CN106566802A

CN106566802A - 一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法

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Publication number: CN106566802A
Application number: CN201610780108.6A
Authority: CN
Inventors: 崔超; 罗光会; 杜丽英; 王伟; 周国梅
Original assignee: Shandong Jingyuan Biotech Co Ltd
Current assignee: Shandong Jingyuan Biotech Co Ltd
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2017-04-19

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的试剂盒由独立包装的如下组分组成，1瓶细胞培养液A（95 ml），1瓶细胞培养液B（5 ml）和1瓶细胞洗涤液（100 ml）。本发明脐血间充质干细胞培养试剂盒能够提高脐血间充质干细胞原代细胞传代时间，并保持脐血间充质干细胞多次传代后依然保持其细胞的全能性，而且降低了免疫原性并增强了使用安全性。

Description

一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种新型脐血间充质干细胞的培养方法。

背景技术

脐血间充质干细胞是从脐带中分离纯化得到的一种具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，因其具有来源容易，易于分离、扩增、保存和运输，用于人体无异体排斥性反应，能够避免伦理的争议等诸多优点而被广泛用于细胞疗法的理想细胞，拥有广阔的临床应用前景，将成为治疗人类由衰老和病变引起的组织器官损伤的一种有效手段。

目前，国内外大多数实验室仍然使用经典的DMEM培养基加上10 %胎牛血清进行脐血间充质干细胞的培养，其中所使用的胎牛血清具有以下潜在风险：第一，所培养的脐带间充质干细胞会有感染朊病毒或者某些未知动物传染病的风险；第二，在细胞培养过程中，胎牛血清中含有的动物源蛋白或肽很有可能对脐带间充质干细胞产生免疫排斥反应，甚至输注患者体内也会无明显治疗效果；第三，在市场上，胎牛血清的质量鱼龙混杂，部分胎牛血清甚至会含有病毒，它将会对患者疾病的治疗带来极大地副作用。

为了解决胎牛血清培养脐血间充质干细胞过程中所存在的缺点，我们找到了胎牛血清的替代物------人血小板裂解物。人血小板裂解物含有血小板衍生生长因子AB，表皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1等多种细胞因子，而且这些细胞因子对于脐血间充质干细胞的增殖起到明显的促进作用。

人血小板裂解物可以使体外分离的脐血间充质干细胞非分化性增殖能力得以提高，并保证其具有多向分化潜能。人血小板裂解物替代物培养脐带间充质干细胞是一种大量、快速和高效获得干细胞的新途径和新方法，它为脐血间充质干细胞的临床应用和科研试验奠定了坚实的理论基础。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的是替代现有脐血间充质干细胞培养基中的不足，人血小板裂解物可以完全取代胎牛血清从而更好的使脐血间充质干细胞生长增殖，这种方法使脐血间充质干细胞体外培养与大规模扩增成为可能。

本发明的技术方案是：一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的试剂盒由独立包装的如下组分组成，1瓶细胞培养液A（95 ml），1瓶细胞培养液B（5 ml）和1瓶细胞洗涤液（100 ml），

细胞培养液A的制备：首先，打开呈现粉末状的DMEM培养基，并称取3.7 g NaHCO₃，一同加入到800 ml三蒸水中，搅拌至溶解，再加入100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素，随后pH调至7.2-7.4，再用0.22 μm 滤器过滤除菌，并用无菌水补至1000 ml，最后混匀，4 ℃保存，待用；

细胞培养液B的制备：收集某医院新鲜采集、经检测达到临床用血标准的多人份机采血小板，使其浓度为1.0×10¹²细胞/L，将所获样本置-80 ℃冰箱过夜，次日使其置于37 ℃水浴至融，这一过程反复5次，4 ℃，3000 r/min，离心30 min，取上清液，0.22 μm过滤，并添加含有5 % 10 U/ml 肝素钠的DMEM培养基。

细胞洗涤液的制备：称取9 g NaCl，溶于800 ml三蒸水中，再定容至1000 ml，高压灭菌，4 ℃保存，待用。

细胞培养液A和细胞培养液B1:1混匀后使用；细胞洗涤液是在培养过程中洗涤细胞用。

脐血间充质干细胞培养试剂盒包括细胞培养液A，细胞培养液B和细胞洗涤液；细胞培养液A为DMEM培养基；细胞培养液B为人血小板裂解物；细胞洗涤液为0.9 %的生理盐水；细胞培养液A，细胞培养液B和细胞洗涤液均为无菌，并各自独立包装。

DMEM培养基是 dulbecco's modified eagle medium的缩写；

DMEM的特性：

(1)氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等;

(2)维生素含量为依格尔培养基的4倍;

(3)含有糖酵解途径中的重要物质------丙酮酸;

(4)含有微量的铁离子。

本发明的优点是脐血间充质干细胞培养试剂盒能够提高脐血间充质干细胞原代细胞传代时间，并保持脐血间充质干细胞多次传代后依然保持其细胞的全能性。与胎牛血清相比，人血小板裂解物用于体外培养脐血间充质干细胞的细胞形态，细胞增殖率，免疫表型，分化能力等基本生物学特性没有影响，这说明脐血间充质干细胞培养试剂盒能够满足脐血间充质干细胞的培养要求，而且降低了免疫原性并增强了使用安全性。人血小板裂解物扩增的脐血间充质干细胞形态细长，呈现成纤维样，漩涡状或呈平行排列生长，与胎牛血清组无差别（图1）。人血小板裂解物组与胎牛血清组相比，P1-P3代脐血间充质干细胞的增殖能力无明显差异，但是P4-P5代脐血间充质干细胞的增殖能力差异显著，尤其是P5代（图2）。人血小板裂解物组与胎牛血清组相比，流式细胞术检测结果显示两组脐血间充质干细胞的CD73，CD90和CD105阳性表达均不低于95 %，CD34，CD45和HLA-DR阴性表达均不高于2 %（图3）。脐血间充质干细胞具有多分化潜能，脐血间充质干细胞可以分化为成骨细胞和成脂细胞，其中成骨细胞的特异性基因是RUNT相关转录因子2（RUNX-2）和碱性磷酸酶（ALPL）；成脂细胞的特异性基因是过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR）和脂蛋白脂肪酶（LPL）。使用实时定量PCR检测脐血间充质干细胞分化后成骨细胞（图4）和成脂细胞（图5）的特异性基因表达情况。使用ELISA检测脐血间充质干细胞分化后成骨细胞（图6）和成脂细胞的特异性蛋白表达情况。

附图说明

图1是脐血间充质干细胞的增殖能力。

数据代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

图2是流式细胞仪分析脐血间充质干细胞的细胞表型。

数据代表± SEM。n=3。

图3是实时定量PCR检测脐血间充质干细胞分化后成骨细胞的特异性基因表达情况。

数据代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

图4实时定量PCR检测脐血间充质干细胞分化后成脂细胞的特异性基因表达情况。数据代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

图5是ELISA检测脐血间充质干细胞分化后成骨细胞的特异性蛋白表达情况。

数据代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

图6是ELISA检测脐血间充质干细胞分化后成脂细胞的特异性蛋白表达情况。数据代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

具体实施方式

一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的试剂盒由独立包装的如下组分组成，1瓶细胞培养液A（95 ml），1瓶细胞培养液B（5 ml）和1瓶细胞洗涤液（100 ml），

细胞培养液B的制备：收集某医院新鲜采集、经检测达到临床用血标准的多人份机采血小板，使其浓度为1.0×10¹²细胞/L，将所获样本置-80 ℃冰箱过夜，次日使其置于37 ℃水浴至融，这一过程反复5次，4 ℃，3000 r/min，离心30 min，取上清液，0.22 μm过滤，并添加含有5 % 10 U/ml 肝素钠的DMEM培养基（全称）。

2、一种如权利要求1所述的脐血间充质干细胞培养试剂盒的使用方法，其特征在于：

脐血取自健康足月剖腹产孕妇，=用含15 mmol/L柠檬酸钠、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的150 ml无菌瓶运至实验室；倒入离心管中，梯度离心，收集上层血浆，加入脐血间充质干细胞培养液，置于5 %CO₂的37 ℃细胞培养箱中进行培养。2天后换液，去除非贴壁细胞，以后每周换液2次。按2000个细胞/cm²的浓度进行传代，使用第5代脐血间充质干细胞进行后续试验。

1、增殖能力检测

用CCK-8法检测细胞增殖情况。在96孔板中接种细胞悬液（100 μl/孔），将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37 ℃，5 % CO₂）。向每孔加入10 μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

2、形态学观察

用倒置相差显微镜观察脐血间充质干细胞的形态学变化。

3 、细胞表面抗原鉴定

流式细胞仪进行细胞表面抗原CD73，CD90，CD105，CD34，CD45和HLA-DR的鉴定。

4 、细胞分化鉴定

分别使用成骨诱导体系和成脂诱导体系进行脐血间充质干细胞的分化，其中成骨诱导体系为：DMEM培养基添加体积分数10 %胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，50 mg/L抗坏血酸和0.01 mol/L β-甘油磷酸钠；成脂诱导体系为：DMEM培养基添加体积分数10 %胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，10 mg/L胰岛素，0.5 mmol/L IBMX和0.1 mmol/L 吲哚美辛。

3.5 RNA的提取和实时定量PCR检测

提取脐血间充质干细胞分化后细胞总RNA，取1μg总RNA反转录为cDNA作为实时定量PCR的模板。所使用的引物序列如下所示。

基因：RUNX-2、ALPL、PPAR、LPL、β-actin；引物序列：上游引物：5’-GGA GTG GAC GAGGCA AGA GTT T-3’下游引物：5’-AGC TTC TGT CTG TGC CTT CTG G-3’；上游引物：5’-GGGAAC GAG GTC ACC TCC AT-3’下游引物：5’-TGG TCA CAA TGC CCA CAG AT-3’；上游引物：5’-GGG AAC GAG GTC ACC TCC AT-3’下游引物：5’-TGG TCA CAA TGC CCA CAG AT-3’；上游引物：5’-GGC TTC ATG ACA AGG GAG TTT C-3’下游引物：5’-AAC TCA AAC TTG GGC TCCATA AAG-3’ ；上游引物：5’-GAG GTA CTT TTC AGC CAG GAT GTA AC-3’下游引物：5’-AGCTGG TCC ACA TCT CCA AGT C-3’ ；上游引物：5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’下游引物：5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’；序列号：XM_011514966.2、XM_017000903.1 、XM_011533842.2、NM_000237.2、NM_001101.3；Tm (℃)：62.5、60.5、59.5、62.0、61.5；产物长度(bp)：133、67、74、82、205。

5、ELISA检测

使用ELISA试剂盒检测RUNX-2，ALPL，PPAR和LPL的蛋白含量。

6. 统计方法

所有结果用mean ± SEM表示。使用ANOVA方法进行数据分析，它属于Tukey 的一种多重比较法。当P < 0.05时，结果有显著性差异。

实验结果

11 细胞形态学结果

在倒置相差显微镜下观察分别接种于人血小板裂解物培养基和胎牛血清培养基的脐血间充质干细胞的形态学变化，实验结果显示这两种培养基中的脐血间充质干细胞的形态相对均一，呈长梭形，漩涡状或呈平行排列生长，两者形态相似。

1.2 细胞增殖能力结果

使用CCK-8方法检测接种于人血小板裂解物培养基和胎牛血清培养基的脐血间充质干细胞的细胞增殖能力，实验结果显示P1-P3代这两种培养基的脐血间充质干细胞的细胞增殖能力无差异，但是从P4代开始这两种培养基的脐血间充质干细胞的增殖能力出现差异，P5代这两种培养基的脐血间充质干细胞的增殖能力差异具有显著性，人血小板裂解物培养基培养的脐血间充质干细胞的增殖能力明显高于胎牛血清培养基培养的脐血间充质干细胞的增殖能力（图1）。

1.3 细胞表型检测结果

使用流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的细胞表型，实验结果显示人血小板裂解物培养基和胎牛血清培养基的脐血间充质干细胞都阳性表达CD73，CD90和CD105，且不低于95%，阴性表达CD34，CD45和HLA-DR，且不高于2 %（图2）。

1.4 脐血间充质干细胞分化后的基因检测结果

使用实时定量PCR方法检测成脐血间充质干细胞分化后的成骨细胞（RUNX-2和ALPL）和成脂细胞（PPAR和LPL）的特异性基因表达情况。人血小板裂解物培养基与胎牛血清培养基对比，实验结果显示人血小板裂解物培养基培养的脐血间充质干细胞的成骨细胞特异性基因RUNX-2和ALPL的表达量均高于胎牛血清培养基的脐血间充质干细胞（图3）。成脂细胞特异性基因PPAR和LPL实时定量PCR的结果与成骨细胞特异性基因RUNX-2和ALPL的结果一致（图4）。

1.5 脐血间充质干细胞分化后的蛋白检测结果

使用ELISA试剂盒检测成骨细胞特异性蛋白RUNX-2和ALPL（图5）以及成脂细胞特异性蛋白PPAR和LPL（图6）的表达情况，实验结果显示与实时定量PCR的结果相一致。

Claims

1.一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的试剂盒由独立包装的如下组分组成，1瓶细胞培养液A95 ml，1瓶细胞培养液B5 ml和1瓶细胞洗涤液100ml，

2.细胞洗涤液的制备：称取9 g NaCl，溶于800 ml三蒸水中，再定容至1000 ml，高压灭菌，4 ℃保存，待用。

3.一种如权利要求1所述的脐血间充质干细胞培养试剂盒的使用方法，其特征在于：细胞培养液A和细胞培养液B1:1混匀后使用；细胞洗涤液是在培养过程中洗涤细胞用。