TW202242096A - 用於擴增並維持ＨＳＣｓ自我更新能力和分化潛能的培養基組合物及其應用 - Google Patents

用於擴增並維持ＨＳＣｓ自我更新能力和分化潛能的培養基組合物及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明公開了一種用於擴增並維持造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)自我更新能力和分化潛能的培養基組合物、細胞群體及其應用。所述培養基組合物包括造血幹細胞培養基和PDGFR靶點的小分子抑制劑。申請人首次證明瞭PDGFR的抑制劑能夠在體外培養過程中顯著擴增HSCs，同時保持HSCs高比例的自我更新能力。申請人發現的PDGFR抑制劑擴增LT-HSCs的效果顯著優於已報導的化學小分子。這是首次證明並報導了PDGF/PDGFR信號通路在造血幹細胞擴增並維持自我更新能力方面發揮重要作用。申請人的研究結果可以實現HSCs的體外擴增的同時維持細胞較高比例的幹性，在此基礎上進行HSCs移植的臨床應用，可廣泛治療一系列血液系統疾病。

Description

用於擴增並維持HSCs自我更新能力和分化潛能的培養基組合物及其應用
本發明涉及生物技術技術領域，尤其涉及一種用於擴增並維持HSCs自我更新能力和分化潛能的培養基組合物、包含HSCs的輸注液及其應用。
造血幹細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是血液系統中一群異質原始造血細胞，具有自我更新和多系分化2個重要特徵。機體處於健康狀態時，體內HSCs長期處於靜息狀態，當機體發生病變或嚴重失血狀態時，HSCs被啟動，進入自我更新、多系分化狀態，維持血液系統穩定及機體穩態。HSCs自我更新特性有利於子代HSCs保持幹性，而HSCs多系分化特性可使其分化成多種成熟血細胞，如髓系細胞（粒細胞、單核細胞、紅細胞及血小板），淋系細胞（T細胞和B細胞）。正因為HSCs的特性，以及處於血液系統而具有的遷移、歸巢能力，有利於HSCs在機體需要時進行分化，以及在機體穩態時歸巢至骨髓微環境發揮功能。
HSCs的這些特性，使通過造血幹細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）治療血液系統疾病成為可能。1959年，Thomas等人利用骨髓造血幹細胞進行了人類歷史上首次造血幹細胞移植，在臨床治療白血病，以恢復病人體內正常造血功能。此後幾十年，經過科研工作者的不斷努力，造血幹細胞移植不僅應用於治療多種血液系統疾病，還被用於治療免疫缺陷疾病、神經系統退行性疾病等。
目前，HSCs主要有三個來源，骨髓（bone marrow，BM）、動員外周血（mobilized peripheral blood，mPB）、臍帶血（umbilical cord blood，CB）。三種來源的HSCs各有利弊，例如採集骨髓來源造血幹細胞，創傷性大，採集量不足；人外周血中HSCs所占比例太低（小於0.1%），採集時需要用粒細胞集落刺激因數（G-CSF）動員造血幹細胞從骨髓中遷移至外周血中，臨床應用中常出現動員效果不佳、所含HSCs數量不足，而多次動員或移植失敗；採集臍帶血來源的造血幹細胞比較方便，對供者無傷害且不存在倫理問題，所採集的HSCs造血能力強。上述三種來源的HSCs中，骨髓和動員外周血來源的HSCs均需要進行供者和患者之間白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型。HLA配型比較困難，一旦發生錯配，則會產生移植物抗宿主反應（graft versus host reaction，GVHD），大量發生GVHD的患者會死於免疫系統紊亂。而臍帶血來源的HSCs對HLA配型相合程度要求低，允許HLA部分錯配，移植後GVHD發病率低，緩解了傳統HSCT配型困難。上述三種方法採集的HSCs面臨的共同問題是細胞量少，有時僅能滿足兒童或體重較輕的成人移植，不能滿足較大體重成人的移植需求。
研究表明，造血幹細胞移植的安全性和有效性取決於移植的HSCs含量，當移植HSCs數量不足時，患者中性粒細胞恢復延遲，導致GVHD風險提高。移植的HSCs含量越高，患者中性粒細胞和血小板恢復時間縮短，住院護理時間縮短，大大降低移植失敗的風險，並減輕患者負擔。
造血幹細胞所具有的自我更新和多系分化的特性，導致造血幹細胞在體外培養過程中，一旦大量分裂增殖，則分化成各譜系血細胞而失去自我更新特性。因此，研究者們不斷努力，嘗試探索利用不同方法對造血幹細胞在體外進行一定程度擴增，同時最大限度維持造血幹細胞自我更新能力。若能實現，則可提高造血幹細胞移植的成功率。目前為止，體外培養造血幹細胞的其中一種思路是在培養基中添加小分子化合物，靶向調控造血幹細胞的分裂增殖信號，通過改變細胞的分裂增殖狀態使造血幹細胞既能保持一定程度的擴增，又能維持其自我更新能力。
已有研究證明血小板衍生生長因數PDGF（platelet-derived growth factor）及血小板衍生生長因數受體PDGFR（platelet-derived growth factor receptor）與細胞的分裂增殖息息相關。PDGF是從人的血小板中分離出來的促血管生成因數，PDGFR是定位於細胞膜上的酪氨酸蛋白激酶家族成員。研究表明，PDGF必須與PDGFR結合，磷酸化啟動PDGFR，啟動PDGF/PDGFR信號通路，才能發揮生物學效應，如能刺激停滯於G0/G1期的成纖維細胞、神經膠質細胞、平滑肌細胞等多種細胞進入分裂增殖週期。機體受損時，血小板大量釋放的PDGF能夠刺激鄰近的結締組織細胞增殖，進而重建受損組織、癒合創口。該信號通路也被證實與一系列疾病的發生發展相關。在多種腫瘤中，PDGF和PDGFR的表達與腫瘤的發生發展密切相關，腫瘤細胞通過釋放PDGF促進血管生成，誘導腫瘤細胞的增殖和遷移，並抑制其調亡。根據PDGF/PDGFR作用機制，進行腫瘤的靶向治療已取得較大進展，目前已有多個針對PDGFR的抑制劑藥物獲批上市。PDGF/PDGFR信號通路在很多類型的細胞中研究報導較多，但在造血幹細胞中報導較少。PDGF/PDGFR信號通路在造血幹細胞擴增和保持自我更新能力方面發揮怎樣的作用還是一片研究空白。
針對上述問題，本發明提供了一種用於擴增並維持HSCs自我更新能力和分化潛能的培養基組合物、細胞群體及其應用。
本發明的發明人在體外培養不同來源的HSCs時，持續加入PDGFR的抑制劑，可維持HSCs一定程度的擴增，但與此同時維持HSCs高比例的自我更新能力，這樣在細胞培養產物中，能獲得大量有移植潛能的LT-HSCs，效果優於已知培養HSCs的化學小分子。這在造血幹細胞擴增和自我更新能力研究中尚屬首次報導。
本發明具體技術方案如下：
1. 一種用於擴增並維持造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)自我更新能力和分化潛能的培養基組合物，其包括造血幹細胞培養基和PDGFR靶點的小分子抑制劑。
2. 根據項1所述的組合物，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，優選為AG1296。
3. 根據項1或2所述的培養基組合物，其中，所述造血幹細胞培養基包含：1）基礎培養基（優選無血清的基礎培養基）；2）生長因數；和/或3）細胞因數。
4. 根據項3所述的培養基組合物，其中，所述生長因數或細胞因數選自如下的一種或多種：生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和白細胞介素IL-6。
5. 根據項4所述的培養基組合物，其中所述生長因數或細胞因數在所述培養基組合物中的濃度如下所示： 所述生長因數Flt-3L的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述生長因數SCF的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述生長因數TPO的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述白細胞介素IL-6的濃度為1-50ng/ml，優選為1-20ng/ml。
6. 根據項1-5中任一項所述的培養基組合物，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑在所述培養基組合物中的濃度為0.1-100μM，優選為0.5-50μM，進一步優選為1-10μM。
7. 根據項1-6中任一項所述的培養基組合物，其中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
8. 一種促進HSCs擴增並維持HSCs自我更新能力的方法，包括在含有PDGFR靶點的小分子抑制劑的培養基組合物中體外培養HSCs。
9. 根據項8所述的方法，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，優選為AG1296。
10. 根據項8或9所述的方法，其中，所述造血幹細胞培養基包含：1）基礎培養基（優選無血清的基礎培養基）；2）生長因數；和/或3）細胞因數。
11. 根據項10所述的方法，其中，所述生長因數或細胞因數選自如下的一種或多種：Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和白細胞介素IL-6。
12. 根據項11所述的方法，其中所述生長因數或細胞因數在所述培養基組合物中的濃度如下所示： 所述生長因數Flt-3L的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述生長因數SCF的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述生長因數TPO的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述白細胞介素IL-6的濃度為1-50ng/ml，優選為1-20ng/ml。
13. 根據項8-12任一項所述的方法，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑在所述培養基組合物中的濃度為0.1-100μM，優選為0.5-50μM，進一步優選為1-10μM。
14. 根據項8-13中任一項所述的方法，其中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因修飾改造的HSCs。
15. 根據項8-14中任一項所述的方法，其中，體外培養時間為約4-21天，優選為約6-15天，進一步優選為約6-10天，最優選為約6-8天。
16. 根據項8-15中任一項所述的方法，其中，體外培養後，CD34+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為40-85%，優選為60-85%，進一步優選為75-80%。
17. 根據項8-16中任一項所述的方法，其中，體外培養後，CD34+CD90+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為6-15%，優選為8-15%，進一步優選為8-12%。
18. 根據項8-17中任一項所述的方法，其中，體外培養後，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為2-10%，優選為2-6%，進一步優選為4-5%。
19. 根據項8-18中任一項所述的方法，其中，體外培養後，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞數占全部細胞中的比例為2-5%，優選為2.5-4%。
20. 一種HSCs輸注液，其中，CD34+表型的HSCs細胞數占全部細胞總數的比例為40-85%，優選為60-85%，進一步優選為75-80%。
21. 根據項20所述的HSCs輸注液，其中，CD34+CD90+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為6-15%，優選為8-15%，進一步優選為8-12%。
22. 根據項20或21所述的HSCs輸注液，其中，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為2-10%，優選為2-6%，進一步優選為4-5%。
23. 根據項20-22任一項所述的HSCs輸注液，其中，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例為2-5%，優選為2.5-4%。
24. 根據項20-23任一項所述的HSCs輸注液，其通過項8-20任一項的方法獲得。
25. 一種給有需要的個體補充血細胞的方法，包括將項20-24任一項所述的HSCs輸注液輸注給所述個體。
26. 根據項25的方法，其中所述HSCs輸注液輸注給所述個體後，所述HSCs在所述個體中定植、分化為血細胞。
27. 根據項25或26的方法，其中所述個體為罹患出血、貧血、癌症、白血病、自身免疫病、病毒或細菌感染的個體。
28. PDGFR靶點的小分子抑制劑在促進HSCs擴增並維持HSCs自我更新能力中的用途，優選的，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，優選為AG1296。
29. 一種預防或治療個體疾病的方法，包括將項20-24中任一項所述的HSCs輸注液輸注給所述個體。
30. 根據項20-24中任一項所述的HSCs輸注液在製備預防或治療疾病的藥物中的用途。
31. 根據項31所述的用途，其中，所述疾病為需要補充血細胞的疾病。
發明的效果
申請人的研究結果首次證明瞭PDGFR的抑制劑能夠在體外培養過程中顯著擴增HSCs，同時保持HSCs高比例的自我更新能力。申請人發現的PDGFR抑制劑擴增LT-HSCs的效果顯著優於已報導的化學小分子。這是首次證明並報導了PDGF/PDGFR信號通路在造血幹細胞擴增並維持自我更新能力方面發揮重要作用。申請人的研究結果可以實現HSCs的體外擴增的同時維持細胞較高比例的幹性，在此基礎上進行HSCs移植的臨床應用，可廣泛治療一系列血液系統疾病。
下面結合附圖所描述的實施方式對本發明做以詳細說明，其中所有附圖中相同的數位表示相同的特徵。雖然附圖中顯示了本發明的具體實施例，然而應當理解，可以以各種形式實現本發明而不應被這裡闡述的實施例所限制。相反，提供這些實施例是為了能夠更透徹地理解本發明，並且能夠將本發明的範圍完整的傳達給本領域的技術人員。
需要說明的是，在說明書及專利申請範圍當中使用了某些詞彙來指稱特定元件。本領域技術人員應可以理解，技術人員可能會用不同名詞來稱呼同一個元件。本說明書及專利申請範圍並不以名詞的差異作為區分元件的方式，而是以元件在功能上的差異作為區分的準則。如在通篇說明書及專利申請範圍當中所提及的“包含”或“包括”為開放式用語，故應解釋成“包含但不限定於”。說明書後續描述為實施本發明的較佳實施方式，然而所述描述乃以說明書的一般原則為目的，並非用以限定本發明的範圍。本發明的保護範圍當視所附專利申請範圍所界定者為准。
本發明提供了一種用於擴增並維持HSCs自我更新能力和分化潛能的培養基組合物，其包括PDGFR靶點的小分子抑制劑。
所述HSCs自我更新能力指的是能產生具有幹性的HSCs而不分化的能力。
所述小分子抑制劑指的是這樣的分子實體（通常為有機或有機金屬的），其不是聚合物，具有醫藥活性，並且具有小於約2kDa、小於約1kDa、小於約900Da、小於約800Da或小於約700Da的分子量，小分子抑制劑可以是合成的，半合成的（即從天然存在的前體合成）或通過生物學方式獲得的。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib；優選為AG1296。
所述AG1296是人工合成的喹啉類化合物，其是一種酶抑制劑，可以與ATP競爭性抑制PDFGR。
所述PDGFR inhibitor 1是人工合成的一種酶抑制劑，可抑制PDGFR靶點。
所述Imatinib是人工合成的多靶點酪氨酸激酶抑制劑，可抑制PDGFR靶點。
所述PP121是人工合成的多靶點抑制劑，可抑制PDGFR靶點。
所述Ponatinib是人工合成的多靶點抑制劑，可抑制PDGFR靶點。
所述Axitinib是人工合成的多靶點抑制劑，可抑制PDGFR靶點。
所述Trapidil是人工合成的PDGF的拮抗劑，可破壞PDGF和PDGFR的自分泌環。
所述Erdafitinib是人工合成的FGFR抑制劑，也可抑制PDGFR靶點。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述組合物還包括造血幹細胞培養基，優選的，所述造血幹細胞培養基包含：1）基礎培養基（優選無血清的基礎培養基）；2）生長因數；和/或3）細胞因數。
所述生長因數或細胞因數選自如下的一種或多種：生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和白細胞介素IL-6。
優選的，所述生長因數Flt-3L的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述生長因數SCF的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述生長因數TPO的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述白細胞介素IL-6的濃度為1-50ng/ml，優選為1-20ng/ml。
所述基礎培養基指的是能夠提供細胞增殖所需的基礎營養物質，所有的基礎培養基都包含氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子等物質，所述的基礎培養基可以是自製的（即需要使用粉體自製成液體），也可以是商購的（即為液體），所述的基礎培養基包括含血清的基礎培養基和無血清的基礎培養基。
所述的含血清的基礎培養基中血清可以為胎牛血清或小牛血清等。
所述的無血清的基礎培養基例如可以為如StemCell公司的SFEM、SFEM II、StemSpan® H3000、StemSpan™ ACF；ThermoFisher公司的StemPro-34；Sigma公司的Stemline II；R＆D公司的StemXVivo；Lonza公司的X-VIVO 15；CellGenix公司的SCGM等。
所述生長因數Flt-3L指的是人FMS相關酪氨酸激酶3配體，可刺激造血幹細胞的增殖。
所述生長因數SCF指的是人幹細胞因數，可刺激造血幹細胞的增殖。
所述生長因數TPO指的是人促血小板生成素，可刺激造血幹性的增殖。
所述白細胞介素IL-6指的是人白介素-6，可促進造血幹細胞增殖。
其中，所述SFEM II培養基指的是StemCell公司的一款培養造血幹細胞的無血清基礎培養基，適用於培養造血幹細胞。
例如，所述生長因數Flt-3L的濃度可以為10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml等。
所述生長因數SCF的濃度可以為10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、等。
所述生長因數TPO的濃度可以為10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml等。
所述白細胞介素IL-6的濃度可以為1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml等。
在本發明優選的一種具體實施方式中，所述造血幹細胞培養基例如包括無血清的基礎培養、生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和白細胞介素IL-6或者所述造血幹細胞培養基可以包括無血清的基礎培養基、生長因數Flt-3L、生長因數SCF和生長因數TPO。
所述的造血幹細胞培養基指的是培養造血幹細胞的培養基。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑在所述培養基組合物中的濃度為0.1-100μM，優選為0.5-50μM，進一步優選為1-10μM。
例如，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑在所述培養基組合物中的濃度可以為0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM等。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
本發明提提供了一種HSCs輸注液，其中，CD34+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為40-85%，優選為60-85%，進一步優選為75-80%。
例如，CD34+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例可以為40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%等。
所述全部細胞指的是指最初的CD34+細胞經過培養之後的所有子代細胞。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，CD34+CD90+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為6-15%，優選為8-15%，進一步優選為8-12%。
例如，CD34+CD90+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例可以為6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%等。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為2-10%，優選為2-6%，進一步優選為4-5%。
例如，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例可以為2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%等。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞數占全部細胞中的比例為2-5%，優選為2.5-4%。
例如，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞數占全部細胞中的比例可以為2%、3%、4%、5%等。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
本發明提供了一種給有需要的個體補充血細胞的方法，包括將上述所述的HSCs輸注液輸注給所述個體。
在本發明優選的一些實施方式中，其中，將所述HSCs輸注液輸注給所述個體後，檢測所述HSCs在所述個體中的定植和分化。在本申請給有需要的個體補充血細胞的方法中，將所述HSCs輸注液輸注給所述個體後，所述HSCs在所述個體中定植、分化成血細胞。將所述HSCs輸注液輸注給所述個體後，所述HSCs是否能在所述個體中定植、分化可通過本領域常規的檢測HSCs定植、分化的方法檢測。例如將動員外周血造血幹細胞移植後，中性粒細胞上升會有2個峰值，第一個峰值在移植後平均11天左右，外周血中性粒細胞達到0.5×10 9個/L，隨後呈現下降趨勢，在移植後3~4周再次出現第二次峰值，隨後恢復正常。因此，可通過檢測外周血中性粒細胞的數量判斷HSCs輸注液輸注後HSCs是否成功定植、分化。也可以通過檢測外周血血小板的數量判斷HSCs輸注液輸注後HSCs是否成功定植、分化。例如在輸注後平均時間為13天左右檢測外周血血小板是否達到50×10 9個/L。在臍帶血造血幹細胞移植後，通過平均22~24天左右檢測外周血中性粒細胞是否達到5×10 9個/L進行判斷；或者平均48~54天，檢測外周血血小板是否達到5×10 9個/L。或者，持續監測所述個體外周血，連續3天中性粒細胞絕對計數≥0.5×10 9個/L；或血小板計數＞20×10 9個/L。另外，還有一些指標，如性染色體轉變、血型轉變、短片段串聯重複（short tandem repeat，STR）轉為供者型也可以作為植入成功標誌。
本發明提供了一種促進HSCs擴增並維持HSCs自我更新能力的方法，包括在含有PDGFR靶點的小分子抑制劑的培養基組合物中體外培養HSCs。
本發明通過將含有PDGFR靶點的小分子抑制劑的培養基組合物中體外培養HSCs，能夠促進HSCs擴增並維持HSCs自我更新的能力，此外，擴增所得到的細胞植入體內後，能夠分化成不同譜系的細胞。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib；優選為AG1296。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述培養基組合物包含造血幹細胞培養基，優選的，所述造血幹細胞培養基包含1）基礎培養基（優選無血清的基礎培養基）；2）生長因數；和/或3）細胞因數。
所述生長因數或細胞因數選自如下的一種或多種：Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和白細胞介素IL-6。
優選的，所述生長因數Flt-3L的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述生長因數SCF的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述生長因數TPO的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述白細胞介素IL-6的濃度為1-50ng/ml，優選為1-20ng/ml。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑在所述培養基組合物中的濃度為0.1-100μM，優選為0.5-50μM，進一步優選為1-10μM。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，體外接觸的時間為約4-21天，優選為約6-15天，進一步優選為約6-10天，最優選為約6-8天。
例如，體外接觸的時間可以為約4-21天、約4-20天、約4-19天、約4-18天、約5-21天、約5-20天、約5-19天、約5-18天、約6-18天、約6-17天、約6-16天、約6-15天、約6-14天、約6-13天、約6-12天、約6-11天、約6-10天、約6-9天、約6-8天等。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，體外接觸上述時間後， CD34+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為40-85%，優選為60-85%，進一步優選為75-80%。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，CD34+CD90+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為6-15%，優選為8-15%，進一步優選為8-12%。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，體外接觸上述時間後，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為2-10%，優選為2-6%，進一步優選為4-5%。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，體外接觸上述時間後， CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞數占全部細胞中的比例為2-5%，優選為2.5-4%。
在本發明優選的一種具體實施方式中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
本發明使用PDGFR靶點的小分子抑制劑體外擴增HSCs細胞，能擴增不同來源的細胞，如上述所述的來源於骨髓、動員外周血或臍帶血的HSCs細胞以及凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
本發明提供了一種細胞群體，其中，CD34+細胞數占細胞群體的比例為40-85%。
所述的細胞群體指的離體細胞產物，指的是將HSCs體外接觸含有PDGFR靶點的小分子抑制劑的培養基組合物得到的細胞群體。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，CD34+細胞數占細胞群體的比例為60-85%，優選為75-80%。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述細胞群體通過含有PDGFR靶點的小分子抑制劑的培養基組合物中體外培養HSCs得到。
所述的細胞群體能夠維持幹性，並且在植入體內後，能夠分化成不同譜系的細胞，以用於治療不同的疾病。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib；優選為AG1296。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述培養基組合物包含造血幹細胞培養基，優選的，所述造血幹細胞培養基包含：1）基礎培養基（優選無血清的基礎培養基）；2）生長因數；和/或3）細胞因數。
所述生長因數或細胞因數選自如下的一種或多種：Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和白細胞介素IL-6。
優選的，所述生長因數Flt-3L的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述生長因數SCF的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述生長因數TPO的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml。
所述白細胞介素IL-6的濃度為1-50ng/ml，優選為1-20ng/ml。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑在所述培養基組合物中的濃度為0.1-100μM，優選為0.5-50μM，進一步優選為1-10μM。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述細胞群體植入體內後分化為不同譜系的血細胞。例如可以分化為B細胞、T細胞、NK細胞、樹突狀細胞、粒細胞、巨噬細胞、巨核細胞或紅細胞。
本發明提供了一種預防或治療個體疾病的方法，包括將上述所述的HSCs輸注液或者上述所述的細胞群體輸注給所述個體。
本發明提供了PDGFR靶點的小分子抑制劑在促進HSCs擴增並維持HSCs自我更新能力中的用途，優選的，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib；優選為AG1296。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
本發明提供了上述所述的HSCs輸注液或者上述所述的細胞群體在製備預防或治療疾病的藥物中的用途。
優選的，所述疾病為需要補充血細胞的疾病。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，當血細胞為紅細胞時，可以治療貧血等；
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，當血細胞為白細胞時，可以治療白細胞減少症、粒細胞缺乏症、嗜酸性粒細胞增多症、急性白血病、慢性白血病、骨髓增生異常綜合症、惡性淋巴瘤（霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤）、傳染性單核細胞增多症、惡性組織細胞病、多發性骨髓瘤等。
在本發明優選的一種具體實施方式中，其中，當血細胞為血小板時，可以治療再生障礙性貧血、急性白血病、急性放射病等。
本發明所述的PDGFR的抑制劑能夠在體外培養過程中顯著擴增HSCs，同時保持HSCs高比例的自我更新能力。並且所述的PDGFR的抑制劑能夠體外擴增不同來源的細胞，所擴增得到的細胞植入體內後，能夠分化成不同譜系的細胞，可廣泛治療一系列血液系統疾病。
在本申請中，術語LT-HSCs是 Long Term Hemopoietic Stem Cells的簡寫，是指處於靜息狀態且能夠自我更新的一類具有高分化潛能的幹細胞，能夠支援長期造血系統的重建，例如能在二次移植中重建受體造血系統。
造血幹細胞（Hemopoietic Stem Cells，HSCs）的自我更新能力和分化潛能可以稱之為造血幹細胞的“幹性”。本申請發現，在CD34+的造血幹細胞中，LT-HSCs是造血幹細胞中最具自我更新能力和分化潛能的一群細胞，能夠支援長期造血系統的重建。
實施例
本發明對試驗中所用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述，在下面的實施例中，如果無其他特別的說明，所用到的化學材料中％表示wt％，即重量百分數。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規試劑產品。
實施例1臍帶血/動員外周血分選CD34+HSCs用於後續小分子篩選
準備試劑H-lyse Buffer(1×)溶液和Wash Buffer(1×)溶液:取5ml H-lyse Buffer 10×儲存液(R&D，貨號：WL1000)，加45ml去離子水(EdiGene，0.22μm濾膜過濾)，混勻，配製成H-lyse Buffer(1×)溶液；
取5ml Wash Buffer 10×儲存液(R&D，貨號：WL1000)，加45ml去離子水，混勻，配製成Wash Buffer(1×)溶液。
向10ml臍帶血/動員外周血(EdiGene)中加注生理鹽水至終體積為30ml，向該稀釋血液中加入人淋巴細胞分離液(達科為，貨號：DKW-KLSH-0100)，之後400g離心30min（設置升速3，降速0），吸取白膜層，500g離心10min。將細胞沉澱集中至一個50ml離心管中，加入H-lyse Buffer(1×)10ml，常溫裂解紅細胞10min，然後加入10ml Wash Buffer(1×)終止裂解反應，補加生理鹽水至終體積為50ml。將上述50ml離心管轉移至高速離心機中，500g離心10min，棄上清，用50ml生理鹽水(1%HSA)重懸細胞，混勻，取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，將該離心管轉移至高速離心機中，500g離心10min。棄上清，根據計數結果加入相應體積的磁珠(100μL FcR/1*10^8 cells和100μL CD34 MicroBeads/1*10^8 cells)，其操作如下：首先加入FcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec，貨號：130-100-453，試劑用量根據細胞計數結果決定)重懸細胞，再加入預混勻的CD34 MicroBeads(CD34 MicroBead Kit UltraPure，human：MiltenyiBiotec，貨號：130-100-453)，混勻，4℃冰箱中孵育30min。往離心管中加生理鹽水(1%HSA)至終體積為50ml，轉移至高速離心機中，500g離心10min。準備磁力分離器(MiltenyiBiotec，型號：130-042-102)和一個磁力架(MiltenyiBiotec，型號：130-042-303)，將磁力分離器調整至合適高度，放入MS Column(MiltenyiBiotec，貨號：130-042-201)或LS Column(MiltenyiBiotec，貨號：130-042-401)(根據細胞量決定選用柱子的類型，具體參考產品相關說明書)，下方放置15ml離心管(Corning，貨號：430791)收集非目標細胞懸液，用1ml(MS柱)或者3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)潤洗MS Column或LS Column。在上述高速離心機(Thermo，型號：ST40)中的離心管離心後，棄上清，用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)重懸細胞，往每個分選柱(分選柱的用量根據臍帶血/動員外周血的份數以及細胞量決定)中加入細胞懸液。再用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)洗滌離心管，洗滌液加入柱中。
用1ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)洗滌MS Column或LS Column。重複3次。將分選柱轉移至新的15ml離心管上方，加入2ml(MS柱)或3ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)洗脫目標細胞，再加入1ml(MS柱)或2ml(LS柱)生理鹽水(1%HSA)重複洗脫目標細胞一次。取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，剩餘細胞懸液400g離心5min。不完全棄上清，留1ml上清，重懸細胞。取一個新的MS Column，加入1ml生理鹽水(1%HSA)潤洗，將上述經重懸的細胞的細胞懸液轉移至該MS Column中，重複上述洗滌和洗脫步驟，獲得3ml目標細胞懸液。取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，根據細胞密度和細胞懸液體積，計算總細胞數，剩餘細胞懸液400g離心5min，棄上清備用。
實施例2小分子抑制劑濃度測試以及篩選
根據小分子抑制劑的說明書標明的溶解度以及所需溶劑(小分子抑制劑貨號參見表1)，進行小分子抑制劑儲存液的配置。接著進行造血幹細胞培養基的配製：SFEM II培養基(stem cell，貨號：09655)+50ng/ml生長因數Flt-3L(PeProtech，貨號：300-100UG)+50ng/ml生長因數SCF(PeProtech，貨號：300-07-100UG)+50ng/ml生長因數TPO(PeProtech，貨號：300-18-100UG)+10ng/ml白細胞介素IL-6(PeProtech，貨號：200-06-20UG)+1%雙抗(HyClone，貨號：sv30010)。根據設置的小分子抑制劑濃度梯度，利用儲存液和基礎培養基，配製含有不同濃度小分子抑制劑的培養基。
首先，將準備好的培養基加入到24孔板(Corning，貨號：3473)中，每孔950μl，放置在二氧化碳培養箱(Thermo，型號：3111)中預熱；將實施例1中備用的臍帶血來源的HSCs用SFEM II+50ng/ml Flt-3L+50ng/ml SCF+50ng/ml TPO+10ng/ml IL-6 +1%雙抗重懸，按照每孔50μl細胞懸液，每孔細胞密度為2*10^5/ml計算所加的培養基體積。例如每孔細胞培養液終體積為1ml，根據每孔細胞密度計算每孔細胞總量為2*10^5個細胞，每孔補加的50μl細胞懸液密度則為4*10^6/ml，將實施例1中備用的HSCs密度調整為計算所得的細胞懸液密度，進行添加；從培養箱中拿出預熱好的培養基，每孔中加入50μl細胞懸液，混勻後，顯微鏡(OLYMPUS，型號：CKX53)下觀察細胞狀態，然後放入培養箱中培養。
表1：小分子抑制劑
小分子抑制劑名稱 作用通路/靶點 貨號 品牌
Scutellarin NOS 73577 sigma
NG-Methyl-L-Arginine acetate salt NOS M7033 sigma
1-Methylnicotinamide chloride NOS SML0704 sigma
RG7834 HBV抑制劑 HY-117650A MCE
PFI-2 lysine methyltransferase SETD7 inhibitor S7294 Selleck
Salirasib prenylated protein methyltransferase (PPMTase) inhibitor S8460 Selleck
UNC0379 N-lysine methyltransferase SETD8  inhibitor S7570 Selleck
CCN3 Notch信號通路的配體 1640-NV-050 R&D
BVT948 methyltransferase SETD8  inhibitor #2176/10 R&D
Sunitinib FLT3, c-Kit, PDGFRβ, VEGFR2 S7781 Selleck
SAG Smoothened S7779 Selleck
AG1296 PDGFR S8024 Selleck
Tamibarotene Retinoic acid receptor (RAR) agonist S4260 Selleck
AM580 Retinoic acid receptor agonist S2933 Selleck
Tretinoin Retinoic acid receptor S1653 Selleck
Anti-hEndomucin Endomucin AF7206-SP R&D
PDGFR inhibitor 1 PDGFR S8721 Selleck
Imatinib (STI571) PDGFR S2475 Selleck
PP121 PDGFR S2622 Selleck
Cynarin GSH/ROS S3301 Selleck
Bezafibrate PPAR激動劑 S4159 Selleck
Pioglitazone HCl cytochrome P450 抑制劑 S2046 Selleck
Diphenyleneiodonium chloride (DPI) NADPH oxidase 的抑制劑 S8639 Selleck
CAY10602 SIRT1啟動劑 S5918 Selleck
Salermide 反向醯胺 S8460 Selleck
Flubendazole Flubendazole is an autophagy inducer by targeting Atg4B, used to treat internal parasite and worm infection. S1837 Selleck
Olaparib 自噬 (autophagy) 和線粒體自噬(mitophagy) 啟動劑 S1060 Selleck
Torkinib mTORC1/C2抑制劑 S2218 Selleck
P62-mediated mitophagy inducer 線粒體自噬調節劑 HY-115576 MCE
實施例3流式檢測HSCs幹性以及CD34+的維持
本實施例中所使用的抗體及其來源參見表2。
表2：抗體
抗體名稱 廠家 貨號
APC/Cy7 anti-human CD45 Biolegend 304014
APC anti-human CD38 Biolegend 356606
Brilliant Violet 510™ anti-human CD34 Biolegend 343528
PE anti-human CD90 (Thy1) Biolegend 328110
FITC anti-human CD45RA Biolegend 304106
APC Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Biolegend 400220
APC/Cyanine7 Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Biolegend 400128
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Biolegend 400212
FITC Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl Biolegend 402208
Brilliant Violet 510™ Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Biolegend 400268
將上述實施例2中培養至6-8天（D6-D8）的細胞取樣20μL計數，根據計數結果取出2*10^5個細胞的懸液至1.5ml離心管中；400g，5min離心，棄上清。取含1% HSA(人血清白蛋白，廣東雙林，貨號：S10970069)的PBS(磷酸緩衝鹽溶液，HyClone，貨號：SH30256.01)100μL，重懸細胞，渦旋混勻，備用。然後，收集對照細胞樣本。細胞數量及收集方法同待測樣本細胞操作。對照分別設定為NC組、ISO組，細胞選擇為本批次實驗中待檢樣本的任一樣本或混合細胞，視細胞數量而定。同批次實驗中各對照組不設重複檢測。組別設置參見表3。
表3：
組別 細胞數量 添加抗體名稱 抗體量
NC 2×10^5 -- --
ISO 2×10^5 APC Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl APC/Cyanine7 Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl PE Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl FITC Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl Brilliant Violet 510™ Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl 2μL 2μL 2μL 2μL 2μL
FMO38 2×10^5 APC/Cy7 anti-human CD45 Brilliant Violet 510™ anti-human CD34 PE anti-human CD90 (Thy1) FITC anti-human CD45RA 2μL 2μL 2μL 2μL
FMO90 2×10^5 APC/Cy7 anti-human CD45 APC anti-human CD38 Brilliant Violet 510™ anti-human CD34 FITC anti-human CD45RA 2μL 2μL 2μL 2μL
樣本 2×10^5 APC/Cy7 anti-human CD45 APC anti-human CD38 Brilliant Violet 510™ anti-human CD34 PE anti-human CD90 (Thy1) FITC anti-human CD45RA 2μL 2μL 2μL 2μL 2μL
按照上表3，向上述待檢測細胞樣本及對照細胞樣本的細胞懸液中，按組別對應加入抗體。渦旋混勻，室溫避光孵育15min。15min孵育結束後，在每個實驗樣本中加入含1% HSA的PBS 1ml，混勻，400g，5min室溫離心。離心結束後，棄上清，每個實驗樣本用100μL含1% HSA的PBS重懸細胞。上機檢測前樣本室溫避光保存。使用流式細胞儀檢測。
檢測結果按如下方法分析：1)目的細胞群為CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-細胞群；2)邏輯門及門位置的確定參見圖1所示：首先圈定細胞群，P1門；來源於P1門的細胞群去除粘連細胞，為P2門；來源於P2門的細胞群用NC或ISO圈定CD34，CD45，CD45RA陰性細胞群，為Q3-LL門(CD34-CD45-)，Q5-UL+Q5-LL門(CD45RA-)；FMO90圈定CD90陰性細胞群，為Q5-LL+Q5-LR門；FMO38圈定CD38陰性細胞群，為Q6-LR門；應用NC，ISO，FMO劃定的門，確定Q3-UR—Q5-UL—Q6-LR門圈定的細胞為CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-目的細胞。
實施例4小分子抑制劑初步篩選
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，以實施例2相同的方法進行小分子抑制劑的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的篩選，小分子誘導6-8天後，用與實施例3相同的方法流式細胞儀檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達。
在本實施例中共進行了29個小分子的篩選（見表1），每個抑制劑測試3個濃度。
圖2結果表明，虛線以上的點所代表的抑制劑能夠很好的維持HSCs的幹性，是陰性對照組Mock的3倍以上。虛線以上三個不同的三角形代表不同濃度的AG1296，使用濃度已標明。
綜上所述：在本實施例中，篩選出1個能夠維持LT-HSCs幹性的小分子，是以PDGFR為靶點的抑制劑AG1296。
實施例5：已篩PDGFR抑制劑AG1296最佳使用濃度的篩選
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，以實施例2相同的方法對已篩抑制劑AG1296進行最佳使用濃度的篩選。不同濃度的小分子抑制劑AG1296誘導6天後，用與實施例3相同的方法用流式細胞儀檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達。在培養6天時取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，並計算第6天最終的CD34+細胞以及LT-HSCs的絕對數量（細胞絕對數量=細胞總數*幹性比例），其結果分別如圖3A-3B以及如圖4A-4B所示。
圖3A的結果表明，在維持CD3+、CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA-細胞比例方面，AG1296在1μM、5μM和10μM濃度下均優於Mock組。
圖3B的結果表明，在總細胞數量中，AG1296(1μM)的細胞數量較高，高於濃度為5μM和10μM，在維持CD34+細胞絕對數量方面，AG1296在1μM、5μM和10μM的濃度下低於mock組，證明AG1296在1μM、5μM和10μM濃度下對細胞增殖略有抑制，但在維持CD34+CD90+CD45RA-細胞絕對數量方面，AG1296（1μM、5μM和10μM）明顯優於Mock組，在增殖LT-HSCs絕對數量方面，AG1296（1μM、5μM和10μM）的效果較好。
圖4A結果表明，在維持CD34+、CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA-細胞比例方面，AG1296在1μM濃度優於Mock組和100nM、500nM使用濃度，具有顯著差異。在提高LT-HSC比例方面，AG1296（1μM）是Mock組、AG1296（100nM）組的3倍左右，是AG1296（500nM）的2倍左右，顯著提高LT-HSC的比例。圖4B結果表明，在維持CD34+細胞絕對數量方面，AG1296（1μM）沒有明顯優於其它組別，證明AG1296在1μM濃度下對細胞增殖略有抑制，但在維持CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA-細胞絕對數量方面，AG1296（1μM）明顯優於其它組別。增殖LT-HSCs絕對數量方面，AG1296（1μM）的效果是其它組別的1~2倍。
綜上所述，在臍帶血來源的HSCs上，維持LT-HSCs乾性和細胞絕對數量方面，AG1296在濃度為1μM、5μM和10μM下效果較好。
實施例6：已篩PDGFR抑制劑AG1296和文獻報導抑制劑UM171，SR1使用的比較
在實施例1中分選出來的動員外周血來源的CD34+細胞上，以實施例2相同的方法對已篩抑制劑AG1296與文獻(Fares I, et al. Science.2014； Boitano A E，et al.Science.2010；)報導抑制劑UM171，SR1進行比較。小分子抑制劑誘導8天後，用與實施例3相同的方法流式細胞儀檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達。在培養8天時取20μL細胞懸液至細胞計數儀(Nexcelom，型號：Cellometer K2)中計數，並計算第6天最終的CD34+細胞以及LT-HSCs的絕對數量（細胞絕對數量=細胞總數*幹性比例），其結果如圖5所示。
圖5A結果表明，在維持CD34+ 、CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA-細胞比例方面，AG1296（1μM）效果明顯優於Mock組、UM171組、AG1296（500nM）組和AG1296（700nM）組，但不如SR1組。在提高LT-HSCs比例方面， AG1296（1μM）是Mock組、UM171組2倍左右，是AG1296（500nM）組和AG1296（700nM）組的1倍左右，顯著提高LT-HSC的比例，但效果不如SR1組。
圖5B結果表明，在維持CD34+細胞絕對數量方面，AG1296（1μM）沒有明顯優於其它組別，證明AG1296在1μM濃度下對細胞增殖有抑制，UM171組效果最好。但在維持CD34+CD90+、CD34+CD90+CD45RA-細胞絕對數量方面，AG1296（1μM）表現出優勢。
實施例7：CD34+造血幹細胞集落形成培養
本實施例通過集落形成單位(Colony-Forming Unit，CFU)檢測臍血來源的造血幹細胞經過小分子抑制劑誘導後的體外功能進行定性和定量檢測，驗證其體外分化潛能。
首先，分裝100mL培養基MethoCult™ H4034 Optimum(Stem Cell,貨號：04034)，在2-8℃過夜解凍。劇烈搖晃1-2 min後靜置10 min，待氣泡浮升至液面。將50mL注射器針頭緊套在5mL一次性注射器後，吸取培養基至1mL，全部推出注射器以排盡注射器內氣體，重新吸取3mL分裝至每個15mL離心管(Corning，貨號：430791)。2-8℃保存1個月，-20℃長期保存，切勿反復凍融。
準備3mL培養基MethoCult™ H4034 Optimum，在室溫(15-25℃)或2-8℃過夜解凍。
進行細胞接種：取小分子抑制劑誘導後擴增培養7天後的細胞 (臍血來源的經小分子抑制劑誘導後的CD34+造血幹細胞)懸液細胞計數，根據計數結果吸取100倍接種密度的細胞懸液 (例如，接種密度100 cells/孔/3ml，應收集10000 cells)，加入到1ml的2% FBS (Gibco，貨號：16000-044)-IMDM(Gibco，貨號：12440-053)培養基中，混勻備用。將上述細胞混勻後吸取50μL細胞懸液加入到0.5mL IMDM (2% FBS)重懸細胞 (相當於將細胞懸液稀釋10倍)，混勻後，取出100μL細胞懸液(100個細胞)加入到3mL MethoCult™ H4034 Optimum中。渦旋至少4s後靜置10min，待氣泡浮升至液面。3 cc Syringes (Stem cell, 貨號：28240)與Blunt-End Needles 16 Gauge (Stemcell，貨號：28110)配合使用，吸取所得細胞懸液至1mL，全部推出注射器以排盡注射器內氣體，重新吸取所得全部細胞懸液，向SmsrtDishTM-6 (stem cell，貨號：27370，6孔板)一個孔注入3mL，緩慢傾斜6孔板使細胞懸液均勻鋪滿孔底部。按上述接種完所有細胞後，將6孔板各孔間隙內補加無菌PBS 3ml，防止培養基乾涸。將6孔板蓋好蓋子後放入二氧化碳培養箱 (Thermo，型號：3111)，37℃，5%CO2，95%相對濕度，培養14天。
於培養第7, 14天進行觀察集落，培養14天後用STEMgridTM-6計數網格(stem cell，貨號：27000)進行克隆計數。集落的判定標準如下（不同分類的集落可反應出HSCs集落形成能力，維持幹性的能力）：
CFU-GEMM(CFU-G、CFU-E、CFU-MM)：粒細胞-紅細胞-巨噬細胞-巨核細胞集落形成單位。一個集落內包含紅細胞和20個或更多個非紅細胞(粒細胞、巨噬細胞和/或巨核細胞)，通常集落中心有紅細胞，周圍有非紅細胞，非紅細胞也可以集中在紅細胞的一側。CFU-GEMM的集落通常比CFU-GM或BFU-E的集落大。在大多數細胞樣本中比較少見(通常占集落總數的10%)。
CFU-GM：含有超過20個以上粒細胞(CFU-G)和/或巨噬細胞(CFU-M)的集落。不顯現紅色或棕色，集落內個體細胞通常可以區分，特別是在集落邊緣，大的集落可能有一個或多個密集的暗核。該集落生長及分化不需要促紅細胞生成素(EPO)。
BFU-E：爆發紅細胞集落形成單位，形成單個或多個細胞簇組成的集落，每個集落包含＞200個成熟紅細胞。當細胞被血紅蛋白化時呈現紅色或棕色，難以區分每簇內的單個細胞，BFU-E是更加不成熟的祖細胞，它的生長需要紅細胞生成素(EPO)和其他細胞因數，尤其是白介素3(IL-3)和幹細胞因數(SCF)，以促進其集落的最佳生長。
CFU-E：紅細胞集落形成單位，可形成1-2個包含有8-200個紅細胞的細胞簇，當細胞被血紅蛋白化時呈現紅色或棕色，在集落內難區分單個細胞。CFU-E是成熟的紅細胞系的祖細胞，需要促紅細胞生成素(EPO)促進其分化。
實施例8：已篩PDGFR抑制劑AG1296對HSC體外克隆形成能力的比較
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上進行已篩PDGFR抑制劑AG1296不同使用濃度的體外克隆形成能力的比較。用不同濃度的AG1296處理細胞，8天後，以實施例7相同的方法進行體外克隆(CFU)形成檢測，接種細胞14天後統計克隆數目，並對CFU-GEMM進行分析，其結果如圖6所示，其中，BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM代表紅系、髓系、淋巴系等血液系統不同譜系的克隆。
圖6結果表明，在總克隆數量方面，各個組別差別不大。在由LT-HSCs分化形成的GEMM克隆數目方面，AG1296（1μM）顯著優於其它組別。GEMM克隆代表造血幹細胞分化形成其它譜系細胞的能力。GEMM克隆數量越多，代表造血幹細胞自我更新能力、移植重建能力越強。綜上所述，AG1296在HSCs體外擴增過程中，能很好的維持LT-HSC的自我更新能力和細胞絕對數量。
實施例 9：已篩PDGFR抑制劑AG1296和文獻報導抑制劑SR1對造血幹細胞體內移植效果的比較
在實施例1中分選出來的臍帶血來源的CD34+細胞上，對已篩選小分子抑制劑AG1296，與文獻報導抑制劑SR1的體內造血系統重建能力進行比較。本實施例中所使用的小分子抑制劑濃度及分組見表4。
表4 小分子抑制劑濃度
組別 小分子抑制劑使用濃度
Mock NA
SR1 5 μM
AG1296 1 μM
配製細胞培養基：SFEM II+100ng/ml Flt-3L+100ng/ml SCF+100ng/ml TPO+20ng/ml IL-6+1%雙抗，所用培養基、生長因數、雙抗等貨號與實施例2中所述一致，根據表4中設置的組別，加入不同的小分子抑制劑。
將配製好的細胞培養基加入到24孔板中，每孔950μl，放置在二氧化碳培養箱中預熱；將實施例1中備用的臍帶血來源的HSCs用SFEMII+100ng/ml Flt-3L+100ng/ml SCF+100ng/ml TPO+20ng/ml IL-6 +1%雙抗重懸，重懸細胞所需培養基體積，按照每孔加入50 μl細胞懸液，每孔細胞密度為0.28*10^5/ml進行計算；從培養箱中拿出預熱的培養基，向每孔中加入50 μl重懸的細胞懸液，混勻後，顯微鏡下觀察細胞狀態，然後放入培養箱中培養。每只小鼠移植的起始培養細胞量為0.28*10^5/只，即24孔板中每個孔所擴增的細胞可移植一隻小鼠。細胞培養過程中隔天計數，計數方法及所用細胞計數儀與實施例1一致，保證細胞密度不超過8*10^5/ml，如細胞過密，則及時分孔，並添加新鮮培養基。
小分子抑制劑處理細胞7天後，用與實施例3相同的方法用流式細胞儀檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達。
準備小鼠，每個組別設置8只小鼠。小鼠購自北京維通達生物技術有限公司，品系為NPG（NOD-Prkdc scidll2rg null/Vst），6周齡，雌鼠，小鼠之間體重克差控制在3g內。小鼠進行細胞移植之前經過半致死劑量輻照，輻照劑量為1.6Gy。
收集培養的細胞懸液（起始培養細胞量為0.28*10^5/ml/孔），室溫離心，400g離心5min，棄上清，細胞沉澱用100 μl生理鹽水（含1% HSA）重懸混勻，尾靜脈注射一隻經輻照的NPG小鼠，不同組別小鼠做好標記。
細胞移植小鼠後，第18周處死小鼠，收集小鼠骨髓細胞，流式檢測human CD45、human CD19、human CD3、human CD33和human CD56比例。本實施例中所用抗體、7-AAD染料及來源參見表5。
表5：抗體及7-AAD染料
抗體名稱 廠家 貨號
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
APC/Cy7 anti-human CD45 Biolegend 304014
Brilliant Violet 510™ anti-human CD3 Biolegend 300448
PE anti-human CD19 Biolegend 363004
Brilliant Violet 421™ anti-human CD33 Biolegend 303416
APC anti-human CD56 Biolegend 304610
7-AAD Viability Staining Solution Biolegend 420404
流式檢測小鼠骨髓細胞中human CD45、human CD19、human CD3、human CD33和human CD56比例，設置的細胞檢測組別參見表6。
表6：
組別 細胞數量 添加抗體名稱 抗體量
NC 2×10^5 -- --
樣本 2×10^5 FITC anti-mouse CD45 APC/Cy7 anti-human CD45 Brilliant Violet 510™ anti-human CD3 PE anti-human CD19 Brilliant Violet 421™ anti-human CD33 APC anti-human CD56 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl 2μl
斷頸處死小鼠，取小鼠一側後腿的脛骨和股骨。用眼科剪和眼科鑷操作，分別剪斷脛骨和股骨兩端，露出骨髓腔。用1ml注射器吸取預冷的PBS（含1% HSA），將針頭刺入骨髓腔的一端，用力推注PBS，將骨髓細胞從骨髓腔另一端沖出。脛骨和股骨骨髓腔分別用2 ml PBS沖洗。用移液器反復吹吸骨髓細胞懸液，用40 um細胞篩網（BD，貨號：352340）過濾細胞懸液，室溫離心，400g，5min。離心結束後，棄上清，骨髓細胞備用。
向備用的骨髓細胞中加入1 ml紅細胞裂解液，渦旋混勻，室溫裂解15 min，期間每隔3 min上下顛倒混勻樣本。裂解結束後，向每個樣本中加入4 ml PBS（含1% HSA），室溫離心，400g，5min。離心結束後，棄上清，向每個樣本中加入1 ml PBS（含1% HSA），渦旋混勻。從每個樣本中各取100 μl細胞懸液，按照表6的組別加入抗體，渦旋混勻，室溫避光孵育15 min。孵育結束後，向每個樣本組中加入5 μl 7-AAD染料，渦旋混勻，室溫避光孵育5 min。孵育結束後，向NC和每個樣本組中加入1ml PBS（含1% HSA），混勻，室溫離心，400g，5min。離心結束後，棄上清，向每個實驗樣本中加入100 μl PBS（含1% HSA）重懸細胞，使用流式細胞儀檢測。
檢測結果按如下方法分析：1)目的細胞群為human CD45+細胞群，human CD19+細胞群，human CD3+細胞群，human CD33+細胞群，以及human CD56+細胞群；2)邏輯門及門位置的確定參見圖7所示：首先圈定細胞群，P1門；來源於P1門的細胞群去除粘連細胞，為P2門；來源於P2門的細胞群用7-AAD陰性細胞圈定活細胞群，為P3門；來源於P3門的細胞群用NC圈定mouse CD45+（P4門）和human CD45+細胞群（P5門）；來源於P5門的細胞群用NC圈定human CD33+（P11門）和human CD56+細胞群（P13門）；來源於P5門的細胞群用NC圈定human CD19+（10門）和human CD3+細胞群（P12門）。人造血幹細胞移植效率用human CD45細胞比例表示，計算方法為human CD45%/（human CD45%+mouse CD45%）。人造血幹細胞在小鼠體內分化為各譜系血細胞的效率用human CD19%（代表B細胞），human CD3%（代表T細胞），human CD33%（代表髓系細胞），human CD56%（代表NK細胞）表示，其結果如圖8A和圖8B所示。
圖8A結果表明，在小鼠移植的起始培養細胞量一致的情況下，AG1296處理的造血幹細胞第18周的骨髓移植效率，明顯高於Mock組和SR1組。圖8B結果表明，AG1296處理的造血幹細胞分化形成的各譜系細胞比例與Mock組和SR1組無明顯差別，AG1296處理的造血幹細胞分化形成各譜系細胞能力正常。
以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。
無
圖1顯示了目的細胞群CD34+CD45+CD45RA-CD90+CD38-細胞群的邏輯門及門位置的確定。 圖2顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行化合物的最佳濃度以及能夠維持HSCs幹性的篩選，表1中化合物（每個化合物3個測試濃度）誘導6-8天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標代表實驗組/對照組LT-HSCs比例的擴增倍數。 圖3 3A顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行化合物AG1296維持HSCs幹性的最佳濃度的篩選，化合物誘導6天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+(%)，CD34+CD90+(%)，CD34+CD90+CD45RA-(%)，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表表達不同標誌物的細胞占總細胞的比例。 3B顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子化合物AG1296擴增HSCs的最佳濃度篩選，化合物誘導處理6天後進行總細胞數量計數，同時流式檢測細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，並根據細胞計數結果得出CD34+細胞、CD34+CD90+細胞、CD34+CD90+CD45RA-細胞、CD34+CD90+CD45RA-CD38-細胞增殖的絕對數量，其中橫坐標代表抑制劑的名稱及濃度，縱坐標細胞數量(*e 5)代表細胞的絕對數量（細胞絕對數量=細胞總數*幹性比例，其中，幹性比例指的是造血幹細胞表面標誌分子組合後篩選的細胞比例）。 圖4 4A顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行化合物AG1296維持HSCs幹性的最佳濃度的篩選，化合物誘導6天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+(%)，CD34+CD90+(%)，CD34+CD90+CD45RA-(%)，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表表達不同標誌物的細胞占總細胞的比例。 4B顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行小分子化合物AG1296擴增HSCs的最佳濃度篩選，化合物誘導處理6天後進行總細胞數量計數，同時流式檢測細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，並根據細胞計數結果得出CD34+細胞、CD34+CD90+細胞、CD34+CD90+CD45RA-細胞、CD34+CD90+CD45RA-CD38-細胞增殖的絕對數量，其中橫坐標代表抑制劑的名稱及濃度，縱坐標細胞數量(*e 5)代表細胞的絕對數量（細胞絕對數量=細胞總數*幹性比例，其中，幹性比例指的是造血幹細胞表面標誌分子組合後篩選的細胞比例）。 圖5 5A顯示了在動員外周血來源的CD34+細胞上進行化合物AG1296與已知文獻報導的抑制劑SR1和UM171在維持HSCs幹性方面的比較。化合物誘導8天後流式檢測LT-HSCs細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，橫坐標代表抑制劑的名稱以及使用濃度，縱坐標CD34+(%)，CD34+CD90+(%)，CD34+CD90+CD45RA-(%)，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-(%)代表表達不同標誌物的細胞占總細胞的比例。 5B顯示了在動員外周血來源的CD34+細胞上進行化合物AG1296與已知文獻報導的抑制劑SR1和UM171在細胞擴增方面的比較。化合物誘導處理8天後流式檢測細胞表面標誌物(CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-)表達分析圖，並根據計數結果得出CD34+細胞、CD34+CD90+細胞、CD34+CD90+CD45RA-細胞、CD34+CD90+CD45RA-CD38-細胞增殖的絕對數量，其中，橫坐標代表抑制劑的名稱，縱坐標細胞數量(*e 5)代表細胞的絕對數量（細胞絕對數量=細胞總數*幹性比例，其中，幹性比例指的是造血幹細胞表面標誌分子組合後篩選的細胞比例）。 圖6顯示了在臍帶血來源的CD34+細胞上進行AG1296不同濃度的體外克隆形成能力的分析圖。BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM代表紅系、髓系、淋巴系等血液系統不同譜系的克隆。其中，橫坐標代表抑制劑名稱以及使用濃度，縱坐標克隆數目代表總克隆數， GEMM克隆數目代表CFU-GEMM克隆數量。 圖7顯示了目的細胞群hCD45+、hCD19+、hCD33+、hCD3+和hCD56+細胞群的邏輯門及門位置的確定。 圖8 8A顯示了化合物AG1296與已知文獻報導的抑制劑SR1，體外培養動員外周血來源的CD34+細胞並進行免疫缺陷型小鼠的體內移植效果的比較。動員外周血來源的CD34+細胞用小分子抑制劑體外培養6天後，移植免疫缺陷型小鼠，移植後18周檢測小鼠骨髓細胞中人CD45+細胞比例。橫坐標代表抑制劑的名稱，縱坐標代表小鼠骨髓細胞中人CD45+細胞比例。 8B顯示了化合物AG1296與已知文獻報導的抑制劑SR1，體外培養動員外周血來源的CD34+細胞並進行免疫缺陷型小鼠的體內移植後各譜系細胞形成能力的比較。動員外周血來源的CD34+細胞用小分子抑制劑體外培養6天後，移植免疫缺陷型小鼠，移植後18周檢測小鼠骨髓細胞中人CD19+（代表B細胞）、人CD33+（代表Myeloid細胞）、人CD3+（代表T細胞）、人CD56+（代表NK細胞）細胞比例。橫坐標代表抑制劑的名稱，縱坐標代表小鼠骨髓細胞中人譜系細胞比例。

Claims (31)

  1. 一種用於擴增並維持造血幹細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)自我更新能力和分化潛能的培養基組合物，其包括造血幹細胞培養基和PDGFR靶點的小分子抑制劑。
  2. 如請求項1所述的組合物，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，優選為AG1296。
  3. 如請求項1或2所述的培養基組合物，其中，所述造血幹細胞培養基包含：1）基礎培養基（優選無血清的基礎培養基）；2）生長因數；和/或3）細胞因數。
  4. 如請求項3所述的培養基組合物，其中，所述生長因數或細胞因數選自如下的一種或多種：生長因數Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和白細胞介素IL-6。
  5. 如請求項4所述的培養基組合物，其中所述生長因數或細胞因數在所述培養基組合物中的濃度如下所示： 所述生長因數Flt-3L的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述生長因數SCF的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述生長因數TPO的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述白細胞介素IL-6的濃度為1-50ng/ml，優選為1-20ng/ml。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的培養基組合物，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑在所述培養基組合物中的濃度為0.1-100μM，優選為0.5-50μM，進一步優選為1-10μM。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的培養基組合物，其中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
  8. 一種促進HSCs擴增並維持HSCs自我更新能力的方法，包括在含有PDGFR靶點的小分子抑制劑的培養基組合物中體外培養HSCs。
  9. 如請求項8所述的方法，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，優選為AG1296。
  10. 如請求項8或9所述的方法，其中，所述造血幹細胞培養基包含：1）基礎培養基（優選無血清的基礎培養基）；2）生長因數；和/或3）細胞因數。
  11. 如請求項10所述的方法，其中，所述生長因數或細胞因數選自如下的一種或多種：Flt-3L、生長因數SCF、生長因數TPO和白細胞介素IL-6。
  12. 如請求項11所述的方法，其中所述生長因數或細胞因數在所述培養基組合物中的濃度如下所示： 所述生長因數Flt-3L的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述生長因數SCF的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述生長因數TPO的濃度為10-110ng/ml，優選為50-100ng/ml； 所述白細胞介素IL-6的濃度為1-50ng/ml，優選為1-20ng/ml。
  13. 如請求項8-12中任一項所述的方法，其中，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑在所述培養基組合物中的濃度為0.1-100μM，優選為0.5-50μM，進一步優選為1-10μM。
  14. 如請求項8-13中任一項所述的方法，其中，所述HSCs來源於骨髓、動員外周血、臍帶血、凍存復蘇的HSCs或經過基因編輯改造的HSCs。
  15. 如請求項8-14中任一項所述的方法，其中，體外培養時間為約4-21天，優選為約6-15天，進一步優選為約6-10天，最優選為約6-8天。
  16. 如請求項8-15中任一項所述的方法，其中，體外培養後， CD34+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為40-85%，優選為60-85%，進一步優選為75-80%。
  17. 如請求項8-16中任一項所述的方法，其中，體外培養後，CD34+CD90+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為6-15%，優選為8-15%，進一步優選為8-12%。
  18. 如請求項8-17中任一項所述的方法，其中，體外培養後，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為2-10%，優選為2-6%，進一步優選為4-5%。
  19. 如請求項8-18中任一項所述的方法，其中，體外培養後，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞數占全部細胞中的比例為2-5%，優選為2.5-4%。
  20. 一種HSCs輸注液，其中，CD34+表型的HSCs細胞數占全部細胞總數的比例為40-85%，優選為60-85%，進一步優選為75-80%。
  21. 如請求項20所述的HSCs輸注液，其中，CD34+CD90+表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為6-15%，優選為8-15%，進一步優選為8-12%。
  22. 如請求項20或21所述的HSCs輸注液，其中，CD34+CD90+CD45RA-表型的HSCs細胞數占全部細胞中的比例為2-10%，優選為2-6%，進一步優選為4-5%。
  23. 如請求項20-22中任一項所述的HSCs輸注液，其中，CD34+CD45+CD90+CD45RA-CD38-表型的HSCs的細胞占全部細胞中的比例為2-5%，優選為2.5-4%。
  24. 如請求項20-23中任一項所述的HSCs輸注液，其通過請求項8-19任一項的方法獲得。
  25. 一種給有需要的個體補充血細胞的方法，包括將請求項20-24任一項所述的HSCs輸注液輸注給所述個體。
  26. 如請求項25所述的方法，其中所述HSCs輸注液輸注給所述個體後，所述HSCs在所述個體中定植、分化為血細胞。
  27. 如請求項25或26所述的方法，其中所述個體為罹患出血、貧血、癌症、白血病、自身免疫病、病毒或細菌感染的個體。
  28. 一種PDGFR靶點的小分子抑制劑在促進HSCs擴增並維持HSCs自我更新能力中的用途，優選的，所述PDGFR靶點的小分子抑制劑選自下述中的一種或多種：AG1296、PDGFR inhibitor 1、Imatinib、PP121、Ponatinib、Axitinib、Trapidil和Erdafitinib，優選為AG1296。
  29. 一種預防或治療個體疾病的方法，包括將請求項20-24中任一項所述的HSCs輸注液輸注給所述個體。
  30. 如請求項20-24中任一項所述的HSCs輸注液在製備預防或治療疾病的藥物中的用途。
  31. 如請求項30所述的用途，其中，所述疾病為需要補充血細胞的疾病。
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