CN104178454B

CN104178454B - 一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法

Info

Publication number: CN104178454B
Application number: CN201310200385.1A
Authority: CN
Inventors: 许嘉森; 刘志明; 吴诗扬; 刘苏燕; 林丽
Original assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2033-05-24
Also published as: CN104178454A

Abstract

本发明提供了一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法，该方法主要包括：对生物体液样本进行红细胞裂解处理；加入与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠进行孵育；用滤膜过滤细胞悬液，富集循环肿瘤细胞。本发明对红细胞裂解、免疫微珠法和滤膜法富集CTCs方法的综合及优化，从而极大地提高循环肿瘤细胞的富集效果，该技术对白细胞的去除效率>99.9%，肿瘤细胞的富集效率>80%。同时，本发明还提供一种使用上述循环肿瘤细胞的富集方法的试剂盒，以及提供一种用于富集循环肿瘤细胞的装置。本发明还提供了一种上述富集的循环肿瘤细胞的分析方法，通过该方法，可以实现肿瘤细胞数量、基因突变、基因表达谱等动态变化的分析。

Description

一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法。

背景技术

目前认为，肿瘤微转移灶起源于侵入循环中的肿瘤细胞，因此，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)可能是肿瘤远处转移的一种标志。近年来，随着分子技术的发展，使得分离、计数外周血CTCs成为可能。在疾病早期阶段，CTCs可能有助于良、恶性肿瘤的鉴别，转移风险的预测和判断。在疾病进展期，CTCs或许可以提供重要的预后信息，以及帮助医生监测治疗效果。而且，CTCs可能反映肿瘤特征，能够指导治疗方案的制定，并且可以作为靶向治疗的靶标。

现有的CTCs富集方法通常是基于CTCs的表面标志物，如免疫磁性分选法，或CTCs的物理性质（密度和大小），如梯度离心法。其中，基于免疫磁珠的CellRearch是一种半自动化的CTCs检测仪器，该方法针对CTCs表面的标志物进行正向富集，2004年已被美国FDA批准用于预测乳腺癌患者的无病生存期和总生存期，但由于CTCs在体内生长过程中会出现丢失上皮细胞黏附因子表面抗原等CTCs表面标志物的现象，不能富集该部分CTCs细胞，在实际使用的局限性较大。

密度梯度离心法的具有简单、廉价、快速等优点，但分离的肿瘤细胞不纯，分离效率不高，有相当一部分肿瘤细胞丢失，在实际应用仍有很大局限。

发明内容

本发明目的之一是提供一种富集循环肿瘤细胞的方法，该方法可以很好地实现肿瘤细胞的富集。

实现上述目的的技术方案如下。

一种循环肿瘤细胞的富集方法，主要包括以下步骤：

1）对生物体液样本进行红细胞裂解处理以去除红细胞；

2）加入与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠进行孵育以去除

白细胞、血小板及残余的红细胞。

在其中一个实施例中，还包括步骤：3）将去除白细胞、红细胞后的细胞悬液在滤膜上进行过滤，得到富集循环肿瘤细胞的滤膜。

本发明中，所述生物体液样本包括但并不局限于以下来源：人或动物的外周循环血，胸腔积液，腹水，脐带血，羊水，骨髓，或培养的人或动物细胞。本发明中，所述免疫微珠由抗体与微珠表面进行共价或非共价偶联而成，所述微珠的直径介于10纳米-100微米，可以为磁性或非磁性，例如具体可以为含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三铁中一种或以上成分的微珠。

所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体，进一步地，所述的免疫微珠上偶联的抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中的两种或以上。

本发明中，所述滤膜孔径为5～8um，选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、或塑料薄膜。

本发明中，使用红细胞裂解液对生物体液样本进行红细胞裂解处理，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份：0.1M～0.5M氯化铵、0.001M～0.2M碳酸氢钾、0.001～0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。进一步地，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份：0.3M～0.32M氯化铵、0.018M～0.022M碳酸氢钾、0.003～0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。进一步地，还包括有0.01%～0.2%的甲醛。

本发明的另一目的是提供一种使用上述循环肿瘤细胞的富集方法的试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒，其组份主要包括：红细胞裂解液，免疫微珠。

进一步地，该试剂盒还可以包括滤膜。

本发明中，所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体，进一步地，所述的免疫微珠上偶联的抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中的两种或以上。

本发明中，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份：0.1M～0.5M氯化铵、0.001M～0.2M碳酸氢钾、0.001～0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。进一步地，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份：0.3M～0.32M氯化铵、0.018M～0.022M碳酸氢钾、0.003～0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。进一步地，还包括有0.01%～0.2%的甲醛。

本发明的另一目的是提供一种用于富集循环肿瘤细胞的装置，包括用于加入红细胞裂解液的部件，用于加入免疫微珠的部件，以及过滤的部件。

本发明的另一目的是提供一种上述富集的循环肿瘤细胞的分析方法。该方法可用于循环肿瘤细胞的分析。

实现上述目的的技术方案如下。

本发明中，循环肿瘤细胞的分析方法包括：免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定。

在其中一个实施例中，该方法为免疫荧光，基因突变检测，基因表达检测。

在其中一个实施例中，该方法包括，将获取循环肿瘤细胞对象的第一份生物体液样本中的循环肿瘤细胞数量与至少接受一部分治疗的同一对象的第二份生物体液样本中的循环肿瘤细胞数量进行比较，从而分析循环肿瘤细胞数量的动态变化。

进一步地，该方法包括，将获取循环肿瘤细胞对象的第一份生物体液样本中的循环肿瘤细胞进行免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定；以及至少接受一部分治疗的同一对象的第二份生物体液样本中的循环肿瘤细胞进行免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定，比较测定结果从而动态的分析获取循环肿瘤细胞对象的基因突变、基因表达谱、蛋白表达谱，和/或酶学的变化。

本发明的另一目的是提供一种细胞纯化试剂盒。该试剂盒可用于去除生物体液中的白细胞、红细胞和/或血小板。该试剂盒主要组份包括有：与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠，所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体；所述抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中的两种或以上。

本发明的主要优点在于：

1）目前富集CTCs的方法中，较为常用的是正性富集法，该法使用的微珠表面偶联与目的细胞结合的抗体（如EpCAM，HEA125，cK7/8），细胞与磁珠结合后，直接被分离出来；而本发明使用的是负性富集法，采用微珠偶联抗白细胞的抗体，从而去除白细胞，使目的细胞得以纯化，避免了因CTCs表面标志物的丢失导致部分CTCs无法有效富集，本发明可以富集更多CTCs。

2）本发明使用负性富集法，避免如正性富集中抗体与CTCs的结合，从而有效保证CTCs细胞的完整性，有利于后续检测与工艺处理。

3）本发明对红细胞裂解、免疫微珠法去除白细胞和滤膜法富集CTCs方法的综合及优化，从而极大地提高循环肿瘤细胞的富集效果，该技术目前对白细胞的去除效率>99.9%，肿瘤细胞的富集效率>80%。

4）本发明联合多种CD抗体免疫微珠，解决了目前由于不同类别白细胞表达CD45的丰度不同，造成单一CD45免疫微珠去除白细胞的结合效率差的问题，极大提高了白细胞的去除效果，从而可以有效富集循环肿瘤细胞。

5）本发明在使用联合多种CD抗体免疫微珠的同时采用微孔滤膜过滤的方法，进一步提高白细胞的去除效率和肿瘤细胞的回收率，极大的提高CTCs纯度，方便后续对肿瘤细胞的研究和分子检测。

附图说明

图1为实施例6的免疫荧光结果示意图，其中图A：DLD-1细胞，图B：HepG2细胞，图C:NCI-H2228，箭头1：白细胞，箭头2：肿瘤细胞。

具体实施方式

实施例1一种富集循环肿瘤细胞的试剂盒，主要包括有：

1、红细胞裂解液

用于红细胞裂解液，具有以下组成：

表1红细胞裂解液

试验组	氯化铵	碳酸氢钾	乙二胺四乙酸二钠	甲醛
					Group1	0.1M	0.001M	0.001M	0.01%
Group2	0.3M	0.018M	0.0036M	0.1%
					Group3	0.31M	0.021M	0.0042M	0.1%
Group4	0.32M	0.022M	0.0045M	0.1%
					Group5	0.5M	0.2M	0.05M	0.2%

蒸馏水补至1L，pH可为7.0～8.0，此实施例中均调至7.4。

2、免疫微珠混合液

免疫微珠由抗体与微珠表面进行共价或非共价偶联而成，所述微珠的直径介于10纳米-100微米，可以为磁性或非磁性，例如具体可以含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三铁中一种或以上的成分。当免疫微珠含有聚苯乙烯和四氧化三铁时，该微珠即为磁珠，使用磁力分离，如磁力架或离心方法均能取得很好的分离效果，当使用非磁性微球时，使用离心方法也能实现相应的技术效果。所述免疫微珠有不同抗体包被，所述抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中的两种或以上。

本实施例中所述微珠使用磁珠，所述免疫磁珠使用1mg时，用于包被免疫磁珠的抗体为30μg，本发明所使用的磁珠购自Thermofisher，并依据产品说明书中的方法进行抗体包被，本发明抗体均购自于协和干细胞基因工程有限公司。在本发明的具体实施例中，用于制备免疫微珠的抗体既可以是特异性地识别任意下述白细胞、红细胞、血小板表面标示物的抗体。具体信息为：

表2免疫磁珠包被抗体

序号	抗体	单克隆号
			1	CD2	HIT11
2	CD15	HI98
			3	CD16	HI16a
4	CD19	HIB19
			5	CD33	HIM3-4
6	CD38	HIT2
			7	CD41	HIP8
8	CD45	HI30
			9	CD235a	HI264

每种包被抗体的免疫磁珠的使用浓度为10mg/mL，依据表3分别取相关免疫磁珠450ul进行混合，离心去上清，加入的1ml PBS重悬，从而制得相关的免疫磁珠混合液，免疫磁珠混合液的具体组成情况列表。

表3免疫磁珠混合液

序号	抗体	实验组
			1	CD2、CD15	Group6
2	CD19、CD33、CD45	Group7
			3	CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a	Group8

3、滤膜

本发明所使用滤膜孔径5～8um，可以使用聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、塑料薄膜。

实施例2一种循环肿瘤细胞的富集方法

使用实施例1中所述的富集循环肿瘤细胞的试剂盒对生物体液样品进行CTCs富集，本发明中的生物体液样本包括但并不局限于以下来源：人或动物的外周循环血，胸腔积液，腹水，脐带血，羊水，骨髓，或培养的人或动物细胞。

具体富集方法包括：

1）样本处理

血液样本与红细胞裂解液以1:3比例进行混合，以裂解红细胞。

2）收集细胞

将预处理后的样本600g离心5min。去上清，加入磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）重悬，600g离心5min，加入PBS重悬细胞。

3）去除白细胞

向细胞悬液中加入免疫磁珠混合液，在混合器上反应30min。将离心管放在磁力架上，静止5min，将上清液转移到一个新的离心管中，得到细胞悬液。

实施例3一种循环肿瘤细胞的分析鉴定方法

1、溶液试剂

1）反应缓冲液：含0.1%BSA，2mM EDTA的PBS，pH7.4。为免疫磁珠上的抗体与细胞表面抗原发生免疫结合反应提供合适的溶液条件。

2）固定液：13%中性福尔马林。

3）封闭液：含10%胎牛血清的PBS，pH7.4。封闭细胞上非特异的抗体结合位点。

4）细胞标记液

配方：含0.1mg/mL FITC标记CD45抗体，0.1mg/mL PE标记CK抗体，15ug/mLDAPI。

功能：向白细胞和肿瘤细胞标记不同颜色的荧光素，用于进行细胞区分。

2、分析鉴定方法

1）细胞标记

向细胞悬液中加入固定液，反应10min。600g离心5min，去除上清。加入封闭液重悬细胞，反应10min。600g离心5min，去除上清。加入细胞标记液重悬细胞，反应30min。600g离心5min，去除上清。加入固定液重悬细胞，反应10min。

2）富集肿瘤细胞

将标记处理的细胞悬液加到滤膜上（滤膜孔径5～8um），进行抽滤处理，抽滤结束后，将滤膜取出，避光保存。

3）细胞鉴定和计数

将滤膜放在荧光显微镜下进行观察，细胞类型判断标准：

白细胞：细胞上同时出现紫色荧光和绿色荧光。

肿瘤细胞：细胞上同时出现紫色荧光和红色荧光。

实施例4使用实施例1中红细胞裂解液对样本进行处理

1、一种红细胞裂解液，具有以下组成：

蒸馏水补至1L，甲醛浓度为体积比，pH可为7.0～8.0，此实施例中均调至7.4。

2、红细胞的裂解：

1）分别取同一标本的血液5ml，红细胞的起始浓度均为5×10¹²/L；

2）分别加入红细胞裂解液试剂15ml，两者充分混合；

3）在4℃放置20min，600g离心5min，弃上清液。采用血细胞自动计数仪对RBC计数，结果如下：

表4红细胞数量平均值（/L）

由以上数据可见，经过本发明所述红细胞裂解液裂解，5组的裂解液均能有效裂解红细胞，其中，Group2、Group3和Group4三组配方红细胞裂解率高达99%以上，裂解效果更佳。

实施例5使用实施例1的试剂盒和实施例2、实施例3的方法对样本进行检测

1）试剂盒的组成

使用实施例1中的循环肿瘤细胞富集试剂盒和实施例2中的实验方法，对20例肿瘤患者外周血分别进行CTCs细胞富集，其中，红细胞裂解液使用实施例4中取得较佳效果的Group2-Group4，滤膜均使用孔径6um的聚碳酸酯滤膜，具体使用试剂盒的组成如表5所示。

表5循环肿瘤细胞富集试剂盒组成

2）样本检测的情况

本实施例使用的样本均为5ml外周血，其中，白细胞在5ml外周血中的平均数量均约为3.5x10⁷，对20例样本富集情况如下表所示，表6为剩余白细胞数量，表7为富集的肿瘤细胞数量。

表6剩余白细胞数量（x10³）

由检测结果可见，本发明实验方案均能有效裂解红细胞、去除白细胞，去除率达99.9%以上，其中，当使用的免疫磁珠混合液含有更多类别的抗体时，去除白细胞效果更佳，如包含Group8的Group11、Group14和Group17，其它抗体组合结果与本实施例一致，试验数据未一一详述。

表7富集的肿瘤细胞数量

由检测结果可见，本发明技术方案采用不同组合的试剂盒，其富集的循环肿瘤细胞数量相近，均能实现一致的技术效果，其它组合结果与本实施例一致。

实施例6一种使用实施例1和实施例2富集的循环肿瘤细胞的分析方法

本实施例所使用的实施例1循环肿瘤细胞富集试剂盒的具体情况为：

名称	具体使用类别
		红细胞裂解液	Group3配方
免疫磁珠混合液	Group8配方
		滤膜	孔径6um的聚碳酸酯滤膜

其它溶液配方和实验步骤如实施例1和实施例2所示。

通过实施例1的试剂盒获取循环肿瘤细胞，回收率高，富集的细胞保持完整的细胞形态，根据实验目的，可用于多种检测方法的分析，该分析方法包括：免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，酶学测定等。

本实施例将具体使用免疫荧光，基因突变检测，基因表达检测等3种分析方法，对通过实施例1获取的循环肿瘤细胞进行分析，具体为：

1）免疫荧光

一方面，如实施例1、实施例2和实施例3所示，本发明实施例4使用免疫荧光技术对富集的循环肿瘤细胞进行标记，从而分析CTCs的数量，具体实验结果见实施例4。

另一方面，本实施例使用免疫荧光技术进行CTCs分析的具体内容为：

A、免疫荧光细胞标记液

配方：含0.1mg/mL FITC标记CD45抗体，0.1mg/mL PE标记CK抗体，15ug/mL DAPI。

B、细胞标记操作

向细胞悬液中加入固定液（配方见实施例3），反应10min。600g离心5min，去除上清。加入封闭液（配方见实施例3）重悬细胞，反应10min。600g离心5min，去除上清。加入细胞标记液重悬细胞，反应30min。600g离心5min，去除上清。加入固定液重悬细胞，反应10min。

C、细胞鉴定和计数

在荧光显微镜下进行观察，细胞类型判断标准：

白细胞：细胞上同时出现紫色荧光和绿色荧光。

肿瘤细胞：细胞上同时出现紫色荧光和红色荧光。

免疫荧光结果，参见图1，其中图A：DLD-1细胞，图B：HepG2细胞，图C:NCI-H2228

箭头1：白细胞，箭头2：肿瘤细胞

细胞在x20放大倍数下分析

CK8-PE：红色荧光；CD45-FITC：绿色荧光；DEPI：蓝色荧光

由上述结果可见，通过本发明获取的循环肿瘤细胞可用于免疫荧光技术分析。

2）基因突变检测

使用益善生物技术股份有限公司提供的“Colonfile可菲”肿瘤个体化医疗靶标检测服务，对本发明上述试剂盒从结直肠癌患者中富集得到的循环肿瘤细胞进行基因突变检测，检测的基因突变有：KRAS基因的E2和E3，BRAF的E15，PIK3CA基因的E9和E20，具体检测结果为：

表8Colonfile可菲检测结果

由此可见，使用本发明获取的循环肿瘤细胞，可用于基因突变检测分析。

3）基因表达检测

使用益善生物技术股份有限公司提供的“Mammafile美菲”肿瘤个体化医疗靶标检测服务，对本发明上述试剂盒从乳腺癌患者中富集得到的CTCs进行基因表达水平分析，检测表达水平的基因包括：TYMS、RRM1、TUBB3、TOP2A、PTEN，具体检测结果为：

表9Mammafile美菲检测结果

由此可见，使用本发明获取的循环肿瘤细胞，可用于基因表达水平的检测分析。

实施例7一种对循环肿瘤细胞进行动态分析的方法

1）循环肿瘤细胞数量的动态变化分析

使用实施例1中的循环肿瘤细胞富集试剂盒和实施例2中的富集方法，并使用实施例3中的分析鉴定方法，分别获取循环肿瘤细胞对象的第一份生物体液样本中的循环肿瘤细胞数量与至少接受一部分治疗的同一对象的第二份生物体液样本中的循环肿瘤细胞数量进行比较，从而分析循环肿瘤细胞数量的动态变化。

分别跟踪5位对象，在其接受治疗之前（时间点1）和至少接受一部分治疗后（时间点2）抽取其血液，使用本发明实施例1中试剂盒和实施例2的富集方法，以及实施例3的分析鉴定方法，对其肿瘤细胞数量进行动态变化分析，结果如表10所示。

表10循环肿瘤细胞数量

对象	时间点1	时间点2
			1	6	3
2	3	2
			3	15	13
4	2	0
			5	5	3

2）循环肿瘤细胞的生物学分析

使用实施例6中CTCs的分析方法，将获取循环肿瘤细胞对象的第一份生物体液样本中的循环肿瘤细胞进行免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定；以及至少接受一部分治疗的同一对象的第二份生物体液样本中的循环肿瘤细胞进行免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定，比较测定结果从而动态的分析获取循环肿瘤细胞对象的基因突变、基因表达谱、蛋白表达谱，和/或酶学的变化。

分别跟踪5位对象，在其接受治疗之前（时间点1）和至少接受一部分治疗后（时间点2）抽取其血液，使用本发明实施例1中试剂盒和实施例2的富集方法，以及使用实施例6中益善生物技术股份有限公司提供的“Mammafile美菲”肿瘤个体化医疗靶标检测服务，对本发明上述试剂盒从乳腺癌患者中富集得到的CTCs进行TYMS和RRM1基因表达水平的动态变化分析，结果如表11所示。

表11基因表达水平的动态变化分析

实施例8免疫磁珠法细胞纯化的方法比较

采用免疫磁珠的方法去除血液中的白细胞，常规的方法是选用单一CD45抗体免疫磁珠。因为CD45抗原在所有的白细胞中都有表达，所以磁珠通过与白细胞结合，达到细胞纯化的目的。而实际上，只采用一种CD45免疫磁珠去除白细胞时，其去除效率一般只能达到80-90%左右。这可能是因为不同类别的白细胞表达CD45的丰度不同，造成与磁珠上抗体的结合效率差异，有一小部分细胞不能有效地被磁珠捕获去除。

为此，本实施例采用针对多个白细胞表面CD抗原的联合免疫磁珠法（联合CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a免疫磁珠）与常规的单一CD45免疫磁珠法进行对比，操作步骤如下，具体实验结果如表12所示。其中，生物体液样本中起始白细胞数均为1×10⁷个。

1、操作步骤：

1）收集细胞：将生物体液样本600g离心5min，去上清，加入磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）重悬细胞。

2）细胞纯化：向细胞悬液中加入免疫磁珠混合液（具体组成参见表12），在混合器上反应30min。将离心管放在磁力架上，静止5min，将上清液转移到一个新的离心管中。

3）检测鉴定方法：具体如实施例3所示。

2、实验结果

表12联合免疫磁珠法与单一免疫磁珠法对比

由上述实施例可见，本发明采用针对多个白细胞表面CD抗原的免疫磁珠去除白细胞，结果表明，与单一采用CD45免疫磁珠相比，采用多种针对白细胞表面抗原的CD抗体免疫磁珠联合去除血液中的白细胞，其去除效率明显提高，达99%以上。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)对生物体液样本进行红细胞裂解处理以去除红细胞；

2)加入与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠进行孵育以去除白细胞、血小板及残余的红细胞；

3)将去除白细胞、红细胞后的细胞悬液在滤膜上进行过滤，得到富集循环肿瘤细胞的滤膜；

所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体；

所述的免疫微珠上偶联的抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中的九种；

所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份：0.3M～0.32M氯化铵、0.018M～0.022M碳酸氢钾、0.003～0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠，所述的红细胞裂解液还包括有0.01％～0.2％的甲醛。

2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述滤膜孔径为5～8um，选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、或塑料薄膜。

3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述免疫微珠由抗体与微珠表面进行共价或非共价偶联而成，所述微珠的直径介于10纳米-100微米。

4.根据权利要求3所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述微珠为磁性或非磁性。

5.根据权利要求4所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述微珠含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三铁中一种或以上的成分。

6.根据权利要求1至5任一所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述生物体液样本来源于人或动物的：外周循环血，胸腔积液，腹水，脐带血，羊水，骨髓，或培养的人或动物细胞。

7.一种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括红细胞裂解液，免疫微珠；该试剂盒还包括滤膜；

所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体；所述的免疫微珠上偶联的抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中的九种；

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述滤膜孔径为5～8um，选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、或塑料薄膜。

9.一种用于富集循环肿瘤细胞的装置，包括用于加入红细胞裂解液的部件，用于加入免疫微珠的部件，以及过滤的部件。

10.一种细胞纯化试剂盒，其特征在于，主要组份包括有：与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠，所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体；所述抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a中的九种。