CN108548920A - 一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法；本发明属于细胞生物学检测领域，包括以下具体步骤：红细胞裂解，免疫磁珠负向去除白细胞，细胞染色等，本发明的有益效果是(1)灵敏度高，流式细胞仪可达到十万分之一的灵敏度；(2)特异性强，利用上皮型CTC特异性抗体EPCAM、CK以及间质型CTC特异性抗体N‑Cadherin以及vimentin联合进行CTC的检测，特异性强；(3)细胞计数由流式细胞自动完成，方便操作，结果客观、精确度高；(4)此方法不依赖于肿瘤细胞大小及特异性抗原，采用免疫磁珠负向吸附法富集CTC，所有种类CTC，CTM等异常细胞都会被富集，不会漏检。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学检测领域，涉及到结肠直肠癌、乳腺癌及胃癌的辅助诊断、疗效监测、个体化治疗指导以及预后判断等，具体涉及一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC，Circulating Tumor Cell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。
早在1869年，Ashworth发现血液中的一种血细胞与同时检验发现的肿瘤细胞相似,首次提出CTC的概念；1889年，Paget提出了“种子和土壤”的学说，强调癌细胞和微环境之间的关系，期间，有专家提出了“解剖--机械”学说，认为CTC的转移为随机现象，CTC在最先到达脏器的毛细血管或淋巴结发生机械性滞留，2004年，强生子公司Veridex开发的Cellsearch CTC检测技术获得美国FDA的认证， 2007年ASCO就将CTC纳入了肿瘤标志物；2012年CFDA批准Veridex 循环肿瘤细胞检测；2013年CTC检测纳入美国医保；不过长时间以来CTC的检测并未在肿瘤病人的防治中发挥应有的作用，主要原因就是检测技术未取得突破性进展；从上世纪末以来CTC检测技术得到了不断的改进，随之带来的是CTC检测在临床的应用；FDA于2004年批准了Cellsearch系统在转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌治疗中的应用，随着CTC研究的不断深入，越来越多的肿瘤治疗会得益于 CTC的检测。
近几年CTC在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值极其显著；与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，优势显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果；而且分离富集CTC只需抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，因此可以高频度的监测，达到实时监测疾病进展的目的；更为重要的是，CTC可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，可以发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗；在多种肿瘤的诊断、治疗监测、预后、用药指导及复发监测等方面有重要的指导价值。
由于外周血中的CTC含量极为稀少，一般认为在外周血中大约 106～107个单核细胞中才有一个CTC，因此，对CTC检测技术的灵敏度和特异性提出了极高的要求；目前各种CTC的检测系统主要包括CTC 分离和富集系统以及CTC的检测和鉴定系统。而分离和富集系统对检测外周血的CTC是非常必要的；
理想的CTC分离与富集及检测技术应能达到以下六点要求：(1) 高捕获率或高灵敏度，就是可以将样品中的CTC尽可能多的分离出来，即至少能够在上亿个血循环细胞中发现一个肿瘤细胞；(2)高特异性，要求检测结果准确无误，尽可能降低假阳性或假阴性，目标是分离出来的细胞只有CTC，其它细胞的含量很少或没有；(3)要求CTC 不能被污染，收集到的CTC可以进行表型和基因型分析；(4)高通量，即能在短时间内处理大量样品；(5)重复性，回收率高；(6)尽可能降低成本；
目前用于临床实验研究的CTC分离和富集技术非常之多，一般来讲根据其物理性质和基于亲和性与识别的生物性质以及两者综合利用可分成3类；但目前来说仍没有理想的方法，每种单独的方法都有自己的优势和缺点；例如存在取样量大、识别类型不全、特异性低、操作繁琐、成本高昂等缺点，鉴于此，本项目旨在建立一种特异性高、成本较低、操作方便的CTC检测方法；通过免疫磁珠负向富集法富集血液中的CTC，再通过流式细胞技术进行鉴定；从而达到富集鉴定CTC 的目的，为后续对明确肿瘤转移过程、辅助诊断、疗效监测、个体化治疗指导、预后判断等临床应用打好基础。
发明内容：
本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法，包括以下具体步骤：
1.1、红细胞裂解
(1)、抽取7.5ml的外周血留置，另准备22.5ml的红细胞裂解液，将两者共同置于离心管中混匀，将离心管置于4℃环境下放置15 分钟，
(2)、放置15分钟后，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200 转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为裂解的红细胞溶液，下层为沉淀的白细胞，吸弃上层裂解的红细胞溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、向沉淀的白细胞中再加入15ml的红细胞裂解液，将离心管置于涡旋机中涡旋混匀用以重悬白细胞，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为新裂解的红细胞溶液，下层为新沉淀的白细胞，吸弃上层新裂解的红细胞溶液，留置新沉淀的白细胞；
(4)、向新沉淀的白细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为第三次裂解的红细胞溶液，下层为第三次沉淀的白细胞，吸弃上层第三次裂解的红细胞溶液，留置第三次沉淀的白细胞；
(5)、向第三次沉淀有白细胞的离心管中加入100ul的磷酸盐缓冲液,用以重悬沉淀的白细胞，后搁置离心管；
1.2、免疫磁珠负向去除白细胞
(1)、计数重悬沉淀后的白细胞的细胞数，并以每106细胞数加入20ul生物素化抗体，将离心管置于4℃温度的冰箱中孵育15分钟后取出；
(2)、加入1ml的磁珠缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合的生物素化抗体及磁珠缓冲液，下层沉淀为结合了生物素化抗体的白细胞，吸弃上层溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、以每106结合了生物素化抗体的白细胞的细胞数中加入5 μl的链霉抗生物素蛋白颗粒，将离心管置于4℃温度下放置30分钟；
(4)、将离心管中的混合溶液转移到圆底试管中，向圆底试管再加入1ml的磁珠缓冲液，将圆底试管置于细胞分离磁力架中放置8分钟；8分钟后结合了链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞被吸附至圆底试管的内壁上，剩余未结合链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞溶液，吸附出该细胞溶液并置于1.5ml的离心试管中即为负向吸附后得到的细胞。
1.3、细胞染色
上述经负向吸附后得到的细胞进行表面抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的表面染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的表面抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；
再向离心管中加入250μl的固定缓冲液，混匀后4℃孵育细胞 20分钟；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的固定缓冲液，下层为被固定的细胞；
吸附出上未结合细胞的固定缓冲液；再向离心管中添加250ul的破膜剂，涡旋混匀；将离心试管4℃温度孵育30分钟后；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的破膜剂，下层为破膜后的细胞；
吸附出未结合细胞的破膜剂；用100ul磷酸盐缓冲液重悬破膜后的细胞，进行胞内抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的胞内染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20 分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的胞内抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；用100ul磷酸盐缓冲液重悬细胞后上流式细胞仪检测。
所述的检测方法采用免疫磁珠负向吸附法富集CTC后利用流式细胞仪进行检测。
所述上皮型CTC特异性抗体为EPCAM、CK8/18/19。
所述间质型CTC特异性抗体为N-Cadherin及vimentin。
本发明所述的检测方法，在获得患者血样后，采用红细胞裂解、离心的方法去除红细胞，然后用免疫磁珠的方式去除绝大多数的白细胞，得到样品中剩余的稀有细胞包括循环肿瘤细胞(CTC)，达到对目标细胞富集的目的；富集之后的细胞再通过流式细胞技术进行计数鉴定；根据白细胞表达CD45抗原、上皮CTC表达EpCAM抗原，间质CTC 表达N-Cadherin/vimentin抗原，采用不同荧光素标记的抗CD45、抗EpCAM(CD326)、抗vimentin以及抗N-Cadherin(CD325)，通过流式细胞术进行分析和分选；此方法不依赖于肿瘤细胞大小及特异性抗原，所有种类CTC，CTM等异常细胞都会被富集；能够检测出结肠直肠癌、乳腺癌及胃癌患者7.5ml外周血中的全部循环肿瘤细胞。
所采用免疫磁珠负向富集法去除表达CD45抗体的绝大多数白细胞，从而富集循环肿瘤细胞，所有种类CTC，CTM等异常细胞都会被富集，不会漏检。
所述利用免疫磁珠负向吸附+流式细胞法检测循环肿瘤细胞试剂盒包括：生物素化抗体(Biotin Mouse Anti-Human CD45)、链霉抗生物素蛋白颗粒(StreptavidinParticles Plus-DM)、磁力架、磁珠缓冲液(1×BD IMagTMBuffer)、表面染色抗体(APC-Mouse Anti-Human CD45、PE anti-human CD326(EpCAM)、PE Mouse anti-Human CD325(N-Cadherin)、胞内染色抗体(PE Mouse Anti-Human vimentin、PE Mouse anti-Human CK8/18/19)、固定缓冲液(Fixation buffer)、破膜剂(Perm Buffer III))、红细胞裂解液等。
其中，CTC是循环肿瘤细胞；EPCAM是上皮细胞粘附分子；CK是细胞角蛋白；CD325是N-钙离子依赖的细胞粘附素家族；Vimentin 是波形蛋白；CD45是白细胞共同抗原；CTM是肿瘤细胞团。
本发明的技术优点在于：通过免疫磁珠负向吸附+流式细胞法检测循环肿瘤细胞：(1)灵敏度高，流式细胞仪可达到十万分之一的灵敏度；(2)特异性强，利用上皮型CTC特异性抗体EPCAM、CK以及间质型CTC特异性抗体N-Cadherin以及vimentin联合进行CTC的检测，特异性强；(3)细胞计数由流式细胞自动完成，方便操作，结果客观、精确度高；(4)此方法不依赖于肿瘤细胞大小及特异性抗原，采用免疫磁珠负向吸附法富集CTC，所有种类CTC，CTM等异常细胞都会被富集，不会漏检。
附图说明
图1是本发明检测方法流程示意图；
图2是免疫磁珠负向吸附前后流式检测CD45白细胞的流式细胞分析图。
具体实施方式
下面就具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
为了理解本发明，下面对本发明进行进一步的详细说明。
1、具体检测流程如下：
一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法，包括以下具体步骤：
1.1、红细胞裂解
(1)、抽取7.5ml的外周血留置，另准备22.5ml的红细胞裂解液，将两者共同置于离心管中混匀，将离心管置于4℃环境下放置15 分钟，
(2)、放置15分钟后，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200 转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为裂解的红细胞溶液，下层为沉淀的白细胞，吸弃上层裂解的红细胞溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、向沉淀的白细胞中再加入15ml的红细胞裂解液，将离心管置于涡旋机中涡旋混匀用以重悬白细胞，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为新裂解的红细胞溶液，下层为新沉淀的白细胞，吸弃上层新裂解的红细胞溶液，留置新沉淀的白细胞；
(4)、向新沉淀的白细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为第三次裂解的红细胞溶液，下层为第三次沉淀的白细胞，吸弃上层第三次裂解的红细胞溶液，留置第三次沉淀的白细胞；
(5)、向第三次沉淀有白细胞的离心管中加入100ul的磷酸盐缓冲液,用以重悬沉淀的白细胞，后搁置离心管；
1.2、免疫磁珠负向去除白细胞
(1)、计数重悬沉淀后的白细胞的细胞数，并以每106细胞数加入20ul生物素化抗体，将离心管置于4℃温度的冰箱中孵育15分钟后取出；
(2)、加入1ml的磁珠缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合的生物素化抗体及磁珠缓冲液，下层沉淀为结合了生物素化抗体的白细胞，吸弃上层溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、以每106结合了生物素化抗体的白细胞的细胞数中加入5 μl的链霉抗生物素蛋白颗粒，将离心管置于4℃温度下放置30分钟；
(4)、将离心管中的混合溶液转移到圆底试管中，向圆底试管再加入1ml的磁珠缓冲液，将圆底试管置于细胞分离磁力架中放置8分钟；8分钟后结合了链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞被吸附至圆底试管的内壁上，剩余未结合链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞溶液，吸附出该细胞溶液并置于1.5ml的离心试管中即为负向吸附后得到的细胞。
1.3、细胞染色
上述经负向吸附后得到的细胞进行表面抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的表面染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的表面抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；
再向离心管中加入250μl的固定缓冲液，混匀后4℃孵育细胞 30分钟；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的固定缓冲液，下层为被固定的细胞；
吸附出上未结合细胞的固定缓冲液；再向离心管中添加250ul的破膜剂，涡旋混匀；将离心试管4℃温度孵育30分钟后；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的破膜剂，下层为破膜后的细胞；
吸附出未结合细胞的破膜剂；用100ul磷酸盐缓冲液重悬破膜后的细胞，进行胞内抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的胞内染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20 分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的胞内抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；用100ul磷酸盐缓冲液重悬细胞后上流式细胞仪检测。
具体实施例一：健康人外周血掺入SW620肿瘤细胞系的检测分析
本实例是使用健康人外周血掺入不同数量的SW620(结肠直肠癌细胞)，并以此为模拟样本对其进行检测分析，以此来评价试剂盒的白细胞去除效率以及试剂盒的回收率等性能，具体详述如下：
1、样本制备
将培养的肿瘤细胞SW620消化并制成单细胞悬液，用计数仪计数后，用磷酸盐缓冲液将其稀释到所需的浓度(1000个/管、500个/ 管、100个/管、10个/管、0个/管；每个浓度均设置3组重复)，向 7.5ml健康人外周血中添加上述不同浓度的SW620。
2、红细胞裂解
2.1、红细胞裂解
(1)、抽取7.5ml的外周血留置，另准备22.5ml的红细胞裂解液，将两者共同置于离心管中混匀，将离心管置于4℃温度下放置15 分钟，
(2)、放置15分钟后，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200 转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为裂解的红细胞溶液，下层为沉淀的白细胞，吸弃上层裂解的红细胞溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、向沉淀的白细胞中再加入15ml的红细胞裂解液，将离心管置于涡旋机中涡旋混匀用以重悬白细胞，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为新裂解的红细胞溶液，下层为新沉淀的白细胞，吸弃上层新裂解的红细胞溶液，留置新沉淀的白细胞；
(4)、向新沉淀的白细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为第三次裂解的红细胞溶液，下层为第三次沉淀的白细胞，吸弃上层第三次裂解的红细胞溶液，留置第三次沉淀的白细胞；
(5)、向第三次沉淀有白细胞的离心管中加入100ul的磷酸盐缓冲液,用以重悬沉淀的白细胞，后搁置离心管；
2.2、免疫磁珠负向去除白细胞
(1)、计数重悬沉淀后的白细胞的细胞数，并以每106细胞数加入20ul生物素化抗体，将离心管置于4℃温度的冰箱中孵育15分钟后取出；
(2)、加入1ml的磁珠缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合的生物素化抗体及磁珠缓冲液，下层沉淀为结合了生物素化抗体的白细胞，吸弃上层溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、以每106结合了生物素化抗体的白细胞的细胞数中加入5 μl的链霉抗生物素蛋白颗粒，将离心管置于4℃温度下放置30分钟；
(4)、将离心管中的混合溶液转移到圆底试管中，向圆底试管再加入1ml的磁珠缓冲液，将圆底试管置于细胞分离磁力架中放置8分钟；8分钟后结合了链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞被吸附至圆底试管的内壁上，剩余未结合链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞溶液，吸附出该细胞溶液并置于1.5ml的离心试管中即为负向吸附后得到的细胞。
2.3、细胞染色
上述经负向吸附后得到的细胞进行表面抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的表面染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的表面抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；
再向离心管中加入250μl的固定缓冲液，混匀后4℃孵育细胞 30分钟；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的固定缓冲液，下层为被固定的细胞；
吸附出上未结合细胞的固定缓冲液；再向离心管中添加250ul的破膜剂，涡旋混匀；将离心试管4℃温度孵育30分钟后；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的破膜剂，下层为破膜后的细胞；
吸附出未结合细胞的破膜剂；用100ul磷酸盐缓冲液重悬破膜后的细胞，进行胞内抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的胞内染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20 分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的胞内抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；用100ul磷酸盐缓冲液重悬细胞后上流式细胞仪检测。
结果分析：
表1、免疫磁珠负向富集法白细胞去除率统计
| 样本组编号 | 血液体积 | 初始白细胞数目 | 白细胞剩余 | 白细胞去除效率 |
| 1 | 7.5ml | 1×107 | 63720 | >99.36％ |
| 2 | 7.5ml | 1×107 | 85540 | >99.15％ |
| 3 | 7.5ml | 1×107 | 72002 | >99.28％ |
表2.流式检测肿瘤细胞回收率统计
本实施例表明：本试剂盒对结肠直肠癌细胞有较好的特异性回收率，在富集过程中能够有效去除白细胞的背景干扰。
具体实施例二：健康人外周血掺入MCF-7肿瘤细胞系的检测分析
本实例是使用健康人外周血掺入不同数量的MCF-7(乳腺癌癌细胞)，并以此为模拟样本对其进行检测分析，以此来评价试剂盒的白细胞去除效率以及试剂盒的回收率等性能，具体详述如下：
1.样本制备
将培养的肿瘤细胞MCF-7消化并制成单细胞悬液，用计数仪计数后，用磷酸盐缓冲液将其稀释到所需的浓度(1000个/管、500个/ 管、100个/管、10个/管、0个/管；每个浓度均设置3组重复)，向 7.5ml健康人外周血中添加上述不同浓度的MCF-7。
2.红细胞裂解
2.1、红细胞裂解
(1)、抽取7.5ml的外周血留置，另准备22.5ml的红细胞裂解液，将两者共同置于离心管中混匀，将离心管置于4℃温度下放置15 分钟，
(2)、放置15分钟后，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200 转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为裂解的红细胞溶液，下层为沉淀的白细胞，吸弃上层裂解的红细胞溶液，留置白细胞；
(3)、向沉淀的白细胞中再加入15ml的红细胞裂解液，将离心管置于涡旋机中涡旋混匀用以重悬白细胞，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为新裂解的红细胞溶液，下层为新沉淀的白细胞，吸弃上层新裂解的红细胞溶液，留置新沉淀的白细胞；
(4)、向新沉淀的白细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为第三次裂解的红细胞溶液，下层为第三次沉淀的白细胞，吸弃上层第三次裂解的红细胞溶液，留置第三次沉淀的白细胞；
(5)、向第三次沉淀有白细胞的离心管中加入100ul的磷酸盐缓冲液,用以重悬沉淀的白细胞，后搁置离心管；
2.2、免疫磁珠负向去除白细胞
(1)、计数重悬沉淀后的白细胞的细胞数，并以每106细胞数加入20ul生物素化抗体，将离心管置于4℃温度的冰箱中孵育15分钟后取出；
(2)、加入1ml的磁珠缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合的生物素化抗体及磁珠缓冲液，下层沉淀为结合了生物素化抗体的白细胞，吸弃上层溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、以每106结合了生物素化抗体的白细胞的细胞数中加入5 μl的链霉抗生物素蛋白颗粒，将离心管置于4℃温度下放置30分钟；
(4)、将离心管中的混合溶液转移到圆底试管中，向圆底试管再加入1ml的磁珠缓冲液，将圆底试管置于细胞分离磁力架中放置8分钟；8分钟后结合了链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞被吸附至圆底试管的内壁上，剩余未结合链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞溶液，吸附出该细胞溶液并置于1.5ml的离心试管中即为负向吸附后得到的细胞。
2.3、细胞染色
上述经负向吸附后得到的细胞进行表面抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的表面染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的表面抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；
再向离心管中加入250μl的固定缓冲液，混匀后4℃孵育细胞 30分钟；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的固定缓冲液，下层为被固定的细胞；
吸附出上未结合细胞的固定缓冲液；再向离心管中添加250ul的破膜剂，涡旋混匀；将离心试管4℃温度孵育30分钟后；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的破膜剂，下层为破膜后的细胞；
吸附出未结合细胞的破膜剂；用100ul磷酸盐缓冲液重悬破膜后的细胞，进行胞内抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的胞内染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20 分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的胞内抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；用100ul磷酸盐缓冲液重悬细胞后上流式细胞仪检测。
结果分析：
表1、免疫磁珠负向富集法白细胞去除率统计
表2、流式检测肿瘤细胞回收率统计
本实施例表明：本试剂盒对乳腺癌癌细胞有较好的特异性回收率，在富集过程中能够有效去除白细胞的背景干扰。
具体实施例三：健康人外周血掺入N87肿瘤细胞系的检测分析
本实例是使用健康人外周血掺入不同数量的N87(胃癌癌细胞)，并以此为模拟样本对其进行检测分析，以此来评价试剂盒的白细胞去除效率以及试剂盒的回收率等性能，具体详述如下：
1、样本制备
将培养的肿瘤细胞N87消化并制成单细胞悬液，用计数仪计数后，用磷酸盐缓冲液将其稀释到所需的浓度(1000个/管、500个/ 管、100个/管、10个/管、0个/管；每个浓度均设置3组重复)，向 7.5ml健康人外周血中添加上述不同浓度的N87。
2、红细胞裂解
2.1、红细胞裂解
(1)、抽取7.5ml的外周血留置，另准备22.5ml的红细胞裂解液，将两者共同置于离心管中混匀，将离心管置于4℃温度下放置15 分钟，
(2)、放置15分钟后，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200 转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为裂解的红细胞溶液，下层为沉淀的白细胞，吸弃上层裂解的红细胞溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、向沉淀的白细胞中再加入15ml的红细胞裂解液，将离心管置于涡旋机中涡旋混匀用以重悬白细胞，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为新裂解的红细胞溶液，下层为新沉淀的白细胞，吸弃上层新裂解的红细胞溶液，留置新沉淀的白细胞；
(4)、向新沉淀的白细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为第三次裂解的红细胞溶液，下层为第三次沉淀的白细胞，吸弃上层第三次裂解的红细胞溶液，留置第三次沉淀的白细胞；
(5)、向第三次沉淀有白细胞的离心管中加入100ul的磷酸盐缓冲液,用以重悬沉淀的白细胞，后搁置离心管；
2.2、免疫磁珠负向去除白细胞
(1)、计数重悬沉淀后的白细胞的细胞数，并以每106细胞数加入20ul生物素化抗体，将离心管置于4℃温度的冰箱中孵育15分钟后取出；
(2)、加入1ml的磁珠缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合的生物素化抗体及磁珠缓冲液，下层沉淀为结合了生物素化抗体的白细胞，吸弃上层溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、以每106结合了生物素化抗体的白细胞的细胞数中加入5 μl的链霉抗生物素蛋白颗粒，将离心管置于4℃温度下放置30分钟；
(4)、将离心管中的混合溶液转移到圆底试管中，向圆底试管再加入1ml的磁珠缓冲液，将圆底试管置于细胞分离磁力架中放置8分钟；8分钟后结合了链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞被吸附至圆底试管的内壁上，剩余未结合链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞溶液，吸附出该细胞溶液并置于1.5ml的离心试管中即为负向吸附后得到的细胞。
2.3、细胞染色
上述经负向吸附后得到的细胞进行表面抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的表面染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的表面抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；
再向离心管中加入250μl的固定缓冲液，混匀后4℃孵育细胞30分钟；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的固定缓冲液，下层为被固定的细胞；
吸附出上未结合细胞的固定缓冲液；再向离心管中添加250ul的破膜剂，涡旋混匀；将离心试管4℃温度孵育30分钟后；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的破膜剂，下层为破膜后的细胞；
吸附出未结合细胞的破膜剂；用100ul磷酸盐缓冲液重悬破膜后的细胞，进行胞内抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的胞内染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20 分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的胞内抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；用100ul磷酸盐缓冲液重悬细胞后上流式细胞仪检测。
结果分析：
表1、免疫磁珠负向富集法白细胞去除率统计
| 样本组编号 | 血液体积 | 初始白细胞数目 | 白细胞剩余 | 白细胞去除效率 |
| 1 | 7.5ml | 1×107 | 73720 | >99.26％ |
| 2 | 7.5ml | 1×107 | 65540 | >99.34％ |
| 3 | 7.5ml | 1×107 | 82002 | >99.18％ |
表2、流式检测肿瘤细胞回收率统计
本实施例表明：本试剂盒对胃癌癌细胞有较好的特异性回收率，在富集过程中能够有效去除白细胞的背景干扰。
Claims (4)
1.一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
1.1、红细胞裂解
(1)、抽取7.5ml的外周血留置，另准备22.5ml的红细胞裂解液，将两者共同置于离心管中混匀，将离心管置于4℃环境下放置15分钟，
(2)、放置15分钟后，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为裂解的红细胞溶液，下层为沉淀的白细胞，吸弃上层裂解的红细胞溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、向沉淀的白细胞中再加入15ml的红细胞裂解液，将离心管置于涡旋机中涡旋混匀用以重悬白细胞，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心10分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为新裂解的红细胞溶液，下层为新沉淀的白细胞，吸弃上层新裂解的红细胞溶液，留置新沉淀的白细胞；
(4)、向新沉淀的白细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，后再次将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为第三次裂解的红细胞溶液，下层为第三次沉淀的白细胞，吸弃上层第三次裂解的红细胞溶液，留置第三次沉淀的白细胞；
(5)、向第三次沉淀有白细胞的离心管中加入100ul的磷酸盐缓冲液，用以重悬沉淀的白细胞，后搁置离心管；
1.2、免疫磁珠负向去除白细胞
(1)、计数重悬沉淀后的白细胞的细胞数，并以每106细胞数加入20ul生物素化抗体，将离心管置于4℃温度的冰箱中孵育15分钟后取出；
(2)、加入1ml的磁珠缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合的生物素化抗体及磁珠缓冲液，下层沉淀为结合了生物素化抗体的白细胞，吸弃上层溶液，留置沉淀的白细胞；
(3)、以每106结合了生物素化抗体的白细胞的细胞数中加入5μl的链霉抗生物素蛋白颗粒，将离心管置于4℃温度下放置30分钟；
(4)、将离心管中的混合溶液转移到圆底试管中，向圆底试管再加入1ml的磁珠缓冲液，将圆底试管置于细胞分离磁力架中放置8分钟；8分钟后结合了链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞被吸附至圆底试管的内壁上，剩余未结合链霉抗生物素蛋白颗粒的细胞溶液，吸附出该细胞溶液并置于1.5ml的离心试管中即为负向吸附后得到的细胞。
1.3、细胞染色
上述经负向吸附后得到的细胞进行表面抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的表面染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的表面抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；
再向离心管中加入250μl的固定缓冲液，混匀后4℃孵育细胞20分钟；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的固定缓冲液，下层为被固定的细胞；
吸附出上未结合细胞的固定缓冲液；再向离心管中添加250ul的破膜剂，涡旋混匀；将离心试管4℃温度孵育30分钟后；将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的破膜剂，下层为破膜后的细胞；
吸附出未结合细胞的破膜剂；用100ul磷酸盐缓冲液重悬破膜后的细胞，进行胞内抗体染色，向1.5ml的离心试管中按照每106各加入5ul的胞内染色抗体充分混匀，将离心试管常温下避光孵育20分钟；向孵育后的细胞中加入1ml的磷酸盐缓冲液，将离心管置于离心机中4℃温度下，1200转离心5分钟停止，自离心机中取出离心管，离心后的混合溶液分为两层，上层为未结合细胞的胞内抗体及磷酸盐缓冲液，下层为沉淀的细胞，吸弃上层的细胞溶液，留置沉淀的细胞；用100ul磷酸盐缓冲液重悬细胞后上流式细胞仪检测。
2.根据权利要求1所述的一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的检测方法采用免疫磁珠负向吸附法富集CTC后利用流式细胞仪进行检测。
3.根据权利要求2所述的一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述上皮型CTC特异性抗体为EPCAM、CK8/18/19。
4.根据权利要求2所述的一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述间质型CTC特异性抗体为N-Cadherin及vimentin。
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