JPH10136978A - 造血幹細胞の培養方法 - Google Patents
造血幹細胞の培養方法Info
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- JPH10136978A JPH10136978A JP8296041A JP29604196A JPH10136978A JP H10136978 A JPH10136978 A JP H10136978A JP 8296041 A JP8296041 A JP 8296041A JP 29604196 A JP29604196 A JP 29604196A JP H10136978 A JPH10136978 A JP H10136978A
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- cells
- kit
- hematopoietic stem
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
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- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来効果的な培養技術が確立されていなかっ
た造血幹細胞の新しい液体培養技術を提供することにあ
る。 【解決手段】 造血幹細胞増殖因子の存在下に、表現型
がＣＤ３４+及びc-kit-として特徴づけられるヒト造血
幹細胞を、付着性培養器により液体培養することを特徴
とする造血幹細胞の培養方法。
た造血幹細胞の新しい液体培養技術を提供することにあ
る。 【解決手段】 造血幹細胞増殖因子の存在下に、表現型
がＣＤ３４+及びc-kit-として特徴づけられるヒト造血
幹細胞を、付着性培養器により液体培養することを特徴
とする造血幹細胞の培養方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はヒト造血幹細胞の新
しい培養方法に関する。
しい培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】造血幹細胞とは、自己複製能と全ての成
熟血球へ分化する能力を持った細胞と定義され、大部分
の造血幹細胞は骨髄に存在し、造血支持能を有する骨髄
ストローマ細胞に接着しているものと考えられる。一
方、造血幹細胞は僅かではあるが、定常状態において末
梢血中にも存在しており、また化学療法後の骨髄回復期
や造血刺激因子ＣＳＦ（colony stimulating factor）
投与後には、末梢血中の造血幹細胞は著増することが知
られている。
熟血球へ分化する能力を持った細胞と定義され、大部分
の造血幹細胞は骨髄に存在し、造血支持能を有する骨髄
ストローマ細胞に接着しているものと考えられる。一
方、造血幹細胞は僅かではあるが、定常状態において末
梢血中にも存在しており、また化学療法後の骨髄回復期
や造血刺激因子ＣＳＦ（colony stimulating factor）
投与後には、末梢血中の造血幹細胞は著増することが知
られている。
【０００３】更に、臍帯血中にも造血幹細胞は存在して
おり、この臍帯血幹細胞は骨髄に比してコロニー形成能
が高いことが知られている。
おり、この臍帯血幹細胞は骨髄に比してコロニー形成能
が高いことが知られている。
【０００４】該造血幹細胞は、抗体によって同定される
特異的なエピトープ部位と関連するマーカー（ＣＤ３
３、ＣＤ３８、ＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ１１７（c-kit）等
のマーカー）の存在の有無によって特定しようとされて
おり、現在、ヒト造血幹細胞としては、ＣＤ３４+ＣＤ
３３-、ＣＤ３４+ＣＤ３８-等の分画が、それに該当す
るのではないかと考えられている。
特異的なエピトープ部位と関連するマーカー（ＣＤ３
３、ＣＤ３８、ＨＬＡ−Ｄｒ、ＣＤ１１７（c-kit）等
のマーカー）の存在の有無によって特定しようとされて
おり、現在、ヒト造血幹細胞としては、ＣＤ３４+ＣＤ
３３-、ＣＤ３４+ＣＤ３８-等の分画が、それに該当す
るのではないかと考えられている。
【０００５】また最近、stem cell factor（ＳＣＦ）の
レセプターであるＣＤ１１７（c-kit）をメルクマール
にした特定法では、ＣＤ３４+c-kitlow細胞が羊を用い
たin vivo実験において、移植可能な造血幹細胞である
ことが報告されている。
レセプターであるＣＤ１１７（c-kit）をメルクマール
にした特定法では、ＣＤ３４+c-kitlow細胞が羊を用い
たin vivo実験において、移植可能な造血幹細胞である
ことが報告されている。
【０００６】一方、in vitroの骨髄ストローマ細胞を用
いた長期培養系において、ＣＤ３４+c-kitlow細胞より
もＣＤ３４+c-kit-細胞の方が、より長期に培養可能で
あるとの報告もあり、その結論が待たれる所である。
いた長期培養系において、ＣＤ３４+c-kitlow細胞より
もＣＤ３４+c-kit-細胞の方が、より長期に培養可能で
あるとの報告もあり、その結論が待たれる所である。
【０００７】このような造血幹細胞は、移植ということ
に関しては、骨髄移植として白血病等の疾患に対して近
年活発に行なわれている。しかしながら、末梢血幹細胞
及び臍帯血幹細胞の移植は、骨髄移植に比して種々の利
点がある。
に関しては、骨髄移植として白血病等の疾患に対して近
年活発に行なわれている。しかしながら、末梢血幹細胞
及び臍帯血幹細胞の移植は、骨髄移植に比して種々の利
点がある。
【０００８】即ち、末梢血幹細胞は、自己幹細胞採取の
ためにアフェレーシスを行なうため、麻酔する必要がな
く、全身状態や臓器機能の悪い患者においても施術可能
であり、移植術後の造血回復速度が速く、正常ドナーか
らの血小板採取回数も減少し、患者と移植チームに対す
る負担が大幅に軽減する等の利点を有する。また、臍帯
血幹細胞は、通常廃棄されていた臍帯より採取するため
人体への負担が全くない利点があり、採取時にウイルス
等の感染の危険性もほとんどなく、移植後のＧＶＨＤも
起こりにくいとされている。
ためにアフェレーシスを行なうため、麻酔する必要がな
く、全身状態や臓器機能の悪い患者においても施術可能
であり、移植術後の造血回復速度が速く、正常ドナーか
らの血小板採取回数も減少し、患者と移植チームに対す
る負担が大幅に軽減する等の利点を有する。また、臍帯
血幹細胞は、通常廃棄されていた臍帯より採取するため
人体への負担が全くない利点があり、採取時にウイルス
等の感染の危険性もほとんどなく、移植後のＧＶＨＤも
起こりにくいとされている。
【０００９】このように、末梢血幹細胞移植及び臍帯血
幹細胞移植は、白血病等の腫瘍性疾患並びに重症再生不
良性貧血等の非腫瘍性疾患に対する根治的治療法とし
て、重要な位置を占めるようになってきている。
幹細胞移植は、白血病等の腫瘍性疾患並びに重症再生不
良性貧血等の非腫瘍性疾患に対する根治的治療法とし
て、重要な位置を占めるようになってきている。
【００１０】このような造血幹細胞移植の臨床展開と並
行して、造血幹細胞のex vivo増殖法の開発の重要性も
指摘され、活発な研究が行なわれているが、現在尚、造
血幹細胞を液体培養して、これをその自己複製能と全成
熟血球への分化能とを維持したままで、増殖させる技術
は、開発されるに至っていない。僅かにストローマ細胞
を用いた系が、知られてはいるが、これは以下の如き欠
点があり、実用面からは適さないと考えられる。
行して、造血幹細胞のex vivo増殖法の開発の重要性も
指摘され、活発な研究が行なわれているが、現在尚、造
血幹細胞を液体培養して、これをその自己複製能と全成
熟血球への分化能とを維持したままで、増殖させる技術
は、開発されるに至っていない。僅かにストローマ細胞
を用いた系が、知られてはいるが、これは以下の如き欠
点があり、実用面からは適さないと考えられる。
【００１１】即ち、第１に造血幹細胞はストローマ細胞
に接着する性質があり、その回収が困難であり、第２
に、ストローマ細胞は正と負の両方の増殖調節因子を産
生することにより巧妙に造血を制御しており、造血幹細
胞の自己複製刺激作用を選択的に強化することは、細胞
レベルでは困難であること等が挙げられる。
に接着する性質があり、その回収が困難であり、第２
に、ストローマ細胞は正と負の両方の増殖調節因子を産
生することにより巧妙に造血を制御しており、造血幹細
胞の自己複製刺激作用を選択的に強化することは、細胞
レベルでは困難であること等が挙げられる。
【００１２】また、造血幹細胞の培養技術は、上述した
幹細胞移植術の面からのみならず、遺伝子治療の面から
もその確立が急務とされている。
幹細胞移植術の面からのみならず、遺伝子治療の面から
もその確立が急務とされている。
【００１３】事実、遺伝子治療は、現在効果的な治療法
のない致死的な遺伝性疾患や、ある種の悪性腫瘍、エイ
ズのように既存の治療法の成績が極めて悪い疾患に対し
て治療効果が期待できること、他の疾患についても既存
の治療法より優れた治療法となること等から、新しい治
療法として急速に広がりを見せているものであり、該遺
伝子治療のための標的細胞として造血幹細胞を選択し、
これに遺伝子を導入するときには、造血幹細胞本来の自
己複製能によって、遺伝子の発現が永続し、これによる
効果も持続することが期待でき、この面より、遺伝子導
入操作を行なうべき造血幹細胞のex vivo増殖法の確立
が、斯界で望まれている。
のない致死的な遺伝性疾患や、ある種の悪性腫瘍、エイ
ズのように既存の治療法の成績が極めて悪い疾患に対し
て治療効果が期待できること、他の疾患についても既存
の治療法より優れた治療法となること等から、新しい治
療法として急速に広がりを見せているものであり、該遺
伝子治療のための標的細胞として造血幹細胞を選択し、
これに遺伝子を導入するときには、造血幹細胞本来の自
己複製能によって、遺伝子の発現が永続し、これによる
効果も持続することが期待でき、この面より、遺伝子導
入操作を行なうべき造血幹細胞のex vivo増殖法の確立
が、斯界で望まれている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来、効果的な培養技術が確立されていなかった造
血幹細胞の新しい液体培養技術を確立、提供することに
ある。
は、従来、効果的な培養技術が確立されていなかった造
血幹細胞の新しい液体培養技術を確立、提供することに
ある。
【００１５】本発明者は上記目的より鋭意研究を重ねた
結果、起源とする造血幹細胞として表現型がＣＤ３４+
及びc-kit-として特徴づけられる細胞を選択し、これを
造血幹細胞増殖因子の存在下に、付着性培養器により液
体培養するときには、得られる培養細胞は、全ての成熟
血球へ分化する能力を保持しており、かくして、上記目
的に合致する造血幹細胞の培養方法が確立できることを
見出し、ここに本発明を完成するに至った。
結果、起源とする造血幹細胞として表現型がＣＤ３４+
及びc-kit-として特徴づけられる細胞を選択し、これを
造血幹細胞増殖因子の存在下に、付着性培養器により液
体培養するときには、得られる培養細胞は、全ての成熟
血球へ分化する能力を保持しており、かくして、上記目
的に合致する造血幹細胞の培養方法が確立できることを
見出し、ここに本発明を完成するに至った。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、造血幹
細胞増殖因子の存在下に、表現型がＣＤ３４+及びc-kit
-として特徴づけられる増殖幹細胞を、付着性培養器に
より液体培養することを特徴とする造血幹細胞の培養方
法が提供される。
細胞増殖因子の存在下に、表現型がＣＤ３４+及びc-kit
-として特徴づけられる増殖幹細胞を、付着性培養器に
より液体培養することを特徴とする造血幹細胞の培養方
法が提供される。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明において、起源細胞として
は、表現型がＣＤ３４+及びc-kit-として特徴づけられ
るヒト造血幹細胞を用いることを必須とする。これは、
常法に従って、各種造血幹細胞より調製、単離（純化）
することができる。原料とする造血幹細胞は、末梢血幹
細胞、骨髄幹細胞及び臍帯血幹細胞のいずれでもよい。
またその調製、単離は、目的とする造血幹細胞のマーカ
ーを指標として通常の方法により行なうことができる。
その詳細は例えば、後記実施例に示されている。
は、表現型がＣＤ３４+及びc-kit-として特徴づけられ
るヒト造血幹細胞を用いることを必須とする。これは、
常法に従って、各種造血幹細胞より調製、単離（純化）
することができる。原料とする造血幹細胞は、末梢血幹
細胞、骨髄幹細胞及び臍帯血幹細胞のいずれでもよい。
またその調製、単離は、目的とする造血幹細胞のマーカ
ーを指標として通常の方法により行なうことができる。
その詳細は例えば、後記実施例に示されている。
【００１８】本発明に従う、造血幹細胞の増殖に利用で
きる造血幹細胞増殖因子としても、従来よりよく知られ
ている各種のコロニー刺激因子（ＣＳＦ，colony stimu
lating factor）等のいずれも同様に利用することがで
きる。その具体例としては、例えばサイトカイン類（ｆ
ｌｔ−３リガンド（flt-3 ligand：ＦＬ）、インター
ロイキン−６（interleukin-6：ＩＬ−６）等）、ＣＤ
３４分子の架橋（CD34cross-linking，ＣＤ３４Ｘ
Ｌ）、ＳＣＦ（stem cell factor）に対して相乗作用を
示すインターロイキン−７（interleukin-7：ＩＬ−
７）等を例示することができる。
きる造血幹細胞増殖因子としても、従来よりよく知られ
ている各種のコロニー刺激因子（ＣＳＦ，colony stimu
lating factor）等のいずれも同様に利用することがで
きる。その具体例としては、例えばサイトカイン類（ｆ
ｌｔ−３リガンド（flt-3 ligand：ＦＬ）、インター
ロイキン−６（interleukin-6：ＩＬ−６）等）、ＣＤ
３４分子の架橋（CD34cross-linking，ＣＤ３４Ｘ
Ｌ）、ＳＣＦ（stem cell factor）に対して相乗作用を
示すインターロイキン−７（interleukin-7：ＩＬ−
７）等を例示することができる。
【００１９】付着性培養器としては、ポリスチレン製の
培養器のうち、付着性細胞の培養を容易にするために接
着性を増強させる処理を表面に施してあるものを有利に
利用できる。この処理は、常法に従って容易に実施でき
る。但し、これは浮遊性細胞培養用の処理をしてあるも
のや付着性が著しく低い処理及び材質のものであっては
ならない。
培養器のうち、付着性細胞の培養を容易にするために接
着性を増強させる処理を表面に施してあるものを有利に
利用できる。この処理は、常法に従って容易に実施でき
る。但し、これは浮遊性細胞培養用の処理をしてあるも
のや付着性が著しく低い処理及び材質のものであっては
ならない。
【００２０】本発明に従う液体培養条件としては、特に
限定されることなく一般に用いられている各種の条件を
いずれも採用することができる。該培養は、代表的に
は、造血幹細胞を培養するためによく使用されている培
養液、例えばα−ＭＥＭ、イスコフ改変ダルベッコ培地
（ＩＭＤＭ）等の適当な培地に、非働化ＦＢＳ及び非働
化horse serumを１０％程度加えたもの、更に細胞の維
持及び増殖を促す添加物として、例えばｆｌｔ−３リガ
ンド（flt-3 ligand）の１００ｎｇ／ｍｌ、インターロ
イキン−６の１０ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン−７の
１０ｎｇ／ｍｌ、固相化した抗ＣＤ３４抗体（１０μｇ
／ｍｌの濃度でプレートに固相化したもの）を、それぞ
れ単独で或いは組み合わせて添加したものを用いて実施
することができる。培養条件は、通常のヒト細胞の培養
と同様でよく、一般には、３７℃、５％ＣＯ2下に行な
い得る。
限定されることなく一般に用いられている各種の条件を
いずれも採用することができる。該培養は、代表的に
は、造血幹細胞を培養するためによく使用されている培
養液、例えばα−ＭＥＭ、イスコフ改変ダルベッコ培地
（ＩＭＤＭ）等の適当な培地に、非働化ＦＢＳ及び非働
化horse serumを１０％程度加えたもの、更に細胞の維
持及び増殖を促す添加物として、例えばｆｌｔ−３リガ
ンド（flt-3 ligand）の１００ｎｇ／ｍｌ、インターロ
イキン−６の１０ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン−７の
１０ｎｇ／ｍｌ、固相化した抗ＣＤ３４抗体（１０μｇ
／ｍｌの濃度でプレートに固相化したもの）を、それぞ
れ単独で或いは組み合わせて添加したものを用いて実施
することができる。培養条件は、通常のヒト細胞の培養
と同様でよく、一般には、３７℃、５％ＣＯ2下に行な
い得る。
【００２１】本発明培養方法によって、得られる培養細
胞は、ＣＤ３４陽性であり、ＣＤ１１７（c-kit）の発
現が陰性から高い陽性（high）まで認められる特徴があ
り、更に、c-kitの発現が低い陽性（low）及びhighの細
胞に関しては、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−
ＣＳＦ、ＳＣＦ等の存在下で赤血球系コロニー、顆粒球
／マクロファージ系コロニー、マクロファジ系コロニ
ー、顆粒球／赤血球系／巨核球／マクロファージ系コロ
ニーを形成する能力を持っている点において特徴付けら
れる。
胞は、ＣＤ３４陽性であり、ＣＤ１１７（c-kit）の発
現が陰性から高い陽性（high）まで認められる特徴があ
り、更に、c-kitの発現が低い陽性（low）及びhighの細
胞に関しては、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−
ＣＳＦ、ＳＣＦ等の存在下で赤血球系コロニー、顆粒球
／マクロファージ系コロニー、マクロファジ系コロニ
ー、顆粒球／赤血球系／巨核球／マクロファージ系コロ
ニーを形成する能力を持っている点において特徴付けら
れる。
【００２２】
【実施例】以下本発明を更に詳しく説明するため実施例
を挙げる。
を挙げる。
【００２３】
【実施例１】 １．造血幹細胞（ＣＤ３４+c-kit-）の分離 （１）材料及び方法 インフォームドコンセントが行なわれた健常人ボランテ
ィアからの臍帯血をＡＣＤ−Ａ液（Terumo, Shibuya To
kyo, Japan, クエン酸ナトリウム２．２０ｗ／ｖ％、ク
エン酸０．８０ｗ／ｖ％、ブドウ糖２．２０w/v％、ｐ
Ｈ４．５−５．５）６ｍｌ入り５０ｍｌチューブに採取
し、これに２％デキストラン溶液（Dextran T-500(Phar
macia, Uppsala, Sweden）を２％（w/v）で生理食塩水
に溶解下もの）を容積比２：１となる割合で添加し、攪
拌後、３０分間静置し、上清を臍帯血有核血球（Cord B
lood Nuclear Cells, CBNC）分画として回収した。
ィアからの臍帯血をＡＣＤ−Ａ液（Terumo, Shibuya To
kyo, Japan, クエン酸ナトリウム２．２０ｗ／ｖ％、ク
エン酸０．８０ｗ／ｖ％、ブドウ糖２．２０w/v％、ｐ
Ｈ４．５−５．５）６ｍｌ入り５０ｍｌチューブに採取
し、これに２％デキストラン溶液（Dextran T-500(Phar
macia, Uppsala, Sweden）を２％（w/v）で生理食塩水
に溶解下もの）を容積比２：１となる割合で添加し、攪
拌後、３０分間静置し、上清を臍帯血有核血球（Cord B
lood Nuclear Cells, CBNC）分画として回収した。
【００２４】この分画をLymphoprep（Nycomed, Oslo, N
orway）に重層し、２０００rpm、３０分間遠心すること
により単核球画分（Cord Blood Monoclear Cells, CBMN
C）を得た。
orway）に重層し、２０００rpm、３０分間遠心すること
により単核球画分（Cord Blood Monoclear Cells, CBMN
C）を得た。
【００２５】更に、ＣＤ３４マルチソートキット（CD34
multisortkit, Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,
Germany）及びミニマックス（MiniMACS, Miltenyi Biot
ec,Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を
用いてＣＤ３４+細胞を単離した。
multisortkit, Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,
Germany）及びミニマックス（MiniMACS, Miltenyi Biot
ec,Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany）を
用いてＣＤ３４+細胞を単離した。
【００２６】このＣＤ３４+細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ
３４クラスIII抗体（HPCA2, Cat. No. 348053, Becton
Dickenson Immunocytometry Systms, San Jose, CA, US
A）及びＰＥ標識抗c-kit抗体（Cat. No. 1360, Immunot
ech, Merseile, France）で二重染色し、FACStar (Bect
on Dickenson Immunocytometry Systems, San Jose, C
A,USA)を用いてソートした。
３４クラスIII抗体（HPCA2, Cat. No. 348053, Becton
Dickenson Immunocytometry Systms, San Jose, CA, US
A）及びＰＥ標識抗c-kit抗体（Cat. No. 1360, Immunot
ech, Merseile, France）で二重染色し、FACStar (Bect
on Dickenson Immunocytometry Systems, San Jose, C
A,USA)を用いてソートした。
【００２７】また、アイソタイプ適合コントロールとし
てＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１（Cat. No.9041, Becton
Dickenson Immunocytometry Systems, San Jose, CA,
USA）及びＰＥ標識マウスＩｇＧ１（Cat. No.9043, Bec
ton Dickenson Immunocytometry Systems, San Jose, C
A, USA）を用いた。
てＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１（Cat. No.9041, Becton
Dickenson Immunocytometry Systems, San Jose, CA,
USA）及びＰＥ標識マウスＩｇＧ１（Cat. No.9043, Bec
ton Dickenson Immunocytometry Systems, San Jose, C
A, USA）を用いた。
【００２８】単離した細胞のコロニー形成能を調べるた
めに、完全メチルセルロース培地（Methocult GF H4434
V, Stemcell technoloies Inc., Vancouver, BC, Canad
a）に懸濁して０．８ｍｌづつ１２ウェルプレート（Ca
t. No. 76-063-05, Flow Laboratories Inc., McLean,
USA）に播種して、３７℃、５％ＣＯ2の条件でＣＯ2イ
ンキュベーター（Tabai, Japan）中にて培養を行ない、
１４日後に倒立顕微鏡下においてコロニーを判別及び計
測し、ＢＦＵ−Ｅ（Burst-forming unit-erythroid）、
ＣＦＵ−ＧＭ（Colony-forming unit-granulocyte/macr
ophage）、ＣＦＵ−Ｍ（Colony-forming unit-macropha
ge）及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ（Colony-forming unit-gran
ulocyte/erythroid/megakaryocyte/macrophage）数を算
出した。
めに、完全メチルセルロース培地（Methocult GF H4434
V, Stemcell technoloies Inc., Vancouver, BC, Canad
a）に懸濁して０．８ｍｌづつ１２ウェルプレート（Ca
t. No. 76-063-05, Flow Laboratories Inc., McLean,
USA）に播種して、３７℃、５％ＣＯ2の条件でＣＯ2イ
ンキュベーター（Tabai, Japan）中にて培養を行ない、
１４日後に倒立顕微鏡下においてコロニーを判別及び計
測し、ＢＦＵ−Ｅ（Burst-forming unit-erythroid）、
ＣＦＵ−ＧＭ（Colony-forming unit-granulocyte/macr
ophage）、ＣＦＵ−Ｍ（Colony-forming unit-macropha
ge）及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ（Colony-forming unit-gran
ulocyte/erythroid/megakaryocyte/macrophage）数を算
出した。
【００２９】各実験は４回行ない、結果は平均（Mean）
±標準誤差（ＳＥ）にて表記した。
±標準誤差（ＳＥ）にて表記した。
【００３０】（２）結果 ヒト臍帯血よりＣＤ３４マルチソートキットを用いた免
疫ビーズ法による陽性選択（positive selection）で得
られたＣＤ３４+細胞分画を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４
クラスIII抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体の二重染色、又
はアイソタイプ適合コントロールであるＦＩＴＣ標識マ
ウスＩｇＧ１及びＰＥ標識マウスＩｇＧ１の二重染色し
たパターンを、前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳ
Ｃ）のパターンと共に図１に示す。
疫ビーズ法による陽性選択（positive selection）で得
られたＣＤ３４+細胞分画を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４
クラスIII抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体の二重染色、又
はアイソタイプ適合コントロールであるＦＩＴＣ標識マ
ウスＩｇＧ１及びＰＥ標識マウスＩｇＧ１の二重染色し
たパターンを、前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳ
Ｃ）のパターンと共に図１に示す。
【００３１】図１中、ＡはＣＢＭＮＣより陽性選択した
ＣＤ３４+細胞のＦＳＣ−ＳＳＣパターンを示し、これ
より、blast gate（Ｒ１）かけた集団のＦＩＴＣ−ＰＥ
パターンを図１のＢ及びＣに示す。ＣはＦＩＴＣ標識抗
ＣＤ３４クラスIII抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体で二重
染色した結果を、Ｂはアイソタイプ適合コントロールで
あるＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１及びＰＥ標識マウスＩ
ｇＧ１で二重染色した結果をそれぞれ示す。また、図１
のＣ中、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれＣＤ３４+c-kit
-、ＣＤ３４+c-kitlow及びＣＤ３４+c-kithighをソーテ
ィングするためのゲートである。
ＣＤ３４+細胞のＦＳＣ−ＳＳＣパターンを示し、これ
より、blast gate（Ｒ１）かけた集団のＦＩＴＣ−ＰＥ
パターンを図１のＢ及びＣに示す。ＣはＦＩＴＣ標識抗
ＣＤ３４クラスIII抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体で二重
染色した結果を、Ｂはアイソタイプ適合コントロールで
あるＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１及びＰＥ標識マウスＩ
ｇＧ１で二重染色した結果をそれぞれ示す。また、図１
のＣ中、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれＣＤ３４+c-kit
-、ＣＤ３４+c-kitlow及びＣＤ３４+c-kithighをソーテ
ィングするためのゲートである。
【００３２】ＣＤ３４陽性細胞のうち、ＰＥ標識マウス
ＩｇＧ１を用いたネガティブ細胞の蛍光強度より充分に
低い蛍光強度の画分をc-kit陰性画分とし、ネガティブ
細胞の蛍光強度より少し強い画分をc-kit弱陽性とし、
またc-kitが最も強い発現量を示す画分をc-kit強陽性画
分として、それぞれゲート設定した。
ＩｇＧ１を用いたネガティブ細胞の蛍光強度より充分に
低い蛍光強度の画分をc-kit陰性画分とし、ネガティブ
細胞の蛍光強度より少し強い画分をc-kit弱陽性とし、
またc-kitが最も強い発現量を示す画分をc-kit強陽性画
分として、それぞれゲート設定した。
【００３３】上記で設定したＦＡＣＳｔａｒを用いてそ
れぞれの細胞をソートし、分けられた分画を同様に設定
されたＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Immunocytom
etrySystems, SanJose, CA, USA）を用いて再解析した
結果、ＣＤ３４+c-kit-分画、ＣＤ３４+c-kitlow分画及
びＣＤ３４+c-kithigh分画において、設定通りの細胞が
得られていることが確認された。
れぞれの細胞をソートし、分けられた分画を同様に設定
されたＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Immunocytom
etrySystems, SanJose, CA, USA）を用いて再解析した
結果、ＣＤ３４+c-kit-分画、ＣＤ３４+c-kitlow分画及
びＣＤ３４+c-kithigh分画において、設定通りの細胞が
得られていることが確認された。
【００３４】次に、之等の各分画の細胞のコロニー形成
能を調べるために行なわれたメチルセルロース培地を用
いたコロニー形成分析の結果は、表１に示す通りであ
る。
能を調べるために行なわれたメチルセルロース培地を用
いたコロニー形成分析の結果は、表１に示す通りであ
る。
【００３５】
【表１】
【００３６】該表１より、c-kitの発現が高い分画ほ
ど、コロニー形成能も高く、特にＣＤ３４+c-kit-分画
ではコロニー形成能を殆ど有していないことが示され
た。
ど、コロニー形成能も高く、特にＣＤ３４+c-kit-分画
ではコロニー形成能を殆ど有していないことが示され
た。
【００３７】２．造血幹細胞の培養 （１）材料と方法 得られたＣＤ３４+c-kit-分画、ＣＤ３４+c-kitlow分画
及びＣＤ３４+c-kithigh分画を、それぞれ１０％熱非働
化牛胎児血清（ＦＢＳ, Stemcell TechnologyInc., Van
couver, BC, Canada）及び１０％熱非働化ウマ血清（Ho
S, Stemcell Technology Inc., Vancouver, BC, Canad
a）を含むα−変性イーグルス培地（ＭＥＭ、Gibco, Gr
and Island, NY, USA）に懸濁させ、付着性２４ウェル
プレート（Cat. No. 76-063-05, Flow Laboratories In
c., McLean, USA）に播種した。
及びＣＤ３４+c-kithigh分画を、それぞれ１０％熱非働
化牛胎児血清（ＦＢＳ, Stemcell TechnologyInc., Van
couver, BC, Canada）及び１０％熱非働化ウマ血清（Ho
S, Stemcell Technology Inc., Vancouver, BC, Canad
a）を含むα−変性イーグルス培地（ＭＥＭ、Gibco, Gr
and Island, NY, USA）に懸濁させ、付着性２４ウェル
プレート（Cat. No. 76-063-05, Flow Laboratories In
c., McLean, USA）に播種した。
【００３８】また、細胞を非付着性２４ウェルプレート
（浮遊培養用マルチプレート；Cat.No. MS-8024R, Sumi
tomo Bankelite Co., Ltd., Tokyo, Japan）及びスクリ
ューキャップ付きポリプロピレン製１．７ｍｌチューブ
（GENE twist top vial, Cat.No. 1441, Yashima Purec
hemicals Co., Ltd., Osaka, Japan）にも播種した。
（浮遊培養用マルチプレート；Cat.No. MS-8024R, Sumi
tomo Bankelite Co., Ltd., Tokyo, Japan）及びスクリ
ューキャップ付きポリプロピレン製１．７ｍｌチューブ
（GENE twist top vial, Cat.No. 1441, Yashima Purec
hemicals Co., Ltd., Osaka, Japan）にも播種した。
【００３９】之等のプレート及びチューブを３７℃、５
％ＣＯ2の条件下、ＣＯ2インキュベーター（Tabai, Jap
an）中にて培養した。
％ＣＯ2の条件下、ＣＯ2インキュベーター（Tabai, Jap
an）中にて培養した。
【００４０】培養液中に添加するサイトカインとして、
組換えヒトＦＬ（recombinant human flt-3 ligand, rh
FL, Cat. No. 80-3692-01, Genzyme, Cambrige, MA, US
A）、組換えヒトＩＬ−６（recombinant human IL-6, r
hIL-6, Cat. No. 1131567,Boehlinger Mannheim Biomed
ica, Germany）及び組換えヒトＩＬ−７（recombinant
human IL-7, rhIL-7, Cat. No. F1-1587-1, Genzyme, C
ambrige, MA, USA）をそれぞれ用いた。
組換えヒトＦＬ（recombinant human flt-3 ligand, rh
FL, Cat. No. 80-3692-01, Genzyme, Cambrige, MA, US
A）、組換えヒトＩＬ−６（recombinant human IL-6, r
hIL-6, Cat. No. 1131567,Boehlinger Mannheim Biomed
ica, Germany）及び組換えヒトＩＬ−７（recombinant
human IL-7, rhIL-7, Cat. No. F1-1587-1, Genzyme, C
ambrige, MA, USA）をそれぞれ用いた。
【００４１】抗ＣＤ３４クラスIII抗体（Cat. No. 5500
18, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, SanJ
ose, CA, USA）を１０μｇ／ｍｌの濃度となるようにＰ
ＢＳ(-)で希釈し、２４ウェルプレートに３００μｌづ
つ添加した。
18, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, SanJ
ose, CA, USA）を１０μｇ／ｍｌの濃度となるようにＰ
ＢＳ(-)で希釈し、２４ウェルプレートに３００μｌづ
つ添加した。
【００４２】３７℃で６０分間インキュベートし、抗体
溶液を除いた後、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％Ｈ
ｏＳ）を添加して、３７℃で３０分間ブロッキングし
た。
溶液を除いた後、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％Ｈ
ｏＳ）を添加して、３７℃で３０分間ブロッキングし
た。
【００４３】ＰＢＳ（０．１％ＦＢＳ含有）で各ウェル
を３回洗浄後、抗ＣＤ３４抗体固相化プレートとして実
験に用いてＣＤ３４ＸＬを行なった。
を３回洗浄後、抗ＣＤ３４抗体固相化プレートとして実
験に用いてＣＤ３４ＸＬを行なった。
【００４４】細胞は、液体培養後ピペッティング操作に
より２４ウェルプレートより回収し、一部を完全メチル
セルロース培地（Methocult GF H4434V, Stemcell tech
noloies Inc., Vancouver, BC, Canada）に懸濁させて
０．８ｍｌづつ１２ウェルプレート（Cat. No. 76-063-
05, Flow Laboratories Inc., McLean, USA）に播種し
て３７℃、５％ＣＯ2の条件でＣＯ2インキュベーター
（Tabai, Japan）中にて培養を行ない、１４日後に倒立
顕微鏡下においてコロニーを判別及び計測し、ＢＦＵ−
Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ数
を算出した。
より２４ウェルプレートより回収し、一部を完全メチル
セルロース培地（Methocult GF H4434V, Stemcell tech
noloies Inc., Vancouver, BC, Canada）に懸濁させて
０．８ｍｌづつ１２ウェルプレート（Cat. No. 76-063-
05, Flow Laboratories Inc., McLean, USA）に播種し
て３７℃、５％ＣＯ2の条件でＣＯ2インキュベーター
（Tabai, Japan）中にて培養を行ない、１４日後に倒立
顕微鏡下においてコロニーを判別及び計測し、ＢＦＵ−
Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ数
を算出した。
【００４５】各実験は４回行ない、結果は平均（Mean）
±標準誤差（ＳＥ）にて表記した。
±標準誤差（ＳＥ）にて表記した。
【００４６】また残りはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラス
III抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体で染色し、ＣＤ３４及
びc-kitの発現量をＦＡＣＳｃａｎで測定し、平均蛍光
強度（Mean fluorescense intesity）を検出器のチャン
ネルで表わした。
III抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体で染色し、ＣＤ３４及
びc-kitの発現量をＦＡＣＳｃａｎで測定し、平均蛍光
強度（Mean fluorescense intesity）を検出器のチャン
ネルで表わした。
【００４７】（２）結果 単離したＣＤ３４+c-kit-細胞分画（Ｒ２）、ＣＤ３４+
c-kitlow細胞分画（Ｒ３）及びＣＤ３４+c-kithigh細胞
分画（Ｒ４）を、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％Ｈ
ｏＳ含有）に懸濁させて、付着性２４ウェルプレートに
て２４時間培養した。培養前の各分画Ｒ２、Ｒ３及びＲ
４の細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII抗体及び
ＰＥ標識抗c-kit抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳcanを用
いてＣＤ３４+細胞におけるc-kit分子の発現状態を調べ
た。
c-kitlow細胞分画（Ｒ３）及びＣＤ３４+c-kithigh細胞
分画（Ｒ４）を、α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％Ｈ
ｏＳ含有）に懸濁させて、付着性２４ウェルプレートに
て２４時間培養した。培養前の各分画Ｒ２、Ｒ３及びＲ
４の細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII抗体及び
ＰＥ標識抗c-kit抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳcanを用
いてＣＤ３４+細胞におけるc-kit分子の発現状態を調べ
た。
【００４８】その結果を図２に示す。
【００４９】図２は、培養前、ソーティング後の各分画
（Ｒ２、Ｒ３及びＲ４）のパターン（Ａ）及び２４時間
培養後の各分画（Ｒ２、Ｒ３及びＲ４）のパターン
（Ｂ）をそれぞれ示す。
（Ｒ２、Ｒ３及びＲ４）のパターン（Ａ）及び２４時間
培養後の各分画（Ｒ２、Ｒ３及びＲ４）のパターン
（Ｂ）をそれぞれ示す。
【００５０】図２より、全ての分画において、培養前
（Ａ）に比べて、２４時間培養後（Ｂ）のc-kitの発現
が増強され、特にＣＤ３４+c-kit-においてもc-kit分子
の発現が認められたが、２４時間後に回収される細胞数
は少なかった。
（Ａ）に比べて、２４時間培養後（Ｂ）のc-kitの発現
が増強され、特にＣＤ３４+c-kit-においてもc-kit分子
の発現が認められたが、２４時間後に回収される細胞数
は少なかった。
【００５１】この細胞の回収率を向上させるため、サイ
トカイン（ＦＬ、ＩＬ−６）を選択し、また固相化抗Ｃ
Ｄ３４抗体を用いたＣＤ３４分子の架橋（CD34 cross-l
inking：ＣＤ３４ＸＬ）及びＳＣＦ（stem cell facto
r）に対して相乗作用を示すＩＬ−７をそれぞれ単独又
はコンビネーションで培地中に添加して培養を行なっ
た。
トカイン（ＦＬ、ＩＬ−６）を選択し、また固相化抗Ｃ
Ｄ３４抗体を用いたＣＤ３４分子の架橋（CD34 cross-l
inking：ＣＤ３４ＸＬ）及びＳＣＦ（stem cell facto
r）に対して相乗作用を示すＩＬ−７をそれぞれ単独又
はコンビネーションで培地中に添加して培養を行なっ
た。
【００５２】即ち、ＣＤ３４+c-kit-細胞７０００個づ
つをそれぞれ２４ウェルプレートに播種し、上記各添加
物の所定量を添加（無添加を対照とする）して、３日間
培養し、培養細胞をピペッティングにより回収して細胞
数を計測した。
つをそれぞれ２４ウェルプレートに播種し、上記各添加
物の所定量を添加（無添加を対照とする）して、３日間
培養し、培養細胞をピペッティングにより回収して細胞
数を計測した。
【００５３】その後、細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４ク
ラスIII抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体を用いて染色し
て、ＦＡＣＳｃａｎを用いてＣＤ３４+細胞におけるc-k
it分子の発現状態を調べた。
ラスIII抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体を用いて染色し
て、ＦＡＣＳｃａｎを用いてＣＤ３４+細胞におけるc-k
it分子の発現状態を調べた。
【００５４】その結果を図３に示す。
【００５５】図３において、（Ａ）は無添加対照（培地
のみ）を、（Ｂ）はＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）添加を、
（Ｃ）はＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）添加を、（Ｄ）は
固相化抗ＣＤ３４抗体を用いたＣＤ３４ＸＬを、（Ｅ）
はＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）添加を、（Ｆ）はＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ
−６（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）
添加を、（Ｇ）はＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−６
（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｃ
Ｄ３４ＸＬ添加をそれぞれ示す。
のみ）を、（Ｂ）はＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）添加を、
（Ｃ）はＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）添加を、（Ｄ）は
固相化抗ＣＤ３４抗体を用いたＣＤ３４ＸＬを、（Ｅ）
はＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）添加を、（Ｆ）はＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ
−６（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）
添加を、（Ｇ）はＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−６
（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）＋Ｃ
Ｄ３４ＸＬ添加をそれぞれ示す。
【００５６】また、回収された細胞数を計測した結果を
下記表２に示す。
下記表２に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】図３及び表２より、付着性プレート上での
培養において、ＦＬ、ＩＬ−６及びＣＤ３４ＸＬの添加
はいずれもc-kit分子を発現させ、且つ細胞の回収率を
向上させることが明らかであり、特にＦＬはその添加に
よりＣＤ３４+c-kit-細胞に対して単独で最も細胞回収
率及び発現強度を高めるサイトカインであることが示さ
れた。また、之等の併用によれば、回収率は一層向上
し、特にＦＬ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−７群及びＦＬ＋ＩＬ−
６＋ＩＬ−７＋ＣＤ３４ＸＬ群では、添加した細胞とほ
ぼ同程度の細胞を回収できた。
培養において、ＦＬ、ＩＬ−６及びＣＤ３４ＸＬの添加
はいずれもc-kit分子を発現させ、且つ細胞の回収率を
向上させることが明らかであり、特にＦＬはその添加に
よりＣＤ３４+c-kit-細胞に対して単独で最も細胞回収
率及び発現強度を高めるサイトカインであることが示さ
れた。また、之等の併用によれば、回収率は一層向上
し、特にＦＬ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−７群及びＦＬ＋ＩＬ−
６＋ＩＬ−７＋ＣＤ３４ＸＬ群では、添加した細胞とほ
ぼ同程度の細胞を回収できた。
【００５９】次に、上記ＦＬ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−７＋Ｃ
Ｄ３４ＸＬ群におけるc-kit分子発現のカイネティック
スをとった結果、培養後１〜３日の時点において、c-ki
t分子の発現は急激に上昇し、８日目にピークに達する
ことが明らかとなった。一方、この培養系では、培養３
日目でＣＤ３４-c-kit-の細胞集団が出現し、これは更
に分化の進んだ細胞であると考えられた。
Ｄ３４ＸＬ群におけるc-kit分子発現のカイネティック
スをとった結果、培養後１〜３日の時点において、c-ki
t分子の発現は急激に上昇し、８日目にピークに達する
ことが明らかとなった。一方、この培養系では、培養３
日目でＣＤ３４-c-kit-の細胞集団が出現し、これは更
に分化の進んだ細胞であると考えられた。
【００６０】更に、ＣＤ３４+c-kit-細胞の培養により
誘導された上記ＣＤ３４+c-kit+細胞がどのようなコロ
ニー形成能を有しているかを調べるために、ＣＤ３４+c
-kit-細胞を付着性プレート上で、ＦＬ＋ＩＬ−６＋Ｉ
Ｌ−７＋ＣＤ３４ＸＬで刺激、培養して４８時間目に培
養細胞を回収して、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII
抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体を用いて染色して、ＦＡ
ＣＳｔａｒを用いて、図１のＣで示したＲ３（ＣＤ３４
+c-kitlow）及びＲ４（ＣＤ３４+c-kithigh）の各細胞
の分画をソートし、その細胞のコロニー形成能をコロニ
ーフォーミングアッセイにて調べた。
誘導された上記ＣＤ３４+c-kit+細胞がどのようなコロ
ニー形成能を有しているかを調べるために、ＣＤ３４+c
-kit-細胞を付着性プレート上で、ＦＬ＋ＩＬ−６＋Ｉ
Ｌ−７＋ＣＤ３４ＸＬで刺激、培養して４８時間目に培
養細胞を回収して、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII
抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体を用いて染色して、ＦＡ
ＣＳｔａｒを用いて、図１のＣで示したＲ３（ＣＤ３４
+c-kitlow）及びＲ４（ＣＤ３４+c-kithigh）の各細胞
の分画をソートし、その細胞のコロニー形成能をコロニ
ーフォーミングアッセイにて調べた。
【００６１】この結果を、誘導前のＣＤ３４+c-kit-細
胞のコロニー形成能及び同時にソートしたＣＤ３４+c-k
itlow細胞とＣＤ３４+c-kithigh細胞のそれぞれのコロ
ニー形成能の結果と共に、下記表３に示す。
胞のコロニー形成能及び同時にソートしたＣＤ３４+c-k
itlow細胞とＣＤ３４+c-kithigh細胞のそれぞれのコロ
ニー形成能の結果と共に、下記表３に示す。
【００６２】
【表３】
【００６３】表３より、ＣＤ３４+c-kit-細胞を付着性
プレート上でＦＬ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−７＋ＣＤ３４ＸＬ
で刺激、培養後に誘導されたＣＤ３４+c-kitlow細胞及
びＣＤ３４+c-kithigh細胞は、誘導前のＣＤ３４+c-kit
-細胞に比べて、コロニー形成能が著しく増加し、最初
に単離したＣＤ３４+c-kitlow細胞及びＣＤ３４+c-kit
high細胞（前記表１参照）と同程度のコロニー形成能を
有することが明らかとなった。
プレート上でＦＬ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−７＋ＣＤ３４ＸＬ
で刺激、培養後に誘導されたＣＤ３４+c-kitlow細胞及
びＣＤ３４+c-kithigh細胞は、誘導前のＣＤ３４+c-kit
-細胞に比べて、コロニー形成能が著しく増加し、最初
に単離したＣＤ３４+c-kitlow細胞及びＣＤ３４+c-kit
high細胞（前記表１参照）と同程度のコロニー形成能を
有することが明らかとなった。
【００６４】最後に、ＣＤ３４+c-kit-細胞からのc-kit
分子の発現誘導が付着性プレート以外の培養器において
も起こり得るものであるか否かを調べるために、ＣＤ３
４+c-kit-細胞を付着性の少ない浮遊細胞培養用プレー
ト及び細胞の付着がほとんどないポリプロピレン製チュ
ーブにそれぞれ播種して、５％ＣＯ2、３７℃下に２４
時間培養を行なった。
分子の発現誘導が付着性プレート以外の培養器において
も起こり得るものであるか否かを調べるために、ＣＤ３
４+c-kit-細胞を付着性の少ない浮遊細胞培養用プレー
ト及び細胞の付着がほとんどないポリプロピレン製チュ
ーブにそれぞれ播種して、５％ＣＯ2、３７℃下に２４
時間培養を行なった。
【００６５】その結果を図４に示す。
【００６６】図において、ＡはＣＤ３４+c-kit-細胞を
α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％ＨｏＳ）のみに懸濁
させて浮遊細胞培養用プレートで培養した結果を、Ｂは
ＣＤ３４+c-kit-細胞をＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含
むα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％ＨｏＳ）に懸濁さ
せて浮遊細胞培養用プレートで培養した結果を、またＣ
はＣＤ３４+c-kit-細胞をα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋
１０％ＨｏＳ）のみに懸濁させてプロピレン製チューブ
で培養した結果をそれぞれ示す。
α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％ＨｏＳ）のみに懸濁
させて浮遊細胞培養用プレートで培養した結果を、Ｂは
ＣＤ３４+c-kit-細胞をＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含
むα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋１０％ＨｏＳ）に懸濁さ
せて浮遊細胞培養用プレートで培養した結果を、またＣ
はＣＤ３４+c-kit-細胞をα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ＋
１０％ＨｏＳ）のみに懸濁させてプロピレン製チューブ
で培養した結果をそれぞれ示す。
【００６７】図４によれば、図２のＢ（Ｒ２）及び図３
の（Ａ）に比べて、付着性の低い培養器ほど、c-kit分
子の発現誘導が低下することが明らかとなった。特に、
プロピレン製チューブを用いた場合においては、全くc-
kit分子の誘導は認められなかった。また、このc-kit分
子の発現誘導の低下は、ＦＬの添加によっても回復させ
ることはできなかった。
の（Ａ）に比べて、付着性の低い培養器ほど、c-kit分
子の発現誘導が低下することが明らかとなった。特に、
プロピレン製チューブを用いた場合においては、全くc-
kit分子の誘導は認められなかった。また、このc-kit分
子の発現誘導の低下は、ＦＬの添加によっても回復させ
ることはできなかった。
【００６８】之等のことより、ＣＤ３４+c-kit-細胞を
液体培養において、ＦＬ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−７＋ＣＤ３
４ＸＬで刺激、培養してＣＤ３４+c-kitlow/high細胞を
得るためには、付着性の培養器が必須であることが示さ
れた。
液体培養において、ＦＬ＋ＩＬ−６＋ＩＬ−７＋ＣＤ３
４ＸＬで刺激、培養してＣＤ３４+c-kitlow/high細胞を
得るためには、付着性の培養器が必須であることが示さ
れた。
【図１】実施例１に従い、ヒト臍帯血よりＣＤ３４マル
チソートキットを用いた免疫ビーズ法による陽性選択
（positive selection）で得られたＣＤ３４+細胞分画
を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII抗体及びＰＥ標
識抗c-kit抗体の二重染色、又はアイソタイプ適合コン
トロールであるＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１及びＰＥ標
識マウスＩｇＧ１の二重染色したパターンを、前方散乱
（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）のパターンと共に示
すグラフである。
チソートキットを用いた免疫ビーズ法による陽性選択
（positive selection）で得られたＣＤ３４+細胞分画
を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII抗体及びＰＥ標
識抗c-kit抗体の二重染色、又はアイソタイプ適合コン
トロールであるＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１及びＰＥ標
識マウスＩｇＧ１の二重染色したパターンを、前方散乱
（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）のパターンと共に示
すグラフである。
【図２】実施例１に従い、ＦＡＣＳｔａｒでソーティン
グしたＣＤ３４+c-kit-細胞（Ｒ２）、ＣＤ３４+c-kit
low細胞（Ｒ３）及びＣＤ３４+c-kithigh細胞（Ｒ４）
を培地のみに懸濁させ、付着性プレート上で２４時間培
養した後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII抗体及び
ＰＥ標識抗c-kit抗体で染色し、ＦＡＣＳcanを用いて培
養後の細胞におけるc-kit分子の発現状態を調べた結果
を、培養前（ＦＡＣＳｔａｒを用いてソーティング後）
の細胞のＣＤ３４とc-kitの発現パターンと合わせて示
すグラフである。
グしたＣＤ３４+c-kit-細胞（Ｒ２）、ＣＤ３４+c-kit
low細胞（Ｒ３）及びＣＤ３４+c-kithigh細胞（Ｒ４）
を培地のみに懸濁させ、付着性プレート上で２４時間培
養した後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII抗体及び
ＰＥ標識抗c-kit抗体で染色し、ＦＡＣＳcanを用いて培
養後の細胞におけるc-kit分子の発現状態を調べた結果
を、培養前（ＦＡＣＳｔａｒを用いてソーティング後）
の細胞のＣＤ３４とc-kitの発現パターンと合わせて示
すグラフである。
【図３】実施例１に従い、ＣＤ３４+c-kit-細胞を、各
添加物の存在下に培養後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラ
スIII抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体を用いて染色し、Ｆ
ＡＣＳｃａｎを用いて培養後の細胞におけるc-kit分子
の発現状態を調べた結果を示すグラフである。
添加物の存在下に培養後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラ
スIII抗体及びＰＥ標識抗c-kit抗体を用いて染色し、Ｆ
ＡＣＳｃａｎを用いて培養後の細胞におけるc-kit分子
の発現状態を調べた結果を示すグラフである。
【図４】実施例１に従い、ＣＤ３４+c-kit-細胞を、培
地のみ、或いはＦＬ存在下で非付着性培養器中で２４時
間培養後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII抗体及び
ＰＥ標識抗c-kit抗体で染色し、ＦＡＣＳcanを用いて培
養後の細胞におけるc-kit分子の発現状態を調べた結果
を示すグラフである。
地のみ、或いはＦＬ存在下で非付着性培養器中で２４時
間培養後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４クラスIII抗体及び
ＰＥ標識抗c-kit抗体で染色し、ＦＡＣＳcanを用いて培
養後の細胞におけるc-kit分子の発現状態を調べた結果
を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】 造血幹細胞増殖因子の存在下に、表現型
がＣＤ３４+及びc-kit-として特徴づけられるヒト造血
幹細胞を、付着性培養器により液体培養することを特徴
とする造血幹細胞の培養方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8296041A JPH10136978A (ja) | 1996-11-08 | 1996-11-08 | 造血幹細胞の培養方法 |
| PCT/JP1997/003797 WO1998021313A1 (fr) | 1996-11-08 | 1997-10-21 | Procede pour la mise en culture de cellules souches hematopoïetiques |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8296041A JPH10136978A (ja) | 1996-11-08 | 1996-11-08 | 造血幹細胞の培養方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10136978A true JPH10136978A (ja) | 1998-05-26 |
Family
ID=17828345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8296041A Pending JPH10136978A (ja) | 1996-11-08 | 1996-11-08 | 造血幹細胞の培養方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10136978A (ja) |
| WO (1) | WO1998021313A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014203A1 (fr) * | 1998-09-02 | 2000-03-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de preparation d'une fraction de cellule contenant des cellules souches hematopoietiques |
| JP2003501081A (ja) * | 1999-06-03 | 2003-01-14 | サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク | 幹細胞の増殖工程 |
| US7510877B2 (en) | 2003-09-26 | 2009-03-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Hematopoietic stem cell identification and isolation |
| US8157774B1 (en) | 2006-03-16 | 2012-04-17 | Deka Products Limited Partnership | Apparatus for stem cell collection and methods thereof |
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|---|---|---|---|---|
| US6383481B1 (en) | 1998-03-30 | 2002-05-07 | Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd. | Method for transplantation of hemopoietic stem cells |
| US7666615B2 (en) | 2001-01-29 | 2010-02-23 | Hemogenix, Inc. | High-throughput assay of hematopoietic stem and progenitor cell proliferation |
| US7989178B2 (en) | 2001-01-29 | 2011-08-02 | Hemogenix, Inc. | Colony assay miniaturization with enumeration output |
| EP1364197B1 (en) | 2001-01-29 | 2010-04-14 | Ivan N. Rich | ATP-based assay for the determination of the proliferation status of hematopoietic stem and progenitor cells |
| US7354730B2 (en) | 2002-01-29 | 2008-04-08 | Hemogenix, Inc. | High-throughput assay of hematopoietic stem and progenitor cell proliferation |
| EP1539997A4 (en) * | 2002-08-21 | 2007-04-25 | Ivan N Rich | HIGH-PERFORMANCE PROLIFERATION ASSAY OF HEMATOPOIETIC STRAINS AND PROGENITOR CELLS |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06508987A (ja) * | 1991-04-09 | 1994-10-13 | インディアナ・ユニバーシティ・ファンデーション | 造血細胞を支持するシステム及び方法 |
-
1996
- 1996-11-08 JP JP8296041A patent/JPH10136978A/ja active Pending
-
1997
- 1997-10-21 WO PCT/JP1997/003797 patent/WO1998021313A1/ja active Application Filing
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000014203A1 (fr) * | 1998-09-02 | 2000-03-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de preparation d'une fraction de cellule contenant des cellules souches hematopoietiques |
| JP2003501081A (ja) * | 1999-06-03 | 2003-01-14 | サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク | 幹細胞の増殖工程 |
| US7510877B2 (en) | 2003-09-26 | 2009-03-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Hematopoietic stem cell identification and isolation |
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| US8383404B2 (en) | 2003-09-26 | 2013-02-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Hematopoietic stem cell identification and isolation |
| US8157774B1 (en) | 2006-03-16 | 2012-04-17 | Deka Products Limited Partnership | Apparatus for stem cell collection and methods thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998021313A1 (fr) | 1998-05-22 |
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