种用于流式细胞筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型的抗体组合，其特征在于，包括第一组合和第二组合；
所述第一组合包括：抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD45抗体、抗CD279抗体、抗CD56抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD319抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD307e抗体、抗CD38抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗 CD27抗体；
所述第二组合包括必选抗体和备选抗体；
所述必选抗体包括：抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体、抗cLambda抗体和抗cKappa抗体；
所述备选抗体选自抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD279抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD117抗体、抗CD319抗体、抗CD307e抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗 CD27抗体中的一种或几种；
所述第一组合和第二组合在检测时分别用于1个流式管中；
所述备选抗体的选择标准包括1）~3）所述标准中的一种或几种：
1）选择与正常浆细胞表达不同的抗原对应的抗体；
2）选择表达阳性的靶点抗原对应的抗体并根据临床对靶点筛查需求进行灵活配置；
3）对使用CD38和/或CD138靶向药物治疗后标本，选择正常浆细胞和异常浆细胞均表达的抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合中的抗体为荧光素标记的抗体；
所述第一组合中，抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD45抗体、抗CD279抗体、抗CD56抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD319抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD307e抗体、抗CD38抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗CD27抗体的荧光素标记按顺序分别为：cFluor V420、BV421、cFluor V450、BV510、cFluor V547、BV605、BV711、BV785、FITC、PE、PE-Dazzle594、cFluor BYG710、PE-Cy7、APC、cFluor R668、AlexaFluor 700、APC/Fire750和APC/Fire810；
所述必选抗体中，抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗cLambda抗体、抗CD19抗体、抗CD138抗体、抗CD38抗体和抗cKappa抗体的荧光素标记按顺序分别为：cFluor V547、BV711、PE-Dazzle594、cFluor BYG710、PE-Cy7、cFluor R668和cFluor R720；
所述备选抗体中，抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD20抗体、抗CD184抗体、抗CD279抗体、抗CD28抗体、抗GPRC5D抗体、抗CD269抗体、抗CD117抗体、抗CD319抗体、抗CD307e抗体、抗CD47抗体、抗CD200抗体和抗CD27抗体的荧光素标记按顺序分别为：cFluor V420、BV421、cFluorV450、BV510、BV605、BV785、FITC、PE、PE-Cy5、PerCP-Cy5.5、APC、Alexa Fluor 700、APC/Fire750和APC/Fire810。
3.根据权利要求1所述的抗体组合，其特征在于，所述抗体还包括第三组合；
所述第三组合包括抗细胞膜抗原抗体和抗细胞胞内抗原抗体；
所述抗细胞膜抗原抗体由抗CD38、抗CD3、抗CD10、抗CD33、抗CD5、抗CD19、抗CD45、抗CD7、抗CD117、抗CD34、抗CD56和抗TRBC1抗体组成；
所述抗细胞胞内抗原抗体由抗cCD79a、抗cLambda、抗cKappa、抗cCD22、抗cCD3、抗cMPO抗体和抗nTdT抗体组成。
4.权利要求1~3任意一项所述抗体组合在制备浆细胞肿瘤检测相关产品中的应用；
所述浆细胞肿瘤检测包括（1）~（3）中的一个或几个方面：
（1）筛查浆细胞治疗靶点和/或异常表型；
（2）浆细胞肿瘤诊断；
（3）浆细胞肿瘤治疗后残留肿瘤性浆细胞检测。
5.一种用于流式细胞检测浆细胞肿瘤和/或浆细胞肿瘤治疗后残留肿瘤性浆细胞的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任意一项所述的抗体组合；所述第一组合和第二组合独立包装。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：红细胞裂解液、破膜剂和缓冲液PBS。
7.一种用于筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型或者用于检测浆细胞肿瘤或者用于检测治疗后残留肿瘤性浆细胞的系统，其特征在于，包括检测部分和分析部分；
所述检测部分包括权利要求1~3任意一项所述的抗体组合或者权利要求5或6所述试剂盒，用于通过流式细胞术检测待测个体的抗原表达水平；
分析部分，用于分析检测部分的检测结果。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于，利用权利要求1~3任意一项所述的抗体组合或者权利要求5或6所述试剂盒对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样品；进行流式细胞上机检测；
其中流式细胞上机检测时按照以下方式设门：
使用FSC的面积和高度设置去双连体细胞门A，使用SSC-A/SSC-B继续去黏连设门B，使用FSC-A/ SSC-A设置活细胞门R1，去除碎片和死细胞；R1门内常规使用CD45/SSC散点图设置血细胞门；所述血细胞门包括淋巴细胞门、粒细胞门、单核细胞门和有核红细胞门。
9.权利要求5或6所述的试剂盒或者权利要求7或8所述的系统在制备筛查浆细胞肿瘤治疗靶点和/或异常表型或者检测浆细胞肿瘤或者检测治疗后残留肿瘤性浆细胞的检测产品中的应用。
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