CN109370986A - 一种犬脂肪干细胞的提取方法及其制剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明采用犬异体脂肪干细胞制备治疗犬慢性肾病制剂，本发明的脂肪干细胞提取方法包括：获得犬腹腔脂肪组织、消化过滤离心、红细胞裂解液重悬、P0～P3代细胞培养。将得到的P3代的脂肪干细胞进行表面抗原检验，筛选出CD29、MHC‑I表达大于70％，且CD34、CD45表达小于2％，分化潜能高，能成脂、成骨、成软骨且染色体无异常，内毒素为阴性，支原体未检出的脂肪干细胞，以1×10⁶细胞/kg～5×10⁶细胞/kg的剂量，用0.5mL～1.0mL生理盐水重悬制备得到犬异体脂肪干细胞制剂，用于治疗犬慢性肾病。本发明的干细胞制剂免疫原性弱；不涉及社会、伦理、法律方面争论；无需接受移植者提供自体干细胞，几乎无损伤；分离方法简单，细胞活力很强，容易大量扩增。

Description

一种犬脂肪干细胞的提取方法及其制剂和应用

技术领域

本发明涉及干细胞制备治疗疾病的制剂领域。具体的，本发明提供了一种犬脂肪干细胞的提取方法及其制剂和在制备异体脂肪干细胞治疗犬慢性肾病的制剂中的用途。

背景技术

肾脏是动物内重要的实质性脏器，担负着排泄代谢废物、调节水电解质酸碱平衡、内分泌的重要功能。但由于其自身结构的复杂性，在受到急性或慢性因素的作用后常会造成肾脏不可逆性损伤，从而逐渐发展至慢性肾功能衰竭。慢性肾病(Chronickidneydisease，CKD)，是以造成动物永久性肾损伤为主要特征的慢性疾病，属于广义范围的疾病。动物单一或双个肾脏存在持续的(3个月以上)结构和功能异常，从单一肾脏轻微的结构病变到大量的肾元损失而影响到双侧肾脏，则可被定义为CKD。CKD在宠物临床中多发于老年犬猫，主要的症状是由肾脏损伤引起的贫血、电解质紊乱和脱水等并发症，最终动物会因并发症而死亡。CKD对肾脏的损伤是不可逆且无法预防的，需要一个长期的治疗过程。CKD根据病因分为两类：先天性和后天性的。先天性肾脏疾病的病因是动物先天性的肾脏病变(如再生障碍性贫血)或者具有将来会导致肾脏疾病的潜能(如多囊肾病)。虽然大多数先天性肾病的病例被认为是遗传的，但遗传传递和发病机制的模式仍不明。后天性CKD是肾实质损害导致肾单位丧失和肾功能逐渐衰退的结果。虽然在某些情况下，有可能确定和治疗肾脏疾病的根本原因(如肾盂肾炎)，但在大多数情况下，无法发现最初损害的性质。

干细胞是一类未分化细胞，具有自我复制、自我更新、多向分化潜能等特性。脂肪间充质干细胞((Adipose-derived stem cells，ADSCs)是其中一种成体干细胞，因其具有取材容易，增殖能力强，生物学特性稳定，可以跨胚层分化，低免疫源性等优点，被广泛应用于多种疾病的治疗研究中，具有良好的临床应用前景。最近研究发现脂肪间充质干细胞可向肾实质细胞转化，参与受损肾脏组织修复，减轻肾脏损害的程度，具有肾脏保护作用。

现在用于治疗犬慢性肾病的干细胞制剂的干细胞主要来源于患犬自体，这意味着需要对患犬进行全身麻醉手术采取脂肪组织，且需要一定周期来培养扩增，不仅对患病动物的损伤大，往往还会延误最佳治疗时期，且成本昂贵。

发明内容

为解决目前对慢性肾病患犬的治疗中，采用自体干细胞治疗所带来的对患犬机体损伤大，制剂制备周期长，且成本昂贵的问题，本发明采用犬异体脂肪干细胞制备治疗犬慢性肾病制剂，具体提供了一种犬异体脂肪干细胞的提取方法，另一个方面，本发明提供了一种犬异体脂肪干细胞制剂，再一个方面，本发明还提供了在制备异体脂肪干细胞治疗犬慢性肾病的制剂中的应用。利用本发明制备的异体脂肪干细胞具有低免疫反应风险，残留低等优点。本发明提供的异体脂肪干细胞能够有效地治疗犬慢性肾病。

本发明具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种犬脂肪干细胞的提取方法，所述包括以下步骤：

步骤1：获得犬腹腔脂肪组织，去除包绕脂肪组织的非脂肪组织，用PBS冲洗处理后的脂肪组织并剪碎；

步骤2：将步骤1获得的脂肪组织用0.1％胶原酶I型37℃震荡消化60～120min后，将消化好的脂肪组织放入冷冻离心机4℃，400～500RCF离心5～10min；

步骤3：去除步骤2离心产物中的上层油脂及上清液，加入适量PBS混匀沉淀，经过100μm细胞筛网过滤，离心并去上清；

步骤4：向步骤3所得离心沉淀加入红细胞裂解液重悬细胞，静置2～5min，加入PBS终止红细胞裂解液的作用，离心并去上清；加入适量DMEM+10％FBS培养液重悬后计数，按接种密度接种于培养瓶中；

步骤5：P0代细胞培养：将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，37℃、5％CO₂及饱和湿度培养24h，使MSCs贴壁，更换培养液去除未贴壁细胞，之后每2～3天更换培养液；待细胞汇合率达70～90％，使用0.25％胰蛋白酶进行常规消化收获得到P0代细胞，用自设冻存程序冻存细胞，建立P0代主细胞库；

步骤6：P1代细胞培养：将所述P0代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO₂培养不超过4天，每2～3天更换培养基；在此期间，在显微镜下观察细胞形态及生长状态，当细胞融合度达到70％～90％后，用胰酶消化收获得到P1代细胞；

步骤7：P2代细胞培养：将所述P1代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到70％～90％，用消化酶消化收获得到P2代细胞；

步骤8：P3代细胞培养：将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到70～90％后，用消化酶消化收获得到P3代细胞。

进一步的，步骤1所述的犬腹腔脂肪组织为腹膜脂肪和/或卵巢双侧脂肪，所述非脂肪组织为血管和/或筋膜。

进一步的，步骤1具体为：无菌条件下手术摘取成年母犬双侧卵巢和/或腹膜上面附着的脂肪组织，用眼科镊子剥除包绕脂肪组织的筋膜和/或血管，在PBS中清洗脂肪组织，去除血污。

进一步的，本发明的犬异体脂肪组织的提取方法还包括步骤9：对所述P3代的脂肪干细胞进行表面抗原检验、分化潜能鉴定、内毒素实验和支原体检查，筛选出表面抗原CD29、MHC-I表达都大于70％，并且表面抗原CD34、CD45表达都小于2％；分化潜能高，能成脂、成骨、成软骨且染色体无异常；且无菌，内毒素、支原体检测阴性的P3代脂肪干细胞。表面抗原检验和筛选指标，说明本发明提取到的细胞符合脂肪干细胞的表面抗原特征，且免疫原性弱；分化潜能鉴定指标，和内毒素实验及支原体检查指标，说明本发明提取的P3代脂肪干细胞分化潜能高且符合注射要求。本发明将提取到的脂肪干细胞进行其特定表面抗原检验，分化潜能鉴定以及内毒素实验及支原体检查，采用三重指标的筛选，确保本发明提取的犬异体脂肪干细胞能用于制备治疗脂肪干细胞制剂，并能够用于治疗与干细胞来源犬体不同的犬体所患的慢性肾病，保证制剂的安全性和有效性。

本发明的第二个目的是提供一种犬脂肪干细胞制剂，所述脂肪干细胞制剂包括前述提取方法步骤9检查筛选的犬异体脂肪干细胞。

进一步的，所述犬脂肪干细胞来源为经过健康筛查的供体成年犬的，非患病犬自身的脂肪干细胞。

进一步的，所述犬异体脂肪干细胞制剂含有的犬异体脂肪干细胞的治疗剂量为1×10⁶细胞/kg～5×10⁶细胞/kg，所述剂量是指每千克(kg)重量的患病犬给予的犬异体脂肪干细胞的个数。

进一步的，以前述提取方法步骤9检查筛选的脂肪干细胞为原料，按照病例所需剂量(1×10⁶细胞/kg～5×10⁶细胞/kg)，用0.5mL～1.0mL生理盐水重悬，吹打均匀后形成细胞悬液，把细胞悬液转移至注射器中，来回推挤直至充分混匀，制作成注射针剂。

本发明的第三个目的是提供前述的犬异体脂肪干细胞提取方法或前述的犬异体脂肪干细胞制剂在制备治疗犬慢性肾病的犬异体脂肪干细胞制剂中的应用。

进一步的，所述治疗犬慢性肾病的犬异体脂肪干细胞制剂为单独使用或与犬慢性肾病常规疗法联合使用。

本发明有益效果在于：

本发明的犬脂肪干细胞(ADSCs)提取方法，

(1)分离方法简单，细胞活力强，容易大量扩增。

(2)采用红细胞裂解液重悬细胞，处理时间2～5min，有助于提高收获的脂肪干细胞的纯度，进一步减少后面细胞培养时的无效细胞。

本发明的犬异体脂肪干细胞制剂及应用：

(1)免疫原性弱，不诱导免疫排斥反应；

(2)通过其抗凋亡、细胞保护和促进血管化等机制来减轻组织损伤和修复病损器官；

(3)不涉及社会、伦理、法律方面的更多争论；

(4)来源充足，无需接受移植者提供自体干细胞，几乎无损伤，更适合治疗老年患病动物；

(5)成本较低。

(6)本发明提供的ADSCs能够有效地治疗犬慢性肾病，说明本发明提取的异体脂肪干细胞以及犬异体脂肪干细胞制剂能广泛用于治疗不同患犬的慢性肾病并且安全有效。

附图说明

图1所示为实施例1提取的脂肪干细胞培养3天时的镜检图(4x10)；

图2所示为实施例2P3代脂肪干细胞培养3天时的镜检图(4x10)；

图3所示为实施例3提取的脂肪干细胞培养进行表面抗原鉴定时的空白对照流式分析图(A为FSC-A波状曲线面积，B为FITC荧光强度，C为PE荧光强度，D为统计表)A为空白对照，B为表面抗原CD29，C为表面抗原CD34，D为表面抗原CD45，E为表面抗原MHC-I)；

图4所示为实施例3提取的脂肪干细胞培养进行表面抗原鉴定时的表面抗原CD29流式分析图(A为FSC-A波状曲线面积，B为FITC荧光强度，C为PE荧光强度，D为统计表)；

图5所示为实施例3提取的脂肪干细胞培养进行表面抗原鉴定时的表面抗原CD34流式分析图(A为FSC-A波状曲线面积，B为FITC荧光强度，C为PE荧光强度，D为统计表)；

图6所示为实施例3提取的脂肪干细胞培养进行表面抗原鉴定时的表面抗原CD45流式分析图(A为FSC-A波状曲线面积，B为FITC荧光强度，C为PE荧光强度，D为统计表)；

图7所示为实施例3提取的脂肪干细胞培养进行表面抗原鉴定时的表面抗原MHC-I流式分析图(A为FSC-A波状曲线面积，B为FITC荧光强度，C为PE荧光强度，D为统计表)

图8所示为实施例3制备的脂肪干细胞培养进行分化潜能鉴定时的细胞培养图(40×)；(A为成骨诱导第7天细胞形态，B为成骨诱导第14天细胞形态，C为成骨诱导第14天茜素红染色结果；D为成软骨诱导第7天细胞形态，E为成软骨诱导第14天阿尔新蓝染色结果；F为成脂诱导第7天细胞形态，G为成脂诱导第21天油红O染色结果。

图9所示为实施例4制备的脂肪干细胞制剂；

图10所示为实施例5尿沉渣染色检查结果，(A为治疗当日，B为常规治疗组治疗28天后，C为MT1组治疗28天后，D为MT2组治疗28天后。)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1犬脂肪干细胞的分离

步骤1：无菌条件下手术摘取成年母犬腹膜和双侧卵巢上面附着的脂肪组织，用生理盐水冲洗脂肪组织，再用医用酒精消毒，将脂肪组织置于保存液中2～8℃恒温保存。用0.9％氯化钠注射液冲洗获得的脂肪组织，重复2～3次，去除血渍。75％乙醇浸没整块脂肪组织消毒灭菌。氯化钠注射液重复洗涤去除残留乙醇。用无菌手术剪将脂肪组织剪成约2～5cm数段，清除脂肪组织小段血管中淤血和凝块。用眼科镊子剥除包绕脂肪组织的筋膜和血管，放入无菌平皿中，加入适量PBS，去除血污并充分剪碎。

步骤2：将步骤1获得的脂肪组织用0.1％胶原酶I型37℃震荡消化60～120min后，将消化好的脂肪组织放入冷冻离心机4℃，400～500RCF离心5～10min；

步骤3：去除步骤2离心产物中的上层油脂及上清液，加入适量PBS混匀沉淀，经过100μm细胞筛网过滤，离心并去上清；

步骤4：向步骤3所得离心沉淀加入红细胞裂解液重悬细胞，静置2～5min，加入PBS终止红细胞裂解液的作用，离心并去上清；加入适量DMEM+10％FBS培养液重悬后计数，按接种密度接种于培养瓶中.

实施例2犬脂肪干细胞的培养

步骤5：P0代细胞培养：将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，37℃、5％CO₂及饱和湿度培养24h，使MSCs贴壁，更换培养液去除未贴壁细胞，之后每2～3天更换培养液；待细胞汇合率达70～90％，使用0.25％胰蛋白酶进行常规消化收获得到P0代细胞，用自设冻存程序冻存细胞，建立P0代主细胞库；

步骤6：P1代细胞培养：将所述P0代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO₂培养不超过4天，每2～3天更换培养基。在此期间，在显微镜下观察细胞形态及生长状态，当细胞融合度达到70％～90％后，用胰酶消化收获得到P1代细胞；

步骤7：P2代细胞培养：将所述P1代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到70％～90％，用消化酶消化收获得到P2代细胞；

步骤8：P3代细胞培养：将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到70～90％后，用消化酶消化收获得到P3代细胞；

实施例3犬脂肪干细胞的鉴定与安全性检查

步骤9：P3代细胞进一步进行特定表面抗原检验，分化潜能鉴定以及内毒素实验和支原体检查，筛选出可以用于制备治疗犬慢性肾病的犬异体脂肪干细胞制剂的P3代细胞。

1、细胞表面抗原鉴定

将实施例2制备得到的P3代ADSCs样品移入相应流式管内，加入1ml PBS充分混匀，500g离心5分钟，弃上清，重复洗涤2次；加入适量PBS混悬细胞，过滤，计数，将细胞浓度调整为(2.0～6.0)×10⁶个/ml待用；取出若干支流式管，加入各组抗体及同型对照试剂(避光操作，具体试剂加样量见表1)；

表1细胞表面抗原鉴定体系

然后将准备好的细胞样品加入已加入抗体试剂的流式管内，每管100μl，充分混匀，置4℃冰箱避光孵育30分钟；孵育完成后每管加入1ml PBS，充分混匀，500g离心5分钟，弃上清液，重复此洗涤过程1次，调整细胞悬液体积至200μl左右，上机检测。

结果如下表2所显示。

表2细胞表面抗原鉴定结果

抗体	百分比	荧光强度(FITC)	荧光强度(PE)
				CD29-PE(human)	99.9	--	5595
CD29-PE(canine)	0.5	--	946
				CD45-FITC(canine)	0.3	1325	--
MHC-I	99.5	3817	--

结果显示：

按本发明获得的脂肪干细胞的表面抗原CD34、CD45表达都小于2％，所述脂肪干细胞的CD29、MHC-I表达都大于70％(图3～图7)。

2、干细胞分化潜能鉴定

2.1操作步骤

细胞解冻后，将用于成骨、成脂以及成软骨诱导分化的细胞分别按照合适密度接种于24孔板(每项诱导做4个孔)，并添加常规培养基培养。24h后观察，当细胞汇合度达到80％以上时，每项诱导选择2个孔，添加相应的诱导培养基作为处理组，而另两个孔更换常规培养基作为对照组，该日期记作D0。随后每三天换液一次。在经过不少于21天的诱导后，用相应的染色试剂盒进行染色(成骨诱导用茜素红；成软骨诱导用阿尔新蓝；成脂诱导用油红O)，以鉴定该样本三系分化的结果。

2.2结果

成骨诱导：在诱导D7天时细胞形态开始发生明显变化(图8A，40×)，D14已有少量钙化结节(成骨标志)产生(图8B，40×)，最终茜素红染色结果可以看到大量红色的钙化结节存在(图8C，40×)。

成软骨诱导：处理组样本D7既已成球(成骨的标志之一)(图8D，40×)，最终可以成功被阿尔新蓝染成蓝色(图8E，40×)。

成脂诱导：处理组样本在诱导D14形态发生明显变化(图8F，40×)，呈收缩状同时出现少量圆球状脂泡(成脂诱导标志之一，诱导成功会形成大量脂滴，并被油红O染成红色)，D21天时细胞收缩明显，脂泡汇聚成大脂滴，经油红O染色后明显被染成红色(图8G，40×)。

3、内毒素实验

使用凝胶法内毒素检测试剂盒进行内毒素实验。该试剂盒用来定量检测革兰氏阴性菌的内毒素。将鲎变形细胞溶解物(LAL)与LAL试剂水混合，加入需要检测的溶液，并确保最终体积相同，孵育一段时间后，若存在内毒素，则溶液发生凝胶化，若不含内毒素，则不会出现此情况。以下为操作方法：

3.1样品制备：

样品I：吸取待检测ADSCs培养基0.2mL，加入0.6mL检查用水稀释至0.8mL；

样品II：吸取样品I 0.2mL，加入0.2mL检查用水稀释至0.4mL；

3.2内毒素标准品制备：

A：吸取细菌内毒素标准品(10EU/支)1支，加入1.0mL检查用水稀释至1mL；

B：吸取A 0.5mL，加入0.5mL检查用水并定容至2mL；

C：吸取B 0.2mL，加入0.8mL检查用水并定容至2.4mL；

D：吸取C 0.2mL，加入0.2mL检查用水并定容至2.0mL；

3.3样品阳性标准液制备：

a：吸取C 0.2mL，加入0.2mL供试液并定容至0.4mL；

3.4阴性对照：检查用水0.4mL；

3.5鲎试剂复溶：按标示量加检查用水，轻轻振摇，不要引起气泡，溶解后10min内使用(即配即用)，加入各处理液，封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃温育60±2min，温育避免震动。

3.6结果判断：

①将试管轻轻取出，缓慢倒转180°，若管内的内容物呈坚实的凝胶，不变形，不从管壁滑脱为阳性；不呈凝胶或虽呈凝胶但不能保持完整并从管壁滑脱为阴性。

②阴性对照为阴性，阳性对照、供试品阳性组为阳性，实验才有效。

内毒素实验为阴性，结果见表3。

表3内毒素实验结果

4、支原体检查

用PCR法进行支原体检查。

4.1溶液配制

A 50×TAE Buffer称取242.0g Tris，37.2g Na₂EDTA·2H₂O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。

B 1×TAE Buffer量取10ml 50×TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。

4.2操作步骤

用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入ControlTemplate进行正对照反应。

4.2.1 1st PCR反应

表4 1st PCR反应混合液配制顺序(50ul体系)

试剂	用量(ul)
		内毒素检查用水	37.75～38.75
10×PCR Buffer	5
		dNTP Mixture	4
MCGp F1Primer	0.5
		MCGp R1Primer	0.5
TaKaRa Taq	0.25

4.2.2向以上反应混合液中分别加入1ul阴性对照样品(内毒素检查用水)，1ul供试品，1ul阳性对照样品(Control Template)和2ul供试品阳性对照(1ul供试品+1ulControl Template)，添加样品时务必防止交叉污染。

为了避免交叉污染，实验过程需分区域操作。在实验区域1完成PCR反应液配置后，先在该实验区域加入1ul内毒素检查用水(阴性对照)，再在实验区域2加入1ul供试品，最后在实验区域3加入1ul ControlTemplate(阳性对照)及“1ul供试品+1ul controlTemplate”(供试品阳性对照)。

4.2.3将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。

94℃30sec

94℃30sec

55℃2min 35 cycles

72℃1min

72℃5min

4.2.4 2nd PCR反应

表5 2nd PCR反应混合液配制顺序

试剂	用量(ul)
		内毒素检查用水	39.25
10×PCR Buffer	5
		dNTP Mixture	4
MCGp F2Primer	0.5
		MCGp R2Primer	0.5
TaKaRa Taq	0.25

4.2.5支原体检查

用水将1st PCR反应产物稀释100倍，取0.5ul加入以上反应混合液中。为了防止交叉污染，加样时需分区域操作，具体加样方式同4.2.2。

4.2.6将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。

94℃30sec

94℃30sec

55℃2min 30 cycles

72℃1min

72℃5min

4.3扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

4.3.1 1％琼脂糖凝胶的制备

称取0.4g Regular Agarose G-10，加入约40ml 1×TAE Buffer(大于40ml)，置于微波炉中中高火加热2min，摇匀，再加热2min。稍微冷却后加入1ul Goldview，振荡摇匀，倒入胶槽中，冷却30min左右直至凝固。取出制备完成的琼脂糖凝胶置于多功能水平电泳槽中，加入1×TAE Buffer直至超过凝胶2mm左右。

4.3.2上样取1st和2nd PCR产物各10ul，加入1.1ul 10×Loading Buffer，混匀后，取10ul上样，用6ul DL5000DNA Marker作为对照。

4.3.3电泳及分析调节电压120V，电泳1h。取出凝胶置于凝胶成像系统，拍照并分析确认扩增片段的有无及片段大小。

4.3.4数据分析

4.4Control实验(阴性对照，阳性对照，供试品阳性对照)

本实验中以内毒素检查用水作为阴性对照样品；以Control Template作为阳性对照样品；以“供试品+Control Template”作为供试品阳性对照样品。使用Control Template时，F1和R1引物扩增产物是810bp，F2和R2引物扩增产物是590bp。当阴性对照结果呈阴性，阳性对照结果呈阳性，此反应系统可行。当供试品阳性对照结果呈阳性，说明待测样品对PCR反应无阻碍；如果供试品阳性对照结果呈阴性，说明检测样品中有阻碍物，建议将检测样品进行DNA提取，再以其作为模板进行扩增。

结果显示样本检测值<6.4×10³copies/ml，低于正常值，说明支原体检查未检查出含支原体核酸的脂肪干细胞。

实施例4：本发明所述脂肪干细胞制剂

以实施例3筛选得到的可以用于制备治疗犬慢性肾病的犬异体脂肪干细胞制剂的P3代ADSCs为原料，按照病例所需细胞量，用0.5mL～1.0mL生理盐水重悬ADSCs，吹打均匀后形成悬液，把细胞悬液转移至注射器中，来回推挤直至充分混匀，形成制剂(图9)。

实施例5脂肪干细胞治疗临床犬慢性肾病的研究

以多例患有CKD 2-3期的犬为研究对象，研究了本发明的犬脂肪干细胞对治疗慢性肾病的有效性。

1、研究对象

于2018年3月至2018年10月南京地区5家有代表性的动物医院收治的临床发病的慢性肾病患犬21例，按照入院顺序随机分为3组，即常规治疗组(NT组，7例)、实施例3筛选的异体脂肪干细胞治疗组(MT1组，7例)、实施例3筛选的异体脂肪干细胞与干细胞与常规疗法混合治疗组(MT2组，7例)；三组患犬的性别、年龄、体重、有无合并疾病、发病时间等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

入选犬应符合以下标准：①经临床检查、实验室检查后，符合CKD诊断标准，且IRISCKD分期处于2-4期，有治疗价；②经常规治疗后，体征稳定；③无其他严重合并性疾病；④畜主同意使用异体ADSCs进行治疗。排除标准：①有肿瘤病史者；②处于IRIS CKD 4期且常规治疗无改善者；③有其他严重合并性疾病者；④畜主不接受ADSCs治疗方案者。

2、分组治疗

常规治疗组予以常规支持疗法，包括根据具体情况补液维持水合状态以及每日喂食肾脏处方粮。

干细胞治疗前10天停用非甾体类抗炎药(NSAIDS)、糖皮质激素和免疫抑制剂。细胞注射后，至少2个月不再使用上述药物。

异体脂肪干细胞治疗组(MT1组)犬按1×10⁶细胞/kg～5×10⁶细胞/kg剂量静脉给予实施例3筛选得到的P3代ADSCs，饮食仍与以前相同且不予以其他支持治疗；

混合治疗组(MT2组)按1×10⁶细胞/kg～5×10⁶细胞/kg剂量静脉给予实施例3筛选得到的P3代ADSCs，并予以常规支持疗法，即根据具体情况补液维持水合状态以及每日喂食肾脏处方粮。

干细胞注射1个月后若血清磷离子、尿素氮及肌酸酐指数未有上升，可再注射一次。

3、血清尿素氮(UREA)及肌酸酐(CREA)检查

于治疗当天及治疗后28天检查接受各组的血清UREA及CREA，观察以上2项指标的变化。

4、血常规检查

于治疗当天及治疗后28天对各组进行血常规检查。于犬颈静脉采血，使用EDTA抗凝。使用全自动血细胞分析仪对采集的EDTA抗凝全血进行血常规检查，主要考察红细胞数(RBC)、血红蛋白量(HGB)及红细胞压积(HCT)。

5、尿沉渣染色

于治疗当天及治疗后28天采用8F导尿管经尿道插入犬膀胱，取出膀胱内尿液，使用尿沉渣染液进行尿沉渣染色，观察尿液中细胞和管型的变化。

6、检查结果

6.1临床表现

6.1.1各组犬在治疗期间的一般状态

常规治疗组犬经治疗后，精神状态有一定改善，反应略迟钝，活动减少，毛色略干，光泽较差，食欲未见明显改善，偶见呕吐，体重增长缓慢；治疗组犬治疗初期与常规治疗组犬有类似表现，其后精神状态改善较多，反应较为灵敏，毛色有光泽，进食正常，体重有所增加，MT2组犬精神状态较MT1组改善更多。

6.1.2治疗过程中犬死亡情况

共入选21只犬，治疗期共28天，常规治疗组7只死亡1只；MT1组犬死亡1只；MT2组犬无死亡。

6.2血清生化检查结果

6.2.1血清尿素氮

治疗前各组血清尿素氮含量之间无显著差异性(P>0.05)。经过ADSCs治疗后，常规治疗组犬尿蛋白排泄显著高于干细胞治疗组犬(P<0.01)，MT2组犬血清尿素氮含量比MT1组犬明显降低(<0.05)，见表6。

与NT组相比，*：P<0.05，**：P<0.01，与MT1组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01。

6.2.2血清肌酐

治疗前各组血清肌酐含量之间无显著差异性(P>0.05)。经过ADSCs治疗后，常规治疗组犬血清肌酐含量显著高于干细胞治疗的MT1、MT2组犬(P<0.01)，MT2组犬血清肌酐含量比MT1组犬明显降低(P<0.05)，见表7。

与NT组相比，*：P<0.05，**：P<0.01，与MT1组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01。

6.3血液检查结果分析

红细胞指数红细胞、血红蛋白和红细胞压积检测值显示治疗当日，各组的红细胞指数均显著低于正常值，各组RBC、HGB、HCT数值之间无显著差异性(P>0.05)，见表8，提示各组CKD病犬正在处于贫血状态。临床检查发现患病动物表现可视黏膜苍白、毛细血管再充盈时间延长(>2S)等提示贫血的症状，与血常规检查结果相一致。而血涂片观察显示为正色素正细胞性贫血，推测是由于肾脏功能下降，产生促红细胞生成素的功能不足，导致红细胞生成不足，而氮血症能使红细胞膜不稳定，加快其凋亡时间，可能加重了贫血的情况。

经过ADSCs治疗后，治疗组(MT1、MT2)犬血液RBC、HGB、HCT的含量比常规组犬明显增加(P＜0.02)。但MT2组犬血液HGB和HCT的含量比MT1组犬的明显增加(P＜0.05)，提示接受ADSCs治疗可改善血液RBC、HGB、HCT的含量，这可能是肾损伤得到了缓解，肾脏分泌促红细胞生成素(EPO)的能力改善的原因。

与NT组相比，*：P<0.05，**：P<0.01，与MT1组相比，▲：P<0.05，▲▲：P<0.01。

6.4尿沉渣染色检查结果

治疗当日各组尿沉渣染色镜检，视野内均可见较多肾小管上皮细胞，提示肾慢性损伤(图10A)，治疗28天后，常规治疗组尿沉渣染色镜检，视野内可见大量肾小管上皮细胞以及上皮管型，提示存在严重的肾慢性损伤(图10B)；MT1组和MT2组尿沉渣染色镜检，视野内只观察到少量肾小管上皮细胞，未见管型，提示肾损伤得到缓解(图10C、D)

由以上实施例证实，用本发明制备的脂肪干细胞(ADSCs)及犬异体脂肪干细胞制剂能够单独使用或者与犬慢性肾病常规疗方法联合使用，均能够有效地治疗犬慢性肾病。

利用本发明制备的脂肪干细胞(ADSCs)具有不同于现有技术的优点：

(1)免疫原性弱，不诱导免疫排斥反应；

(2)通过其抗凋亡、细胞保护和促进血管化等机制来减轻组织损伤和修复病损器官；

(3)不涉及社会、伦理、法律方面的更多争论；

(4)来源充足，无需接受移植者提供自体干细胞，几乎无损伤，更适合治疗老年患病动物；

(5)分离方法简单，细胞活力很强，容易大量扩增。例如，根据本发明的上述工艺，每1瓶P0代细胞(5×10⁶细胞/瓶)，传代至P3代并继续培养，汇合率到70％～90％后收获，可获得125瓶(5×10⁶细胞/瓶)。

本发明提供的ADSCs能够有效地治疗犬慢性肾病。

Claims (10)

1.一种犬脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，所述包括以下步骤：

步骤1：获得犬腹腔脂肪组织，去除包绕脂肪组织的非脂肪组织，用PBS冲洗处理后的脂肪组织并剪碎；

步骤2：将步骤1获得的脂肪组织用0.1％胶原酶I型37℃震荡消化60～120min后，将消化好的脂肪组织放入冷冻离心机4℃，400～500RCF离心5～10min；

步骤3：去除步骤2离心产物中的上层油脂及上清液，加入适量PBS混匀沉淀，经过100μm细胞筛网过滤，离心并去上清；

步骤4：向步骤3所得离心沉淀加入红细胞裂解液重悬细胞，静置2～5min，加入PBS终止红细胞裂解液的作用，离心并去上清；加入适量DMEM+10％FBS培养液重悬后计数，按接种密度接种于培养瓶中；

步骤5：P0代细胞培养：将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，37℃、5％CO₂及饱和湿度培养24h，使MSCs贴壁，更换培养液去除未贴壁细胞，之后每2～3天更换培养液；待细胞汇合率达70～90％，使用0.25％胰蛋白酶进行常规消化收获得到P0代细胞，用自设冻存程序冻存细胞，建立P0代主细胞库；

步骤6：P1代细胞培养：将所述P0代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱37℃、5％CO₂培养不超过4天，每2～3天更换培养基；在此期间，在显微镜下观察细胞形态及生长状态，当细胞融合度达到70％～90％后，用胰酶消化收获得到P1代细胞；

步骤7：P2代细胞培养：将所述P1代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到70％～90％，用消化酶消化收获得到P2代细胞；

步骤8：P3代细胞培养：将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到70～90％后，用消化酶消化收获得到P3代细胞。

2.根据权利要求1所述的犬脂肪组织的提取方法，其特征在于，步骤1所述的犬腹腔脂肪组织为腹膜脂肪和/或卵巢双侧脂肪，所述非脂肪组织为血管和/或筋膜。

3.根据权利要求1所述的犬脂肪组织的提取方法，其特征在于，步骤1具体为：无菌条件下手术摘取成年母犬双侧卵巢和/或腹膜上面附着的脂肪组织，用眼科镊子剥除包绕脂肪组织的筋膜和/或血管，在PBS中清洗脂肪组织，去除血污。

4.根据权利要求1至3任一项所述的犬脂肪干细胞的提取方法，其特征在于，还包括步骤9：对所述P3代的脂肪干细胞进行表面抗原检验、分化潜能鉴定、内毒素实验和支原体检查，筛选出表面抗原CD29、MHC-I表达都大于70％，并且表面抗原CD34、CD45表达都小于2％；分化潜能高，能成脂、成骨、成软骨且染色体无异常；且无菌，内毒素、支原体检测阴性的P3代脂肪干细胞。

5.一种犬异体脂肪干细胞制剂，其特征在于，所述脂肪干细胞制剂包括权利要求4所述提取方法检查筛选的犬脂肪干细胞。

6.根据权利要求5所述的犬异体脂肪干细胞制剂，其特征在于，所述犬脂肪干细胞来源为经过健康筛查的供体成年犬的脂肪干细胞。

7.根据权利要求5所述的犬异体脂肪干细胞制剂，其特征在于，所述犬异体脂肪干细胞制剂含有的犬脂肪干细胞的治疗剂量为1×10⁶细胞/kg～5×10⁶细胞/kg，所述剂量是指每千克(kg)重量的患病犬给予的犬异体脂肪干细胞的个数。

8.根据权利要求5所述的犬异体脂肪干细胞制剂，其特征在于，以权利要求4所述提取方法检查筛选的脂肪干细胞为原料，按照病例所需剂量，用0.5mL～1.0mL生理盐水重悬，吹打均匀后形成细胞悬液，把细胞悬液转移至注射器中，来回推挤直至充分混匀，制作成注射针剂。

9.权利要求1至4任意一项所述的犬脂肪干细胞提取方法或权利要求5至8任一项所述的犬异体脂肪干细胞制剂在制备治疗犬慢性肾病的犬异体脂肪干细胞制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述治疗犬慢性肾病的犬异体脂肪干细胞制剂为单独使用或与犬慢性肾病常规疗方法联合使用。