CN115290875A - 一种6色tbnk淋巴细胞亚群检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种6色tbnk淋巴细胞亚群检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞生物学检测技术领域，具体涉及一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒和检测方法。本发明采用一种新的淋巴细胞亚群检测配色方案，在原有的6色方案基础上加入CD14单克隆抗体，以此来排除单核细胞干扰，同时将CD19和CD4利用相同荧光素标记，进行通道合并，将原来的6通道合并为5通道，空出一个通道给CD14抗体，形成全新的6色TBNK淋巴细胞亚群检测方案。本发明将CD19和CD4分子用同一种荧光素染料标记，可以用CD3来区分B细胞和Th细胞，CD3‑CD19+为B细胞，CD3+CD4+为Th细胞，不影响结果的准确性。

Description

一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于细胞生物学检测技术领域，具体涉及一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒和检测方法。
背景技术
人体正常免疫的维持依赖体液免疫和细胞免疫，多种免疫细胞参与复杂的免疫调控网络，尤其是淋巴细胞。淋巴细胞的绝对数量和相对比例在过敏性疾病、自身免疫性疾病、免疫缺陷疾病、病毒感染和癌症治疗状态均会对发生改变。作为反映细胞免疫水平的关键指标，外周血淋巴细胞亚群检测(TBNK)对影响机体免疫系统的多种因素的诊断和监测提供了重要信息。目前流式细胞术检测单克隆抗标记后的淋巴细胞是监测外周血淋巴细胞亚群的主流方法。流式细胞术(Flow Cytometer,FCM)是对处于快速直线流动状态的单细胞或生物微粒(如细菌)进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。
目前主流外周血淋巴亚群检测主要通过CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16和CD56单克隆抗体实现T细胞(CD3+)，辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+)，细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)，B细胞(CD3-CD19+)，自然杀伤细胞(NK细胞)(CD3-CD16+/CD56+)等淋巴细胞亚群分型。而取得国家医疗器械注册证的试剂抗体组合方案主要有两种：一种是两管四色方案：管1(CD45-PerCP、CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE)，管2(CD45-PerCP、CD3-FITC、CD19-APC、CD16/CD56-PE)。另一种是一管六色方案(CD45-PerCP、CD3-FITC、CD19-APC、CD16/CD56-PE、CD4-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7)。根据《流式细胞术检测试剂质量控制要点分析》在淋巴细胞亚群的绝对计数方面，建议采用单平台方法进行。
目前，单平台计数有微球法和体积法2种方式：微球法，通过加入已知浓度的荧光微球计算各淋巴细胞亚群的绝对数量；体积法，即仪器自身通过计量泵去实时计算通过流动室样本体积来换算成各淋巴细胞亚群的绝对数量。但在临床实际工作中，受个体差异、疾病本身及标本存放时间等因素影响，经常出现淋巴细胞和其他细胞群尤其是单核细胞群不能完全区分的现象，极大的影响检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的提供一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒及检测方法，将CD19和CD4分子用同一种荧光素染料标记，可以用CD3来区分B细胞和Th细胞，CD3-CD19+为B细胞，CD3+CD4+为Th细胞，不影响结果的准确性；并增加CD14，用以排除单核细胞干扰。
本发明提供了一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，包括利用荧光素标记的8种抗体；
所述抗体包括CD14、CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16和CD56；
其中，CD16和CD56标记相同的荧光素，CD4和CD19标记相同的荧光素，且与其他抗体的荧光素不同。
优选的，所述荧光素包括APC-Cy7、APC、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、FITC和PE。
优选的，所述CD16和CD56均标记PE；所述CD4和CD19均标记APC。
优选的，所述CD14标记APC-Cy7，所述CD8标记PE-Cy7，所述CD45标记PerCP-Cy5.5，所述CD3标记FITC。
优选的，所述荧光素标记的8种抗体的工作体积分别为：CD3、CD16、CD56、CD45和CD19的混合抗体体积为20μl，CD4的工作体积为2.5μl，CD8的工作体积为2.5μl，CD14的工作体积为2.5μl。
本发明还提供了上述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒在对外周血进行淋巴细胞亚群进行检测中的应用。
本发明还提供了一种基于上述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒的外周血进行淋巴细胞亚群的检测方法，包括以下步骤：
(1)在流式专用管底部依次加入工作体积的抗体和抗凝全血，混匀后涡旋，避光反应20min，得第一反应物；
(2)将所述第一反应物与溶血素混合并涡旋，避光孵育10min，进行流式细胞术测定。
优选的，在经步骤(2)所述流式细胞术测定后还包括数据分析，所述数据分析包括淋巴细胞TBNK亚群相对分析和/或TBNK亚群的绝对计数分析。
优选的，所述淋巴细胞TBNK亚群相对分析，包括依次建立Time/Count直方图，选取液流稳定区域进行分析；建立CD45/SSC散点图，显示时间门内细胞，圈出CD45+白细胞；建立FSC-A/FSC-H散点图，去除黏连细胞；建立CD14/SSC散点图，显示CD45+细胞，在CD45+细胞中圈出CD14+单核细胞；建立CD45/SSC散点图，建立CD45+CD14-的逻辑门，在CD45+CD14-的细胞中圈出SSC低的淋巴细胞；建立CD3/CD16+CD56散点图，显示淋巴细胞，圈出T细胞和NK细胞；在淋巴细胞中建立去除NK细胞的逻辑门，建立CD3/CD19散点图，显示去除NK细胞的淋巴细胞，圈出B细胞；建立CD4/CD8散点图，显示CD3+T细胞，画十字门，确定CD3+/CD4+的辅助性T淋巴细胞和CD3+/CD8+的细胞毒性T淋巴细胞；
分析各门内细胞的逻辑关系，并分别记录淋巴细胞的获取数，根据各亚群的获取数计算各亚群的相对比例。
优选的，在进行流式细胞术测定时，利用流式细胞的绝对计数管进行TBNK亚群的绝对计数分析。
有益效果：本发明提供了一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，采用一种新的淋巴细胞亚群检测配色方案，在原有的6色方案基础上加入CD14单克隆抗体，以此来排除单核细胞干扰，同时将CD19和CD4利用相同荧光素标记，进行通道合并，将原来的6通道合并为5通道，空出一个通道给CD14抗体，形成全新的6色TBNK淋巴细胞亚群检测方案。
利用本发明所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒进行淋巴细胞亚群检测时，CD19是一个B细胞限制性抗原，表达在B祖细胞开始的B细胞分化、成熟全过程；CD3分子仅存在于T细胞表面起着信号传递的作用，CD4分子主要表达于辅助T细胞(Th)细胞，是Th细胞TCR识别抗原受体，参与Th细胞TCR识别抗原的信号传导；成熟的B淋巴细胞表面表达CD19分子，但不表达CD3分子，成熟的T淋巴细胞表达CD3分子，但不表达CD19分子。本发明将CD19和CD4分子用同一种荧光素染料标记，可以用CD3来区分B细胞和Th细胞，CD3-CD19+为B细胞，CD3+CD4+为Th细胞，不影响结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1淋巴细胞TBNK亚群相对分析图；
图2为本发明实施例1配合流式细胞绝对计数微球检测淋巴亚群绝对计数分析图；
图3为单核细胞干扰淋巴细胞圈门图；
图4为三种方案检测细胞低值质控品结果图；
图5为病例1以常规无CD14方案分析结果图；
图6为病例1以CD14-BV421标记单核细胞的方案分析结果图；
图7为病例1以CD14-APC-Cy7标记单核细胞的方案分析结果图；
图8为病例2以CD14-APC-Cy7标记单核细胞的方案分析结果图；
图9为病例3以CD14-APC-Cy7标记单核细胞的方案分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，包括利用荧光素标记的8种抗体；
所述抗体包括CD14、CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16和CD56；
其中，CD16和CD56标记相同的荧光素，CD4和CD19标记相同的荧光素，且与其他抗体的荧光素不同。
本发明所述抗体均为单克隆抗体，且所述荧光素优选包括APC-Cy7、APC、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、FITC和PE。本发明所述CD16和CD56优选均标记PE，在进行细胞流式检测时，共占一个通道。本发明所述CD4和CD19优选均标记APC，在进行细胞流式检测时，共占一个通道。
在本发明中，所述CD19表达于B细胞，并分布于除浆细胞外的B细胞谱系发育的各个阶段，是B细胞的重要标记；也可以表达于生发中心滤泡树突细胞。本发明所述CD3表达于胸腺细胞和成熟T细胞，CD4表达于辅助T淋巴细胞、胸腺细胞亚型、粒细胞、外周血单核细胞及组织巨噬细胞。本发明基于CD19、CD3和CD4的表达谱，将CD19和CD4两种抗体合并通道而不会相互串扰，不影响检测结果，并利用T特异性抗原CD3、B细胞特异性抗原CD19在其它细胞中无交叉表达的特性，将CD19和CD4抗原检测置于同一通道中，既可以空出一个通道给CD14，又不影响结果的准确性，从而实现在主流双激光6色流式细胞仪单管检测TBNK淋巴亚群。
本发明所述CD14优选标记APC-Cy7，所述CD8优选标记PE-Cy7，所述CD45优选标记PerCP-Cy5.5，所述CD3优选标记FITC。
本发明所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒中，优选还包括流式细胞术过程中涉及的试剂盒耗材如溶血素、缓冲液和流式专用管等。基于本发明所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，可以不同的荧光标记抗体组合实现在双激光6色流式细胞仪单管检测淋巴细胞亚群。本发明实施例中，所用的仪器为双激光流式细胞仪(BD FACSCanto II、BCNavios机型)，其他品牌或机型的仪器同样能够得到相似或相同的结果，因此不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明所述荧光素标记的8种抗体的工作体积，优选分别为：CD3、CD16、CD56、CD45和CD19的混合抗体体积为20μl，CD4的工作体积为2.5μl，CD8的工作体积为2.5μl，CD14的工作体积为2.5μl。本发明所用的各抗体均为商品化试剂，且在使用时，不对抗体进行稀释，使用量均为说明书推荐使用量，实施例中，所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒的抗体组成优选如表1所示。
表1抗体来源和种类及用量
Figure BDA0003797405480000051
本发明还提供了上述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒在对外周血进行淋巴细胞亚群进行检测中的应用。
本发明还提供了一种基于上述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒的外周血进行淋巴细胞亚群的检测方法，包括以下步骤：
(1)在流式专用管底部依次加入工作体积的抗体和抗凝全血，混匀后涡旋，避光反应20min，得第一反应物；
(2)将所述第一反应物与溶血素混合并涡旋，避光孵育10min，进行流式细胞术测定。
利用本发明所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒在对外周血进行淋巴细胞亚群检测，其方法可总结为：孵育：将EDTA抗凝血与上述抗体组合进行孵育；重悬：向上述孵育的细胞中加入溶血素孵育后重悬细胞；检测：对上述重悬的细胞进行流式细胞术测定。在本发明实施例中，具体包括：样品处理过程：在流式专用管底部加入抗体：CD3、CD16、CD56、CD45和CD19的组合抗体20μl，CD14抗体2.5μl，CD4抗体2.5μl和CD8抗体2.5μl；吸取50μl混匀EDTA-K2抗凝全血，加入流式管底部；盖上盖帽，涡旋混匀约3秒钟，室温避光反应20min；向管内加入500μl 1X流式细胞仪用溶血素；盖上管帽，涡旋混匀约10秒钟，室温避光孵育10min；上机检测：仪器运行前使用矫正微球进行矫正，并调节电压补偿。
本发明在经所述流式细胞术测定后，优选还包括数据分析，所述数据分析优选包括淋巴细胞TBNK亚群相对分析和/或TBNK亚群的绝对计数分析。
本发明所述淋巴细胞TBNK亚群相对分析的分析方方法，优选包括用流式专用分析软件建立分析，具体包括：建立Time/Count直方图，选取液流稳定区域进行分析；建立CD45/SSC散点图，显示时间门内细胞，圈出CD45+白细胞；建立FSC-A/FSC-H散点图，去除黏连细胞；建立CD14/SSC散点图，显示CD45+细胞，在CD45+细胞中圈出CD14+单核细胞；建立CD45+/SSC散点图，建立CD45+CD14-的逻辑门，在CD45+CD14-的细胞中圈出SSC低的淋巴细胞；建立CD3/CD16+CD56+散点图，显示淋巴细胞，圈出T细胞(CD3+)，NK细胞(CD3-CD16+CD56+)。在淋巴细胞中建立去除NK细胞的逻辑门，建立CD3/CD19散点图，显示去除NK细胞的淋巴细胞，圈出B细胞(CD3-CD19+)。建立CD4/CD8散点图，显示CD3+T细胞，画十字门，确定CD4+的辅助性T淋巴细胞和CD8+的细胞毒性T淋巴细胞。根据各亚群门内细胞的获取数(Count数)计算各亚群相对数。根据各亚群的Counts数计算各亚群的相对比例及CD3+CD4+Th细胞，CD3+CD8+CTL细胞的比值。
在本发明中，如配合使用绝对计数微球管，可根据已知浓度微球的计数计算各亚群绝对值。淋巴亚群绝对数(cells/μl)＝各淋巴亚群门内细胞数/绝对计数微球数*绝对计数微球浓度(个/μl)。本发明在进行绝对计数的分析时，优选包括：建立Time/Count直方图，选取液流稳定区域进行分析；建立CD3/CD56散点图，显示时间门内(Time)所有细胞，在右上角圈出绝对计数微球(Beads)；
建立CD45/SSC散点图，显示去除Beads的时间门(Time)内细胞，圈出CD45+白细胞(WBC)。在CD45/SSC散点图中CD45强阳性SSC低的区域为淋巴细胞(黑色)；CD45中等强度SSC高的区域为粒细胞(灰色)；处于中间的是单核细胞区域(浅灰色)；建立FSC-A/FSC-H散点图，去除黏连细胞；建立CD14/SSC散点图，显示CD45+细胞，在CD45+细胞中圈出CD14+单核细胞；建立CD45/SSC散点图，建立CD45+CD14-的逻辑门，在CD45+CD14-的细胞中圈出SSC低的淋巴细胞(Lym)；建立CD3/CD16+CD56散点图，显示淋巴细胞(Lym)，圈出T细胞(CD3+)，NK细胞(CD3-CD16+CD56+)；在淋巴细胞中建立去除NK细胞的逻辑门，建立CD3/CD19散点图，显示去除NK细胞的淋巴细胞，圈出B细胞(CD3-CD19+)；建立CD4/CD8散点图，显示CD3+T细胞，画十字门，确定CD3+/CD4+的辅助性T淋巴细胞和CD3+/CD8+的细胞毒性T淋巴细胞；分析方案中各门内细胞逻辑关系。本发明基于获取绝对计数微球、淋巴细胞，CD3+T细胞，CD3+CD4+Th细胞，CD3+CD8+CTL细胞，CD3-CD19+B细胞和CD3-CD16+CD56+NK细胞的获取数(counts)，根据微球已知的浓度计算各亚群的绝对值。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒及检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、样品处理过程：
(1)在流式专用管底部加入表1所示抗体。
(2)吸取50μl混匀EDTA-K2抗凝全血，加入流式管底部。
(3)盖上盖帽，涡旋混匀约3秒钟，室温避光反应20分钟。
(4)向管内加入500μl 1X流式细胞仪用溶血素。
(5)盖上管帽，涡旋混匀约10秒钟，室温避光孵育10分钟。
(6)上机检测：仪器运行前使用矫正微球进行矫正，并调节电压补偿。
2、淋巴细胞TBNK亚群相对分析
(1)如图1中A所示：建立Time/Count直方图，选取液流稳定区域进行分析；
(2)如图1中B所示：首先建立CD45/SSC散点图，显示时间门内细胞，圈出CD45+白细胞。在CD45/SSC散点图中CD45强阳性SSC低的区域为淋巴细胞(黑色)；CD45中等强度SSC高的区域为粒细胞(灰色)；处于中间的是单核细胞区域(浅灰色)。
(3)如图1中C所示：建立FSC-A/FSC-H散点图，去除黏连细胞；
(4)如图1中D所示：建立CD14/SSC散点图，显示CD45+细胞，在CD45+细胞中圈出CD14+单核细胞；
(5)如图1中E所示：建立CD45/SSC散点图，建立CD45+CD14-的逻辑门，在CD45+CD14-的细胞中圈出SSC低的淋巴细胞(Lym)；
(6)如图1中F所示：建立CD3/CD16+CD56散点图，显示淋巴细胞(Lym)，圈出T细胞(CD3+)，NK细胞(CD3-CD16+CD56+)；
(7)如图1中G所示：在淋巴细胞中建立去除NK细胞的逻辑门，建立CD3/CD19散点图，显示去除NK细胞的淋巴细胞，圈出B细胞(CD3-CD19+)；
(8)如图1中H所示：建立CD4/CD8散点图，显示CD3+T细胞，画十字门，确定CD3+/CD4+的辅助性T淋巴细胞和CD3+/CD8+的细胞毒性T淋巴细胞；
(9)分析方案中各门内细胞的逻辑关系见图1中I。
(10)分别记录淋巴细胞，CD3+T细胞，CD3+CD4+辅助T淋巴细胞，CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞，CD3-CD19+B细胞和CD3-CD16+CD56+NK细胞的获取数(Counts)，根据各亚群的Counts数计算各亚群的相对比例及CD3+CD4+Th细胞，CD3+CD8+CTL细胞的比值。
3、加上流式细胞的绝对计数管，用于TBNK亚群的绝对计数分析。绝对计数的分析过程如下(图2)：
(1)如图2中A所示：建立Time/Count直方图，选取液流稳定区域进行分析；
(2)如图2中B所示：建立CD3/CD56散点图，显示时间门内(Time)所有细胞，在右上角圈出绝对计数微球(Beads)；
(3)如图2中C所示：建立CD45/SSC散点图，显示去除Beads的时间门(Time)内细胞，圈出CD45+白细胞(WBC)。
(4)如图2中D所示：建立FSC-A/FSC-H散点图，去除黏连细胞；
(5)如图2中E所示：建立CD14/SSC散点图，显示CD45+细胞，在CD45+细胞中圈出CD14+单核细胞；
(6)如图2中F所示：建立CD45/SSC散点图，建立CD45+CD14-的逻辑门，在CD45+CD14-的细胞中圈出SSC低的淋巴细胞(Lym)；
(7)如图2中G所示：建立CD3/CD16+CD56散点图，显示淋巴细胞(Lym)，圈出T细胞(CD3+)，NK细胞(CD3-CD16+CD56+)；
(8)如图2中H所示：在淋巴细胞中建立去除NK细胞的逻辑门，建立CD3/CD19散点图，显示去除NK细胞的淋巴细胞，圈出B细胞(CD3-CD19+)；
(9)如图2中I所示：建立CD4/CD8散点图，显示CD3+T细胞，画十字门，确定CD3+/CD4+的辅助性T淋巴细胞和CD3+/CD8+的细胞毒性T淋巴细胞；
(10)图2中J显示分析方案中各门内细胞逻辑关系。
同样获取绝对计数微球、淋巴细胞，CD3+T细胞，CD3+CD4+Th细胞，CD3+CD8+CTL细胞，CD3-CD19+B细胞和CD3-CD16+CD56+NK细胞的获取数(counts)，根据微球已知的浓度计算各亚群的绝对值。淋巴亚群绝对数(cells/μl)＝各淋巴亚群门内细胞数/绝对计数微球数*绝对计数微球浓度(个/μl)。
在加入CD14抗体后，可以更加清晰的分辨淋巴细胞与单核细胞(图3中A)，没有用CD14抗体去除单核细胞时淋巴细胞门内会圈到单核细胞，而去除了单核细胞的WBC图中淋巴细胞更加清晰得分辨出来(图3中B)。
实施例2
1、使用细胞低值质控品(Beckman Coulter公司，货号：6607098)进行精密度评价，重复10次完整检测和分析。分别计算各指标(Lym(％)、CD3+(％)、CD3+CD4+(％)、CD3+CD8+(％)、CD19+(％)、NK(％)、Lym(cells/μl)、CD3+(cells/μl)、CD3+CD4+(cells/μl)、CD3+CD8+(cells/μl)、CD19+(cells/μl)、NK(cells/μl))的平均值(mean)、标准差(SD)、和变异系数(CV)，从而对各变量进行精密度评价。根据YY/T1184行业规定，当试剂所测样本的阳性百分比大于等于30％时，CV值应不大于8％；当试剂所测样本的阳性百分比小于30％时，CV值应不大于15％；实施例1方案检测细胞低值质控品的检测结果CV值均不大于5％，符合行业规定。检测结果见表2。
表2细胞低值质控品精密度检测(n＝10)
Figure BDA0003797405480000091
2、使用细胞低值质控品，分别使用常规方案(不加CD14抗体，表3)和以BV421标记的CD14(表4)或实施例1的荧光标记的CD14方案检测细胞低值质控品(抗体组合方案见表1)，每种抗体组合重复10次完整检测和分析。分别计算Lym(％)、CD3+(％)、CD3+CD4+(％)、CD3+CD8+(％)、CD19+(％)、NK(％)、Lym Count(cells/μl)、CD3+(cells/μl)、CD3+CD4+(cells/μl)、CD3+CD8+(cells/μl)、CD19+(cells/μl)、NK(cells/μl)。如图4所示，三种方案检测细胞低值质控无显著差异，具体检测结果见表5。
表3常规方案抗体组合(未加CD14)
Figure BDA0003797405480000101
表4常规方案加CD14-BV421抗体组合
Figure BDA0003797405480000102
表5细胞低值质控品不同组合方案检测结果(n＝10)
Figure BDA0003797405480000103
Figure BDA0003797405480000111
实施例3
正常人新鲜血采用现有常规无CD14抗体的方案已能够达到圈出淋巴细胞的目的，但在疾病状态下病人外周血淋巴细胞和单核细胞区分度不够，本发明提供3例病人加以说明。
病例1诊断为急性扁桃炎，以现有常规不加CD14的方案(实施例2表3)处理分析样本如图5所示，其中淋巴细胞与单核细胞分界不清(图5中D)，在圈出的淋巴细胞中有CD14+的单核细胞混杂(图5中H)。
以BV421标记CD14(实施例2表4)检测同一样本的淋巴亚群。结果如图6所示，去除单核细胞的淋巴细胞更清晰(图6中E)，同样如果分析时不去除单核细胞则淋巴细胞门内会圈入大量单核细胞(图6中J-K)。但BV421需用紫外激光管激发，即在三激光流式细胞仪上实现，无法在双激光流式细胞上实现检测。
利用实施例1所述方法进行检测，结果如图7所示，CD14被标记出来的同时，CD4+的T细胞和CD19+的B细胞也能准确被圈出(图7中G-H)。
病例2为弥漫大B细胞淋巴瘤患者，此患者分析结果如图8所示。
病例3为肺移植状态患者，此患者分析结果如图9所示。
由图5～9可知，到如果没有CD14去除单核细胞干扰，圈出的淋巴细胞门内会混杂单核细胞，如果因为怕混杂单核细胞而把淋巴细胞门放小则淋巴细胞会圈不全。对这三例患者结果进行定量分析见表6，由于单核细胞的混入，使用传统方案淋巴细胞的比例均高于以CD14区分单核细胞分析方案。传统方案淋巴细胞各亚群由于混杂单核细胞，CD3+T细胞、CD3+CD4+辅助T淋巴细胞、CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞、CD19+B细胞占淋巴细胞比例均偏低。传统方案NK细胞比例偏高，是由于单核细胞部分表达CD16，因此多圈入的单核细胞被认为是NK细胞，从而造成了结果的不准确。如果使用绝对计数管计数淋巴细胞及各亚群的绝对值也会增加误差。加入CD14标记单核细胞后能更精确圈出淋巴细胞，而以APC-Cy7标记CD14，以APC同时标记CD19和CD4的方案在检测淋巴各亚群比例时与BV421标记CD14的方案显示了良好的一致性。
表6三例病人新方法与传统方法分析结果
Figure BDA0003797405480000121
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，其特征在于，包括利用荧光素标记的8种抗体；
所述抗体包括CD14、CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16和CD56；
其中，CD16和CD56标记相同的荧光素，CD4和CD19标记相同的荧光素，且与其他抗体的荧光素不同。
2.根据权利要求1所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，其特征在于，所述荧光素包括APC-Cy7、APC、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、FITC和PE。
3.根据权利要求1或2所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，其特征在于，所述CD16和CD56均标记PE；所述CD4和CD19均标记APC。
4.根据权利要求1或2所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，其特征在于，所述CD14标记APC-Cy7，所述CD8标记PE-Cy7，所述CD45标记PerCP-Cy5.5，所述CD3标记FITC。
5.根据权利要求1所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒，其特征在于，所述荧光素标记的8种抗体的工作体积分别为：CD3、CD16、CD56、CD45和CD19的混合抗体体积为20μl，CD4的工作体积为2.5μl，CD8的工作体积为2.5μl，CD14的工作体积为2.5μl。
6.权利要求1～5任一项所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒在对外周血进行淋巴细胞亚群进行检测中的应用。
7.一种基于权利要求1～5任一项所述6色TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒的外周血进行淋巴细胞亚群的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在流式专用管底部依次加入工作体积的抗体和抗凝全血，混匀后涡旋，避光反应20min，得第一反应物；
(2)将所述第一反应物与溶血素混合并涡旋，避光孵育10min，进行流式细胞术测定。
8.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于，在经步骤(2)所述流式细胞术测定后还包括数据分析，所述数据分析包括淋巴细胞TBNK亚群相对分析和/或TBNK亚群的绝对计数分析。
9.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于，所述淋巴细胞TBNK亚群相对分析，包括依次建立Time/Count直方图，选取液流稳定区域进行分析；建立CD45/SSC散点图，显示时间门内细胞，圈出CD45+白细胞；建立FSC-A/FSC-H散点图，去除黏连细胞；建立CD14/SSC散点图，显示CD45+细胞，在CD45+细胞中圈出CD14+单核细胞；建立CD45/SSC散点图，建立CD45+CD14-的逻辑门，在CD45+CD14-的细胞中圈出SSC低的淋巴细胞；建立CD3/CD16+CD56散点图，显示淋巴细胞，圈出T细胞和NK细胞；在淋巴细胞中建立去除NK细胞的逻辑门，建立CD3/CD19散点图，显示去除NK细胞的淋巴细胞，圈出B细胞；建立CD4/CD8散点图，显示CD3+T细胞，画十字门，确定CD3+/CD4+的辅助性T淋巴细胞和CD3+/CD8+的细胞毒性T淋巴细胞；
分析各门内细胞的逻辑关系，并分别记录淋巴细胞的获取数，根据各亚群的获取数计算各亚群的相对比例。
10.根据权利要求7或8所述检测方法，其特征在于，在进行流式细胞术测定时，利用流式细胞的绝对计数管进行TBNK亚群的绝对计数分析。
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