CN107576788A

CN107576788A - 一种检测白细胞分化抗原的参照品及其制备方法

Info

Publication number: CN107576788A
Application number: CN201711071946.7A
Authority: CN
Inventors: 李博
Original assignee: Shenzhen Bard Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Bard Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明申请提供了一种检测白细胞分化抗原的参照品及其制备方法，所述参照品由外周淋巴细胞经过表面或者胞内特异抗体标记，可用于流式细胞仪直接检测。不仅如此，所述参照品在制备过程中，通过特定抗原阳性细胞计数后，标定了特定细胞的浓度，因此其不仅能够给流式细胞仪相对计数检测提供参照，而且可以在绝对计数检测中被用作参照品或计数参照，尤其是用于体积法计算的流式细胞仪在不同时间、不同设备、不同人员的参照和校对。

Description

一种检测白细胞分化抗原的参照品及其制备方法

技术领域

本发明申请涉及一种检测白细胞分化抗原参照品的制备方法，以及由该方法制备得到的参照品，属于免疫学检测技术领域。

背景技术

白细胞分化抗原是白细胞(还包括血小板、血管内皮细胞等)在正常分化成熟不同谱系(lineage)和不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。它们大都是穿膜的蛋白或糖蛋白，含胞膜外区、穿膜区和胞浆区。簇分化抗原(cluster ofdifferentiation，CD)T细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的淋巴细胞可表达不同的分化抗原，这是区分淋巴细胞的重要标志。

人外周血中白细胞表面抗原临床价值在于：1、CD3细胞代表T淋巴细胞总数，表示人体细胞免疫功能状态。CD3+T细胞增高见于某些自身免疫性疾病(如SLE)、重症肌无力、慢性活动性肝炎。CD3+T淋巴细胞数减低，见于恶性肿瘤、自身免疫疾病、先天性免疫缺陷。2、CD19+细胞的数量可间接反映机体的体液免疫功能。B细胞升高多见于慢性细菌感染，急/慢B淋巴细胞白血病，慢性肝病。B细胞下降主要见于原发性B细胞缺陷，严重联合型免疫缺陷。3、CD3-/CD19+反映总B细胞的数量，细胞增多见于自身免疫性疾病；细胞降低见于传染性单核细胞增多症等。

目前流式细胞法临床检测时所采用的参照品为全血(例如CDChex和)和液氮冻存细胞等。这些参照品已经被广泛使用，但是存在以下问题：⑴储存和运输条件苛刻，需要低温(2-8℃)或者超低温(-80℃)；⑵储存周期短，全血的保存期限为3个月；⑶使用过程复杂，例如液氮冻存细胞需要先进行细胞复苏。同一种参照品不能用于不同的设备或检测平台，一次不同设备之间不兼容，设备需要和试剂配套使用，不同设备间的数据不能进行对照。

目前细胞绝对计数在流式细胞仪检测中的临床意义越显重要，例如CD4+细胞绝对计数用于艾滋病的诊断，CD19+细胞在细胞治疗中的应用。目前进行细胞绝对计数常用的方法有：⑴微球类，使用计数微球进行细胞绝对计数的问题在于：试剂价格昂贵；容易因电压调节过高等原因使微球超出数据采集范围，导致检测失败，因而对于操作者的技能要求较高。⑵进样量固定的流式细胞仪，可以每次收集固定体积的样本量，再根据进样量进行细胞计数。这种方式所存在的问题：需要每次使用记数微球进行校对，而微球试剂的价格较高，同时由于微球和细胞性状的差异(微球不含有内容物)，在采集数据时，微球容易超出采集范围。因此，亟需提供一种便于数据采集，成本较低的校对品/参照品。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明申请的目的是提供新的检测白细胞分化抗原的参照品以及其制备方法。

具体来说，本发明申请所述的检测白细胞分化抗原的参照品，为冻干的阳性细胞悬液，由荧光抗体标记的阳性细胞和保存剂组成，保存剂中含有缓冲液，具体来说，含有PBS缓冲液，组份包含Na₂HPO₄,KH₂PO₄,NaCl，KCl，海藻糖和甘露醇。

本发明申请还提供所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，包括如下步骤：

1)收集培养的细胞或者人外周血淋巴细胞，然后与缓冲液混合成细胞悬液；

2)在所述细胞悬液中加入抗人CD3和抗人CD19抗体，进行孵育，然后离心收集细胞，重新在缓冲液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心得到抗体标记的细胞；

3)将得到的细胞加入细胞固定液，充分混匀后，避光固定；

4)洗脱细胞固定液，使用流式细胞仪，计阳性细胞数，根据计数结果，在细胞冻干保护缓冲液中，稀释阳性细胞；

5)将含有细胞的溶液分装后冷冻；

6)抽真空冻干，至瓶内容物为白色或者淡黄色粉、饼状；

7)从冻干机中取出，快速封口，保存。

进一步的，所述步骤1)中，经静脉采血或者冲洗血沉棕黄层(Buffy coat)，收集人外周血细胞，将细胞悬液平铺在蔗糖溶液或者商品化的人淋巴细胞分离液上离心，使得不同密度的细胞聚集，收集人外周淋巴细胞，然后使用含有血清的磷酸盐缓冲液或者汉克氏液(Hank’s buffer)混合成细胞悬液。

进一步的，所述步骤2)中，在所述细胞悬液中加入抗人CD3和抗人CD19抗体，避光条件下，15-30℃孵育15-30分钟，离心收集细胞，重新在磷酸盐缓冲液或Hank’s液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心得到抗体标记的细胞；

进一步的，所述步骤3)中，将得到的细胞，按照10³-10⁸个细胞/毫升的浓度，加入细胞固定液，充分混匀后，在2-30℃条件下，避光固定0.25-48小时；

进一步的，所述步骤3)中，加入的固定液含有多聚甲醛。

进一步的，所述步骤4)中，稀释阳性细胞的浓度为10²-10⁸个细胞/毫升。

进一步的，所述步骤5)中，将含有细胞的溶液分装成0.2-2毫升/瓶，置于-80至-20℃，冷冻4-72小时；

进一步的，所述步骤6)中，抽真空冻干时间为12-96小时。

进一步的，所述步骤7)中，从冻干机中取出，快速封口，在-20-8℃条件下保存。

本发明申请的有益效果在于：

1.预标记的阳性冻干细胞在-20℃的条件下可以保存4-6年，在同一个批次的产品件不需要进行对照验证，相较于全血节省了每两个月需要进行的不同批次产品的对照验证；

2.非高温地区的运输，预标记的阳性冻干细胞不需要冷链，相对于液氮冻存细胞所需要的严格的在-80℃条件，节省运输和储存成本，也能满足更多终端用户的需求；

3.冻干细胞所使用的标记荧光素选择常用的FITC，PE,APC等，可应用于目前是常规使用的来自不同厂家的不同型号的仪器。

4.冻干细胞也可用于不同机器、不同操作者或不同实验室之间对于检测方法、操作规程和参数设定的对照。检测结果具有可比性和一定的通用性。

5.本发明产品针对“流式细胞术”设计，荧光抗体标记的阳性细胞表面抗原经固定后保持稳定的数量和荧光强度，相较于未做荧光抗体标记的细胞冻干品，有更好的抗原表达稳定性和细胞特性重现性。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明申请所述的技术方案进行非限制性的说明。

实施例1

本实施例用于说明淋巴细胞CD3和CD19抗原的流式细胞记数参照品及其制备方法，CD3-/CD19+反映总B细胞的数量，细胞增多见于自身免疫性疾病；细胞降低见于传染性单核细胞增多症等。制备方法如下：

1)经静脉采血收集人外周血细胞，将细胞悬液平铺在蔗糖溶液离心，使得不同密度的细胞聚集，收集人外周淋巴细胞，然后使用含有血清的磷酸盐缓冲液混合成细胞悬液。

2)在所述细胞悬液中加入抗人CD3和抗人CD19抗体，避光条件下，20℃孵育20分钟，离心收集细胞，重新在磷酸盐缓冲液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心得到抗体标记的细胞；

3)将得到的细胞，按照10³个细胞/毫升的浓度，加入含有多聚甲醛的细胞固定液，充分混匀后，在20℃条件下，避光固定24小时；

4)洗脱细胞固定液，使用流式细胞仪，计阳性细胞数，根据计数结果，在细胞冻干保护缓冲液中，稀释阳性细胞的浓度为10⁵个细胞/毫升；

5)将含有细胞的溶液分装成1毫升/瓶，置于-20℃，冷冻20小时；

6)抽真空冻干时间为24小时，至瓶内容物为白色或者淡黄色粉、饼状；

7)从冻干机中取出，快速封口，在-10℃条件下保存。

实施例2

1)经冲洗血沉棕黄层收集人外周血细胞，将细胞悬液平铺在商品化的人淋巴细胞分离液上离心，使得不同密度的细胞聚集，收集人外周淋巴细胞，然后使用汉克氏液(Hank’s buffer)混合成细胞悬液；

2)在所述细胞悬液中加入抗人CD3和抗人CD19抗体，避光条件下，26℃孵育18分钟，离心收集细胞，重新或Hank’s液中悬浮细胞，洗脱未标记的多余抗体，离心得到抗体标记的细胞；

3)将得到的细胞，按照10⁷个细胞/毫升的浓度，加入含有多聚甲醛的细胞固定液，充分混匀后，在10℃条件下，避光固定6小时；

4)洗脱细胞固定液，使用流式细胞仪，计阳性细胞数，根据计数结果，在细胞冻干保护缓冲液中，稀释阳性细胞的浓度为10⁶个细胞/毫升；

5)将含有细胞的溶液分装成0.8毫升/瓶，置于-60℃，冷冻46小时；

6)抽真空冻干时间为48小时，至瓶内容物为白色或者淡黄色粉、饼状；

7)从冻干机中取出，快速封口，在6℃条件下保存。

实验例1

取2个不同批次的样品，每个批次各取3瓶。在每瓶中加入1ml超纯水，在15-30℃下放置5-10分钟，使冻干的细胞充分吸水复溶。充分混匀后，每一瓶细胞悬液，以50微升/管的量，均匀分到20只流式上样管，每只上样管中加150微升的磷酸盐缓冲液，分别在BDFACSCalibur和BC Cytomics FC 500流式细胞仪上进行检测。显示冻干预标记的人外周T淋巴细胞在不同的操作者和实验室之间能够保持较好的一致性。结果如下表所示：

表1

		平均值	标准偏差	测试次数
					批次1	管1	103.9	6.6	20
批次1	管2	98.6	7.4	20
					批次1	管3	100.9	13.6	20
批次2	管1	107.4	19.1	20
					批次2	管2	109.2	5.9	20
批次2	管3	97.9	18.7	20

结果显示：

1.该方法制备的细胞，保持完整的细胞形态和细胞内容物，与新鲜细胞相似或相同；

2.该方法制备的细胞，保持了表面抗原表达量，没有目标抗原丢失现象；

3、该方法制备的阳性细胞，在不同的流式细胞仪上检测结果一致，可形成不同机型间的参照和对照；

4、该方法制备的阳性细胞，数量均一，可用于流式计数的校准和参照。

本发明申请提供了一种便于数据采集，且成本较低的淋巴细胞抗原的流式细胞记数参照品。所述参照品由外周淋巴细胞经过表面或者胞内特异抗体标记，可用于流式细胞仪直接检测。不仅如此，所述参照品在制备过程中，通过特定抗原阳性细胞计数后，标定了特定细胞的浓度，因此其不仅能够给流式细胞仪相对计数检测提供参照，而且可以在绝对计数检测中被用作参照品或计数参照，尤其是用于体积法计算的流式细胞仪在不同时间、不同设备、不同人员的参照和校对，是目前仅有的此类产品。

本发明申请提供的参照品可在室温条件下运输和短期储存，并可在2-8℃条件下储存3年以上，可作为流式细胞检测法在细胞分析中的质量控制参考品。

以上一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种检测白细胞分化抗原的参照品，其特征在于：为冻干的阳性细胞悬液，由荧光抗体标记的阳性细胞和保存剂组成，保存剂中含有缓冲液。

2.权利要求1所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3)将得到的细胞加入细胞固定液，使用震荡或者吹打的方式，充分混匀后，避光固定；

5)将含有细胞的溶液分装后冷冻；

6)抽真空冻干，至瓶内容物为白色或者淡黄色粉、饼状；

7)从冻干机中取出，快速封口，保存。

3.权利要求2所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，经静脉采血或者冲洗血沉棕黄层，收集人外周血细胞，将细胞悬液平铺在蔗糖溶液或者商品化的人淋巴细胞分离液上离心，使得不同密度的细胞聚集，收集人外周淋巴细胞，然后使用含有血清的磷酸盐缓冲液或者汉克氏液混合成细胞悬液。

4.权利要求2所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，在所述细胞悬液中加入抗人CD3和抗人CD19抗体，避光条件下，15-30℃孵育15-30分钟，离心收集细胞，重新在磷酸盐缓冲液或Hank’s液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心得到抗体标记后的细胞。

5.权利要求2所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，将得到的细胞，按照10³-10⁸个细胞/毫升的浓度，加入细胞固定液，充分混匀后，在2-30℃条件下，避光固定0.25-48小时。

6.权利要求2所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，加入的固定液含有多聚甲醛。

7.权利要求2所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，稀释阳性细胞的浓度为10²-10⁸个细胞/毫升。

8.权利要求2所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，将含有细胞的溶液分装成0.2-2毫升/瓶，置于-80至-20℃，冷冻4-72小时。

9.权利要求2所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于：所述步骤6)中，抽真空冻干时间为12-96小时。

10.权利要求2所述的检测白细胞分化抗原的参照品的制备方法，其特征在于：所述步骤7)中，从冻干机中取出，快速封口，在-20-8℃条件下保存。