CN108220233A - 细胞分离器具表面处理方法、相关器具、外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞快速高效分离方法 - Google Patents

细胞分离器具表面处理方法、相关器具、外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞快速高效分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种外周血稀有细胞快速高效分离方法，包括：(1)分离外周血中的白细胞，用细胞稀释液重悬浮白细胞得到白细胞溶液；(2)将磁球‑白细胞表面生物标志物抗体与白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；(3)将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用细胞稀释液稀释孵育溶液获得孵育稀释液，使孵育稀释液在环形管路中循环流动，通过磁场吸附孵育稀释液中的磁球，收集环形管路中的液体组分。还提供外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法、细胞分离器具表面处理方法和相关器具。本发明的外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞分离方法能够快速高效地分离外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞，设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。

Description

细胞分离器具表面处理方法、相关器具、外周血稀有细胞或循 环肿瘤细胞快速高效分离方法
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞分离技术领域，具体是指一种细胞分离器具表面处理方法、相关器具、外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞快速高效分离方法。
背景技术
外周血中的循环肿瘤细胞检测作为一种肿瘤液态活检重要内容具有极大的临床诊断价值。外周血中循环肿瘤细胞的检测面临的主要难点包括：1、循环肿瘤细胞数量极少，在7.5ml的血液样本中仅有数个到数十个；2、样本中比例极低，数个或数十个的细胞分布在5-7千万的正常细胞中；3、缺乏明确的循环肿瘤细胞的细胞表面标志物，目前较为广泛使用的循环肿瘤细胞的细胞表面标志分子为EpCAM，但越来越多的研究表明有相当数量的循环肿瘤细胞低表达或不表达该分子；4、缺乏明确的区别于正常细胞的物理特性。一些方法依据细胞密度或细胞大小进行循环肿瘤细胞的富集分离，这些方法都存在处理繁杂耗时、缺乏特性的缺陷。
目前的研究方向趋向于采用负向富集的方法，即将外周血样本中正常的细胞去除，得到外周血稀有细胞，其中最大限度地保留循环肿瘤细胞。外周血中正常细胞都表达CD45细胞表面分子，因此目前广泛采用的方法是采用表面包被特异性CD45抗体的磁球对正常细胞进行修饰，然后在磁场的作用下进行快速分离。但运用该方法往往不能得到预期的分离效果，原因包括：1、处理细胞过程中器具的与细胞接触的表面会非特异性吸附细胞，造成目标细胞10％-60％的损失，在运用一般的表面处理比如一定浓度的血清进行处理后，并不能有效改善；2、在加磁场进行分离时，由于磁场的作用距离较短，所以一般磁球对细胞的修饰会在一个较小的反应体系中进行，一般为小于1-5ml，这就造成样本中细胞的密度过大，达到1千万-7千万每ml，在加磁场分离的过程中，磁球修 饰的细胞会大量携带非磁球修饰的细胞一起分离，导致目的细胞大量丢失。
一些采用微流体芯片的方法通过微流体的特性，将细胞的流动路径进行扰动，以增强细胞表面和流动管道内壁修饰的抗体接触，从而提高目标细胞的捕获效率；另一种微流体芯片采用微流体的特性或声波作用于流体的特性，将流体中不同粒径大小的细胞进行分层分离；无论哪种微流体芯片，其处理样品时采用的微流体处理样本的速度较慢，一般处理1ml的样本在2-3个小时以上。
因此，需要提供一种外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其能够快速高效地分离外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种外周血稀有细胞快速高效分离方法，其能够快速高效地分离外周血稀有细胞，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种外周血稀有细胞快速高效分离方法，其设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其能够快速高效地分离外周血循环肿瘤细胞，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种细胞分离器具表面处理方法，采用该方法进行表面处理的细胞分离器具可以有效减少细胞操作过程中对细胞的非特异性吸附，从而可以减少目标细胞的损失，提高目标细胞的富集分离效率，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种细胞分离器具表面处理方法，其设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种表面处理的细胞分离器具，其可以有效减少细胞操作过程中对细胞的非特异性吸附，从而可以减少目标细胞的损失，提高目标细胞的富集分离效率，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种表面处理的细胞分离器具，其设计巧妙，结构简洁，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种细胞分离器具表面处理方法，其特点是，采用纤维蛋白原封闭处理细胞分离器具的接触细胞表面。
较佳地，所述纤维蛋白原采用纤维蛋白原溶液的形式，将所述纤维蛋白原溶液浸润所述的细胞分离器具的接触细胞表面进行所述封闭处理。
更佳地，所述纤维蛋白原溶液含有的纤维蛋白原是人纤维蛋白原或牛纤维蛋白原。
更佳地，所述纤维蛋白原溶液是0.1％(w/v)-60％(w/v)的纤维蛋白原溶液。
较佳地，所述封闭处理的时间为15分钟-60分钟。
较佳地，所述细胞分离器具是液体盛放容器、液体流经管路或移液吸头。
更佳地，所述液体流经管路的内径为2mm-15mm，所述液体流经管路的外径不超过20mm。
更进一步地，所述液体流经管路的内径为5mm-10mm。
在本发明的第二方面，提供一种表面处理的细胞分离器具，其特点是，所述的表面处理的细胞分离器具的接触细胞表面封闭有纤维蛋白原。
在本发明的第三方面，提供一种表面处理的细胞分离器具，其特点是，采用上述的细胞分离器具表面处理方法处理形成。
在本发明的第四方面，提供一种外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮所述白细胞得到白细胞溶液；
(2)将磁球-白细胞表面生物标志物抗体与所述白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；
(3)将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的所述细胞稀释液稀释所述孵育溶液获得孵育稀释液，然后使所述孵育稀释液在所述环形管路中循环流动，通过所述磁场吸附所述孵育稀释液中的所述磁球，收集所述环形管路中的液体组分。
较佳地，在所述步骤(1)中，采用密度梯度离心或红细胞裂解方法去除所述外周血中的红细胞和血小板。
较佳地，在所述步骤(2)中，所述白细胞表面生物标志物抗体是CD45抗 体。
较佳地，在所述步骤(3)中，所述环形管路的内径为2mm-15mm，所述环形管路的外径不超过20mm。
更佳地，在所述步骤(3)中，所述环形管路的内径为5mm-10mm。较佳地，在所述步骤(3)中，在所述循环流动之前将所述的环形管路的一部分挤压成扁平状管路，所述扁平状管路的距离较短的两个相对管壁之间的间距为1mm-10mm。
较佳地，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.1ml-10ml。
更佳地，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.2ml-5ml。
更进一步地，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.5ml-1ml。
较佳地，在所述步骤(3)之后，所述外周血稀有细胞快速高效分离方法还包括步骤：(4)保持所述的环形管路的一部分在所述磁场中，采用另外的所述细胞稀释液清洗所述环形管路并收集清洗液。
在本发明的第五方面，提供一种外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特点是，包括以下步骤：
A、分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮所述白细胞得到白细胞溶液；
B、将磁球-循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体与所述白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；
C、将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的所述细胞稀释液稀释所述孵育溶液获得孵育稀释液，然后使所述孵育稀释液在所述环形管路中循环流动，通过所述磁场吸附所述孵育稀释液中的所述磁球，弃去所述环形管路中的液体组分，移除所述磁场，采用另外的所述细胞稀释液清洗所述环形管路并收集清洗液。
较佳地，在所述步骤A中，采用密度梯度离心或红细胞裂解方法去除所述外周血中的红细胞和血小板。
较佳地，在所述步骤B中，所述循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体是EpCAM抗体。
较佳地，在所述步骤C中，所述环形管路的内径为2mm-15mm，所述环形管路的外径不超过20mm。
更佳地，在所述步骤C中，所述环形管路的内径为5mm-10mm。
较佳地，在所述步骤C中，在所述循环流动之前将所述的环形管路的一部分挤压成扁平状管路，所述扁平状管路的距离较短的两个相对管壁之间的间距为1mm-10mm。
较佳地，在所述步骤C中，所述循环流动的速度为每分钟0.1ml-10ml。
更佳地，在所述步骤C中，所述循环流动的速度为每分钟0.2ml-5ml。
更进一步地，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.5ml-1ml。
较佳地，在所述步骤C之后，所述外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法还包括步骤：D、采用另外的所述细胞稀释液冲洗所述环形管路并收集冲洗液。
发明的有益效果主要在于：
1、本发明的细胞分离器具表面处理方法采用纤维蛋白原封闭处理细胞分离器具的接触细胞表面，采用该方法进行表面处理的细胞分离器具可以有效减少细胞操作过程中对细胞的非特异性吸附，从而可以减少目标细胞的损失，提高目标细胞的富集分离效率，适于大规模推广应用。
2、本发明的细胞分离器具表面处理方法采用纤维蛋白原封闭处理细胞分离器具的接触细胞表面，设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。
3、本发明的表面处理的细胞分离器具的接触细胞表面封闭有纤维蛋白原，采用上述的细胞分离器具表面处理方法处理形成，可以有效减少细胞操作过程中对细胞的非特异性吸附，从而可以减少目标细胞的损失，提高目标细胞的富集分离效率，适于大规模推广应用。
4、本发明的表面处理的细胞分离器具的接触细胞表面封闭有纤维蛋白原，采用上述的细胞分离器具表面处理方法处理形成，设计巧妙，结构简洁，适于大规模推广应用。
5、本发明的外周血稀有细胞快速高效分离方法包括以下步骤：(1)分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮白细胞得到白细胞溶液；(2)将磁球-白细胞表面生物标志物抗体与白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；(3)将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的细胞稀释液稀释孵育溶液获得孵育稀释液，然后使孵育稀释液在环形管路中循环流动，通过磁场吸附孵育稀释液中的磁球，收集环形管路中的液体组分，能够快速高效地分离外周血稀有细胞，适于大规模推广应用。
6、本发明的外周血稀有细胞快速高效分离方法包括以下步骤：(1)分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮白细胞得到白细胞溶液；(2)将磁球-白细胞表面生物标志物抗体与白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；(3)将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的细胞稀释液稀释孵育溶液获得孵育稀释液，然后使孵育稀释液在环形管路中循环流动，通过磁场吸附孵育稀释液中的磁球，收集环形管路中的液体组分，设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。
7、本发明的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法包括以下步骤：A、分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮白细胞得到白细胞溶液；B、将磁球-循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体与白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；C、将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的细胞稀释液稀释孵育溶液获得孵育稀释液，然后使孵育稀释液在环形管路中循环流动，通过磁场吸附孵育稀释液中的磁球，弃去环形管路中的液体组分。移除磁场，采用另外的细胞稀释液清洗环形管路并收集清洗液，能够快速高效地分离外周血循环肿瘤细胞，适于大规模推广应用。
8、本发明的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法包括以下步骤：A、分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮白细胞得到白细胞溶液；B、将磁球-循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体与白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；C、将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的细胞稀释液稀释孵育溶液获得孵育稀释液，然后使孵育稀释液在环形管路中循环流动，通过磁场吸附孵育稀释液中的磁球，弃去环形管路中的液体组分。移除磁场，采用另外的细胞稀释液清洗环形管路并收集清洗液，设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
具体实施方式
为了减少处理细胞过程中器具的接触细胞表面非特异性吸附细胞，本发明提供一种细胞分离器具表面处理方法，采用纤维蛋白原封闭处理细胞分离器具 的接触细胞表面。
所述纤维蛋白原可以是任何合适的纤维蛋白原，较佳地，所述纤维蛋白原是人纤维蛋白原或牛纤维蛋白原。
所述纤维蛋白原可以采用任何合适的形式，较佳地，所述纤维蛋白原采用纤维蛋白原溶液的形式，将所述纤维蛋白原溶液浸润所述的细胞分离器具的接触细胞表面进行所述封闭处理。
所述纤维蛋白原溶液可以具有任何合适的浓度，更佳地，所述纤维蛋白原溶液是0.1％(w/v)-60％(w/v)的纤维蛋白原溶液。
所述封闭处理的时间可以根据需要确定，较佳地，所述封闭处理的时间为15分钟-60分钟。
所述细胞分离器具可以是任何合适的细胞分离器具，为细胞分离过程中与细胞接触的任何器具，较佳地，所述细胞分离器具是液体盛放容器、液体流经管路或移液吸头。
所述液体流经管路可以具有合适的尺寸，更佳地，所述液体流经管路的内径为2mm-15mm，所述液体流经管路的外径不超过20mm。更进一步地，所述液体流经管路的内径为5mm-10mm。
本发明还提供了一种表面处理的细胞分离器具，其接触细胞表面封闭有纤维蛋白原，可以采用上述的细胞分离器具表面处理方法处理形成。
通过采用上述的表面处理的细胞分离器具，本发明还提供一种外周血稀有细胞快速高效分离方法，包括以下步骤：
(1)分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮所述白细胞得到白细胞溶液；
(2)将磁球-白细胞表面生物标志物抗体与所述白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；
(3)将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的所述细胞稀释液稀释所述孵育溶液获得孵育稀释液，然后使所述孵育稀释液在所述环形管路中循环流动，通过所述磁场吸附所述孵育稀释液中的所述磁球，收集所述环形管路中的液体组分。
这里的环形管路可以认为就是上述的液体流经管路。
在所述步骤(1)中，去除所述外周血中的红细胞和血小板可以采用任何合 适的方式，较佳地，在所述步骤(1)中，采用密度梯度离心或红细胞裂解方法去除所述外周血中的红细胞和血小板。
在所述步骤(2)中，所述白细胞表面生物标志物抗体可以是任何合适的白细胞表面生物标志物抗体，较佳地，在所述步骤(2)中，所述白细胞表面生物标志物抗体是CD45抗体。
在所述步骤(3)中，所述环形管路可以具有合适的尺寸，较佳地，在所述步骤(3)中，所述环形管路的内径为2mm-15mm，所述环形管路的外径不超过20mm。更佳地，在所述步骤(3)中，所述环形管路的内径为5mm-10mm。
为了更好地分离外周血稀有细胞，较佳地，在所述步骤(3)中，在所述循环流动之前将所述的环形管路的一部分挤压成扁平状管路，所述扁平状管路的距离较短的两个相对管壁之间的间距为1mm-10mm。
所述循环流动的速度可以根据需要确定，较佳地，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.1ml-10ml。更佳地，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.2ml-5ml。更进一步地，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.5ml-1ml。
为了能够更加充分地分离外周血稀有细胞，较佳地，在所述步骤(3)之后，所述外周血稀有细胞快速高效分离方法还包括步骤：(4)保持所述的环形管路的一部分在所述磁场中，采用另外的所述细胞稀释液清洗所述环形管路并收集清洗液。
通过采用上述的表面处理的细胞分离器具，本发明还提供一种外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，包括以下步骤：
A、分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮所述白细胞得到白细胞溶液；
B、将磁球-循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体与所述白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；
C、将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的所述细胞稀释液稀释所述孵育溶液获得孵育稀释液，然后使所述孵育稀释液在所述环形管路中循环流动，通过所述磁场吸附所述孵育稀释液中的所述磁球，弃去所述环形管路中的液体组分，移除所述磁场，采用另外的所述细胞稀释液清洗所述环形管路并收集清洗液。
这里的环形管路可以认为就是上述的液体流经管路。
在所述步骤A中，去除所述外周血中的红细胞和血小板可以采用任何合适的方式，较佳地，在所述步骤A中，采用密度梯度离心或红细胞裂解方法去除所述外周血中的红细胞和血小板。
在所述步骤B中，所述循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体可以是任何合适的循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体，较佳地，在所述步骤B中，所述循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体是EpCAM抗体。
在所述步骤C中，所述环形管路可以具有合适的尺寸，较佳地，在所述步骤C中，所述环形管路的内径为2mm-15mm，所述环形管路的外径不超过20mm。更佳地，在所述步骤C中，所述环形管路的内径为5mm-10mm。
为了更好地分离外周血循环肿瘤细胞，较佳地，在所述步骤C中，在所述循环流动之前将所述的环形管路的一部分挤压成扁平状管路，所述扁平状管路的距离较短的两个相对管壁之间的间距为1mm-10mm。
所述循环流动的速度可以根据需要确定，较佳地，在所述步骤C中，所述循环流动的速度为每分钟0.1ml-10ml。更佳地，在所述步骤C中，所述循环流动的速度为每分钟0.2ml-5ml。更进一步地，在所述步骤C中，所述循环流动的速度为每分钟0.5ml-1ml。
为了能够更加充分地分离外周血循环肿瘤细胞，较佳地，在所述步骤C之后，所述外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法还包括步骤：D、采用另外的所述细胞稀释液冲洗所述环形管路并收集冲洗液。
本文涉及以下相关术语，特解释如下：
外周血稀有细胞：指外周血中除了血小板、红细胞、白细胞等正常细胞之外的细胞，其中包含循环肿瘤细胞。
循环肿瘤细胞：指从原发或转移肿瘤病灶部位主动或被动脱离进入血液和淋巴循环的肿瘤细胞，是目前肿瘤液态活检的重要检测对象，比如MCF-7，SK-Br-3，sW60等。
CD45分子：外周血中所有正常的白细胞表面表达的一种细胞表面蛋白分子，通常作为正常细胞的标志物。
磁球-抗体：指通过一定的方法将抗体和磁性球的表面进行共价交联，用于 样本中需要分离的目标物的修饰，并可在磁场作用下移动和聚集实现从样本中分离出来。
DAPI(4,6-diamino-2-phenyl indole):一种对细胞核中的DNA分子进行着色的荧光染料。
CD45-PE(CD45-P-phycoerythrin)：用荧光分子PE修饰的特异性识别CD45分子的抗体分子。
CK19-FITC(Cytokertin19-fluorescein isothiocyanate):用荧光染料分子FITC修饰的特异性识别CK19抗原的抗体分子。
封闭处理:用一定的蛋白或其它的有机物组分对接触样本表面浸润，以减少接触样本表面对样本中目标物的非特异性吸附。
正向选择：指将要分离富集的目标物用磁球抗体修饰后，在磁场的作用下直接从混合物中分离出来。
负向选择：指将溶液中大量存在的和分离富集目标物类似的组分进行磁球抗体修饰后，在磁场的作用下从混合物中分离出来，将目标物留在混合物中。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
实施例1纤维蛋白原对管壁的封闭作用
用如下三种方法对1.5ml和15ml的离心管(材质为PP)以及长度为30厘米的硅胶软管(内径5mm，外径9mm)的表面进行封闭处理，并在离心管和硅胶软管中加入含有一定数量的淋巴细胞、MCF细胞的液体，经过30分钟的孵育反应后对液体中的细胞进行计数，计算细胞的得率。三种方法分别为1、10mMPBS(pH7.0)(SIGMA,Cat#P5493)配制的5％牛纤维蛋白原(上海叶源，货号：9001-32-5)溶液，浸润表面30分钟(以下简称封闭方法一)；2、10mM PBS(pH7.0)配制的5％BSA溶液(以下简称封闭方法二)；3、10mMPBS(pH7.0)配制的30％的牛血清(Bioteck,Cat#P30-3302)(以下简称封闭方法三)；4、对照组采用10mPBS(pH7.0)溶液(以下简称封闭方法四)；5、10mMPBS(pH7.0)配制的0.1％人纤维蛋白原(SIGMACat#F3879)溶液，浸润表面60分钟(以下简称封闭方法五)；6、10mMPBS(pH7.0)配制的60％牛纤维蛋白原(上海叶源，货号：9001-32-5)溶液，浸润表面15分钟(以下简称封闭方法六)。表1列举了不同封闭方法针对的不同表面、加入不同的细胞种类(淋巴细胞(自制，取健康个体抗凝全血，经红细胞裂解后获得)、人乳腺癌细胞MCF-7(中国科学院细胞研究所细胞库货号：TCHu74))、数量，最终通过细胞计数计算结果及回收率。
表1：纤维蛋白原的表面封闭效果
结论：根据表1的数据显示，对于1.5ml离心管，15ml离心管而言，封闭方法二、三、四这三种方式，不论是淋巴细胞还是MCF-7细胞，回收率在50％-70％之间；而封闭方法一、封闭方法五和封闭方法六则可达到98％及以上的效果；对于硅胶软管而言，封闭方法二、三、四，淋巴细胞和MCF-7回收率在50％-70％之间，没有封闭方法一、封闭方法五和封闭方法六回收率高(98％以上)。可见，封闭方法一、封闭方法五和封闭方法六不论是不同的封闭对象表面，还是不同的细胞，其都有非常好的回收率，回收率达到98％及以上，封闭方法一、封闭方法五和封闭方法六所用两种来源的纤维蛋白原效果无明显差异，均可有效消除非特异性吸附。这是利用纤维蛋白原进行表面封闭可有效减少接触细胞表面对细胞的非特异性吸附，从而提高目标细胞的富集分离效率。
实施例2 7.5ml全血样本中循环肿瘤细胞的富集分离(正向选择)
1、样本处理
取7.5ml健康个体抗凝全血样本10个，每例样本中平均加入100个稀有细胞，如MCF-7示踪细胞(中国科学院细胞研究所细胞库货号：TCHu 74)混匀，加入8ml的红细胞裂解液(天根生物科技有限公司货号：RT122-02),室温下静置15分钟，300g离心20分钟收集白细胞细胞，并重复以上裂解步骤；
2、封闭处理
用5％的牛纤维蛋白原溶液(配制方法同实施例1)对以下步骤中所有细胞分离器具的接触细胞表面，包括离心管、液体流经管路及移液吸头等进行15-60分钟的封闭处理；
3、分离回收
取8个样本作为实验组，如下操作：用300ul的细胞稀释液(SIGMA,Cat#P5493)重新悬浮所得到的白细胞，并加入磁球-抗体(EpCAM)(美天尼货号：130061101)100ul和细胞混匀后放入混合器上混合孵育60分钟；用细胞稀释液将完成孵育的细胞稀释至50ml的体积；取长度为30厘米、内径为5mm、外径为9mm的硅胶管，固定到蠕动泵上，管子一端连接到50ml医用注射器的下端开口，另一端放入注射器的上端开口，形成环形管路；将样本加入注射器中，并在蠕动泵的驱动下以2ml每分钟的流速进行样本循环流动；将4x40x90mm的长方形板状磁铁放置在蠕动泵出口的10cm位置的一段管子上方，并施加一定的压力，让管道的内腔呈扁平状，腔体高度为1mm；50分钟后将管道中样本弃去，将磁板移去，用50ml细胞稀释液，5ml每分钟流速条件下，对管道内进行冲洗，并收集清洗液；再用50ml细胞稀释液，5ml每分钟流速条件下，对管道内进行冲洗，并收集清洗液；
取2个样本作为对照组，如下操作：完成孵育后的细胞直接在管壁外施加磁场，待到溶液变澄清后，弃去液体组分，移去磁场，用50ul体积(20-50ul都可以)的细胞稀释液重新悬浮磁球，进行下一步的制片和染色检测。
4、检测及结果
所获细胞组分经过制片后，采用DAPI、CD45-PE、CK-19-FITC进行荧光染色，采用OlympusX83全自动荧光扫面显微镜扫面采集图像并进行分析处理，取DAPI阳性-CK19-FITC阳-CD45阴性判定为目标细胞。检测结果见表2。
表2：10例样本中循环肿瘤细胞的正向富集分离
本实施例对正常健康人提供的10份全血样品加入了一定数量的示踪细胞进行了检测，其中设立实验组8例和对照组2例。根据检测结果，对照1和2最终的MCF-7的检出率在20-40％，而用纤维蛋白原封闭处理的管路进行收集，可在50分钟内，对平均5千万白细胞中的100个示踪细胞进行富集，获得87％以上的回收率，可见通过该方法，对示踪细胞的捕获效率有十分明显的提高。
实施例3 7.5ml全血样本中稀有细胞的富集分离(负向选择)
1、样本处理
取7.5ml健康个体抗凝全血样本10个，每例样本中平均加入100个SK-Br-3示踪细胞(中国科学院细胞研究所细胞库货号：TCHu225)混匀，加入8ml的红细胞裂解液(天根生物科技有限公司货号：RT122-02),室温下静置15分钟，300g离心20分钟收集白细胞细胞，并重复以上裂解步骤；
2、封闭处理
用5％的人纤维蛋白原溶液(配制方法同实施例1)对以下步骤所有细胞分离器具的接触细胞表面，包括离心管、液体流经管路及移液吸头等进行15-60分钟的封闭处理。
3、分离及回收
选8个样本作为实验组8例，如下操作：用300ul的细胞稀释液(天根生物科技有限公司货号：RT122-02)重新悬浮所得到的白细胞，并加入磁球-抗体(CD45)(美天尼货号：130045801)和细胞混匀后放入混合器上混合孵育60分钟；用细胞稀释液将完成孵育的细胞稀释至50ml的体积；取长度为30厘米、内径为15mm、外径为20mm的硅胶管，固定到蠕动泵上，管子一端连接到50ml医用注射器的下端开口，另一端放入注射器的上端开口；将样本加入注射器中，并在蠕动泵的驱动下以2ml每分钟的流速进行样本循环流动；将4x40x90mm的长方形板状磁铁放置在蠕动泵出口的10cm位置的一段管子上方，并施加一定的压力，让管道的内腔呈扁平状，腔体高度为10mm；50分钟后将管道的出口一端放入新的收集管中，收集非磁球修饰细胞组分，当管道中样本流尽后，用50ml细胞稀释缓冲液在1.5ml每分钟流速条件下，对管道内进行清洗并收集清洗液。
剩余2个样本作为对照组，如下操作：完成孵育后的细胞直接在管壁外施加磁场，待到溶液变澄清后，取液体组分转移至新的收集管中，进行下一步的制片和染色检测。
4、检测及结果
所获细胞组分经过制片后，采用DAPI、CD45-PE、CK-19-FITC进行荧光染色，采用OlympusX83全自动荧光扫面显微镜扫面采集图像并进行分析处理，取DAPI阳性-CK19-FITC阳-CD45阴性判定为目标细胞。检测结果见表3。
表3：10例样本稀有细胞的负向富集分离
本实施例对正常健康人提供的10份全血样品加入了一定数量的示踪细胞进行了检测，其中设立实验组8例和对照组2例。根据检测结果，对照1和2最终的SK-Br-3的检出率在20-30％，而用纤维蛋白原封闭处理的管路进行收集， 可在50分钟内，对平均5千万白细胞中的100个示踪细胞进行富集，获得90％以上的回收率，可见通过该方法，对示踪细胞的捕获效率有十分明显的提高。
因此，本发明一方面提供一种在进行外周血稀有细胞富集分离时使用的细胞分离器具的与细胞接触的表面的封闭修饰方法，这个方法可以有效减少细胞操作过程中细胞分离器具的接触细胞表面对细胞的非特异性吸附，从而可以提高稀有细胞的富集分离效率；另一方面提供一种经过磁球-抗体修饰细胞后，样品以一定的浓度和流速循环流经磁场的方法，以实现高通量样本细胞的快速特异性富集分离。
由于外周血中的稀有细胞绝对数量及比例含量极低，因此需要处理的外周血样本一般在5ml-15ml，一般为7.5ml，这些样本中含有的白细胞数量为3-7千万，红细胞数量为3-4亿，血小板数量为10-30亿，而其中需要分离富集的稀有细胞(循环肿瘤细胞包含在其中)数量极少，循环肿瘤细胞的数量在一到数十个，且缺乏特异性的表面标志物和物理特性。为了对这些稀有细胞进行有效富集分离，首先需要通过密度梯度离心或者红细胞裂解的方法去除红细胞及血小板，得到白细胞。正常的白细胞的表面都表达CD45分子，因此可采用特异性识别结合该分子的磁球-单抗对其进行修饰，然后在磁场的作用下去除，实现稀有细胞的富集分离。在磁球-抗体和白细胞的孵育反应及随后的分离过程中，如果没有进行封闭处理，所用的管子和器皿的表面都会非特异性吸附细胞，造成相当数量的细胞损失，同时也会造成数量极少的稀有细胞的损失，这种损失一般在10-60％，为了减少这种非特异性吸附，一般文献提供的解决方法是进行一定含量的BSA、牛血清等组分经表面处理，但是这样的处理并不能有效解决对细胞的非特异性吸附。本发明采用配制在PBS缓冲液中0.1％-60％的人或者牛的纤维蛋白原对细胞分离器具的接触细胞的表面进行修饰处理(以下称表面修饰)，使得表面附着一层纤维蛋白原，从而可以有效减少对细胞的非特异性吸附，能够使得对细胞的非特异性吸附减少至2％或更低，目前尚没有文献报道这样方法。
经过磁球-抗体修饰的细胞，通常在外加磁场的作用下发生定向运动，表面吸附有磁球的细胞在磁球的推动或拉动下聚集到管壁的一边，从而实现和溶液的分离。由于外加磁场的强度以及磁场随着距离增大呈指数减弱的特性，磁场 作用的距离一般不超过10mm，这就限定了样本的处理体积不能过大，一般都小于1ml才适合处理，而在这样的体积下，细胞的密度过大，直接导致磁珠修饰细胞运动中的阻碍或者携带效应。本发明提供一种可以解决这一矛盾的方法：首先将磁珠-抗体修饰后的样本稀释到一定的缓冲溶液即细胞稀释液中，通常使用的缓冲溶液包括0.9％重量的生理盐水、10mMPBS(pH7.0-7.5)等，稀释的体积可以在10-200ml，通常25ml-50ml为最佳体积，所用稀释的管壁内表面必须经过表面修饰；借助一般的可调节液体流动驱动装置，比如流量可调节蠕动泵和一定长度和弹性的塑料材质的软管，将稀释后的样本进行循环流动，流动的管道内壁必须经过表面修饰，管道的内径在2mm-15mm范围，其中5mm-10mm最佳，管道的外直径不超过20mm，流动的速度范围0.1ml-10ml每分钟，其中0.2ml-5ml较为合适，0.5ml-1ml每分钟最佳；在样本的流动过程中，将磁铁置于管道的上方，或者可以通过一定的方式从上到下挤压但不能封闭管道的内腔，在保证液体流动的情况下，内腔的上下管壁之间应大于1mm但小于10mm；当样本流动通过体积等于或大于2倍的样本体积即循环流动至少两个样本体积时，可以通过管道开口收集非磁球-抗体修饰细胞样本，并可以用一定体积(比如样本等体积)的相同的细胞稀释液以小于等于循环流动的流速清洗管道；撤去磁场后可以用不小于管道内体积的相同的细胞稀释液以不小于循环流动的流速冲洗管道同时收集磁珠富集的细胞样本即磁球-抗体修饰细胞样本，并可以重复冲洗一次。
综上，本发明的外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞快速高效分离方法能够快速高效地分离外周血稀有细胞或循环肿瘤细胞，设计巧妙，操作简便，适于大规模推广应用。本发明的细胞分离器具表面处理方法能使得细胞分离器具可以有效减少细胞操作过程中对细胞的非特异性吸附，从而可以减少目标细胞的损失，提高目标细胞的富集分离效率，适于大规模推广应用。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。

Claims (30)

1.一种细胞分离器具表面处理方法，其特征在于，采用纤维蛋白原封闭处理细胞分离器具的接触细胞表面。
2.如权利要求1所述的细胞分离器具表面处理方法，其特征在于，所述纤维蛋白原是人纤维蛋白原或牛纤维蛋白原。
3.如权利要求1所述的细胞分离器具表面处理方法，其特征在于，所述纤维蛋白原采用纤维蛋白原溶液的形式，将所述纤维蛋白原溶液浸润所述的细胞分离器具的接触细胞表面进行所述封闭处理。
4.如权利要求3所述的细胞分离器具表面处理方法，其特征在于，所述纤维蛋白原溶液是0.1％(w/v)-60％(w/v)的纤维蛋白原溶液。
5.如权利要求1所述的细胞分离器具表面处理方法，其特征在于，所述封闭处理的时间为15分钟-60分钟。
6.如权利要求1所述的细胞分离器具表面处理方法，其特征在于，所述细胞分离器具是液体盛放容器、液体流经管路或移液吸头。
7.如权利要求6所述的细胞分离器具表面处理方法，其特征在于，所述液体流经管路的内径为2mm-15mm，所述液体流经管路的外径不超过20mm。
8.如权利要求7所述的细胞分离器具表面处理方法，其特征在于，所述液体流经管路的内径为5mm-10mm。
9.一种表面处理的细胞分离器具，其特征在于，所述的表面处理的细胞分离器具的接触细胞表面封闭有纤维蛋白原。
10.一种表面处理的细胞分离器具，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的细胞分离器具表面处理方法处理形成。
11.一种外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮所述白细胞得到白细胞溶液；
(2)将磁球-白细胞表面生物标志物抗体与所述白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；
(3)将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的所述细胞稀释液稀释所述孵育溶液获得孵育稀释液，然后使所述孵育稀释液在所述环形管路中循环流动，通过所述磁场吸附所述孵育稀释液中的所述磁球，收集所述环形管路中的液体组分。
12.如权利要求11所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，采用密度梯度离心或红细胞裂解方法去除所述外周血中的红细胞和血小板。
13.如权利要求11所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述白细胞表面生物标志物抗体是CD45抗体。
14.如权利要求11所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述环形管路的内径为2mm-15mm，所述环形管路的外径不超过20mm。
15.如权利要求14所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述环形管路的内径为5mm-10mm。
16.如权利要求11所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，在所述循环流动之前将所述的环形管路的一部分挤压成扁平状管路，所述扁平状管路的距离较短的两个相对管壁之间的间距为1mm-10mm。
17.如权利要求11所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.1ml-10ml。
18.如权利要求17所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.2ml-5ml。
19.如权利要求18所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述循环流动的速度为每分钟0.5ml-1ml。
20.如权利要求11所述的外周血稀有细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤(3)之后，所述外周血稀有细胞快速高效分离方法还包括步骤：
(4)保持所述的环形管路的一部分在所述磁场中，采用另外的所述细胞稀释液清洗所述环形管路并收集清洗液。
21.一种外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、分离外周血中的白细胞，并采用细胞稀释液重悬浮所述白细胞得到白细胞溶液；
B、将磁球-循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体与所述白细胞溶液混合孵育获得孵育溶液；
C、将内壁采用纤维蛋白原封闭的环形管路的一部分置于磁场中，采用另外的所述细胞稀释液稀释所述孵育溶液获得孵育稀释液，然后使所述孵育稀释液在所述环形管路中循环流动，通过所述磁场吸附所述孵育稀释液中的所述磁球，弃去所述环形管路中的液体组分，移除所述磁场，采用另外的所述细胞稀释液清洗所述环形管路并收集清洗液。
22.如权利要求21所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤A中，采用密度梯度离心或红细胞裂解方法去除所述外周血中的红细胞和血小板。
23.如权利要求21所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤B中，所述循环肿瘤细胞表面生物标志物抗体是EpCAM抗体。
24.如权利要求21所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述环形管路的内径为2mm-15mm，所述环形管路的外径不超过20mm。
25.如权利要求24所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述环形管路的内径为5mm-10mm。
26.如权利要求21所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤C中，在所述循环流动之前将所述的环形管路的一部分挤压成扁平状管路，所述扁平状管路的距离较短的两个相对管壁之间的间距为1mm-10mm。
27.如权利要求21所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述循环流动的速度为每分钟0.1ml-10ml。
28.如权利要求27所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述循环流动的速度为每分钟0.2ml-5ml。
29.如权利要求28所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述循环流动的速度为每分钟0.5ml-1ml。
30.如权利要求21所述的外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法，其特征在于，在所述步骤C之后，所述外周血循环肿瘤细胞快速高效分离方法还包括步骤：
D、采用另外的所述细胞稀释液冲洗所述环形管路并收集冲洗液。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111830249A (zh) * 2019-04-23 2020-10-27 长庚大学 用于纯化分离及分析非典型循环肿瘤细胞的方法的用途及非典型循环肿瘤细胞的用途
CN112444507A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 长庚大学 循环肿瘤细胞信息评估方法及其用途
CN113424061A (zh) * 2019-02-06 2021-09-21 赛诺利比奥有限公司 从具有非磁性生物材料的悬浮液中分离所需细胞的方法和装置

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1091315A (zh) * 1992-10-08 1994-08-31 E·R·斯奎布父子公司 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法
CN1911440A (zh) * 2005-08-08 2007-02-14 上海莱士血制品有限公司 一种用于形成纤维蛋白膜的试剂盒及其应用
CN1922304A (zh) * 2003-10-31 2007-02-28 维特克公司 用于检测循环肿瘤和内皮细胞的血液测试样机和方法
EP2228451A1 (en) * 2009-03-11 2010-09-15 Universiteit Maastricht Method for determining the primary site of cup
CN102482703A (zh) * 2009-09-03 2012-05-30 斯克里普斯研究所 对循环肿瘤细胞进行分类的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1091315A (zh) * 1992-10-08 1994-08-31 E·R·斯奎布父子公司 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法
CN1922304A (zh) * 2003-10-31 2007-02-28 维特克公司 用于检测循环肿瘤和内皮细胞的血液测试样机和方法
CN1911440A (zh) * 2005-08-08 2007-02-14 上海莱士血制品有限公司 一种用于形成纤维蛋白膜的试剂盒及其应用
EP2228451A1 (en) * 2009-03-11 2010-09-15 Universiteit Maastricht Method for determining the primary site of cup
CN102482703A (zh) * 2009-09-03 2012-05-30 斯克里普斯研究所 对循环肿瘤细胞进行分类的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUHA FAHHAM等: "Insoluble fibrinogen particles for harvesting and expanding attachment-dependent cells and for trapping suspended cancer cells in the presence of blood", 《BIOMEDICAL MATERIALS》 *
赵敬湘等: "《黏附分子在血小板诱导肿瘤转移中的作用》", 《中国输血杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113424061A (zh) * 2019-02-06 2021-09-21 赛诺利比奥有限公司 从具有非磁性生物材料的悬浮液中分离所需细胞的方法和装置
CN111830249A (zh) * 2019-04-23 2020-10-27 长庚大学 用于纯化分离及分析非典型循环肿瘤细胞的方法的用途及非典型循环肿瘤细胞的用途
CN112444507A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 长庚大学 循环肿瘤细胞信息评估方法及其用途

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