体外高效制备非人灵长类动物巨核细胞及血小板的体系及其
应用
技术领域
本发明属于细胞生物学领域,更具体地,本发明涉及体外高效制备非人灵长类动物巨核细胞及血小板的体系及其应用。
背景技术
血小板减少症是接受化疗、放疗和骨髓移植患者常见的并发症,也是延长患者病程的主要原因,严重者危及生命。目前,世界上尚无公认的血小板生长刺激因子用于临床,志愿者捐献来源的浓缩血小板输注是临床唯一治疗血小板减少症的手段。但是,血小板资源短缺、贮存时间短且易被污染、反复输注产生抗体等问题严重限制了浓缩血小板输注的广泛应用,迫切需要发展血小板减少症治疗的新手段。
目前,利用优化的扩增及分化因子组合可以体外高效扩增人造血干细胞并分化产生巨核细胞及血小板(参见一种离体人造血干细胞扩增培养液配方,201410066590.8;利用人造血干细胞制备巨核细胞及血小板的方法和体系,201410397915.0),由该技术产生的巨核细胞/血小板在数目和功能上都具有优势。
非人灵长类动物在组织结构、生理机能等方面与人类较为相似,是人类生命科学研究、生物医药开发临床前实验的重要动物模型。但是,本发明人在研究中发现,获得猴的造血干/祖细胞(CD34+干细胞)后,如果采用与人CD34+干细胞诱导巨核细胞及血小板相同的方法,并不能获得理想的诱导结果,无法获得有活力的巨核细胞及血小板。这是由于人和猴存在着种间差异,两者的细胞因子及其受体如SCF、IL-3、TPO等在氨基酸序列上的同源性上的差异,有的细胞因子在两类物种间的同源性仅约50%,应用重组人细胞因子对猴造血干细胞进行扩增分化,不同的细胞因子反应活性有很大的差异。因此,如果单纯的采用与人CD34+干细胞诱导巨核细胞及血小板相同的细胞因子浓度和组合方式,无法高效率、高产量的扩增分化猴造血干细胞获得猴巨核细胞及血小板。
因此,有必要研究适合于诱导非人灵长类动物的巨核细胞及血小板的方法及制剂。同时,建立非人灵长类动物血小板减少症病理模型,应用此模型验证体外产生的巨核细胞/血小板的安全性及有效性,则可以为巨核细胞/血小板制剂的临床试验提供有利的临床前实验数据。
发明内容
本发明的目的在于提供体外高效制备非人灵长类动物巨核细胞及血小板的体系及其应用。
在本发明的第一方面,提供一种制备非人灵长类动物巨核细胞的方法,所述方法包括:
(1)利用造血干细胞扩增培养基扩增非人灵长类动物造血干/祖细胞;
(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到巨核细胞诱导分化培养基中培养,获得非人灵长类动物巨核细胞;
其中,所述的造血干细胞扩增培养基包括:干细胞基础培养基以及如下组分:
干细胞因子:100-500ng/mL;
Flt3-配体:100-500ng/mL;
促血小板生成素:5-200ng/mL;
白介素3:5-50ng/mL;和
白介素6:5-50ng/mL;
其中,所述的巨核细胞诱导分化培养基包括:干细胞基础培养基以及如下组分:
干细胞因子:20-200ng/mL;
促血小板生成素:50-300ng/mL;
白介素3:5-50ng/mL;
白介素6:5-50ng/mL;
粒细胞巨噬细胞刺激因子:5-50ng/ml;和
低密度脂蛋白:10-60ug/ml。
在一个优选例中,所述的干细胞基础培养基选自:StemSpan培养基或者ModifiedIMDM培养基。
在另一优选例中,步骤(1)包括:非人灵长类动物造血干/祖细胞加入到所述的造血干细胞扩增培养基中,使得细胞浓度为0.5×104-10×105个细胞/mL;培养2-4天后根据细胞数目增加量添加所述的造血干细胞扩增培养基使得细胞浓度为0.5×104-10×105个细胞/mL;步骤(1)进行5-7天。
在另一优选例中,步骤(2)包括:步骤(1)进行5-7天后,将获得的细胞转移到所述的巨核细胞诱导分化培养基中,细胞密度为1.0×105-10×105个细胞/mL,继续培养2-4天后根据细胞数目增加量添加所述的巨核细胞诱导分化培养基使得细胞浓度为1.0×105-10×105个细胞/mL,继续培养3-5天后收获细胞。
在另一优选例中,所述的非人灵长类动物为猴。
在另一优选例中,所述的造血干/祖细胞是CD34+造血干/祖细胞。
在本发明的另一方面,提供一种用于扩增非人灵长类动物造血干/祖细胞的造血干细胞扩增培养基,其中包括:干细胞基础培养基以及如下组分:
干细胞因子:100-500ng/mL;
Flt3-配体:100-500ng/mL;
促血小板生成素:5-200ng/mL;
白介素3:5-50ng/mL;和
白介素6:5-50ng/mL。
在一个优选例中,所述的用于扩增非人灵长类动物造血干/祖细胞的造血干细胞扩增培养基中包括如下组分:
干细胞因子:100-300ng/mL;
Flt3-配体:100-300ng/mL;
促血小板生成素:10-100ng/mL;
白介素3:10-40ng/mL;和
白介素6:10-40ng/mL。
在本发明的另一方面,提供一种用于诱导分化非人灵长类动物巨核细胞的培养基,其中包括:干细胞基础培养基以及如下组分:
干细胞因子:20-200ng/mL;
促血小板生成素:50-300ng/mL;
白介素3:5-50ng/mL;
白介素6:5-50ng/mL;
粒细胞巨噬细胞刺激因子:5-50ng/ml;和
低密度脂蛋白:10-60ug/ml。
在一个优选例中,所述的用于诱导分化非人灵长类动物巨核细胞的培养基中,所述组分包括:
干细胞因子:30-150ng/mL;
促血小板生成素:80-200ng/mL;
白介素3:10-40ng/mL;
白介素6:10-40ng/mL;
粒细胞巨噬细胞刺激因子:10-40ng/ml;和
低密度脂蛋白:15-50ug/ml。
在本发明的另一方面,提供前面任一所述的培养基的用途,用于制备非人灵长类动物巨核细胞。
在本发明的另一方面,提供一种用于制备非人灵长类动物巨核细胞的试剂盒,所述试剂盒中包括:(a)所述的用于扩增非人灵长类动物造血干/祖细胞的造血干细胞扩增培养基;和(b)所述的用于诱导分化非人灵长类动物巨核细胞的培养基。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、卡铂注射后不同的时间,对食蟹猴血小板数目变化百分比产生的影响。
图2、食蟹猴骨髓动员后外周血CD34+干细胞的扩增情况。
A、0-6天总细胞数及CD34+细胞扩增的数目;
B、0-6天总细胞数及CD34+细胞扩增的倍数;
C、0-6天CD34+细胞及CD41a+细胞比例。
图3、食蟹猴骨髓动员后外周血CD34+干细胞扩增分化为CD41a+巨核细胞的情况。
A、0-13天总细胞数及CD41a+细胞扩增的数目;
B、0-13天总细胞扩增的倍数;
C、0-13天CD41a+细胞扩增的倍数。
图4、本发明食蟹猴骨髓动员后外周血CD34+干细胞扩增分化为巨核细胞的形态学观察结果。
图5、本发明对食蟹猴血小板减少症的治疗效果。
A、不同实验组血小板数目百分比的变化情况;
B、不同实验组出血时间测定。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,建立了体外高效制备巨核细胞及血小板的制剂和方法;并且,本发明人还建立了非人灵长类动物血小板减少症病理模型,利用该模型验证了所获得的巨核细胞及血小板的有效性。
如本文所用,术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”“基本上由……构成”、和“由……构成”。
除非另外说明,本发明中所用的细胞因子是人细胞因子。
培养基
本发明人根据培养的不同阶段,提供了不同的培养基,包括:造血干细胞扩增培养基和巨核细胞诱导分化培养基。
所述的造血干细胞扩增培养基包括:干细胞因子(SCF)、Flt3-配体(FLT-3L)、促血小板生成素(TPO)、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)。上述各组分以适合的比例添加到干细胞基础培养基中,可为非人灵长类动物的造血干/祖细胞(CD34+干细胞)提供适合的离体生长环境的培养基,促进非人灵长类动物的造血干/祖细胞的生长和扩增。作为本发明的优选方式,用于配制本发明的造血干细胞扩增培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
|
含量 |
优选量 |
更优选量 |
干细胞因子(SCF) |
100-500ng/mL |
100-300ng/mL |
200ng/ml |
Flt3-配体(FLT-3L) |
100-500ng/ml |
100-300ng/mL |
200ng/ml |
促血小板生成素(TPO) |
5-200ng/mL |
10-100ng/mL |
50ng/ml |
白介素3(IL-3) |
5-50ng/mL |
10-40ng/mL |
15ng/ml |
白介素6(IL-6) |
5-50ng/mL |
10-40ng/mL |
25ng/ml |
表1配方的细胞因子被添加于干细胞基础培养基中,得到干细胞扩增培养基,从而为非人灵长类动物的造血干/祖细胞提供适宜的生长和扩增环境。所述的干细胞基础培养基可以选择StemSpan培养基或者Modified IMDM培养基等。
所述的巨核细胞诱导分化培养基包括:干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和低密度脂蛋白(LDL)。上述各组分以适合的比例添加到干细胞基础培养基中,获得本发明的非人灵长类动物来源的巨核细胞的诱导分化培养基。作为本发明的优选方式,用于配制本发明的非人灵长类动物的巨核细胞诱导分化培养基的各组分的用量如表2所示。
表2
表2配方的组分被添加于干细胞基础培养基中,得到本发明的非人灵长类动物来源的巨核细胞的诱导分化培养基,从而为非人灵长类动物来源的巨核细胞的制备提供了优选的培养基配方。
用于配制培养基的SCF、TPO、Flt-3L、IL-3、GM-CSF、IL-6、LDL等细胞因子均是本领域技术人员易于获得的,例如可通过商业途径购买,或可通过人工合成或重组表达获得。
培养方法
本发明人发现,人的细胞因子对非人灵长类动物细胞的反应活性和对人细胞反应活性不同,尽管本发明人在先获得了扩增人巨核细胞的方法及培养基,但是,当用于非人灵长类动物时,效果不理想,并且目前市场上没有商业化的非人灵长类动物的细胞生长因子,只有人细胞因子可以选择。因此,本发明人针对非人灵长类动物,在细胞因子组合方面和配方浓度方面进行优化,从而使得非人灵长类动物的造血干/祖细胞也可以达到较高的扩增并高效的分化成巨核细胞及血小板。
本发明提供了一种制备非人灵长类动物来源的巨核细胞的方法,所述方法包括:(1)利用本发明的造血干细胞扩增培养基扩增非人灵长类动物来源的造血干/祖细胞(CD34+干细胞);(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到巨核细胞诱导分化培养基中培养,获得非人灵长类动物来源的巨核细胞。
本发明中,所述的非人灵长类动物来源的造血干/祖细胞(CD34+干细胞)可分离自非人灵长类动物来源的动员后外周血以及非人灵长类动物的骨髓,或者购自专业培养机构。
本发明首先分离非人灵长类动物来源的造血干/祖细胞(CD34+干细胞),然后按时间调整培养基中的细胞生长因子实现造血干/祖细胞先扩增后分化的过程。第一步使用促进增殖为主的造血干细胞扩增培养基,第二步使用以诱导分化为主的巨核细胞诱导分化培养基。本发明的方法可以获得高效的非人灵长类动物来源的巨核细胞用于血小板的生成,使血小板这种能够进行移植治疗的宝贵资源能够充分获得,突破性解决多种血小板来源问题。
世界上尚无公认的血小板生长刺激因子用于临床,志愿者捐献来源血小板常常供不应求,血小板资源极其短缺,利用干细胞体外扩增并诱导分化为巨核细胞及血小板用于输注治疗是世界上众多科研团队竞相开发的一种血小板减少症新兴治疗手段。其中干细胞来源包括利用胚胎干细胞,诱导多功能干细胞,骨髓造血干细胞,动员外周血干细胞,脐带血干细胞等等,扩增及分化方案有基因修饰(包括基因过表达和基因沉默),基质细胞共培养,细胞因子刺激,小分子化合物作用等等。这些研究方案由于涉及病毒转染的基因操作或者分化效率和产量低等原因都仅处于研发阶段,达不到临床应用的水平。
本发明人虽然在前期研究中开发了体外高效扩增人造血干细胞并分化产生巨核细胞及血小板,由该技术产生的巨核细胞/血小板在数目和功能上都具有优势。但是,本发明人前期研究中也发现,非人灵长类动物虽然是人类的最近亲属,在获得其造血干/祖细胞(CD34+干细胞)后,如果采用与人造血干/祖细胞诱导巨核细胞及血小板相同的方法,并不能获得理想的诱导结果,无法获得有活力的巨核细胞及血小板。因此,在之前研究的基础上,本发明人经过反复研究筛选,改进了方法,获得了针对非人灵长类动物来源的造血干/祖细胞(CD34+干细胞)诱导巨核细胞的方法。
本发明中的细胞培养基中,不需要加入StemRegenin-1,不需要加入DMSO。StemRegenin-1是一种小分子物质,需要DMSO作为溶媒溶解。本发明人的实验结果显示,StemRegenin-1对于扩增猴造血干细胞没有明显的促进效果。
本发明中的细胞培养体系不涉及基因操作,不涉及基质细胞,培养用的细胞生长因子可以按照GMP生产标准生产,也不含有血清。所获得的非人灵长类巨核细胞数量相比于现有技术有极大的增加。因此,应用本发明的方法可以高产量、高效率获得非人灵长类动物的巨核细胞及血小板,在此基础上可进一步进行非人灵长类动物巨核系生理发育的机制研究、相应疾病模型的建立以及血小板缺乏疾病的治疗研究等。
非人灵长类动物的建立及验证
本发明还建立了非人灵长类动物血小板减少病理症模型,并将之应用于进行巨核细胞/血小板自体和异体输注的研究。
血小板的前体是巨核细胞,巨核细胞位于骨髓血窦,成熟后释放血小板到外周血中发挥止血功能。通常小动物模型的血小板减少症模型是利用全身辐照,造成骨髓抑制从而损伤骨髓中造血干细胞及巨核细胞,使动物的血小板数目下降。但是对于非人灵长类动物的辐照的难度远远超过小动物辐照,一方面需要有专门辐照大动物的辐照仪,另一方面大动物顺从性差,动物的运输和操作都比较不易。因此,本发明利用静脉注射化学药物的方法建立非人灵长类动物血小板减少病理症模型,操作简便,对动物的损伤小,并且停药后28-35天动物血小板数目可以自主恢复到正常水平,该病理模型安全有效。
在本发明的优选实施例中,首先,将卡铂溶解于5%葡萄糖溶液中使浓度为10mg/mL,然后按8-12mg/kg/d的剂量,通过静脉注射于非人灵长类动物体内,每隔24小时注射一次,连续3天。受试动物的血小板数目于10天后出现明显下降,15-19天达到最低点,随后缓慢回升,28-25天后可恢复值正常值。
作为优选,所述血小板减少症主要为严重再生障碍性贫血型血小板减少症以及恶性血液病造血干细胞移植所引起的难治性血小板减少症。
作为优选,所述药物卡铂的使用剂量为12mg/kg/d。
本发明还提供了一种制备非人灵长类巨核细胞及血小板并用于治疗上述血小板减少症的方法。该治疗手段为捐献来源血小板输注的替代疗法,其中体外制备的巨核细胞/血小板制剂生产过程不涉及基因操作,不涉及基质细胞,可以于液氮中长期保存复苏后使用。并且,由于体外培养过程不涉及血清成分,无ABH抗体,因此对于ABO和HLA的配型不严格。作为一种优选实施方式,所述方法包括:
(1)利用造血干细胞扩增培养基扩增CD34+干细胞(来源于非人灵长类动员外周血造血干细胞),培养周期为6天左右;
(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到巨核细胞诱导分化培养基中培养,继续培养7天左右,获得非人灵长类巨核细胞及血小板;
(3)将获得的巨核细胞/血小板制剂按1×107/kg的剂量,重悬于生理盐水中,通过静脉注射的方式,输注给已进行血小板减少症造模的动物,输注3小时后受试动物血小板数目出现升高,在输注后24-48小时达到峰值,血小板数目可提高10%-20%。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、建立非人灵长类动物血小板减少病理症模型
实验动物:食蟹猴6只(Macaca Cynomolgus,雄性,4-7岁,体重3-6千克),购自中国医学科学院医学生物学研究所。
主要试剂:卡铂(Carboplatin),购自齐鲁制药有限公司。
主要溶液配制:将卡铂加入到50~100ml 5%葡萄糖注射液中。
主要仪器:全自动血细胞分析仪(Sysmex公司,日本)。
实验方法:
用5%葡萄糖注射液按10mg/kg/d剂量配制卡铂注射液,总体积在50~100ml之间。采用静脉注射的方法,输注实验动物体内。其中注射位点可采用手臂部和腿部静脉。应缓慢注射,2-5mL/min的速度为宜。按此方法连续给药3天。
于卡铂注射前以及注射后每隔一天取实验动物外周血0.5-2mL,应用血细胞分析仪进行血小板计数,分析实验动物血小板数目的变化。
实验结果:
在卡铂首次注射后的前10天,食蟹猴的血小板数目无明显变化,但从10-12天开始,6只食蟹猴的血小板数目出现明显、迅速的下降,并于15-19天达到最低点。最低点血小板数目仅为卡铂给药前的10-20%。随后,其血小板数目缓慢上升,于25-28天出现短暂的血小板数目增多,最高可能达到卡铂注射前的150%。随后趋于正常,于30天左右完全恢复到卡铂注射前正常水平,如图1。
制备本模型的成功率为100%。
实施例2、将CD34+干细胞扩增分化为巨核细胞及血小板——方法1
食蟹猴骨髓动员后外周血采集:采集前5天开始,给予实验动物采用100ug/kg粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及50ug/kg干细胞因子(SCF),皮下注射给药,连续动员5天,于第6、7天采集15-20mL外周血。
第0天:
(1)配制扩增培养基
在Stemspan培养基中加入各种细胞因子,制备扩增培养基,使细胞因子终浓度如表3。
表3
|
配方 |
SCF |
200ng/ml |
FLT-3L |
200ng/ml |
IL3 |
15ng/ml |
TPO |
50ng/ml |
IL6 |
25ng/ml |
(2)分离纯化外周血CD34+干细胞
采用新鲜的动员后外周血10mL,PBS稀释20倍,使用美天旎公司MCS磁珠分选系统分离CD34+单个核细胞,获得细胞数量为3.7×106个细胞。采用造血干细胞扩增培养基调细胞浓度为1×105个细胞/mL,每孔1mL置于24孔板培养(n=3)。用显微镜观察然后置于培养箱中39℃,10%CO2。
(3)流式检测
取2×105细胞置于15mL离心管中,平均分配5×104细胞置于1.5mL EP管中,共4个EP管,每管加入1mL含1%BSA的PBS洗涤液,室温下1200rpm离心5分钟,弃去上清,用100uL含1%BSA的PBS重悬细胞沉淀,管1-1加入2uL CD34抗体(APC-Mouse anti-human CD34),管1-2加入2uL相对应的同型对照(APC-Mouse anti-human IgG1)。管2-1加入2uL CD41a抗体(FITC-Mouse anti-human CD41a),管2-2加入相对应的同型对照(FITC-Mouse anti humanIgG1)抗体2uL,抗体加入后室温避光孵育15分钟,而后每管加入1mL PBS洗涤,1200rpm离心5分钟,弃去上清,用500uL PBS重悬细胞,用流式细胞仪分析细胞表面CD34和CD41a的表达情况。
第3天:
根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL),扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基(表3)。
第6天:
培养至第6天更换为诱导分化培养基培养。
(1)细胞计数
用流式细胞仪分析细胞表面CD34和CD41a的表达情况,并统计总细胞数目、CD34细胞数目。总细胞绝对数目为6.14×107±1.34×107,CD34细胞绝对数目为3.05×107±5.45×106(n=3),CD34细胞比例为50.03%±2.91%,CD41a细胞比例为18.73%±1.11%,总细胞扩增倍数为17.02±2.45倍,CD34+细胞扩增倍数为9.56±1.5倍(n=3),结果见图2A-C。
(2)配制诱导分化培养基
在Ste1llspan培养基(无血清)中加入多种成分配制诱导分化培养基,各成分终浓度如表4。
表4
(3)培养
将前面扩增至第6天的所有细胞更换至诱导分化培养基,调细胞浓度为5.0×105/mL,置于T-75细胞培养瓶中培养(n=3)。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(39℃,10%CO2)。
第9天:
(1)细胞计数,用流式细胞仪分析细胞表面标志CD34和CD41a的表达情况。
(2)此时总细胞数目为1.04×108±2.35×107,扩大培养体系,添加新鲜诱导分化培养基(表4)调细胞浓度为5.0×105/mL。
第13天:
(1)细胞计数,用流式细胞仪分析细胞表面巨核系标志CD41a的表达情况,统计第3、6、9、13天的总细胞和CD41a+细胞数,结果见图3A。在第13天,相比于第0天,总细胞的扩增倍数为109.38±10.43,CD41a+细胞的扩增倍数为3474.81±376.20倍,结果见图3B-C。
(2)取第13天细胞0.5-1×106细胞用PBS液洗3遍后拍照,取4×104细胞悬于30u LPBS中,制作细胞涂片,并用Wright-Giemsa染色观察后拍照,结果见图4。
实施例3、自体及同种异体移植巨核细胞/血小板治疗食蟹猴血小板减少症
(1)实验分组
阴性对照组(输注生理盐水n=3);
阳性对照组(输注新鲜分离的血小板n=1);
自体移植组(输注自体成熟巨核细胞/血小板n=3);
异体移植组(输注同种异体成熟巨核细胞/血小板n=2)。
(2)实验过程
采用实施例1中的方法建立食蟹猴血小板减少症模型。卡铂首次给药后第15天,阳性对照组输注从全血中分离得到的血小板(输注剂量为2×1010个),自体移植组输注如实施例2的方法培养13天的自体成熟巨核细胞(移植剂量为2×107/kg),异体移植组输注如实施例2的方法培养13天的同种异体巨核细胞(移植剂量为2×107/kg),阴性对照组输注等体积生理盐水。
对各组实验动物采集外周血,进行血常规检测,分析血小板数目变化。检测时间点为卡铂给药前、回输前、及回输后3h、24h、48h、72h、72h后每隔一天进行,观察血小板数目回升情况。并且,于不同时间点对各组实验动物进行出血时间的检测,观察血小板的止血功能。出血时间检测方法为:首先将食蟹猴手臂掌心向上置于固定的台面上(台面高度最好接近心脏水平),以肘窝皮肤皱褶下方2-3cm,前臂外侧1/3处作为试验部位,试验部位需剃毛。在手臂上段套上血压计袖带,给血压计袖带打气,使压力达40mmHg并在测定过程中要确保压力稳定在40mmHg。使用标准化的出血时间测定器,在前臂选定的位置上,作一平行于肘窝皮肤皱褶的切口。切口长5mm,深1mm。随后,按下秒表开始计时。每隔30秒用滤纸吸去从切口流出的血滴,注意应避免触及切口,也不能挤压,如果出血量较多,可增加用滤纸吸去血滴的频率,直至出血停止。记录在皮肤上作切口直至出血停止的时间即出血时间。
(3)实验结果
在卡铂首次注射后的前10天,食蟹猴的血小板数目无明显变化,但从10-12天开始,食蟹猴的血小板数目出现明显、迅速的下降,第15天回输前,各组动物血小板计数约为卡铂给药前的15-20%。回输后3h,输注生理盐水的阴性对照组血小板数目进一步下降,输注血小板的阳性对照组血小板计数升高14%,自体和异体成熟巨核细胞移植组均升高3%;回输后24h,阳性对照组血小板计数维持不变,自体和异体成熟巨核细胞移植组进一步升高约6%,见图5A。
出血时间检测结果显示,回输了自体和异体成熟巨核细胞/血小板的动物于回输24h后出血时间缩短,与阴性对照组相比有显著差异,见图5B。
这些结果说明,移植体外培养的成熟巨核细胞/血小板可以提升血小板数目,发挥止血功能。
实施例4、将CD34+干细胞扩增分化为巨核细胞及血小板——方法2
食蟹猴骨髓动员后外周血采集:采集前5天开始,给予实验动物采用120ug/kg粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及40ug/kg干细胞因子(SCF),皮下注射给药,连续动员5天,于第6、7天采集15-20mL外周血。
第0天:
(1)配制扩增培养基
在Stemspan培养基中加入各种细胞因子,制备扩增培养基,使细胞因子终浓度如表5。
表5
|
配方 |
SCF |
120ng/ml |
FLT-3L |
150ng/ml |
IL3 |
10ng/ml |
TPO |
30ng/ml |
IL6 |
15ng/ml |
(2)分离纯化外周血CD34+干细胞
采用新鲜的动员后外周血10mL,PBS稀释20倍,使用美天旎公司MCS磁珠分选系统分离CD34+单个核细胞,获得细胞数量为2×106个细胞。采用造血干细胞扩增培养基调细胞浓度为1×105个细胞/mL,每孔1mL置于24孔板培养(n=3)。用显微镜观察然后置于培养箱中39℃,10%CO2。
(3)流式检测
取2×105细胞置于15mL离心管中,平均分配5×104细胞置于1.5mL EP管中,共4个EP管,每管加入1mL含1%BSA的PBS洗涤液,室温下1200rpm离心5分钟,弃去上清,用100uL含1%BSA的PBS重悬细胞沉淀,管1-1加入2uL CD34抗体(APC-Mouse anti-human CD34),管1-2加入2uL相对应的同型对照(APC-Mouse anti-human IgG1)。管2-1加入2uL CD41a抗体(FITC-Mouse anti-human CD41a),管2-2加入相对应的同型对照(FITC-Mouse anti humanIgG1)抗体2uL,抗体加入后室温避光孵育15分钟,而后每管加入1mL PBS洗涤,1200rpm离心5分钟,弃去上清,用500uL PBS重悬细胞,用流式细胞仪分析细胞表面CD34和CD41a的表达情况。
第3天:
根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL),扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基(表5)。
第6天:
培养至第6天更换为诱导分化培养基培养。
(1)细胞计数
用流式细胞仪分析细胞表面CD34的表达情况。并统计总细胞数目、CD34细胞数目,总细胞绝对数目3.3×107±4.6×106,CD34细胞绝对数目为1.8×107±2.4×106(n=3),总细胞扩增倍数为14.8±2.2倍,CD34+细胞扩增倍数为8.3±1.6倍(n=3)。
(2)配制诱导分化培养基
在Ste1llspan培养基(无血清)中加入多种成分配制诱导分化培养基,各成分终浓度如表6。
表6
(3)培养
将前面扩增至第6天的所有细胞更换至诱导分化培养基,调细胞浓度为4.5×105/mL,置于T-75细胞培养瓶中培养(n=3)。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(39℃,10%CO2)。
第9天:
(1)细胞计数,用流式细胞仪分析细胞表面标志CD34和CD41a的表达情况。
(2)此时总细胞数目为7.1×107±8.3×106,扩大培养体系,添加新鲜诱导分化培养基(表6)调细胞浓度为4.5×105/mL。
第13天:
(1)细胞计数,用流式细胞仪分析细胞表面巨核系标志CD41a的表达情况,统计第3、6、9、13天的总细胞和CD41a+细胞数。在第13天,相比于第0天,总细胞的扩增倍数为89.3±13.5,CD41a+细胞的扩增倍数为2764.5±236.4倍。
实施例5、将CD34+干细胞扩增分化为巨核细胞及血小板——方法3
食蟹猴骨髓动员后外周血采集:采集前5天开始,给予实验动物采用100ug/kg粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及50ug/kg干细胞因子(SCF),皮下注射给药,连续动员5天,于第6、7天采集15-20mL外周血。
第0天:
(1)配制扩增培养基
在Modified IMDM培养基中加入各种细胞因子,制备扩增培养基,使细胞因子终浓度如表7。
表7
|
配方 |
SCF |
300ng/ml |
FLT-3L |
300ng/ml |
IL3 |
40ng/ml |
TPO |
150ng/ml |
IL6 |
45ng/ml |
(2)分离纯化外周血CD34+干细胞
采用新鲜的动员后外周血10mL,PBS稀释20倍,使用美天旎公司MCS磁珠分选系统分离CD34+单个核细胞,获得细胞数量为2.5×106个细胞。采用造血干细胞扩增培养基调细胞浓度为1×105个细胞/mL,每孔1mL置于24孔板培养(n=3)。用显微镜观察然后置于培养箱中39℃,10%CO2。
(3)流式检测
取2×105细胞置于15m1离心管中,平均分配5×104细胞置于1.5mL EP管中,共4个EP管,每管加入1mL含1%BSA的PBS洗涤液,室温下1200rpm离心5分钟,弃去上清,用100uL含1%BSA的PBS重悬细胞沉淀,管1-1加入2uL CD34抗体(APC-Mouse anti-human CD34),管1-2加入2uL相对应的同型对照(APC-Mouse anti-human IgG1)。管2-1加入2uL CD41a抗体(FITC-Mouse anti-human CD41a),管2-2加入相对应的同型对照(FITC-Mouse anti humanIgG1)抗体2uL,抗体加入后室温避光孵育15分钟,而后每管加入1mL PBS洗涤,1200rpm离心5分钟,弃去上清,用500uL PBS重悬细胞,用流式细胞仪分析细胞表面CD34和CD41a的表达情况。
第3天:
根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL),扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基(表7)。
第6天:
培养至第6天更换为诱导分化培养基培养。
(1)细胞计数
用流式细胞仪分析细胞表面CD34的表达情况。并统计总细胞数目、CD34细胞数目,总细胞绝对数目为4.8×107±5.1×106,CD34细胞绝对数目为2.1×107±4.4×106(n=3),总细胞扩增倍数为19.4±2.6倍,CD34+细胞扩增倍数为8.9±1.7倍(n=3)。
(2)配制诱导分化培养基
在Modified IMDM培养基(无血清)中加入多种成分配制诱导分化培养基,各成分终浓度如表8。
表8
|
配方 |
SCF |
180ng/mL |
IL-3 |
45ng/mL |
TPO |
350ng/mL |
IL-6 |
45ng/mL |
GM-CSF |
45ng/mL |
LDL |
50ug/mL |
(3)培养
将前面扩增至第6天的所有细胞更换至诱导分化培养基,调细胞浓度为6.0×105/mL,置于T-75细胞培养瓶中培养(n=3)。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(39℃,10%CO2)。
第9天:
(1)细胞计数,用流式细胞仪分析细胞表面标志CD34和CD41a的表达情况。
(2)此时总细胞数目为1.1×108±1.3×107扩大培养体系,添加新鲜诱导分化培养基(表8)调细胞浓度为6.0×105/mL。
第13天:
细胞计数,用流式细胞仪分析细胞表面巨核系标志CD41a的表达情况,统计第3、6、9、13天的总细胞和CD41a+细胞数。在第13天,相比于第0天,总细胞的扩增倍数为130.5±25.7,CD41a+细胞的扩增倍数为2805.8±312.6倍。
实施例6、对比例
应用专利申请201410397915.0中实施例2的配方,来诱导猴细胞。
食蟹猴骨髓动员后外周血采集:采集前5天开始,给予实验动物采用100ug/kg粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及50ug/kg干细胞因子(SCF),皮下注射给药,连续动员5天,于第6、7天采集15-20mL外周血。
第0天:
(1)配制扩增培养基
在Stemspan培养基中加入各种细胞因子,制备扩增培养基,使细胞因子终浓度如下:
SCF:100ng/mL;
Flt-3L:100ng/mL;
IL-3:15ng/mL;
TPO:25ng/mL;
Sall-4B:3ng/mL;
StemRegenin-1:1μM。
(2)分离纯化外周血CD34+干细胞
采用新鲜的动员后外周血10mL,PBS稀释20倍,使用美天旎公司MCS磁珠分选系统分离CD34+单个核细胞,获得细胞数量为2×106个细胞。采用造血干细胞扩增培养基调细胞浓度为1×105个细胞/mL,每孔1mL置于24孔板培养(n=3)。用显微镜观察然后置于培养箱中39℃,10%CO2。
(3)流式检测
取2×105细胞置于15m1离心管中,平均分配5×104细胞置于1.5mL EP管中,共4个EP管,每管加入1mL含1%BSA的PBS洗涤液,室温下1200rpm离心5分钟,弃去上清,用100uL含1%BSA的PBS重悬细胞沉淀,管1-1加入2uL CD34抗体(APC-Mouse anti-human CD34),管1-2加入2uL相对应的同型对照(APC-Mouse anti-human IgG1)。管2-1加入2uL CD41a抗体(FITC-Mouse anti-human CD41a),管2-2加入相对应的同型对照(FITC-Mouse anti humanIgG1)抗体2uL,抗体加入后室温避光孵育15分钟,而后每管加入1mL PBS洗涤,1200rpm离心5分钟,弃去上清,用500uL PBS重悬细胞,用流式细胞仪分析细胞表面CD34和CD41a的表达情况。
第3天:
根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL),扩大培养体系并每孔添加新鲜扩增培养基。
第6天:
培养至第6天更换为诱导分化培养基培养。
(1)细胞计数
用流式细胞仪分析细胞表面CD34的表达情况。并统计总细胞数目、CD34细胞数目,总细胞绝对数目为1.8×107±3.2×106,CD34细胞绝对数目为8.9×106±1.4×106(n=3),总细胞扩增倍数为8.4±2.3倍,CD34+细胞扩增倍数为4.7±2.7倍(n=3)。
(2)配制诱导分化培养基
在Modified IMDM培养基(无血清)中加入多种成分配制诱导分化培养基,各成分终浓度如下:
SCF 100ng/mL;
IL-3 15ng/mL;
TPO 100ng/mL;
IL-6 50ng/mL;
IL-11 25ng/mL;
GM-CSF 25ng/mL;
LDL 25μg/mL。
(3)培养
将前面扩增至第6天的所有细胞更换至诱导分化培养基,调细胞浓度为6.0×105/mL,置于T-75细胞培养瓶中培养(n=3)。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(39℃,10%CO2)。
第9天:
(1)细胞计数,用流式细胞仪分析细胞表面标志CD34和CD41a的表达情况。
(2)此时总细胞数目为3.7×107±6.3×106,扩大培养体系,各自添加新鲜诱导分化培养基调细胞浓度为6.0×105/mL。
第13天:
(1)细胞计数,用流式细胞仪分析细胞表面巨核系标志CD41a的表达情况,统计第3、6、9、13天的总细胞和CD41a+细胞数。在第13天,相比于第0天,总细胞的扩增倍数为39.8±4.3,CD41a+细胞的扩增倍数为745.1±92.3倍。
因此,采用针对人细胞的扩增、诱导培养基来诱导猴细胞,效果不理想。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。