JP6706836B2 - 単核球培養用無血清培地 - Google Patents
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Description
そのような技術として、CD34及び/又はCD133陽性細胞から血管内皮前駆細胞の生体増殖法(特許文献1)、血管内皮細胞分化動態解析方法による内皮細胞様大コロニー(分化型EPCコロニー)形成細胞と内皮細胞様小コロニー(未分化型EPCコロニー)形成細胞の作製法(特許文献2)、骨髄単核球からCD34及び/又はCD133陽性細胞の増幅方法(特許文献3)が報告されている。さらに、本発明者らは、単核球から血管新生に寄与する細胞群へと分化、増殖し得る培養条件として、単核球を幹細胞因子、インターロイキン6、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子の5種の因子を含有する無血清培地中で培養する方法を開発した(特許文献4)。
従って、本発明の課題は、虚血性疾患、組織再生、特に難治性潰瘍の治療に有効な十分量のEPCが増幅可能な新たな無血清培地を提供することにある。
〔2〕〔1〕記載の無血清培地中で単核球を培養することを特徴とする、少なくとも血管内皮前駆細胞が富化した細胞群の製造法。
〔3〕〔1〕記載の無血清培地中の単核球培養物を有効成分とする虚血性疾患治療剤及び/又は組織再生療法剤。
〔4〕虚血性疾患治療剤及び/又は組織再生療法剤が、難治性潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病及び全身の虚血性疾患から選ばれる疾患の治療剤、組織再生療法剤である〔3〕記載の虚血性疾患治療剤及び/又は組織再生療法。
〔5〕〔1〕記載の無血清培地中の単核球培養物を投与することを特徴とする虚血性疾患治療方法及び/又は組織再生療法。
〔6〕難治性潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病及び全身の虚血性疾患から選ばれる疾患の治療方法、組織再生療法である〔5〕記載の治療方法。
無血清培地中のSCFの濃度は、用いるSCFの種類によっても異なるが、ヒト組換えSCFの場合であれば、好ましくは10〜1000ng/mL、より好ましくは50〜500ng/mL、さらに好ましくは約100ng/mLである。
無血清培地中のγ−セクレターゼ阻害剤の濃度は、用いるγ−セクレターゼ阻害剤の種類によっても異なるが、0.001〜10μMが好ましく、0.1〜5μMがより好ましく、PF−03084014の場合であれば1μMが好ましい。
無血清培地中のVEGFの濃度は、用いるVEGFの種類によっても異なるが、ヒト組換えVEGF165の場合であれば、好ましくは5〜500ng/mL、より好ましくは約20〜100ng/mL、さらに好ましくは50ng/mLである。
無血清培地中のFLの濃度は、用いるFLの種類によっても異なるが、ヒト組換えFlt−3リガンドの場合であれば、好ましくは10〜1000ng/mL、より好ましくは50〜500ng/mL、さらに好ましくは100ng/mLである。
無血清培地中のTPOの濃度は、用いるTPOの種類によっても異なるが、ヒト組換えTPOの場合であれば、好ましくは1〜500ng/mL、より好ましくは5〜100ng/mL、さらに好ましくは20ng/mLである。
本発明で用いられる単核球は、CD34および/またはCD133陽性細胞の選別(陽性選別)を行うことなく、取得した単核球をそのまま細胞培養に用いることができる。
従って、本発明の無血清培地は、特許文献4記載の無血清培地に比べて、CD34陽性細胞及びCD206陽性細胞の増加、分化型EPCコロニー形成細胞の増加により、優れた血管内皮前駆細胞富化能に優れており、血管新生を必要とする虚血性疾患治療用の培地あるいは組織再生療法用の培地として優れている。そのような虚血性疾患としては、難治性潰瘍(例えば糖尿病性潰瘍)、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病、慢性と急性を含む全身の虚血性疾患(脳、腎臓、消化管等)等が挙げられる。組織再生療法の対象としては、創傷、乳房再建等が挙げられる。
(1)SCF、γ−セクレターゼ阻害剤、VEGF、FL及びTPO含有無血清培地の調製
培地に用いる無血清培地(Restoration culture ; 以下RC)は、stemlineTMII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma-Aldrich, Cat No. S0192)を用いて表1に示す組成に基づいて作成した。即ち、表1に示す各成分を、所定の最終濃度となるように無血清培地に無菌的に添加した。
1.単核球の入手
20〜80歳の糖尿病(DM)患者から、翼付採血セットを用いて末梢血を40〜65mL、EDTA−2NA入り真空採血管へ採取した。採取は順天堂大学医学部医学調査委員会の承認の下で行い、得られた末梢血サンプルの取り扱いはヒトサンプルに対する生物学的ガイドラインに沿って行った。末梢血からの単核球(PBMNC)単離は、末梢血を遠心後、バッフィーコート層を採取しHistopaque−1077(Sigma-Aldrich, #10771)を用いた密度勾配遠心分離法にて単離した。単離されたPBMNCはPBS−EDTAで洗浄し、緩衝液中に懸濁し、細胞懸濁液を調整した。単離されたPBMNCにおいて得られる細胞数は末梢血1mLあたり約0.82×106個細胞、CD34陽性率は0.06±0.04%、CD133陽性率は0.04±0.02%であった。
上記方法により単離されたPBMNCを、Primaria Tissue culture plate(6well PrimariaTM tissue culture plate, BD Falcon, #353846)を用い、1ウェル当たり2×106細胞/2mL RC培地の条件下、(1)で調整された無血清培地中で7日間培養した。
・RC細胞数
培養の結果、培養開始前のPBMNCに対する上記培養後の細胞(以下、RCCといい、上記培養法をRCCという場合がある)の数は、全ての糖尿病被験者において減少していた(平均で0.56倍;図1)。血液100mLの末梢血に換算すると、血液100mLから平均で約4.6×107個のRC細胞が得られた。
上記培養条件により得られたRCCの特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリーにより、血液血管系の幹細胞、血液系細胞、または血管系細胞の細胞表面マーカーの発現を調べた。フローサイトメトリー解析は下記の通りに行った。
MACS buffer中に懸濁した細胞(1.5×106細胞/300μL−MACS buffer)にFCブロッキング試薬を10μL添加し4℃で30分間培養する。その後染色反応用チューブに等量ずつ分注した(100μL/チューブ×3チューブ)。各アリコートに各一次抗体を2μL添加し4℃で20分間培養した。その後1mLのMACS bufferで2回洗浄し、染色した細胞をMACS buffer中に懸濁した(5×105細胞/200〜300μL−MACS buffer)。フローサイトメトリー計測はFACSAriaTMIIIセルソーター(BD)を用いて行った。なお、抗体はいずれも市販のものを使用した。
計測された細胞の解析はFlowJoTMソフトウェア(Tomy Digital Biology)を用いて行った。PBMNCまたはRCCの散布図をそれぞれ、細胞サイズにより3つの集団、即ちリンパ球サイズ(Lymph gate)、単球サイズ(Mono gate)、および大型細胞サイズ(Large gate)にゲートした(図2)。先ずPBMNCまたはRCC各々の生存細胞率を各ゲートにおいて推定する。次に、3つの細胞サイズ領域ごとに各細胞表面マーカー陽性細胞を測定し、ゲートした細胞集団中の生存細胞分画における陽性率(%)を計算した。
また、上記3集団にゲートした細胞の合計を100%とした場合の陽性率を算出し、さらにこの場合のRCC前後の細胞全体における各マーカー発現細胞の%変化も算出した。
解析の結果、CD34陽性幹細胞の比率が、PBMNCでは約0.06%であるのに対してRCCでは約1.02%となり、RCC前後で比較するとCD34陽性細胞の割合は17倍と大幅に増加していた(図3)。内皮系細胞マーカーの陽性率はCD31で0.93倍となりわずかに減少がみられた。
更に、抗炎症性M2型マクロファージのパラメーターであるCD206は、PBMNCでは1.31%、RCCでは22.91%で、RCC前後比較は17.4倍に増加していた。CD34陽性細胞の増加と同程度に増加していた(図4)。
この結果は上記3集団にゲートした細胞の合計を100%とした場合の陽性率でも同様の傾向であった。
PBMNCおよびRCCの血管形成能を調べるため、EPCコロニー形成アッセイ(EPC−CFA)によりEPCコロニーを定量した。EPC−CFAは、Masuda H.et al.,Circulation research,109:20−37(2011)に記載される方法を元に実施した。具体的には、35mm PrimariaTM dish(BD Falcon)中、表2に示す組成に基づいて作製した半固形培地中でPBMNC/RCCを培養し(2×105細胞/1ディッシュ)、培養開始から16日前後に位相差光学顕微鏡(Eclipse Ti−U,Nikon)下にて、1ディッシュあたりのEPCコロニー数を測定した。形成されるEPCコロニーの種類として未分化型EPCコロニー(PEPC−CFU(primitive EPC colony forming unit);図5左)と、分化型EPCコロニー(DEPC−CFU(definitive EPC colony forming unit);図5右)があり、これらをそれぞれカウントした。
更に本発明のRC培養(本RC)と前記特許文献4記載の培地成分を元にした培養(特4)を行ったRCCをEPCコロニー形成アッセイにて比較したところ、特4に比べ本RCCはDEPC−CFU及びtotal−CFUが優位に増加した(図7)。
以上のことから、本発明のRC培養は、血管形成能を有する細胞が量的にも機能的(質的)にも大いに向上することが実証された。
本発明のRC培養が虚血性疾患(この場合、特に糖尿病患者を示す)に対してより有効であるのを示すため、糖尿病患者と健常者のPBMNCおよびRCCでEPCコロニー形成アッセイ(EPC−CFA)を行いEPCコロニーを定量し血管形成能を比較した。
その結果、RCCにおけるEPCコロニー形成頻度はPBMNCに対して、各コロニーいずれにおいても健常者(Healthy)より糖尿病患者(DM)で増加していた(図8)。(PEPC−CFUはDM:1.57倍、Healthy:1.08倍、DEPC−CFUはDM:23.32倍、Healthy:18.91倍、total−CFUはDM:7.43倍、Healthy:5.29倍。)。
故に、本発明のRC培養が健常者よりもむしろ糖尿病患者においてより優れた効果を発揮することを示している。EPC機能障害の生じている各疾患由来の血液からでも血管形成能を高めた細胞集団を培養することが可能である。
Claims (4)
- 幹細胞因子、γ−セクレターゼ阻害剤、血管内皮細胞増殖因子、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド及びトロンボポエチンを含有し、インターロイキン6を含有しない単核球培養用無血清培地。
- 請求項1記載の無血清培地中で単核球を培養することを特徴とする、少なくとも血管内皮前駆細胞が富化した細胞群の製造法。
- 請求項1記載の無血清培地中で培養された単核球の培養物であって、少なくとも血管内皮前駆細胞が富化した細胞群を含有する培養物を有効成分とする虚血性疾患治療剤又は組織再生療法剤。
- 虚血性疾患治療剤又は組織再生療法剤が、難治性潰瘍、虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症、バージャー病及び全身の虚血性疾患から選ばれる疾患の治療剤又は組織再生療法剤である請求項3記載の虚血性疾患治療剤又は組織再生療法剤。
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