CN106969964B - 一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒 - Google Patents

一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒，负相富集步骤包括：(1)使用前处理液对血液样本进行离心处理，去除血液中部分杂质；(2)使用裂解液对经过步骤(1)的样本进行裂解，去除血液中红细胞，收集剩余细胞；(3)在剩余细胞中加入连接有相应抗体的磁微粒结合白细胞，室温下进行免疫反应；(4)使用分离介质对经过步骤(3)的样本进行分离，去除未结合的磁微粒；(5)使用免疫磁微粒捕获仪，利用微流控技术进行分离，对白细胞进行去除，最后得到富集后的样本。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明对红细胞进行裂解并优化结合了免疫磁分离、密度梯度离心，微流控等多种技术对白细胞进行快速去除，对白细胞的去除率达到了99％以上。

Description

一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集 方法及试剂盒
技术领域
本发明属于细胞富集领域，特别涉及一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒。
背景技术
CTC(Circulating Tmor Cells)被定义为自发或因诊疗操作而脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。自2003年，美国德州大学Anderson肿瘤中心的克里斯托弗尼Cristofanilli教授及其团队在新英格兰医学杂志上发表的文献中，首次证实治疗前的CTC数量可作为转移性乳腺癌患者无进展生存率(PFS)和总生存率(OS)的独立预测因子后，有关CTC的检测也已经逐步在科研和临床领域得到了推广和应用。在针对CTC的检测中依据原理主要分为正向与负向。正向主要通过特异性捕捉血液中的CTC细胞来进行相关检测，负向则主要通过特异性的去除血液中已知的除CTC之外的生物标志物(蛋白，细胞，核酸)，从而从全血样本中富集CTCs，而CTC在血液中的存在数量要远远少于血液中的其它细胞，去除CTC之外的细胞会减少对CTC的干扰，提高检测的灵敏度与特异性，故在CTC检测之前如何去除无关检测的杂质也是一个重要的研究方向。
CD系列抗原为人白细胞分化抗原，其中CD45由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面；CD45在所有白细胞中均呈高表达，称为白细胞共同抗原。现在常规的白细胞去除主要通过离心、免疫等方式，使用免疫原理去除也有使用亲和层析、磁微粒等多种不同手段，但是所使用的免疫抗体通常只有单独的抗CD-45抗体，虽然抗CD-45抗体是现有CD系列抗体中与白细胞结合率最高的抗体，但结果依然有可提升的空间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法及试剂盒，该方法对红细胞进行裂解并优化结合了免疫磁分离、密度梯度离心、微流控等多种技术对白细胞进行去除，对白细胞的去除率达到了99％以上。
本发明提供了一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法，包括：
(1)使用前处理液对血液样本进行离心处理，去除血液中部分杂质；
(2)使用裂解液对经过步骤(1)的样本进行裂解，去除血液中红细胞，收集剩余细胞；
(3)在剩余细胞中加入连接有相应抗体的磁微粒结合白细胞，室温下进行免疫反应；
(4)使用分离介质对经过步骤(3)的样本进行分离，去除未结合的磁微粒；
(5)使用免疫磁微粒捕获仪，利用微流控技术进行分离，对白细胞进行去除，最后得到富集后的样本。
所述步骤(1)中的前处理液的组成为每升80.00g氯化钠，2.00g氯化钾，14.20g磷酸氢二钠，2.77g磷酸二氢钾，3.72g乙二胺四乙酸二钠，50.00g小牛血清白蛋白，5.00mlTween-20，20.00g蔗糖，0.5ml Proclin-300。
所述步骤(2)中的裂解液的组成为每升32.094g氯化铵，10.00g碳酸氢钾，0.372g乙二胺四乙酸二钠，0.5mlProclin-300。
所述步骤(3)中的抗体为CD2、CD14、CD15、CD45、CD45RA、CD45RO中的三个或三个以上的抗体组。
所述步骤(3)中的免疫反应时间为20分钟。
所述步骤(4)中的分离介质的组成为每升8.000g氯化钠，0.200g氯化钾，1.420g磷酸氢二钠，0.277g磷酸二氢钾，15.00g聚蔗糖400，100.00g泛影酸钠，2.00g甲基纤维素。
所述步骤(5)中提供了一种微流控技术：专利号为201210389753.7的中国发明专利申请文件公开的“一种血液中稀有细胞的分离仪”，以及专利号为ZL201310058653.0的中国发明专利申请文件公开的“一种血液中稀有细胞的分离方法”。两发明提供了一种基于正向富集原理的血液中稀有细胞的富集方法，其中翻转微芯片使微芯片处于不同的三个状态，第一个状态：PBS缓冲液将微芯片内的空气排出；第二个状态：让血液样本流经微芯片，进行检测，微流体通道位于磁铁的下方，此时利用磁铁和微磁场对稀有细胞的磁力和稀有细胞重力的方向相反的原理将稀有细胞从血液样本中分离出来；第三个状态：将微芯片处于垂直状态，提高稀有细胞和血红细胞的分离效率。在检测结束后，微芯片处于垂直状态，便于将附有肿瘤细胞的载玻片从微芯片中取出，进行后续分析。三个状态完成了对稀有细胞的分离。
本发明则主要应用于血液中稀有细胞的负向富集。其中三个状态具体为第一个状态：PBS缓冲液将微芯片内的空气排出；第二个状态：让经过之前步骤处理的血液样本流经微芯片，微流体通道位于磁铁的下方，此时利用磁铁和微磁场对白细胞的磁力和白细胞重力的方向相反的原理将白细胞从血液样本中分离出来，稀有细胞则保留在样本中流经微芯片；第三个状态：将微芯片处于垂直状态，提高白细胞和血样中稀有细胞的分离效率。在处理结束后，微芯片处于垂直状态，收集流经微芯片的血样，进行后续分析。三个状态完成了对白细胞从样本的分离，从而使得血液中稀有细胞得到富集。
本发明还提供了一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集试剂盒，所述试剂盒包括前处理液、裂解液、连接有相应抗体的磁微粒和分离介质。
有益效果
本发明对红细胞进行裂解并优化结合了免疫磁分离、密度梯度离心、微流控等多种技术对白细胞进行去除，对白细胞的去除率达到了99％以上；采用本发明的血液中稀有细胞的富集方法及试剂盒，可以达到富集血液中循环稀有细胞的目的，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例提供了一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集试剂盒，所述试剂盒包括前处理液、裂解液、连接有相应抗体的磁微粒和分离介质。
前处理液的组成为每升80.00g氯化钠，2.00g氯化钾，14.20g磷酸氢二钠，2.77g磷酸二氢钾，3.72g乙二胺四乙酸二钠，50.00g小牛血清白蛋白，5.00ml Tween-20，20.00g蔗糖，0.5ml Proclin-300。
裂解液的组成为每升32.094g氯化铵，10.00g碳酸氢钾，0.372g乙二胺四乙酸二钠，0.5mlProclin-300。
分离介质的组成为每升8.000g氯化钠，0.200g氯化钾，1.420g磷酸氢二钠，0.277g磷酸二氢钾，15.00g聚蔗糖400，100.00g泛影酸钠，2.00g甲基纤维素。
具体步骤如下：
(1)使用前处理液对血液样本进行离心处理，去除血液中部分杂质；
充分混匀一次性真空采血管的全血标本，取20μL全血，加至装有380μL 2％冰醋酸水溶液的一次性试管中，充分混匀，取10μL混匀液加入血球计数板，静置1-2分钟，镜下计数，连续计数3次，取4个大方格总数的平均数。4ml全血中的白细胞数＝4个大方格总数的平均数×2×105。轻微颠倒混匀后取4mL全血至50ml离心管中。用前处理液将离心管内的体积补充到45mL，轻微颠倒混匀，离心(700g，室温，5分钟)，弃上清，留12mL于离心管，轻摇离心管混匀沉淀细胞。
(2)使用裂解液对经过步骤(1)的样本进行裂解，去除血液中红细胞，收集剩余细胞；
添加裂解液至45mL，将离心管置于垂直混匀仪，室温10分钟(20转/分钟)。离心(700g，室温，5分钟)，弃上清溶液，加200μL前处理液于离心管，轻摇离心管混匀沉淀细胞(试管沿同一方向竖直摇匀，但不要使液体超过5mL)，再加入前处理液至5mL。(离心过程中，可开始第4步处理磁微粒)
(3)在剩余细胞中加入连接有相应抗体的磁微粒结合白细胞，室温下进行免疫反应；
洗涤磁微粒：吸取适量混匀磁微粒混悬液(100μL/人份)至2mL EP管中，静置磁力架上1-2分钟，待溶液澄清后，吸出溶液。取下EP管，添加1mL前处理液用枪吹打混匀，磁力架上分离磁微粒1-2分钟，弃上清。重复洗涤3次后，用前处理液重悬磁微粒至原体积。将洗涤好的磁微粒避光保存在试管架上。(磁微粒不能久置于磁力架上，必须随时用前处理液浸泡磁微粒，清洗过程中尽量避免气泡的产生。)按每人份100μL的比例将磁微粒溶液缓慢加入到上述预处理好的血液样本中，同时摇动离心管以充分混匀磁微粒。将摇床摇速调节到100-120rpm，将离心管以45°角倾斜固定于摇床，室温摇动20分钟。
(4)使用分离介质对经过步骤(3)的样本进行分离，去除未结合的磁微粒；
取3mL分离介质加入新的50mL离心管中，将上述步骤3中的所有液体轻轻叠加到分离介质顶层，离心(300g，室温，5分钟)。离心后可见3层溶液，轻柔吸取最上2层溶液，加至新15mL离心管中，添加前处理液至14mL，轻柔颠倒混匀后离心(1000g，室温，5分钟)，弃上清至0.3mL左右，加1mL前处理液，轻柔吹打混匀后移至样本管内。
(5)使用免疫磁微粒捕获仪，利用微流控技术进行分离，对白细胞进行去除，最后得到富集后的样本。
将上述样本管置于免疫磁微粒捕获仪中，自动程序进行免疫磁微粒富集，并收集剩余液体。离心：将上述步骤4的离心管离心(2100g，室温，3分钟)，弃上清至100μL，混匀细胞。计数剩余白细胞数，方法与步骤1中相同。剩余白细胞数＝4个大方格内的白细胞的平均数×5×103。
按照(1-白细胞最终计数)/白细胞初始计数×100％的公式计算白细胞去除率。
使用不同的抗体白细胞去除率结果见以下表格：
表一单个抗体白细胞去除率
抗体 CD2 CD14 CD15 CD45 CD45RA CD45RO
去除率 59.36％ 43.08％ 62.42％ 88.22％ 52.86％ 50.64％
表二双抗体组合白细胞去除率
抗体 CD2+CD14 CD2+CD15 CD2+CD45 CD2+CD45RA CD2+CD45RO
去除率 67.28％ 94.71％ 97.47％ 78.53％ 75.89％
抗体 CD14+CD15 CD14+CD45 CD14+CD45RA CD14+CD45RO CD15+CD45
去除率 68.27％ 89.54％ 62.14％ 60.81％ 97.87
抗体 CD15+CD45RA CD15+CD45RO CD45+CD45RA CD45+CD45RO CD45RA+CD45RO
去除率 76.57％ 75.43％ 95.63％ 96.85％ 87.46％
表三三抗体组合白细胞去除率
Figure BDA0001231535700000041
Figure BDA0001231535700000051

Claims (6)

1.一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法，包括：
(1)使用前处理液对血液样本进行离心处理，去除血液中部分杂质；
(2)使用裂解液对经过步骤(1)的样本进行裂解，去除血液中红细胞，收集剩余细胞；
(3)在剩余细胞中加入连接有相应抗体的磁微粒结合白细胞，室温下进行免疫反应；
(4)使用分离介质对经过步骤(3)的样本进行分离，去除未结合的磁微粒；其中，分离介质的组成为每升8.000g氯化钠，0.200g氯化钾，1.420g磷酸氢二钠，0.277g磷酸二氢钾，15.00g聚蔗糖400，100.00g泛影酸钠，2.00g甲基纤维素；
(5)使用免疫磁微粒捕获仪，利用微流控技术进行分离，对白细胞进行去除，最后得到富集后的样本。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法，其特征在于：所述步骤(1)中的前处理液的组成为每升80.00g氯化钠，2.00g氯化钾，14.20g磷酸氢二钠，2.77g磷酸二氢钾，3.72g乙二胺四乙酸二钠，50.00g小牛血清白蛋白，5.00ml Tween-20，20.00g蔗糖，0.5ml Proclin-300。
3.根据权利要求1所述的一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法，其特征在于：所述步骤(2)中的裂解液的组成为每升32.094g氯化铵，10.00g碳酸氢钾，0.372g乙二胺四乙酸二钠，0.5mlProclin-300。
4.根据权利要求1所述的一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法，其特征在于：所述步骤(3)中的抗体为CD2、CD14、CD15、CD45、CD45RA、CD45RO中的三个或三个以上的抗体组。
5.根据权利要求1所述的一种基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法，其特征在于：所述步骤(3)中的免疫反应时间为20分钟。
6.一种采用如权利要求1所述的基于微流控及免疫磁分离的血液中稀有细胞的负相富集方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括前处理液、裂解液、连接有相应抗体的磁微粒和分离介质。
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