CN110055220B - 造血干细胞诱导分化为巨核细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了式(1)所示化合物在获得巨核细胞和血小板中的用途、获得巨核细胞和血小板的方法及用于造血干细胞诱导分化为巨核细胞的培养基。所述巨核细胞是通过将造血干细胞进行诱导分化而获得的。式(1)所示化合物可以促使造血干细胞向巨核细胞诱导分化,从而提高巨核细胞的分化效率,获得大量巨核细胞,并最终生成血小板,具有广泛地应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地,本发明涉及造血干细胞诱导分化为巨核细胞的方法。更具体地,本发明涉及式(1)所示化合物在获得巨核细胞及血小板中的用途、获得巨核细胞及血小板的方法及培养基。
背景技术
血小板是血液系统中成熟巨核细胞胞质片段化的活性产物,在机体止血、血栓形成、免疫调节等生理和病理过程中发挥重要作用。血小板减少是再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜等血液系统疾病以及放化疗过程中常见的并发症,血小板输注是临床治疗血小板减少的唯一手段。目前,常规血小板制剂主要来源于无偿献血者捐献的全血进行分离制备或采用成分分离制备机采集而来,健康供者来源有限、血小板贮存时间短且易被污染是制约血小板供给的重要因素,很多患者需要反复多次输注血小板进一步导致供需矛盾日益尖锐,因此迫切需要寻求血小板新来源。
血小板的前体细胞是巨核细胞,而巨核细胞则起源于造血干细胞。造血干细胞具有自我复制和更新的能力,能分化成为各类成熟的血细胞。Choi等已经证明,外周血中的CD34+细胞在促进巨核细胞生成的培养体系中培养,可诱导生成成熟的巨核细胞,继而分化为血小板前体,前体表达血小板特异性分子:糖蛋白Ⅰb和Ⅱb以及纤维蛋白原,最终生成血小板。研究表明,从外周血中获取多能干细胞,可减少患者损伤,但是诱导效率极低。Bernardi等研究表明,骨髓中分离得到的CD34+在含有TPO的无血清培养体系中可以生成巨核细胞,最终生成血小板。但是通过此方法得到的血小板数量少,在临床应用中受到限制。
因此,目前获得巨核细胞及血小板的方法有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
在本发明的一个方面,本发明提出了式(1)所示化合物在获得巨核细胞及血小板中的用途。根据本发明的实施例,所述巨核细胞是通过将初始细胞进行诱导分化而获得的。
发明人发现,目前适用于促使造血干细胞诱导分化为巨核细胞的小分子化合物不多,而且有些化合物虽然可以促使生成巨核细胞,但是进一步生成的血小板数量较少。进而,发明人经过深入研究发现,式(1)所示化合物不仅可以促使造血干细胞向巨核细胞诱导分化,提高巨核细胞的分化效率,还可以促使生成血小板,从而获得大量巨核细胞和血小板,具有广泛地应用前景。
需要说明的是,目前,式(1)所示化合物通常用作选择性的、非ATP竞争性的MEK抑制剂。本发明对于式(1)所示化合物的获得方式不作严格限定,可以自行合成或者通过市售获得。根据本发明的优选实施例,式(1)所示化合物通过市售获得,型号为PD0325901。
根据本发明的实施例,上述式(1)所示化合物在获得巨核细胞及血小板中的用途还可以具有下列附加技术特征:
根据本发明的实施例,所述造血干细胞选自外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞或者脐带血造血干细胞。造血干细胞的标志物为CD34,从脐带血、外周血和骨髓中分离得到的CD34+细胞可以诱导生成巨核细胞,最终生成血小板。根据本发明的优选实施例,造血干细胞选自脐带血造血干细胞。脐带血本身的取材方法简便,细胞分化阶段相对原始,在临床中已经应用于干细胞移植、治疗白血病等。其与外周血造血干细胞和骨髓造血干细胞相比,具有较高的扩增效率,诱导分化的巨核细胞多,具有一定的优势。
根据本发明的实施例,所述式(1)所示化合物是以培养基的形式提供的,所述培养基包括:基础培养基;以及所述式(1)所示化合物。由此,通过将造血干细胞培养于含有式(1)所示化合物的培养基,进行诱导分化,以便获得大量巨核细胞,并最终生成血小板。
根据本发明的实施例,所述培养基进一步包括:重组人干细胞因子;白细胞介素-3;白细胞介素-6;以及促血小板生长因子。由此,以便进一步提高诱导效率,获得大量巨核细胞,并进一步促使最终生成血小板。
根据本发明的实施例,所述式(1)所示化合物的浓度为0.2~0.8μM;所述重组人干细胞因子的浓度为20~70ng/mL;所述白细胞介素-3的浓度为10~30ng/mL;所述白细胞介素-6的浓度为20~70ng/mL;所述促血小板生长因子的浓度为20~70ng/mL。由此,以便进一步提高诱导效率,获得大量巨核细胞,并进一步促使最终生成血小板。
在本发明的另一方面,本发明提出了一种获得巨核细胞及血小板的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将造血干细胞培养于含有式(1)所示化合物的培养基中,以便获得巨核细胞及血小板。式(1)所示化合物可以促使造血干细胞向巨核细胞诱导分化,从而提高巨核细胞的分化效率,获得大量巨核细胞,并进一步促使最终生成血小板,具有广泛地应用前景。
根据本发明的实施例,所述造血干细胞选自外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞或者脐带血造血干细胞。利用式(1)所示化合物对外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞或者脐带血造血干细胞进行诱导分化,以便获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例,所述造血干细胞是通过从单个核细胞中分选获得的。
根据本发明的实施例,所述培养基包括:基础培养基;所述式(1)所示化合物;重组人干细胞因子;白细胞介素-3;白细胞介素-6;以及促血小板生长因子。由此,以便进一步提高诱导效率,获得大量巨核细胞和血小板。
根据本发明的实施例,所述式(1)所示化合物的浓度为0.2~0.8μM;所述重组人干细胞因子的浓度为20~70ng/mL;所述白细胞介素-3的浓度为10~30ng/mL;所述白细胞介素-6的浓度为20~70ng/mL;所述促血小板生长因子的浓度为20~70ng/mL。由此,以便进一步提高诱导效率,获得大量巨核细胞和血小板。
在本发明的又一方面,本发明提出了一种用于造血干细胞诱导分化为巨核细胞的培养基。根据本发明的实施例,所述培养基包括:基础培养基;以及所述式(1)所示化合物。式(1)所示化合物可以促使造血干细胞向巨核细胞诱导分化,从而提高巨核细胞的分化效率,获得大量巨核细胞,并最终生成血小板,具有广泛地应用前景。
根据本发明的实施例,所述培养基进一步包括:重组人干细胞因子;白细胞介素-3;白细胞介素-6;以及促血小板生长因子。由此,以便进一步提高诱导效率,获得大量巨核细胞,并最终生成血小板。
根据本发明的实施例,所述式(1)所示化合物的浓度为0.2~0.8μM;所述重组人干细胞因子的浓度为20~70ng/mL;所述白细胞介素-3的浓度为10~30ng/mL;所述白细胞介素-6的浓度为20~70ng/mL;所述促血小板生长因子的浓度为20~70ng/mL。由此,以便进一步提高诱导效率,获得大量巨核细胞,并最终生成血小板。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1~4分别显示了根据本发明一个实施例的流式细胞分析示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 PD0325901促进单个核细胞向巨核细胞诱导分化
采用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞,用含有50ng/ml SCF、20ng/ml IL-3、50ng/ml IL-6、50ng/ml TPO和0.5μM PD0325901的StemSpan培养基进行诱导。培养7天后,取106细胞用PBS洗两遍后,标记抗体并进行流式检测,具体流程如下:
1、重悬用上述培养基处理的细胞于1.5ml EP管中,每管加入100μl的PBS;
2、每管细胞加入CD41a-APC和CD42b-PE抗体各1μl,放入4℃冰箱孵育40mins;
3、离心2000rpm,5mins;
4、PBS洗两遍,定容200~500μl,进行流式检测。
实验结果显示(图1),与溶剂对照组相比,PD0325901能够显著提高单个核细胞分化获得的CD41a+CD42b+的细胞比例。
实施例2 PD0325901促进单个核细胞诱导分化获得血小板
采用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞,用含有50ng/ml SCF、20ng/ml IL-3、50ng/ml IL-6、50ng/ml TPO和0.5μM PD0325901的StemSpan培养基进行诱导。培养20天后,收集血小板,标记抗体并进行流式检测,具体流程如下:
1、收集细胞和培养基,2000rpm离心5mins,去除细胞及细胞碎片;
2、取上清,2000g离心10min,收集血小板;
3、重悬血小板于1.5ml EP管中,每管加入100μl的PBS;
4、每管细胞加入CD41a-APC和CD61-FITC抗体各1μl,放入4℃冰箱孵育40mins;
5、离心2000rpm,5mins;
6、PBS洗两遍,定容200~500μl,进行流式检测。
实验结果显示(图2),与溶剂对照组相比,PD0325901能够显著提高单个核细胞分化获得的CD41a+CD61+的血小板比例。
实施例3 PD0325901促进CD34+造血干细胞向巨核细胞诱导分化
采用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞,用CD34磁珠抗体富集CD34+造血干细胞,然后用含有50ng/ml SCF、20ng/ml IL-3、50ng/ml IL-6、50ng/ml TPO和0.5μMPD0325901的StemSpan培养基进行诱导。培养7天后,取106细胞用PBS洗两遍后,标记抗体并进行流式检测,具体流程如下:
1、重悬用上述培养基处理的细胞于1.5ml EP管中,每管加入100μl的PBS;
2、每管细胞加入CD41a-APC和CD42b-PE抗体各1μl,放入4℃冰箱孵育40mins;
3、离心2000rpm,5mins;
4、PBS洗两遍,定容200~500μl,进行流式检测。
实验结果显示(图3),与溶剂对照组相比,PD0325901能够显著提高CD34+造血干细胞分化获得的CD41a+CD42b+的细胞比例。
实施例4 PD0325901促进CD34+造血干细胞诱导分化获得血小板
采用密度梯度离心法从脐带血中分离出单个核细胞,用CD34磁珠抗体富集CD34+造血干细胞,然后用含有50ng/ml SCF、20ng/ml IL-3、50ng/ml IL-6、50ng/ml TPO和0.5μMPD0325901的StemSpan培养基进行诱导。培养14天后,收集血小板,标记抗体并进行流式检测,具体流程如下:
1、收集细胞和培养基,2000rpm离心5mins,去除细胞及细胞碎片;
2、取上清,2000g离心10min,收集血小板;
3、重悬血小板于1.5ml EP管中,每管加入100μl的PBS;
4、每管细胞加入CD41a-APC和CD61-FITC抗体各1μl,放入4℃冰箱孵育40mins;
5、离心2000rpm,5mins;
6、PBS洗两遍,定容200~500μl,进行流式检测。
实验结果显示(图4),与溶剂对照组相比,PD0325901能够显著提高CD34+造血干细胞分化获得的CD41a+CD61+血小板比例。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述造血干细胞选自外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞或者脐带血造血干细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述造血干细胞选自外周血造血干细胞、骨髓造血干细胞或者脐带血造血干细胞。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述造血干细胞是通过从单个核细胞中分选获得的。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述培养时间为7~21天。
7.一种用于造血干细胞诱导分化为巨核细胞的培养基,其特征在于,所述培养基由基础培养基;以及
所述式(1)所示化合物;
重组人干细胞因子;
白细胞介素-3;
白细胞介素-6;以及
促血小板生长因子组成,
其中,所述式(1)所示化合物的浓度为0.2~0.8μM;
所述重组人干细胞因子的浓度为20~70ng/mL;
所述白细胞介素-3的浓度为10~30ng/mL;
所述白细胞介素-6的浓度为20~70ng/mL;
所述促血小板生长因子的浓度为20~70ng/mL。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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