CN113073078A - 脐带来源间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法 - Google Patents

脐带来源间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脐带来源的间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法，所述方法包括：提供脐带来源的间充质干细胞；对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理，制备血小板制剂；其中，所述血小板为低免疫原性的通用型血小板。该制备方法便于操作，制剂便于保存，基本可以做到随用随取；此外，采用该方法制备的血小板制剂通用性好，能够有效减少免疫因素带来的输注无效的问题，有利于提高输注效率。

Description

脐带来源间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种脐带来源的间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法。
背景技术
血小板输注(Platelet transfusion，PLT)疗法在临床上主要用于预防和治疗血小板数量减少或者功能异常所导致的出血，从而恢复和维持机体的止血和凝血功能。
现有技术中，临床输注用血小板制剂依赖献血志愿者通过血细胞单采机进行单采血小板获取，单采获取的血小板制剂保质期很短，一般在4到5天。至今，业内尚未开发出可以长期保存具有治疗效果的血小板方法，因此，考虑到检验和运输必需消耗的时间后，血小板制剂的体外保存时间一般在3天左右。与此同时，血小板输注在临床应用上还存在输注无效的情况，尽管首次输注时可以使用与患者不同类型的人白细胞抗原(HLA)的血小板，但当重复输血时，患者体内会产生针对相应HLA的特异性抗体，使得血小板在输注后迅速失效并被排斥。而且，血小板本身还具有特异性的人血小板抗原(HPA)，异体HPA同样也会导致血小板输注后迅速被排斥失效，造成免疫性输注无效的问题。
在这种情况下，已有相关研究者着手开发体外诱导成血小板的技术开发，但相关技术需要进行HLA和/或HPA配型来避免生产的血小板出现输注无效的情况，操作复杂，材料来源受限。更重要的是，从获取用于诱导产生血小板的材料到制备所需时间至少在8周以上，处理周期长。此外，在某些情况下，用于诱导产生血小板的材料价格高昂，材料需要从患者身上获取、诱导阶段可控性较差。因此，开发异体来源的、低(无)免疫原性、可以随需随取、随取随用的人造血小板实在必行。
可见，现有技术有待进一步改进。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请公开了一种脐带来源的间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法，能够解决现有技术中制备的血小板通用性差及制备和保存不方便的问题。
本发明的技术方案如下：
一种脐带来源的间充质干细胞制备通用型血小板的方法，其中，所述方法包括：提供脐带来源的间充质干细胞；对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理，得到血小板制剂；其中，所述血小板为低免疫原性的通用型血小板。
其中，对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理之前，所述方法包括：对获取的新鲜脐带进行剥离获取华通氏胶，并在原代培养基上对所述华通氏胶进行原代培养，得到原代培养细胞；对所述原代培养细胞进行扩增，得到扩增后的细胞用于后续操作。
其中：所述扩增后的细胞的细胞代数为P3到P5之间，在所述后续操作进行的前一天，所述增后的细胞细胞融合度大于85％，并培养在37摄氏度，CO2浓度为5％的培养箱中。
其中，所述对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理的方法包括：对所述脐带来源的间充质干细胞进行成脂诱导处理和血小板诱导处理。
其中，所述成脂诱导处理中的成脂诱导因子包括：胰岛素、谷氨酰胺、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、罗格列酮、地塞米松、胎牛血清中的一种或以上的组合。
其中，所述方法包括：在成脂诱导培养基上对所述扩增后的干细胞培养10-20天，得到成脂诱导后的细胞，其中，所述成脂培养基包括：0.1-1.0mM的吲哚美辛、0.2-2.0mM的IBMX、0.2-2.0mM的罗格列酮、0.5-4.0μM的地塞米松、2.0-30μg/ml的胰岛素、2-10mM的谷氨酰胺或体积比例为2.0-15.0％的胎牛血清中的至少一种。
其中，所述血小板诱导处理中的血小板诱导因子包括：促血小板生成素、低密度脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、胎牛血清、牛血清蛋白、复合核糖核苷酸、β-巯基乙醇、人白细胞介素3、人白细胞介素6、人白细胞介素11、干细胞生长因子中的一种或以上的组合。
其中，所述方法还包括包括：在血小板诱导培养基上对所述成脂诱导后的细胞培养4-16天，得到血小板诱导后的细胞，其中，所述血小板培养基包括：10-200ng/ml的促血小板生成素、2-20μg/ml的低密度脂蛋白、10-1000μg/ml的转铁蛋白、10-100μM的复合核糖核苷酸(ATP、UTP、CTP、GTP)、20-200μM的β-巯基乙醇、2-100μg/ml的人白细胞介素3、10-200μg/ml的人白细胞介素6、2-50μg/ml的人白细胞介素11、20-200ng/ml的干细胞生长因子、5.0-40μg/ml的胰岛素、体积比例为0.1-10.0％的胎牛血清或体积比例为1-5％的牛血清蛋白中至少一种。
其中，所述方法还包括：对所述诱导处理后的细胞培养液进行离心，收集血小板并进行检测，得到血小板制剂。
为解决上述技术问题，本申请还公开了：
一种脐带来源的间充质干细胞制备的通用型血小板制剂，其中，所述血小板制剂采用上述的方法制备，所述血小板制剂特异性具有间充质干细胞表面标志物CD90，同时低表达和/或不表达人白细胞抗原，并表达CD42b血小板成熟标志物，不表达CD62P血小板激活标志物。
区别于现有技术的，本申请通过对脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理，得到的低免疫原性的通用型血小板。由于制备血小板的材料并非血细胞，保存较为方便，可以做到随用随取；同时，由于制备的血小板免疫原性低，能够有效避免输注无效的问题，有利于提高输注效率。
附图说明
图1是本申请一种脐带来源的间充质干细胞制备通用型血小板的方法第一实施方式的流程示意图；
图2是本申请实施例1中血小板诱导阶段不同诱导天数的血小板的流式检测结果图；
图3是本申请实施例1中血小板诱导阶段的D14的巨核细胞照片。
图4是本申请实施例1中血小板诱导阶段不同诱导天数巨核细胞相关基因表达结果图；
图5是本申请实施例1中血小板诱导阶段D16血小板凝集试验结果图；
图6是本申请实施例1中血小板诱导阶段后收集的血小板通过流式细胞术进行HLA-DR表面标志物检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
请参考图1，本申请公开了一种脐带来源的间充质干细胞制备通用型血小板的方法，其中，所述方法包括：
S100、提供脐带来源的间充质干细胞。
S200、对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理，得到血小板制剂；其中，所述血小板为低免疫原性的通用型血小板。
本实施方式通过对脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理，得到的低免疫原性的通用型血小板。由于制备血小板的材料并非血细胞，保存较为方便，可以做到随用随取；同时，由于制备的血小板免疫原性低，能够有效避免输注无效的问题，有利于提高输注效率。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)最初是从骨髓中分离得到的非造血类的干细胞，它参与构成骨髓造血微环境，对造血干细胞的增殖与分化具有明显的支持作用，具有低免疫原性及高免疫调节能力、也具备多向分化潜能，可以在多种不同疾病方向上发挥临床治疗作用。MSCs来源广泛，可从骨髓、脐带、脂肪、胎盘、牙髓等组织中获得，其中人脐带来源MSCs(hUC-MSCs)因其来源广泛、取材简易、没有伦理问题等优势，在临床试验中备受青睐。在分化潜能上，间充质干细胞也是具有巨大潜力的。MSCs天然具备三系潜能，可以通过诱导分化为成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞。同时也可以通过其他小分子物质诱导分化成生殖细胞、血管细胞、上皮细胞等。
本申请以脐带来源的间充质干细胞为材料，在不改变细胞基因结构、不引入外源转录因子的前提下，保证整个分化系统的稳定性和安全性。由于同时使用多种因子的方式进行细胞分化，可以有效节约成本，便于质量控制；也即通过多阶段多因子的调控，获得低免疫原性的血小板。
进一步的，由于制备的血小板为低免疫原性，则所述脐带来源的间充质干细胞可以是自体来源的，也可以是异体来源的。不需要进行人白细胞抗原(HLA)和/或特异性的人血小板抗原(HPA)配型来避免生产的血小板出现输注无效的情况。在本实施方式中，由于制备血小板的材料来源广泛，可以根据需求提前准备，基本可以做到随用随取，制备和保存都非常方便。
输注无效是血小板输注过程中非常棘手的问题。如，经过造血干细胞移植的患者，在移植后的会产生持续性的血小板减少，这种情况下，很难通过血小板配型来避免输注无效的情况，患者体内存在异体来源的血小板，极易产生排斥反应，被机体代谢，所以接受造血干细胞移植的患者需要输注与自身配型相符的血小板时，很难再通过配型获得相应的血小板制品，血小板输注无效的概率大大提高，只能通过多次输注以提高体内血小板含量。血小板输注无效的现象，对患者来说不仅增加了治疗费用，也延长了患者的治疗时间和治疗风险。同时，频繁出现血小板输注无效的情况，也极大的增加了医疗成本和医疗资源的浪费。对长期需要进行血小板输注的患者，血小板输注无效降低了愈后的生活幸福感，增加了经济负担。
因此，本申请制备的低免疫原性的通用型血小板意义重大，所述血小板制剂特异性具有间充质干细胞表面标志物CD90，同时低表达和/或不表达HLA，并表达CD42b血小板成熟标志物，不表达CD62P血小板激活标志物。这意味着，输注无效的问题得到了有效的解决，能够显著提高输注效率，更好的满足使用需求。
在一个实施方式中，对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理之前，所述方法包括：对获取的新鲜脐带进行剥离获取华通氏胶，并在原代培养基上对所述华通氏胶进行原代培养，得到原代培养细胞；对所述原代培养细胞进行扩增，得到扩增后的细胞用于后续操作。具体的，新鲜脐带在知情同意的前提下获取，对剥离获取的华通氏胶进行剪碎处理，并采用贴壁法进行培养，所述原代培养基为无血清培养体系，包括：DMEM/F11和市售MSCs培养因子。进一步的，所述扩增后的细胞的细胞代数为P3到P5之间，在所述后续操作进行的前一天，所述增后的细胞细胞融合度大于85％，并培养在37摄氏度，CO2浓度为5％的培养箱中。
在另一个实施方式中，所述对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理的方法包括：对所述脐带来源的间充质干细胞进行成脂诱导处理和血小板诱导处理。其中，所述成脂诱导处理中的成脂诱导因子包括：胰岛素、谷氨酰胺、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、罗格列酮、地塞米松、胎牛血清中的一种或以上的组合。所述血小板诱导处理中的血小板诱导因子包括：促血小板生成素(TPO)、低密度脂蛋白(LDL)、转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、胎牛血清(FBS)、牛血清蛋白(BSA)、复合核糖核苷酸(NTP)、β-巯基乙醇、人白细胞介素3(IL-3)、人白细胞介素6(IL-6)、人白细胞介素11(IL-11)、干细胞生长因子(SCF)中的一种或以上的组合。
在本实施方式中，通过定量和/或定时地调控普通脐带间充质干细胞的表达，来产生低免疫原性的通用型血小板。通过多阶段、多因子组合的方法，对普通脐带间充质干细胞按时序性分阶段定量和/或定时调控其表达。具体的，以多因子调节JAK/STAT信号通路、PI3K/Akt信号通路、Ras/MAPK信号通路、Wnt信号通路、TGF-β/BMPs信号通路、Hedgehog信号通路等的基因或蛋白表达水平，改变细胞不同代谢途径，从而诱导脐带间充质干细胞向脂肪前体细胞分化再向巨核细胞分化，最终产生血小板。
在一个具体的实施方式中，所述成脂诱导的方法包括：在成脂诱导培养基上对所述扩增后的干细胞培养10-20天，如：10天、15天或20天等，得到成脂诱导后的细胞，其中，所述成脂培养基包括：0.1-1.0mM的吲哚美辛，如：0.1mM、0.5mM或1.0mM等；0.2-2.0mM的IBMX，如：0.2mM、1.0mM或2.0mM等；0.2-2.0mM的罗格列酮，如：0.2mM、1.0mM或2.0mM等；0.5-4.0μM的地塞米松，如：0.5mM、2.0mM或4.0mM等；2.0-30μg/ml的胰岛素，如：2μg/m、18μg/m或30μg/m等；2-10mM的谷氨酰胺，如：2mM、6mM或10mM等；或体积比例为2.0-15.0％的胎牛血清，如：0.2％、1.0％或2.0％等；中的至少一种。
其中，所述方法还包括包括：在血小板诱导培养基上对所述成脂诱导后的细胞培养4-16天，如：4天、10天或16天等，得到血小板诱导后的细胞，其中，所述血小板培养基包括：10-200ng/ml的促血小板生成素，如：10ng/ml、120ng/ml或200ng/ml等；2-20μg/ml的低密度脂蛋白，如：2μg/ml、11μg/ml或20μg/ml等；10-1000μg/ml的转铁蛋白，如：10μg/ml、500μg/ml或1000μg/ml等；10-100μM的复合核糖核苷酸(ATP、UTP、CTP、GTP)，如：10μM、50μM或100μM等；20-200μM的β-巯基乙醇，如：20μM、100μM或200μM等；2-100μg/ml的人白细胞介素3，如：2μg/ml、50μg/ml或100μg/ml等；10-200μg/ml的人白细胞介素6，如：10μg/ml、100μg/ml或200μg/ml等；2-50μg/ml的人白细胞介素11，如：2μg/ml、25μg/ml或50μg/ml等；20-200ng/ml的干细胞生长因子，如：20ng/ml、120ng/ml或200ng/ml等；5.0-40μg/ml的胰岛素，如：5μg/ml、23μg/ml或40μg/ml等；体积比例为0.1-10.0％的胎牛血清或体积比例为1-5％的牛血清蛋白，如：1％、3％或5％等；中至少一种。
从上述多阶段诱导过程可知，诱导过程总时间约14-36天，约2-5周，处理时间短，过程可控性较好，获取血小板的过程高效可控。
进一步的，所述方法还包括：对所述诱导处理后的细胞培养液进行离心，收集血小板并进行检测，得到血小板制剂。具体的，取诱导过程结束后的培养液进行离心，取上清液过滤后再次离心，收集离心沉淀并用血小板保存液进行保存和重悬。最后，对保存液中的血小板进行性能检测，如，凝集功能检测等。
为解决上述技术问题，本申请还公开了：一种脐带来源的间充质干细胞制备的通用型血小板制剂，其中，所述血小板制剂采用上述的方法制备，所述血小板制剂特异性具有间充质干细胞表面标志物CD90，同时低表达和/或不表达人白细胞抗原，并表达CD42b血小板成熟标志物，不表达CD62P血小板激活标志物。
本实施方式通过多阶段、多因子诱导普通脐带间充质干细胞，制备得到通用型血小板。所述通用型血小板特点在于特异性具有间充质干细胞表面标志物CD90，同时低表达和/或不表达HLA，并表达CD42b血小板成熟标志物，不表达CD62P血小板激活标志物；所述通用型血小板，可解决患者极易面临由于HLA和/或HPA抗原排斥导致的血小板输注无效问题，提高患者疾病的治疗效果，起到预防或治疗的作用。
下面通过具体的实施例对本申请的技术方案进行阐释：
实施例1:
1.脐带间充质干细胞的制备
1.1在知情同意下，获取新鲜的脐带进行剥离获取华通氏胶，对华通氏胶进行剪碎后，采用贴壁法，在无血清培养体系进行原代细胞培养，所述无血清培养体系为：DMEM/F11+市售MSCs培养因子。
1.2对原代脐带间充质干细胞进行扩增，细胞代数在P3-P5之间，用于进行向成脂诱导转化，启动诱导前一天(Day-1)，细胞融合度应大于85％以上并培养于37℃、5％CO2的培养箱中。
2.诱导阶段
2.1成脂诱导阶段
2.1.1启动成脂诱导时(Day0)，将无血清培养体系完全更换为成脂诱导阶段培养基，培养细胞10天，成脂诱导培养基是指：0.3mM吲哚美辛+0.6mM IBMX+0.4mM罗格列酮+1.0μM地塞米松+15μg/ml胰岛素+3mM谷氨酰胺+体积比例为8.0％的胎牛血清+高糖DMEM并培养于37℃、5％CO2的培养箱中。
2.2.血小板诱导阶段
2.2.1通过上述第2.1步骤的处理后，对细胞进行消化，以0.25％胰酶消化液于37℃、5％CO2的培养箱中处理1min30s后，终止消化，收集细胞悬液并进行离心，所述离心参数为300g，10min。
2.2.2对离心沉淀以血小板诱导培养基进行重悬，细胞浓度调整为1.5×105/ml，转入细胞培养袋中于37℃、5％CO2的培养箱培养10天，所述血小板诱导培养基是指70ng/mlTPO+10μg/ml LDL+500μg/ml转铁蛋白+30μM复合核糖核苷酸(ATP、UTP、CTP、GTP)+80μMβ-巯基乙醇+30μg/ml IL-3+40μg/ml IL-6+20μg/ml IL-11+90ng/ml SCF+20μg/ml胰岛素+体积比例为5.0％的胎牛血清+IMDM。
2.2.3对血小板诱导阶段进行相关检测，于第0、2、4、6、8、10天从培养袋内取适量体积的培养液，经过200g，10min离心后，取一部分离心沉淀进行流式细胞术检测，检测细胞表面标志物CD42b、CD90及HLA-DR等；另一部分离心沉淀提取总RNA进行实时荧光定量PCR检测相关基因表达，包括但不限于：TPO、VWF、MPL等。
3.通用型血小板收集
3.1通过上述第2.2步骤处理后，收集培养液并进行离心，所述离心参数为125g，10min。
3.2前述离心操作完成后收集离心上清，并用11μm无菌尼龙滤网过滤，对过滤后的液体进行再次离心，所述离心参数为1200g，10min。
3.3前述离心操作结束后，收集离心沉淀，并用血小板保存液重悬。
3.4对血小板保存液中的血小板，使用血小板凝集功能检测仪进行凝集功能检测，得到血小板制剂1。
实施例2:
1.脐带间充质干细胞的制备
1.1在知情同意下，获取新鲜的脐带进行剥离获取华通氏胶，对华通氏胶进行剪碎后，采用贴壁法，在无血清培养体系进行原代细胞培养，所述无血清培养体系为：DMEM/F11+市售MSCs培养因子。
1.2对原代脐带间充质干细胞进行扩增，细胞代数在P3-P5之间，用于进行向成脂诱导转化，启动诱导前一天(Day-1)，细胞融合度应大于85％以上并培养于37℃、5％CO2的培养箱中。
2.诱导阶段
2.1成脂诱导阶段
2.1.1启动成脂诱导时(Day0)，将无血清培养体系完全更换为成脂诱导阶段培养基，培养细胞16天，成脂诱导培养基是指：0.3mM吲哚美辛+0.6mM IBMX+0.2mM罗格列酮+1.0μM地塞米松+10μg/ml胰岛素+3mM谷氨酰胺+体积比例为10.0％的胎牛血清+高糖DMEM并培养于37℃、5％CO2的培养箱中。
2.2.血小板诱导阶段
2.2.1通过上述第2.1步骤的处理后，对细胞进行消化，以0.25％胰酶消化液于37℃、5％CO2的培养箱中处理1min30s后，终止消化，收集细胞悬液并进行离心，所述离心参数为300g，10min.
2.2.2对离心沉淀以血小板诱导培养基进行重悬，细胞浓度调整为1.5×105/ml，转入细胞培养袋中于37℃、5％CO2的培养箱培养12天，所述血小板诱导培养基是指100ng/ml TPO+20μg/ml LDL+700μg/ml转铁蛋白+20μM复合核糖核苷酸(ATP、UTP、CTP、GTP)+50μMβ-巯基乙醇+20μg/ml IL-3+20μg/ml IL-6+40μg/ml IL-11+50ng/ml SCF+10μg/ml胰岛素+体积比例为5.0％的牛血清蛋白+IMDM。
2.2.3对血小板诱导阶段进行相关检测，于第0、2、4、6、8、10天从培养袋内取适量体积的培养液，经过200g，10min离心后，取一部分离心沉淀进行流式细胞术检测，检测细胞表面标志物CD42b、CD90及HLA-DR等；另一部分离心沉淀提取总RNA进行实时荧光定量PCR检测相关基因表达，包括但不限于：TPO、VWF、MPL等。
3.通用型血小板收集
3.1通过上述第2.2步骤处理后，收集培养液并进行离心，所述离心参数为125g，10min。
3.2前述离心操作结束后收集离心上清，并用11μm无菌尼龙滤网过滤，对过滤后的液体进行再次离心，所述离心参数为1200g，10min。
3.3前述离心操作结束后，收集离心沉淀，并用血小板保存液重悬。
3.4对血小板保存液中的血小板，使用血小板凝集功能检测仪进行凝集功能检测，得到血小板制剂2。
实施例3:
1.脐带间充质干细胞的制备
1.1在知情同意下，获取新鲜的脐带进行剥离获取华通氏胶，对华通氏胶进行剪碎后，采用贴壁法，在无血清培养体系进行原代细胞培养，所述无血清培养体系为：DMEM/F11+市售MSCs培养因子。
1.2对原代脐带间充质干细胞进行扩增，细胞代数在P3-P5之间，用于进行向成脂诱导转化，启动诱导前一天(Day-1)，细胞融合度应大于85％以上并培养于37℃、5％CO2的培养箱中。
2诱导阶段
2.1成脂诱导阶段
2.1.1启动成脂诱导时(Day0)，将无血清培养体系完全更换为成脂诱导阶段培养基，培养细胞13天，成脂诱导培养基是指：0.3mM吲哚美辛+0.6mM IBMX+0.2mM罗格列酮+1.0μM地塞米松+10μg/ml胰岛素+3mM谷氨酰胺+体积比例为10.0％的胎牛血清+高糖DMEM并培养于37℃、5％CO2的培养箱中。
2.2.血小板诱导阶段
2.2.1通过上述第2.1步骤的处理后，对细胞进行消化，以0.25％胰酶消化液于37℃、5％CO2的培养箱中处理1min30s后，终止消化，收集细胞悬液并进行离心，所述离心参数为300g，10min.
2.2.2对离心沉淀以血小板诱导培养基进行重悬，细胞浓度调整为1.5×105/ml，转入细胞培养袋中于37℃、5％CO2的培养箱培养11天，所述血小板诱导培养基是指100ng/ml TPO+15μg/ml LDL+1000μg/ml转铁蛋白+70μM复合核糖核苷酸(ATP、UTP、CTP、GTP)+150μMβ-巯基乙醇+50μg/ml IL-3+120μg/ml IL-6+40μg/ml IL-11+150ng/ml SCF+30μg/ml胰岛素+体积比例为5.0％的牛血清蛋白+IMDM。
2.2.3对血小板诱导阶段进行相关检测，于第0、2、4、6、8、10天从培养袋内取适量体积的培养液，经过200g，10min离心后，取一部分离心沉淀进行流式细胞术检测，检测细胞表面标志物CD42b、CD90及HLA-DR等；另一部分离心沉淀提取总RNA进行实时荧光定量PCR检测相关基因表达，包括但不限于：促血小板生成素(TPO)、血管性血友病因子(VWF)、促血小板生成素受体(MPL)等。
3.通用型血小板收集
3.1通过上述第2.2步骤处理后，收集培养液并进行离心，所述离心参数为125g，10min。
3.2前述离心操作结束后收集离心上清，并用11μm无菌尼龙滤网过滤，对过滤后的液体进行再次离心，所述离心参数为1200g，10min。
3.3前述离心操作结束后，收集离心沉淀，并用血小板保存液重悬。
3.4对血小板保存液中的血小板，使用血小板凝集功能检测仪进行凝集功能检测，得到血小板制剂3。
下面对实施例1中制备的血小板进行表征和检测，请参考图2-6。
图2为实施例1中血小板诱导阶段不同诱导天数的血小板的流式检测结果，该过程在悬浮培养下进行，从图2中可以看出，从D2-D10，在诱导阶段中，血小板诱导阶段不断产生表达巨核系细胞成熟标志物CD42b及间充质干细胞特异性表面标志物CD90。表明血小板诱导阶段成功诱导产生
图3为实施例1中血小板诱导阶段的D14的巨核细胞，该图片通过光学显微镜获得，从图3中可以看到的巨核细胞形态，进一步证明了血小板诱导阶段产生了巨核系细胞。
图4为实施例1中血小板诱导阶段不同诱导天数巨核细胞相关基因表达结果，对照组(对照组为：无血清体系培养的普通脐带MSCs)及D0-D6，从纵坐标表达量对比，可以发现血小板诱导阶段提高了细胞在巨核系细胞特异性基因促血小板生成素(TPO)、血管性血友病因子(VWF)及促血小板生成素受体(MPL)的表达。
图5为实施例1中血小板诱导阶段D16血小板凝集试验结果，其中，各种凝集刺激剂分别是Chanel 1为二磷酸腺苷；Chanel 2为凝血酶；Chanel 3为肾上腺素；Chanel 4为花生四烯酸；纵坐标为凝集百分比；从图中可以发现经过血小板诱导阶段后收集的血小板具有相应的血小板基本的凝集功能。
图6为实施例1中血小板诱导阶段后收集的血小板通过流式细胞术进行HLA-DR表面标志物检测，检测条件为，取2×106cells进行荧光染色后，进行流式检测，纵坐标为荧光强度，从图中可发现，与同型对照样本相比，本发明制备的血小板低表达HLA-DR。
综上所述，本申请公开了一种脐带来源的间充质干细胞制备通用型血小板的方法，其中，所述方法包括：提供脐带来源的间充质干细胞；对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理，得到血小板制剂；其中，所述血小板为低免疫原性的通用型血小板。由于制备血小板的材料并非血细胞，保存较为方便，可以做到随用随取；同时，由于制备的血小板免疫原性低，能够有效避免输注无效的问题，有利于提高输注效率。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种脐带来源的间充质干细胞制备通用型血小板的方法，其特征在于，所述方法包括：
扩增脐带来源的间充质干细胞；
对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理，制备血小板制剂；
其中，所述血小板为低免疫原性的通用型血小板。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理之前，所述方法包括：
对获取的新鲜脐带进行剥离获取华通氏胶，并在原代培养基上对所述华通氏胶进行原代培养，得到原代培养细胞；
对所述原代培养细胞进行扩增，得到扩增后的细胞用于后续操作。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述扩增后的细胞的细胞代数为P3到P5之间，在所述后续操作进行的前一天，所述增后的细胞细胞融合度大于85％，并培养在37摄氏度，CO2浓度为5％的培养箱中。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述对所述脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理的方法包括：
对所述脐带来源的间充质干细胞进行成脂诱导处理和血小板诱导处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述成脂诱导处理中的成脂诱导因子包括：胰岛素、谷氨酰胺、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、罗格列酮、地塞米松、胎牛血清中的一种或以上的组合。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
在成脂诱导培养基上对所述扩增后的干细胞培养10-20天，得到成脂诱导后的细胞，其中，所述成脂培养基包括：0.1-1.0mM的吲哚美辛、0.2-2.0mM的IBMX、0.2-2.0mM的罗格列酮、0.5-4.0μM的地塞米松、2.0-30μg/ml的胰岛素、2-10mM的谷氨酰胺或体积比例为2.0-15.0％的胎牛血清中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述血小板诱导处理中的血小板诱导因子包括：促血小板生成素、低密度脂蛋白、转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、胎牛血清、牛血清蛋白、复合核糖核苷酸、β-巯基乙醇、人白细胞介素3、人白细胞介素6、人白细胞介素11、干细胞生长因子中的一种或以上的组合。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
在血小板诱导培养基上对所述成脂诱导后的细胞培养4-16天，得到血小板诱导后的细胞，其中，所述血小板培养基包括：10-200ng/ml的促血小板生成素、2-20μg/ml的低密度脂蛋白、10-1000μg/ml的转铁蛋白、10-100μM的复合核糖核苷酸(ATP、UTP、CTP、GTP)、20-200μM的β-巯基乙醇、2-100μg/ml的人白细胞介素3、10-200μg/ml的人白细胞介素6、2-50μg/ml的人白细胞介素11、20-200ng/ml的干细胞生长因子、5.0-40μg/ml的胰岛素、体积比例为0.1-10.0％的胎牛血清或体积比例为1-5％的牛血清蛋白中至少一种。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
对所述诱导处理后的细胞培养液进行离心，收集血小板并进行检测，得到血小板制剂。
10.一种脐带来源的间充质干细胞制备的通用型血小板制剂，其特征在于，所述血小板制剂采用权利要求1-9任一项所述的方法制备，所述血小板制剂特异性具有间充质干细胞表面标志物CD90，低表达HLA-DR抗原，同时低表达和/或不表达人白细胞抗原，并表达CD42b血小板成熟标志物，不表达CD62P血小板激活标志物。
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