CN106701684A - 一种高效率循环肿瘤细胞富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种循环肿瘤细胞的富集方法及其应用,适用于生物技术及医学领域。该循环肿瘤细胞的富集方法包括:将血液样品与通过配体特异性结合白细胞的微球进行孵育、将孵育后样品进行密度梯度离心,以及将上清通过滤膜截留或者进一步离心。本发明涉及的循环肿瘤细胞富集方法具有富集效率高、灵敏度高,且操作简便、成本低廉的特点。富集后的循环肿瘤细胞没有经过任何标记,能够保持循环肿瘤细胞的原始状态,便于进行后续分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效率高纯度分离稀有细胞的方法,特别涉及一种从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法,本发明还涉及一种用于从肿瘤患者外周血中富集循环肿瘤细胞的试剂盒和一种循环肿瘤细胞的富集装置,以及分离出的循环肿瘤细胞的分析方法及其应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是从自发或因诊疗操作由肿瘤原发灶、转移灶等途径播散进入肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞,是肿瘤转移灶的直接来源。循环肿瘤细胞CTCs作为原发灶和转移灶之间的连接,是研究肿瘤生物学和转移机制的最佳窗口,是指导个体化肿瘤治疗的绝佳研究对象,最为重要的是可作为具有肿瘤(包括转移灶)代表性的“液体活检”(liquid biopsy)样本,允许多次、实时、非侵入性获取。鉴于超过90%的癌症死亡是由转移造成的,从血液中检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。
循环肿瘤细胞对于肿瘤的早期诊断和治疗评估有很重要的临床研究价值,目前已有证据显示肿瘤的侵袭和微转移很可能在肿瘤发生的早期就已出现,很多肿瘤在1毫米的情况下已经可以在血液里检测到循环肿瘤细胞,另外检测外周血中的循环肿瘤细胞数目可用于实体瘤患者的预后以及预测化疗的有效性,并用来指导实体瘤患者的病程分期和复发监控,具体包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肾细胞癌和黑色素瘤等。
CTCs富集关键在于如何从复杂的血液环境中高效、迅速、准确地富集CTCs。血液循环系统存在着数量巨大的血液细胞,包括红细胞约5×109个/mL、白细胞约7×106个/mL及血小板约3×108个/mL。而CTCs数量极为稀少,转移癌患者体内每毫升血液中只有1个到几十个CTCs,大量血液细胞的存在严重干扰CTCs的富集,因此CTCs在血液检测中极具挑战性。CTCs的富集效果(尤其富集效率)直接影响了对病人肿瘤诊断的预判以及后续的基因检测等,因此高富集效率、高灵敏度、高纯度、高通量以及高活性的CTCs富集技术成为近年来的研究热点和难点。
CTCs的富集方法主要分为物理法和生物化学法两大类。物理法基于肿瘤细胞与正常细胞物理性质,如大小、变形性、密度、介电性等的差异,利用外力场比如磁场,流体场,电场等的作用进行分离捕获。生物化学法通常依赖于细胞膜表面的抗原与偶联在分离介质上的抗体相结合,以达到分离捕获的目的。具体来讲,凭借众多学者专家的努力,多种基于不同机制的技术被用于CTCs的检测,主要包括基于细胞密度的离心法、基于细胞体积大小的滤膜过滤法(isolation by size of epithelial tumor cells,ISET)、基于肿瘤标记物的免疫磁珠法(magnetic activated cell sorting,MACS)、基于微流控芯片的CTC-Chip技术等CTCs富集技术。
其中,免疫磁珠法是目前最常用的CTCs分离和富集的技术。免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原分子与连接在磁珠上的特异性单抗结合,形成抗原—抗体—磁珠免疫复合物,在外加磁场的作用下发生力学移动,将含有靶抗原的目的细胞与其他细胞分离,从而达到特异性分离细胞的目的,具有简便易行、分离纯度高、保留细胞活性的优点。免疫磁珠法富集CTCs,具体可分为阳性富集策略和阴性富集策略。前者通过磁珠偶联上皮细胞黏附分子EpCAM和细胞角蛋白CK等标志直接富集外周血中上皮来源的稀有细胞。后者通过磁珠偶联CD45等白细胞标志或巨噬细胞、血小板表达的CD61,去除外周血白细胞而间接富集稀有上皮细胞。
近年来,纳米技术制造的纳米级(10~100nm)磁珠被用于外周肿瘤细胞的富集分离,用与肿瘤特异性表面抗原相对应的单克隆抗体包被免疫磁珠,以此磁珠对肿瘤患者外周血样本中的肿瘤细胞进行浓缩、分离,可对肿瘤细胞进行104~2×105倍的富集,大大提高了外周血样本中肿瘤细胞的浓度,从而提高检测的敏感性。EpCAM是目前最优的肿瘤特异性表面抗原,但有研究显示大多数恶性肿瘤的CTCs会丢失该抗原,因此基于EpCAM抗原的方法可能会漏检CTCs。研究发现134种组织类型不同的肿瘤细胞,只有70%表达EpCAM抗原,同时还存在该抗原在不同患者中表达强度不一、在循环肿瘤细胞群体中表达强度不一的问题。目前,尚没有一种100%特异性的肿瘤特异性表面抗原。因此,开发不依赖于CTCs特异性表面抗原的分离方法也是一个重要方向。
阴性富集策略不依赖于肿瘤特异性表面抗原,采用免疫磁珠法,通过有效去除CD45+的白细胞或CD61+的巨噬细胞、血小板等外周血其他细胞而间接富集CD45或CD61阴性的稀有细胞,克服了EpCAM阳性富集策略的缺陷。但这种阴性富集策略得到的产物纯度较低,特异性不高,回收率也有待提高。
整体上,传统的密度梯度离心法、细胞大小过滤法存在富集效率低的致命缺陷,免疫磁珠阳性富集法存在操作繁琐、使用不方便、漏检等缺点,微流控芯片技术则存在成本高、技术难度高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种循环肿瘤细胞的富集方法,所述方法包括步骤:
(1)将样品与白细胞特异性结合的微球进行孵育;
(2)将孵育后样品加入密度梯度离心介质的分离管中进行密度梯度离心;
(3)收集分离管上层液体,通过滤膜截留或者再次离心得到循环肿瘤细胞。
在一优选实施例中,所述微球直径范围为1nm至200μm,密度范围为1.01-5.5g/mL,优选微球直径范围为1-10μm,密度范围为1.3-4.0g/mL,进一步优选微球密度范围为1.6-2.5g/mL。
在另一优选实施例中,所述微球为磁性或非磁性,所述微球可含有聚苯乙烯、四氧化三铁、三氧化二铁、二氧化硅、右旋糖苷、琼脂糖、交联葡聚糖、明胶、藻多糖或其他高密度材质中的一种或以上成分,所述微球优选为聚苯乙烯塑料微球、二氧化硅微球或磁性微球中的一种。
在另一优选实施例中,所述微球为经过表面修饰的表面活化微球,所述表面修饰方式为羟基修饰、羧基修饰、乙酰化修饰、硅烷化修饰、生物素修饰、亲和素修饰、链霉亲和素修饰、蛋白A修饰、蛋白G修饰、蛋白A/G修饰、蛋白L修饰、二抗修饰及其他修饰方式。
在另一优选实施例中,所述微球数量与白细胞数量的比例范围为1:1至1000:1。
在另一优选实施例中,所述微球上直接或间接、共价或非共价偶联有与白细胞特异性结合的配体。
在另一优选实施例中,所述与白细胞特异性结合的配体选自抗体、多肽、蛋白、核酸、适配体及其他行使与白细胞结合功能的无机物、有机物。
在另一优选实施例中,所述抗体为CD45抗体或CD45抗体与选自CD2、CD3、CD4、CD8、CD15、CD16、CD32、CD45、CD56、CD61b及其他识别血源细胞的抗体中的一种或以上的组合。
在另一优选实施例中,所述配体为单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一优选实施例中,该方法采用的分离管为淋巴细胞或PBMC分离管,所述淋巴细胞或PBMC分离管具有可隔离密度梯度离心后形成的白膜层与下方红细胞沉淀的结构。
在另一优选实施例中,所述密度梯度离心介质密度范围为1.050-1.7g/mL,优选1.078-1.091g/mL。
所述密度梯度离心介质成分包括聚蔗糖、泛影葡胺、葡聚糖胺、氯化铷、溴化铯、碘克沙醇及其他具有特定密度特性的化合物,通过对以上成分不同比例混合或其他介质稀释得到具有特定密度的密度梯度离心介质,所述密度梯度离心液包括商品化的Ficoll、Percoll、Histopaque、Optiprep、Nycodenz、Polymorphprep及其他密度梯度离心介质。
在另一优选实施例中,所述滤膜为多孔膜,孔径范围为0.1-12μm,优选为0.1-4.9μm,更优选为3-4.9μm。
所述滤膜行使截留循环肿瘤细胞功能时,可以单独使用,也可以与其他任一形状的容器结合为特制容器;所述滤膜,可以通过重力法过滤,也可以通过负压、正压、离心及其他施压方式进行过滤。
所述滤膜还可以为微孔滤膜,选自纤维素酯滤膜、尼龙滤膜、石英滤膜、聚碳酸酯滤膜、各种玻璃材质微孔滤膜、各种纤维材质滤膜、各种塑料材质滤膜或其他符合要求材质的滤膜。
本发明的目的还在于提供一种用于从肿瘤患者外周血中富集循环肿瘤细胞的试剂盒,所述试剂盒采用上述循环肿瘤细胞的富集方法,所述试剂盒包括通过配体特异性结合白细胞的微球,细胞分离介质,分离管和含滤膜容器。
本发明的目的还在于提供一种循环肿瘤细胞的富集装置,该装置采用上述循环肿瘤细胞的富集方法。
本发明的目的还在于提供一种循环肿瘤细胞的分析方法,该分析方法包括免疫荧光染色、免疫细胞化学染色、常规细胞化学染色、细胞培养、基因突变检测、基因测序、蛋白组学、多维度组学,循环肿瘤细胞计数、循环肿瘤细胞基因信息的获取、循环肿瘤细胞蛋白信息的获取、循环肿瘤细胞药物敏感性信息的获取。
本发明的目的还在于提供一种循环肿瘤细胞的应用,所述应用包括肿瘤医学领域的临床应用,具体包括癌症的诊断、疗效监测、预后判断和个体化用药指导。
本发明通过高密度微球特异性结合并选择性增加了白细胞的密度,从而扩大其与密度梯度离心介质的差异性,通过一步密度梯度离心即可对血样高效率的去除数量巨大的红细胞、白细胞,再通过对密度梯度离心后含有循环肿瘤细胞的上清液进一步通过滤膜截留,极大的提高了富集效率。本发明所述方法解决了循环肿瘤细胞富集过程复杂、繁琐、产物纯度低、富集效率低、灵敏度不够高的问题,提高了CTCs富集效率和灵敏度,同时产物纯度高,操作简便,极大程度的降低成本。富集后的循环肿瘤细胞没有经过任何标记,保持循环肿瘤细胞的原始状态,便于后续分析,尤其是使循环肿瘤中细胞截留在滤膜上更便于进行后续免疫染色、细胞化学染色等操作。
关于本发明中提及的专业术语示意如下:
微球:是指由通过特殊工艺加工而成的直径从nm(纳米)级到μm(微米)级的特殊材质的球状物。材质包括但不限于聚苯乙烯、四氧化三铁、三氧化二铁、二氧化硅、右旋糖苷、琼脂糖、交联葡聚糖、明胶、藻多糖等,微球形式包括但不限于聚苯乙烯塑料微球、磁性微球、二氧化硅微球、其他复合材料微球,其中磁性微球最为常见。不同材质不同配方的微球往往具有截然不同的多种特性,如磁性、化学稳定性、密度、大小、光滑度、折光度等等。
表面活化微球:是指在微球表面通过化学修饰、蛋白修饰等手段进行处理,使其具有与其他化合物(包括蛋白、抗体、其他配体等)结合能力的微球。包括但不限于羟基修饰、羧基修饰、乙酰化修饰、硅烷化修饰、生物素修饰、亲和素修饰、链霉亲和素修饰、蛋白A修饰、蛋白G修饰、蛋白A/G修饰、二抗(羊抗兔、羊抗鼠及其他)修饰等。
配体:广义的指具有特异性的与目的物质(抗原、蛋白、抗体、细胞、细菌等)相结合能力的物质。配体的形式包括:小分子化合物、多肽、抗体、抗原、核酸适配体等,最常见的配体形式为抗体。
功能化微球:一般指表面结合了抗体、多肽、适配体或其他配体后的微球,具有通过表面结合的配体与目的物质(抗原、蛋白、抗体、细胞、细菌等)结合的能力。一般通过表面活化微球结合某种配体得到,最常见的是免疫磁珠,即表面结合某种抗体后的磁性微球,如链霉亲和素修饰的抗体与生物素化的抗体结合后得到识别该抗体对应抗原的功能化微球。功能化微球中配体与微球的结合方式包括共价键结合与非共价键结合。
密度梯度离心介质:指具有特定密度物理特性的介质,包括聚蔗糖、泛影葡胺、葡聚糖胺、氯化铷、溴化铯、碘克沙醇等类型,一般通过不同比例混合或其他介质稀释得到具有特定密度的溶液或颗粒悬浮液,一般俗称密度梯度离心液。
密度梯度离心:用一定的离心介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。应用于细胞分离,尤其是传统的淋巴细胞分离,即利用不同血液细胞之间存在密度、沉降系数差异,在一定离心力作用下,不同细胞各自以一定速度沉降,最终在密度梯度体系的不同区域上形成不同细胞密度对应的区带。
分离管:一般指具有特殊结构的离心管,该特殊构造可以形成物理隔离,达到固液分离、液液分离的目的。在生物学、医学领域,分离管往往与密度梯度离心介质组合使用,如最常见的淋巴细胞分离过程中,其原理为能有效隔离密度梯度离心后形成的白膜层与下方红细胞沉淀,从而减少全血与分离液的混合,减少细胞损失,提高细胞分离纯化效率。所述特殊构造的形式包括但不限于膜、隔板、隔层、高分子聚合物、金属物、分离胶、特定密度油脂及其他具有物理空间隔离效果的嵌入物。
免疫荧光:通过连接有不同荧光基团的抗体,该荧光抗体即可结合对应抗原分子,这些荧光基团在特定条件下被激发即可发出该荧光基团特有的荧光。通常用这些如最常见的FITC荧光基团发出绿色荧光,PE荧光基团发出红色荧光,细胞核特异性荧光染料DAPI发出蓝色荧光。
附图说明
图1为血样处理流程第一方案;
图2为血液处理流程第二方案;
图3为密度梯度离心等组合策略富集循环肿瘤细胞流程图;
图4为掺入100个肿瘤细胞血样肿瘤细胞富集效率;
图5为免疫荧光法鉴定富集到的循环肿瘤细胞(CK+CD45-DAPI+)。
具体实施方式
据报道,除肝脏等少数器官来源的循环肿瘤细胞密度为1.09-1.15g/mL外,绝大多数循环肿瘤细胞的密度范围在1.042-1.085g/mL的范围之间。血细胞中的红细胞密度范围为1.10-1.15g/mL,白细胞密度范围为1.07-1.09g/mL。利用密度梯度离心法,将细胞按照不同密度分布在离心液中,以常规PBMC分离为例,这种基于1.077g/mL Ficoll-PaquePlus的常规密度梯度离心方法只能去除血样中大量的红细胞及密度高于密度梯度离心介质的部分粒细胞。
因此本发明在传统阴性富集方法中引入了一种通过主动改变白细胞密度的策略,通过高密度的功能化微球特异性结合白细胞以改变白细胞密度,通过优化的特定密度的密度梯度离心介质,进行一步密度梯度离心法达到阴性富集效果。
据报道,血液中红细胞直径4~8μm,白细胞中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞直径一般为10-15μm,单核细胞直径14~20μm,淋巴细胞直径跨度较大为6-20μm。血液中的循环肿瘤细胞直径大多为7-30μm。因此,传统的ISET方法采用8μm滤膜富集循环肿瘤细胞时,由于循环肿瘤细胞与血液细胞中白细胞具有相当大的交叉范围,很难达到较高的灵敏度和纯度。
在本发明中,因密度梯度离心后收集的上清液中白细胞数量较少,首创性的使用孔径大大小于循环肿瘤细胞的0.1-4.9μm滤膜,理论上可以截留全部的循环肿瘤细胞,极大程度的提高了富集效率;并且通过与负压发生装置连接后,对于后续免疫染色、细胞化学染色等下游应用,极大程度的提高了操作便利性、缩短耗时。
在一个优选的实施例中,所使用的微球密度范围为1.01-5.5g/mL,直径范围为1纳米-200微米。所述微球为经过表面修饰的表面活化微球,所述表面活化方式包括但不限于羟基修饰、羧基修饰、乙酰化修饰、硅烷化修饰、生物素修饰、亲和素修饰、链霉亲和素修饰、蛋白A修饰、蛋白G修饰、蛋白A/G修饰、蛋白L修饰、二抗修饰等,微球材质包括但不限于聚苯乙烯、四氧化三铁、三氧化二铁、二氧化硅、右旋糖苷、琼脂糖、交联葡聚糖、明胶、藻多糖等,微球形式包括但不限于聚苯乙烯塑料微球、磁性微球、二氧化硅微球、其他复合材料微球。优选密度为1.3-4g/mL、直径为1-10μm的表面活化二氧化硅微球或磁性微球。
在一个优选的实施例中,所使用的微球上直接或间接、共价或非共价偶联有与白细胞特异性结合的配体;所述微球为磁性或非磁性。
特异性结合白细胞是指通过特异性配体结合白细胞表面分子达到的,配体包括但不限于抗体、多肽、蛋白、核酸、适配体及其他行使与白细胞结合功能的无机物、有机物。抗体包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD8、CD15、CD16、CD32、CD45、CD56、CD61b等识别血源细胞的抗体,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、抗体混合液等形式。特异性配体优选为CD45抗体,或基于CD45抗体与CD2、CD3、CD4、CD8、CD15、CD16、CD32、CD45、CD56、CD61b中一种或多种抗体的混合抗体。
在一个优选的实施例中,特异性结合白细胞可以通过表面活化微球结合特异性配体后形成的功能化微球实现,还可以通过分别加入特异性配体、再加入表面活化微球获得。
在一个优选的实施例中,特异性结合白细胞可以通过直接加入特异性配体功能化的表面活化微球,优选为结合CD45抗体及CD45抗体与CD15、CD61b等其他抗体的混合抗体的二氧化硅微球或磁性微球,如符合参数要求的商品化CD45免疫磁珠。
在一个优选的实施例中,特异性结合白细胞可以通过先加入特异性配体,优选为CD45抗体及CD45抗体与CD15、CD61b等其他抗体混合抗体;再加入表面活化微球,优选密度为1.3-4g/mL、直径为1-10μm的表面活化二氧化硅微球或磁性微球。
所需功能化微球或活化微球用量需根据目的细胞数量按比例计算,其特征在于微球数量与目的细胞数量比例为1-1000:1,优选微球数量与目的细胞数量比例为2-50:1。
在一个优选的实施中,所需配体用量需根据目的细胞数量按比例计算,优选使用CD45等抗体时,其特征在于每107个目的细胞所需抗体用量为0.1ug-100ug,优选抗体用量为每107个目的细胞使用抗体1-10ug。
在一个优选的实施例中,优化的特定密度的密度梯度离心介质范围为1.060-1.5g/mL。包括聚蔗糖、泛影葡胺、葡聚糖胺、氯化铷、溴化铯、碘克沙醇等其他具有特定密度特性的化合物,通过对以上成分不同比例混合或其他介质稀释得到的具有特定密度的密度梯度离心介质,此类密度梯度离心液包括但不限于商品化的Ficoll、Percoll、Histopaque、Optiprep、Nycodenz、Polymorphprep等密度梯度离心介质。优选为密度为1.083的Histopaque、Ficollpremium。
在一个优选的实施例中,所使用的分离管为具有特殊结构的PBMC分离管,该特殊构造的原理为能有效隔离密度梯度离心后形成的白膜层与下方红细胞沉淀,从而减少全血与分离液的混合,减少细胞损失,提高细胞分离纯化效率。所述特殊构造的形式包括但不限于膜、隔板、隔层、高分子聚合物、金属物、分离胶、特定密度油脂及其他具有物理空间隔离效果的嵌入物。此类具有特殊构造的PBMC分离管包括但不限于商品化的Lymphoprep分离管、Sepmate分离管、LeucoSep分离管等具有物理空间隔离分离物与沉淀物作用的分离管。优选为Sepmate分离管,优选容积为8ml-100ml。
在一个优选的实施例中,使用的滤膜为微孔滤膜,孔径为0.1-4.9μm;所述滤膜行使截留循环肿瘤细胞功能时,可以单独使用,也可以与其他任意形状的容器结合为特制容器。所述滤膜行使截留循环肿瘤细胞功能时,可以通过重力法过滤,也可以通过负压、正压、离心及其他施压方式进行过滤;所述滤膜还可以为微孔滤膜,选自纤维素酯滤膜、尼龙滤膜、石英滤膜、聚碳酸酯滤膜、各种玻璃材质微孔滤膜、各种纤维材质滤膜、各种塑料材质滤膜或其他符合要求材质的滤膜。
本发明还提供一种用于从肿瘤患者外周血中富集循环肿瘤细胞的试剂盒,所述试剂盒采用上述循环肿瘤细胞的富集方法,所述试剂盒包括通过配体特异性结合白细胞的微球(功能化微球,如CD45微球、CD15微球、CD61b微球),细胞分离介质(细胞分离用密度梯度离心介质),分离管(PBMC分离管),细胞分离缓冲液和含滤膜容器。
该试剂盒通过微球表面配体特异性结合白细胞,增加白细胞密度,在装有特定密度的细胞分离介质的分离管中离心后,红细胞、白细胞均沉淀至管底,取上清加入含滤膜容器中过滤截留或再次离心。
本发明还提供一种循环肿瘤细胞的富集装置,该装置采用上述循环肿瘤细胞的富集方法。在一个优选的实施例中,如图3所示,可以将滤膜放置在PE材质或金属材质的滤膜支撑装置中,上端为进样处,下端为排放废液处。该装置可以在正常重力条件下静置,也可连接正压泵、负压泵、离心,以达到过滤分离效果。该装置包括负压泵及与含滤膜滤器连接装置,在负压条件下进行过滤。
本发明还提供一种循环肿瘤细胞的分析方法,该分析方法包括免疫荧光染色、免疫细胞化学染色、常规细胞化学染色、细胞培养、基因突变检测、基因测序、蛋白组学、多维度组学,循环肿瘤细胞计数、循环肿瘤细胞基因信息的获取、循环肿瘤细胞蛋白信息的获取、循环肿瘤细胞药物敏感性信息的获取。
本发明还提供一种循环肿瘤细胞的应用方法,所述应用包括肿瘤医学领域的临床应用,具体包括癌症的疗效监测、预后判断和个体化用药指导。
用于循环肿瘤细胞阴性富集的来源包括健康人、疑似病例、肿瘤患者,用于循环肿瘤细胞阴性富集的样本形式包括但不限于全血、抗凝全血、全血经过红细胞裂解等处理后产物、外周血单个核细胞、外周血淋巴细胞、胸水、腹水、针吸穿刺物、肿瘤组织消化产物、尿液、淋巴液、骨髓穿刺物等。
在一个优选的实施例中,病人血样与特异性结合白细胞的微球的混合方式为在4摄氏度至45摄氏度的条件下孵育,孵育时间为15分钟-2小时。优选方案为在4摄氏度下孵育1小时,或20至25摄氏度下孵育30分钟。
在一个优选的实施例中,将孵育后的血液样品缓慢滴加到密度梯度分离介质的上层后,即进入密度梯度离心过程。密度梯度离心介质用量范围为1-50ml,优选用量为淹没特殊构造分离管物理隔层及以上所需体积,通常为1-50ml。离心力范围为100g-1500g,离心转速范围为500rpm-10000rpm,离心时间为5-90分钟,离心温度为2度-37度。优选方案为4-25度400-1200g离心20-40分钟,以20-25度600g离心20min为最佳。
离心分离后,取PBMC分离管的上层所有液体部分,取得密度梯度离心后离心介质上层肿瘤细胞的方式包括但不限于直接倾倒、直接吸取、弃部分上清后倾倒、弃部分上清后吸取及其他转移方式。优选方案为直接倾倒、弃部分上清后倾倒,对分离管加以适当的清洗,并将清洗液与上清液一起收集等。
将收集得到的上清液及清洗液进一步离心后弃上清得到沉淀,离心力范围为100g-1500g,离心转速范围为500rpm-10000rpm,离心时间为5-90min,离心温度为2摄氏度-37摄氏度;优选方案为4-25摄氏度100-1200g条件下离心3-30分钟,其中,20-25摄氏度600g离心7min为最佳。
在本发明的一个优选的实施例中,循环肿瘤细胞阴性富集方法包括如下步骤:
(1)配制密度范围为1.083-1.085g/mL的细胞分离用密度梯度离心介质;
(2)将特别制备的一定密度范围内的密度梯度离心介质加入具有特殊结构的PBMC分离管中;
(3)准备密度范围为1.6-2.0g/mL直径为1-10μm的表面活化微球;
(4)制备通过配体特异性结合白细胞的功能化微球,如CD45微球、CD15微球、CD61b微球;
(5)将病人血样与特异性结合白细胞的功能化微球混匀,4摄氏度下孵育1h或20-25摄氏度孵育30分钟;
(6)将孵育后的血液样品滴加到1.083-1.085g/mL细胞分离用密度梯度离心介质的上层,600g离心20min;
(7)离心分离后,取PBMC分离管的上层所有液体部分;
(8)将收集的上清通过4μm滤膜即可将所有循环肿瘤细胞截留在滤膜上,或者将收集的上清在600g速度下离心5min,所得沉淀部分即为阴性富集得到的循环肿瘤细胞。
在本发明的另一个优选的实施例中,另一种替代可行的循环肿瘤细胞阴性富集方法包括如下步骤:
(1)配制密度范围为1.083-1.085g/mL的细胞分离用密度梯度离心介质;
(2)将特别制备的一定密度范围内的密度梯度离心介质加入具有特殊结构的PBMC分离管中;
(3)准备特异性结合白细胞的配体,如CD45抗体、CD15抗体、CD61b抗体;
(4)将病人血样与特异性结合白细胞的配体混匀,4度或20-25度孵育30分钟;
(5)准备密度范围为1.6-2.0g/mL直径为1-10μm的表面活化微球,加入病人血样中混匀,4度或20-25度孵育30分钟;
(6)将孵育后的血液样品滴加到1.083-1.085g/mL细胞分离用密度梯度离心介质的上层,600g离心20min;
(7)离心分离后,取PBMC分离管的上层所有液体部分;
(8)将收集的上清通过4μm滤膜即可将所有循环肿瘤细胞截留在滤膜上,或者将收集的上清在600g速度下离心5min,所得沉淀部分即为阴性富集得到的循环肿瘤细胞。
实施例1应用该循环肿瘤细胞富集方法及试剂盒的富集效率评价
一、荧光标记细胞
肺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF-7经培养消化后用完全培养基稀释至~104/mL,取0.5ml细胞悬液加入1μl的Cell Tracker Green CMFDA Dye(终浓度0.5μM),于37℃孵育30min。
二、细胞计数
取10ul Cell Tracker Green荧光标记后的肿瘤细胞在荧光显微镜下计数,精确调整细胞浓度至100/10ul。
三、模拟肿瘤病人外周血
采集3ml健康人外周血于EDTA抗凝的真空采血管中,备用。将Cell Tracker GreenCMFDA Dye荧光标记的肿瘤细胞计数后,取10ul细胞浓度为100/10ul Cell Tracker GreenCMFDA Dye荧光标记的肿瘤细胞掺入到健康人外周血中模拟肿瘤病人外周血中的循环肿瘤细胞。
四、循环肿瘤细胞阴性富集
第一种方案,如附图1、附图3所示:
1.材料准备
1.1配制密度范围为1.083-1.085g/mL的细胞分离用密度梯度离心介质;
1.2取略多于3ml特别制备的1.083-1.085g/mL的密度梯度离心介质加入具有特殊结构的PBMC分离管中(如15ml Sepmate分离管),800g离心1分钟,使密度梯度离心介质完全淹没物理隔层;
1.3制备通过配体特异性结合白细胞的功能化微球,如CD45微球、CD15微球、CD61b微球,其密度范围为1.6-2.0g/mL、直径为1-10μm;
2.阴性富集
2.1向上述掺入100个Cell Tracker Green荧光标记的肿瘤细胞的外周血真空采血管中加入适量功能化微球,4℃孵育1h或20-25℃孵育30分钟;
2.2将孵育后的血液样品滴加到1.083-1.085g/mL细胞分离用密度梯度离心介质的上层,1200g离心15min;
2.3离心分离后,收集特殊构造分离管中的隔层上方所有液体部分,适当洗涤数次并收集洗涤液;
2.4将收集的所有液体通过4μm滤膜过滤后取出滤膜,用含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片,留待观察计数。
或者用以下2.5与2.6步骤替代2.4步骤。
2.5将收集的所有液体600g离心5min后,所得沉淀部分即为阴性富集得到的循环肿瘤细胞。
2.6弃上清并重悬管底细胞,将含有循环肿瘤细胞的细胞悬液转移到细胞载玻片上,室温干燥过夜后用含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片,留待观察计数。
第二种方案,如附图2、附图3所示:
1.材料准备
1.1配制密度范围为1.083-1.085g/mL的细胞分离用密度梯度离心介质;
1.2取略多于3ml特别制备的1.083-1.085g/mL的密度梯度离心介质加入具有特殊结构的PBMC分离管中(如15ml Sepmate分离管),800g离心1分钟,使密度梯度离心介质完全淹没物理隔层;
1.3分别准备CD45抗体或CD45、CD15、CD61b抗体混合液,以及范围为1.6-2.0g/mL、直径为1-10μm的高密度表面活化微球;
2.阴性富集
2.1向上述掺入100个Cell Tracker Green荧光标记的肿瘤细胞的外周血真空采血管中加入适量CD45抗体或CD45、CD15、CD61b抗体混合液,4度孵育20-30分钟;离心弃上清,用含BSA和EDTA的PBS溶液重悬后,再加入适量表面活化磁珠4℃孵育30分钟。
2.2将孵育后的血液样品滴加到1.083-1.085g/mL细胞分离用密度梯度离心介质的上层,600g离心20min;
2.3离心分离后,收集特殊构造分离管中的隔层上方所有液体部分,适当洗涤数次并收集洗涤液;
2.4将收集的所有液体通过4μm滤膜过滤后取出滤膜,用含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片,留待观察计数。
或者用以下2.5与2.6步骤替代2.4步骤。
2.5将收集的所有液体600g离心5min后,所得沉淀部分即为阴性富集得到的循环肿瘤细胞。
2.6弃上清并重悬管底细胞,将含有循环肿瘤细胞的细胞悬液转移到细胞载玻片上,室温干燥过夜后用含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片,留待观察计数。
五、观察计数
用Z字形扫描法对荧光显微镜视野下Cell tracker+DAPI+细胞进行计数,根据起始细胞数量为100个肿瘤细胞计算富集效率。
如附图4所示,掺入100个肺癌A549肿瘤细胞或乳腺癌MCF7肿瘤细胞到健康人外周血中,经过基于改变白细胞密度的阴性富集后,富集效率分别达到96.56%和97.67%。
实施例2应用该富集方法及试剂盒对外周血中循环肿瘤细胞进行富集并免疫荧光鉴定
一、外周血中循环肿瘤细胞检测
向健康人外周血中掺入~100个未经过任何荧光标记的肺癌A549肿瘤细胞或乳腺癌MCF7肿瘤细胞,按照实施例1所述方法获得循环肿瘤细胞后,分别用CK-FITC荧光抗体、CD45-PE荧光抗体进行荧光标记。
二、外周血中循环肿瘤细胞检测结果判读
用含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片后,Z字形扫描法对荧光显微镜视野下进行观察。
如附图5所示,经过基于改变白细胞密度的阴性富集后及免疫荧光鉴定后,CK-FITC+、CD45-PE-、DAPI+的细胞即为掺入的未经过任何荧光标记的肿瘤细胞。
实施例3
选用不同材质、不同直径、不同的密度的表面活化微球,具有,与同一CD45抗体结合后按照实施例1操作,残留的白细胞数量具体表现见表1。其中低密度指1.01-1.3g/mL,中密度指1.3-2g/mL,高密度指2-5.5g/ml。其中白细胞残留数量极少为102-103个,白细胞残留数量少为104-105个,白细胞残留数量多为105-106个。
表1.
实施例4
选用不同配体和配体组合,在此主要指抗体,与同一种直径10μm密度2-5.5g/ml二氧化硅或四氧化三铁材质的表面活化微球结合后按照实施例1操作,残留的白细胞数量具体表现见表2。其中白细胞残留数量极少为102-103,白细胞残留数量少为104-105。
表2.
实施例5
选用密度范围为1.050-1.7g/mL的密度梯度离心介质,通过与普通离心管、分离管搭配使用,按照实施例1操作,对掺入健康人血液的肿瘤细胞富集效率具体表现见表3。
表3.
实施例6
选用孔径范围为0.1-4.9μm的多孔膜,按照实施例1操作,对掺入健康人血液的肿瘤细胞富集效率具体表现见表4。
滤膜孔径(μm) | 再次离心法富集效率 | 滤膜截留法富集效率 | 过滤流速 |
0.1 | ~88% | ~97% | 慢、堵孔 |
0.22 | ~86% | ~95% | 慢、堵孔 |
1 | ~88% | ~98% | 慢 |
3 | ~90% | ~95% | 均匀 |
4 | ~88% | ~96% | 均匀 |
4.9 | ~87% | ~96% | 快 |
8 | ~92% | ~93% | 快 |
12 | ~89% | ~91% | 快 |
本领域的技术人员应当明了,前述实施例仅作描述目的,并不构成对本发明的限制。本领域技术人员应当理解,根据需要可以对其进行多种修改、等同替换、改进和组合、亚组合、组合变换,凡在本发明的原理和原则之内所作的以上改变,均应落入本发明所附的权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种循环肿瘤细胞富集方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将样品与特异性结合白细胞的微球进行孵育;
(2)将孵育后的样品在加入密度梯度离心介质的分离管中进行密度梯度离心;
(3)收集分离管上层液体,通过滤膜截留或者再次离心得到循环肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法,其特征在于,所述微球密度范围为1.01-5.5g/ml,优选密度范围为1.3-4.0g/ml;所述微球直径范围为1nm至200μm,优选直径范围为1-10μm。
3.根据权利要求1和权利要求2所述的循环肿瘤细胞富集方法,其特征在于,所述与白细胞特异性结合的配体为抗体、多肽、蛋白、核酸、适配体及其他行使与白细胞结合功能的无机物、有机物。
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法,其特征在于,所述密度梯度离心介质密度范围为1.050-1.7g/mL,最佳密度范围为1.078-1.091g/mL。
5.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法,其特征在于,所述分离管为淋巴细胞或PBMC分离管,所述分离管具有可隔离密度梯度离心后形成的白膜层与下方红细胞沉淀的结构。
6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞富集方法,其特征在于,所述滤膜为微孔滤膜,其具有0.1-12μm的孔径,优选具有0.1-4.9μm的孔径。
7.一种用于从肿瘤患者外周血中富集循环肿瘤细胞的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用根据权利要求1至6中任一项所述的方法,所述试剂盒包括通过配体特异性结合白细胞的微球,细胞分离介质,分离管和含滤膜容器。
8.一种循环肿瘤细胞的富集装置,其特征在于,其富集方法采用权利要求1-7中任一项所述的方法。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的循环肿瘤细胞的分析方法,其特征在于,该分析方法包括免疫荧光染色、免疫细胞化学染色、常规细胞化学染色、细胞培养、基因突变检测、基因测序、蛋白组学、多维度组学,循环肿瘤细胞计数、循环肿瘤细胞基因信息的获取、循环肿瘤细胞蛋白信息的获取、循环肿瘤细胞药物敏感性信息的获取。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的循环肿瘤细胞富集及分析方法的应用,所述应用包括癌症的诊断、疗效监测、预后判断和个体化用药指导。
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