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一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，属于细胞分离技术领域，先向分离管内加入分离胶，离心使其沉到管底，再加入分离介质，然后将体腔积液或抗凝全血缓慢加入到分离介质的上层，室温离心后，先吸弃分离管最上面的液体以除去细胞碎片，然后将分离胶层上方的剩余液体倾倒入收集管中，再进行室温离心后，用PBS重悬细胞后即可获得肿瘤细胞，所述分离胶的密度为1.06‑1.08g/mL，所述分离介质的密度为1.05‑1.06g/mL。本发明可用于分离循环肿瘤细胞和体腔积液肿瘤细胞，制备方法简便高效，且分离得到的肿瘤细胞的纯度较高。

Description

一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法
技术领域
本发明属于细胞分离技术领域，具体涉及一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法。
背景技术
体腔积液是指人体脏器周围腔隙的积液，主要包括胸腔、腹腔、盆腔以及蛛网膜下腔等的积液。体腔积液与许多类型的恶性肿瘤有关，如肝癌、肺癌、乳腺癌、Koposi肉瘤和淋巴瘤等。分离和鉴定体腔积液中肿瘤细胞及其基因突变类型对于疾病诊断、病情评估以及治疗策略的制定都具有重要的临床意义。肿瘤患者体腔积液中细胞类型较为复杂，主要包括红细胞、白细胞以及间皮细胞等，肿瘤细胞数量相对较少，对于转移早期或已接受治疗的患者来说，肿瘤细胞数量可能会更低。在传统临床病理检测中，用少量体腔积液离心后进行细胞形态学分析可能会导致假阴性的结果。文献报道，在多达40％的病例中，传统的细胞学检查无法检测到肿瘤细胞，故从体腔积液中富集纯化肿瘤细胞可以明显改善基于细胞学诊断的灵敏度。
循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是指脱落于肿瘤原发灶或转移灶，经由上皮间质转化后侵入血液循环的肿瘤细胞。由于CTC能逃避机体的免疫监视，可随血液循环到达并驻留于其它组织器官，发生间质上皮转化后增殖形成新的肿瘤病灶。CTC可用于肿瘤早期诊断、预后判断，制定/调整治疗方案以及疗效和复发的实时监测等。
在临床医学的检验中，Percoll是一种通过密度离心方法分离细胞的介质，因其渗透压低，对细胞无毒等特点，广泛用于含不同细胞类型生物样品中目的细胞的分离。但直接用Percoll通过密度离心方法分离循环肿瘤细胞或体腔积液肿瘤细胞，在收获肿瘤细胞的同时不可避免要受到其它细胞的污染，不能获得较高纯度的肿瘤细胞。因此急需一种能够解决现有问题，且应用于分离体腔积液肿瘤细胞和循环肿瘤细胞的分离管的制备方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，该分离管可用于分离循环肿瘤细胞和体腔积液肿瘤细胞，分离得到的肿瘤细胞的纯度较高。
本发明提供了如下的技术方案：
一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，包括如下步骤：
S1：先将密度为1.06-1.08g/mL的分离胶加入到分离管中，室温条件下，设定离心力为1000-1200g，离心3-10min，使分离胶沉于分离管管底；
S2：再将密度为1.05-1.06g/mL的分离介质加入到分离胶上层；
S3：将肿瘤患者穿刺得到的体腔积液或抗凝全血缓慢加入到分离介质的上层，室温条件下，设定离心力为1000-1200g，离心8-12min，分离管中部形成不通透的分离胶层，将分离胶层上方的肿瘤细胞和分离胶层下方的非目的细胞有效分开；
S4：吸弃分离管内最上面的液体以除去细胞碎片，吸弃液位于分离胶层的上方；
S5：然后将分离胶层上方剩余液体倾倒至收集管中，室温条件下，设定离心力为800-1000g，离心3-10min，再用PBS重悬细胞后即可获得肿瘤细胞。
优选的，所述分离胶为聚脂、羟基硅油、聚烯烃、有机聚硅氧烷、丙烯中任意一种或任意若干种的混合液，所述分离胶具有触变性特点。
优选的，所述分离介质为Percoll、聚蔗糖、泛影葡胺中任意一种或任意若干种的混合液。
优选的，密度为1.05-1.06g/mL的所述Percoll分离介质的浓度为38-42％。
优选的，S1步骤和S2步骤中的所述分离胶与所述分离介质的体积比为1:4-1:3，所述分离胶和所述分离介质的总体积与所述分离管的体积比为1:2-1:1。
优选的，S3步骤中体腔积液或抗凝全血与所述分离介质的体积比为1:1。
优选的，S4步骤中所述吸弃液体积与所述分离胶层上方剩余液体体积比为1:3-1:2。
优选的，该方法不仅可以应用于分离循环肿瘤细胞和体腔积液肿瘤细胞，也可应用于对肿瘤患者肿瘤组织块中肿瘤细胞的分离。
本发明的有益效果是：
本发明采用Percoll分离介质的浓度为38-42％，密度为1.05-1.06g/ml，采用的分离胶具有触变性特点，其密度为1.06-1.08g/ml，在分离管的制备过程中，先向分离管内加入分离胶，离心使其沉到管底，再加入Percoll分离介质，然后将体腔积液或抗凝全血缓慢加入到分离介质的上层，室温离心后，在肿瘤细胞层下方形成一个不通透的分离胶层，将肿瘤细胞层与非目的细胞有效分开，红细胞、白细胞、淋巴细胞等非目的细胞均沉于管底，而肿瘤细胞则位于血浆内或体腔积液上清与Percoll分离介质的交界面，分离得到的肿瘤细胞纯度较高；由于分离胶形成的不通透的分离胶层的存在，可运用吸取或倾倒等方式直接获得高纯度的肿瘤细胞，操作方便、高效，且能避免收获肿瘤细胞时受到其它非目的细胞的污染。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明的分离管用于分离体腔积液中肿瘤细胞的流程图；
图2是肺腺癌患者胸腔积液分离肿瘤细胞的形态学特征；
图3是iFISH方法鉴定分离的肿瘤细胞；
图4是本发明的分离管用于分离循环肿瘤细胞的流程图；
图5是抗凝全血分离前的荧光显微镜图；
图6是抗凝全血分离后的荧光显微镜图。
图中标记为：1、分离胶；2、分离介质；3、体腔积液；4、抗凝全血；5、体腔积液上清；6、血浆；7、体腔积液肿瘤细胞；8、循环肿瘤细胞；9、非目的细胞。
具体实施方式
实施例1
一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，该方法用于分离体腔积液肿瘤细胞，如图1所示，包括如下步骤：
S1：先将5mL分离胶加入到50mL分离管中，室温条件下，设定离心力为1000g，离心5min，使分离胶沉于分离管管底，该分离胶具有触变性特点，密度为1.06-1.08g/mL；
S2：再将20mLPercoll分离介质加入到分离胶上层，Percoll分离介质的浓度为38-42％，对应的密度为1.05-1.06g/ml；
S3：将肿瘤患者穿刺得到的20mL体腔积液缓慢加入到Percoll分离介质的上层，室温条件下，设定离心力为1000g，离心10min，如图1所示，红细胞、白细胞和间皮细胞等非目的细胞沉于分离管管底，体腔积液上清位于分离管最上层，肿瘤细胞位于体腔积液上清与Percoll分离液的交界面，分离管中部形成不通透的分离胶层，分离胶层位于Percoll分离介质内部的上方，分离胶层将肿瘤细胞和非目的细胞有效分开；
S4：吸弃分离管内最上面的液体以除去细胞碎片，吸弃液位于分离胶层的上方，吸弃液的体积为6.5mL；
S5：然后将分离胶层上方剩余液体倾倒至收集管中，室温条件下，设定离心力为800g，离心5min，再用PBS重悬细胞后即可获得肿瘤细胞。
按照上述步骤，利用该方法分离肺腺癌患者胸水肿瘤细胞，所分离肿瘤细胞的形态学特征如图2所示，从图2中可见成簇的中大型细胞，出现细胞质空泡化现象。经对分离肿瘤细胞计数，从胸腔积液中分离得到的肿瘤细胞数量为109个，经iFISH检测显示DAPI(+)CD45(–)CD31(–)CEP8(异倍体)，如图3所示，符合肿瘤细胞的特征性标记，随机选取20个视野，经计算得到肿瘤细胞的纯度为85％。
实施例2
一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，该方法用于分离循环肿瘤细胞，如图4所示，包括如下步骤：
S1：先将2mL分离胶加入到15mL分离管中，室温条件下，设定离心力为1000g，离心5min，使分离胶沉于分离管管底，该分离胶具有触变性特点，密度为1.06-1.08g/mL；
S2：再将6mLPercoll分离介质加入到分离胶上层，Percoll分离介质的浓度为38-42％，对应的密度为1.05-1.06g/ml；
S3：将6mL抗凝全血缓慢加入到Percoll分离介质的上层，室温条件下，设定离心力为1000g，离心10min，如图4所示，红细胞、白细胞等非目的细胞沉于分离管管底，血浆位于分离管最上层，肿瘤细胞位于血浆内，分离管中部形成不通透的分离胶层，分离胶层位于Percoll分离介质内部的上方，分离胶层将肿瘤细胞和非目的细胞有效分开；
S4：吸弃分离管内最上面的液体以除去细胞碎片，吸弃液位于分离胶层的上方，吸弃液的体积为2mL；
S5：然后将分离胶层上方剩余液体倾倒至收集管中，室温条件下，设定离心力为800g，离心5min，再用PBS重悬细胞后即可获得肿瘤细胞。
将表达绿色荧光蛋白的20个人子宫颈癌细胞Hela细胞放入到6mL抗凝全血，如图5所示，能够在荧光显微镜下观察到表达绿色荧光蛋白的Hela细胞。然后按照上述步骤对Hela细胞进行分离，如图6所示，PBS重悬细胞后在荧光显微镜下能够再次观察到表达绿色荧光蛋白的Hela细胞，分离得到的Hela细胞纯度>95％。
此外，需要说明的是本发明一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法不仅可以应用于分离循环肿瘤细胞和体腔积液肿瘤细胞，也可应用于对肿瘤患者肿瘤组织块中肿瘤细胞的分离。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：先将密度为1.06-1.08g/mL的分离胶加入到分离管中，室温条件下，设定离心力为1000-1200g，离心3-10min，使分离胶沉于分离管管底；
S2：再将密度为1.05-1.06g/mL的分离介质加入到分离胶上层；
S3：将肿瘤患者穿刺得到的体腔积液或抗凝全血缓慢加入到分离介质的上层，室温条件下，设定离心力为1000-1200g，离心8-12min，分离管中部形成不通透的分离胶层，将分离胶层上方的肿瘤细胞和分离胶层下方的非目的细胞有效分开；
S4：吸弃分离管内最上面的液体以除去细胞碎片，吸弃液位于分离胶层的上方；
S5：然后将分离胶层上方剩余液体倾倒至收集管中，室温条件下，设定离心力为800-1000g，离心3-10min，再用PBS重悬细胞后即可获得肿瘤细胞。
2.根据权利要求1的一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，其特征在于，所述分离胶为聚脂、羟基硅油、聚烯烃、有机聚硅氧烷、丙烯中任意一种或任意若干种的混合液，所述分离胶具有触变性特点。
3.根据权利要求1的一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，其特征在于，所述分离介质为Percoll、聚蔗糖、泛影葡胺中任意一种或任意若干种的混合液。
4.根据权利要求3的一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，其特征在于，密度为1.05-1.06g/mL的所述Percoll分离介质的浓度为38-42％。
5.根据权利要求1的一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，其特征在于，S1步骤和S2步骤中的所述分离胶与所述分离介质的体积比为1:4-1:3，所述分离胶和所述分离介质的总体积与所述分离管的体积比为1:2-1:1。
6.根据权利要求1的一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，其特征在于，S3步骤中体腔积液或抗凝全血与所述分离介质的体积比为1:1。
7.根据权利要求1的一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，其特征在于，S4步骤中所述吸弃液体积与所述分离胶层上方剩余液体体积比为1:3-1:2。
8.根据权利要求1的一种用于分离肿瘤细胞的分离管的制备方法，其特征在于，该方法不仅可以应用于分离循环肿瘤细胞和体腔积液肿瘤细胞，也可应用于对肿瘤患者肿瘤组织块中肿瘤细胞的分离。
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