JP6682090B2 - 虚血性疾患治療に適した細胞を含む細胞群の生体外増幅方法 - Google Patents
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Description
本発明は単核球画分から無血清培養下で虚血性疾患の治療に適した血管内皮前駆細胞を含んでなる細胞群を増幅・修飾する方法、該方法により得られる細胞群および当該細胞群を含んでなる虚血性疾患治療剤の製造方法などに関する。
近年虚血性心疾患を対象として、骨髄単核球移植治療や末梢血幹細胞採取による血管内皮前駆細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ；ＥＰＣ）を用いた細胞移植治療法がおこなわれるようになった。それゆえ、ＥＰＣを大量に培養する技術が特に求められていた。本発明者らが開発したＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞からの血管内皮前駆細胞の生体外増幅方法は、効率的なＥＰＣの培養技術を提供することを可能にした（特許文献１）。さらに本発明者らが発明した血管内皮細胞分化動態解析方法によって内皮細胞様大コロニー（分化型ＥＰＣコロニー）形成細胞と内皮細胞様小コロニー（未分化型ＥＰＣコロニー）形成細胞が存在することが明らかになり細胞移植による治療効果を予測、把握することを可能にした（特許文献２）。また本発明者らは骨髄単核球からＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を効率的に増幅させる方法を示した（特許文献３）。
一方で、CD34陰性細胞集団に存在するAngiogenic T細胞と呼ばれるCD3陽性CD31陽性細胞とEPCとを共培養することで、EPCの血管再生能力が高まることも報告されており、CD34陰性細胞集団の中にEPCの能力を高める細胞が含まれていることが示唆されている（非特許文献１）。
一方で、CD34陰性細胞集団に存在するAngiogenic T細胞と呼ばれるCD3陽性CD31陽性細胞とEPCとを共培養することで、EPCの血管再生能力が高まることも報告されており、CD34陰性細胞集団の中にEPCの能力を高める細胞が含まれていることが示唆されている（非特許文献１）。
Circulation 2007, 116:1671-1682
上記文献に示されるように、本発明者らは新たなＥＰＣ培養技術を開発したが、末梢血等からＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を選別する必要があったため、そのＥＰＣ調製工程は依然として時間とコストを要するものであった。また上記非特許文献１のように、ＣＤ３４陰性細胞集団の中にもＥＰＣの能力を高める能力のある細胞が存在する可能性があった。そこで、上記特許文献３のように、ＥＰＣ分画を得るためにＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を選別することなく、あるいはＣＤ３４陽性細胞とＣＤ３４陰性細胞とを一定の割合で混合して、単核球を培養するための条件を検討した結果、本発明の方法を用いることにより、血管内皮細胞に分化能が高いとされる分化型（大型）ＥＰＣコロニー形成細胞が効率的に増幅されるだけではなく、驚くべきことに本方法により得られた培養物または細胞群は、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を培養して得られた培養物または細胞群よりも、血管内皮の優れた形成能とともに炎症の抑制作用をもつため血管新生作用とともに組織修復能に優れ、虚血性疾患の治療に効果的であることを証明した。
すなわち、本発明の課題は虚血性疾患治療に用いる細胞群の調製工程の簡略化と、より当該治療に効果を示す細胞群を提供することにある。より具体的には骨髄、臍帯血および末梢血採取後の細胞選別工程の簡略化により、血管再生性細胞：具体的には血管新生能力の高い分化型ＥＰＣコロニー形成細胞だけでなく、抗炎症・免疫寛容誘導細胞：具体的には抗炎症性に転化したM2マクロファージや、Tリンパ球サブセット、制御性T細胞を含む細胞群を増幅するための手段を提供することにある。
すなわち、本発明の課題は虚血性疾患治療に用いる細胞群の調製工程の簡略化と、より当該治療に効果を示す細胞群を提供することにある。より具体的には骨髄、臍帯血および末梢血採取後の細胞選別工程の簡略化により、血管再生性細胞：具体的には血管新生能力の高い分化型ＥＰＣコロニー形成細胞だけでなく、抗炎症・免疫寛容誘導細胞：具体的には抗炎症性に転化したM2マクロファージや、Tリンパ球サブセット、制御性T細胞を含む細胞群を増幅するための手段を提供することにある。
本発明者らは、上記課題に鑑み、生体外において単核球を選別することなく、あるいはCD34選別、非選別の細胞を混合して、これらの細胞が血管新生に寄与する細胞群へと分化・増殖し得る培養条件を検討した。結果、（１）幹細胞因子（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ），（２）インターロイキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６），（３）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ；ＦＬ），（４）トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）および（５）血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）からなる群より選ばれる因子を含む無血清培地において単核球を培養することにより、ＥＰＣを含む細胞群を生体外で効率よく増幅することに成功した。このEPCを含む細胞群は、特にEPCと抗炎症性のM2マクロファージを含んでいる点に特徴があり、抗炎症性のTリンパ球サブセットや制御性T細胞も含んでいる。したがってこの細胞群は血管発生だけでなく抗炎症性作用も有する細胞群であることを明らかにした。さらに本発明者らは、健常人だけでなく、糖尿病患者から採取した細胞群でも同様の機能を有する細胞群を得られることを明らかにした。
特に培養に用いる単核球において、CD34陽性細胞と陰性細胞とを一定の割合で培養した場合、血管再生能が著しく高い細胞群を得られることを明らかにした。
特に培養に用いる単核球において、CD34陽性細胞と陰性細胞とを一定の割合で培養した場合、血管再生能が著しく高い細胞群を得られることを明らかにした。
即ち、本発明は下記の通りである。
［１］骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する無血清培地中で培養して得られる、細胞群。
［２］骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球を、無血清培地中で培養して得られる細胞群であって、血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージが富化した細胞群。
［３］血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージを含む、上記［１］に記載の細胞群。
［４］血管内皮前駆細胞が分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、上記［２］または［３］に記載の細胞群。
［５］抗炎症性マクロファージがM2マクロファージである、上記［２］〜［４］のいずれかに記載の細胞群。
［６］幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する無血清培地において、骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球を培養することを特徴とする、血管内皮前駆細胞および／または抗炎症性マクロファージが富化した細胞群の製造方法。
［７］血管内皮前駆細胞が分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、上記［６］に記載の方法。
［８］抗炎症性マクロファージがM2マクロファージである、上記［６］または［７］に記載の方法。
［９］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞群を含んでなる、虚血性疾患の治療剤。
［１０］虚血性疾患が、血管新生により治癒する疾患である、上記［９］に記載の治療剤。
［１１］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞群を含んでなる、難治性潰瘍または糖尿病関連疾患の治療剤。
［１］骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する無血清培地中で培養して得られる、細胞群。
［２］骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球を、無血清培地中で培養して得られる細胞群であって、血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージが富化した細胞群。
［３］血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージを含む、上記［１］に記載の細胞群。
［４］血管内皮前駆細胞が分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、上記［２］または［３］に記載の細胞群。
［５］抗炎症性マクロファージがM2マクロファージである、上記［２］〜［４］のいずれかに記載の細胞群。
［６］幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する無血清培地において、骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球を培養することを特徴とする、血管内皮前駆細胞および／または抗炎症性マクロファージが富化した細胞群の製造方法。
［７］血管内皮前駆細胞が分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、上記［６］に記載の方法。
［８］抗炎症性マクロファージがM2マクロファージである、上記［６］または［７］に記載の方法。
［９］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞群を含んでなる、虚血性疾患の治療剤。
［１０］虚血性疾患が、血管新生により治癒する疾患である、上記［９］に記載の治療剤。
［１１］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞群を含んでなる、難治性潰瘍または糖尿病関連疾患の治療剤。
本発明によって増幅された細胞群を移植することにより虚血性疾患の血流量および壊死改善率の改善がみられた。さらに本発明者らはこれらの効果を検討し、本発明が内皮系細胞を質・量ともに産生する上で有用であり、虚血性疾患等の血管障害を対象とした細胞移植療法の有用な方法であると結論するに至った。
特に本発明によれば、糖尿病患者のような血管再生能の低下した患者であっても質・量共に高い血管再生能を有する細胞群が得られ、さらに細胞移植時においても抗炎症性細胞の存在により炎症が抑えられるため、細胞移植療法として極めて有用であるといえる。
特に本発明によれば、糖尿病患者のような血管再生能の低下した患者であっても質・量共に高い血管再生能を有する細胞群が得られ、さらに細胞移植時においても抗炎症性細胞の存在により炎症が抑えられるため、細胞移植療法として極めて有用であるといえる。
本発明は、生体外において血管内皮前駆細胞を含む細胞群を増殖させる方法、特に血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージが富化した細胞群を増殖させる方法、及び当該方法によって得られる細胞移植用細胞群（特に血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージが富化された細胞群）を提供する。
本発明で用いられる単核球とは、末梢血、骨髄または臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞の総称で、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。単核球はさらにＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を含んでいる。動物から骨髄、臍帯血または末梢血を採取し、それを例えば密度勾配遠心法に付して該分画を抽出することにより単核球が得られる。密度勾配遠心法としては、単核球分画が形成されれば特に限定されないが好ましくはＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７(Sigma-Aldrich)が用いられる。
本発明で用いられる単核球は、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別（陽性選別）を行うことなく、取得した単核球をそのまま後述する細胞培養に用いることができる点に大きな特徴がある。
本発明で用いられる単核球は、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別（陽性選別）を行うことなく、取得した単核球をそのまま後述する細胞培養に用いることができる点に大きな特徴がある。
本発明で用いられる細胞が由来する動物種は、虚血性疾患等の疾患に対する細胞移植療法が適用されるヒトを含む哺乳動物一般を意味するが、臨床応用という本発明の目的に鑑みれば、好ましくはヒトである。
本発明で用いられる幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、本発明で用いるＳＣＦはＥＰＣ等の培養に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。ＳＣＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、ＥＰＣ等の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、例えば１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられるインターロイキン６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量２１万の糖タンパク質であり、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。本発明で用いるＩＬ−６は適宜選択されるが、ヒトＥＰＣ等の培養に用いる場合には、ヒトＩＬ−６が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＩＬ−６の濃度は、用いるＩＬ−６の種類によっても異なり、ＥＰＣ等の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＩＬ−６の場合であれば、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられるＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）は、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼのリガンドとして知られている。いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。本発明で用いるＦＬは、ＥＰＣ等の培養に有用である限り、いずれのタイプのＦＬであってもよい。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＦＬの濃度は、用いるＦＬの種類によっても異なり、ＥＰＣ等の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＦｌｔ−３リガンドの場合であれば、例えば１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられるトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。本発明で用いるＴＰＯの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯの種類によっても異なり、ＥＰＣ等の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＴＰＯの場合であれば、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
本発明で用いられ得る血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＥＰＣに特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種のＶＥＧＦタンパク質が産生されるが、本発明で用いるＶＥＧＦはＥＰＣのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプのＶＥＧＦでもよい。好ましくはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦの由来等は特に限定されないが、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。無血清培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、ＥＰＣ等の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、例えば約５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明の無血清培地に添加される各種因子はまた、単核球が由来する動物と同種の動物に由来する因子で統一することが好ましい。このように単核球及び各種因子の由来を統一することで、同種異系移植等の同種移植に好適な細胞培養物が得られる。また、細胞移植が意図される個体由来の単核球を用いることで、同種同系移植に好適な細胞培養物を得ることも可能である。このように異種動物由来の成分を一切含有しない環境でＥＰＣ等を含む細胞群の培養が可能であるため、得られる細胞培養物は、移植等に際して感染リスク・拒絶反応を回避できるという利点を有する。
上記した各成分は無血清培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液（ストック溶液）を調製し、無血清培地で所定の濃度に希釈することによって本発明の、血管内皮前駆細胞を含んでなる細胞群を生体外増幅させる為の無血清培地を調製することができる。例えば市販の無血清培地に必要な成分を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の無血清培地に添加、希釈することによって本発明の無血清培地を調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０.２２μｍや０.４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
本発明で用いられる「無血清培地」は、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている無血清培地を用いることができる。無血清培地として用いられる基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が挙げられる。
本発明の無血清培地は、ＳＣＦ,ＩＬ−６，ＦＬ，ＴＰＯ及びＶＥＧＦからなる群より選ばれる１又は２以上の因子、好ましくは３以上の因子、より好ましくは全ての因子を含有する。従って本発明の培養方法で用いられる無血清培地は例えば、ａ）ＳＣＦ、ｂ）ＩＬ−６、ｃ）ＦＬ、ｄ）ＴＰＯ、ｅ）ＶＥＧＦ、ｆ）ＳＣＦとＩＬ−６との組合せ、ｇ）ＳＣＦとＦＬとの組合せ、ｈ）ＳＣＦとＴＰＯとの組合せ、ｉ）ＳＣＦとＶＥＧＦの組合せ、ｊ）ＩＬ−６とＦＬとの組合せ、ｋ）ＩＬ−６とＴＰＯとの組合せ、ｌ）ＩＬ−６とＶＥＧＦの組合せ、ｍ）ＦＬとＴＰＯとの組合せ、ｎ）ＦＬとＶＥＧＦの組合せ、ｏ）ＴＰＯとＶＥＧＦの組合せ、ｐ）ＳＣＦ、ＩＬ−６及びＦＬの組合せ、ｑ）ＳＣＦ、ＩＬ−６及びＴＰＯの組合せ、ｒ）ＳＣＦ、ＦＬ及びＴＰＯの組合せ、ｓ）ＳＣＦ、ＦＬ及びＶＥＧＦの組合せ、ｔ）ＩＬ−６、ＦＬ及びＴＰＯの組合せ、ｕ）ＩＬ−６、ＦＬ及びＶＥＧＦの組合せ、ｖ）ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ及びＴＰＯの組合せ、ｗ）ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ及びＶＥＧＦの組合せ、ｘ）ＩＬ−６、ＦＬ、ＴＰＯ及びＶＥＧＦの組合せ、ｙ）ＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ、ＴＰＯ及びＶＥＧＦの組合せを含むものであり得る。
本発明の無血清培地はより好ましくはＳＣＦ、ＩＬ−６、ＦＬ、ＴＰＯ及びＶＥＧＦを含む。さらに好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍＬのＦＬ、約２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む。
上述した因子を含有する無血清培地での単核球培養は、単核球を含有する細胞懸濁液を、上述の因子を含有する無血清培地に添加することにより行われる。細胞懸濁液としてはまた、単核球を含有する体液自体（例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）を用いることもできる。単核球の培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で7日間以上（例えば１０日間以上）培養される。単核球の無血清培地中の濃度は、ＥＰＣ等の培養を可能とする限り特に限定されないが、例えば約０．５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは約１〜５×１０５細胞／ｍｌ、最も好ましくは約３〜４×１０５細胞／ｍｌである。
本発明における細胞群とは単核球を上述した因子を含有する無血清培地で培養した結果得られる細胞の総称であり、ＥＰＣと共に、血管内皮細胞、抗炎症性マクロファージ、血管新生促進および線維化抑制細胞のうち少なくとも一つ以上を含む細胞群である。また、単核球を上述した因子を含有しない培地で培養したものであっても、上記のＥＰＣと共に、血管内皮細胞、抗炎症性マクロファージ、血管新生促進および線維化抑制細胞を優位に増幅させたものであれば、同様の効果が得られると考えられる。
また本発明における細胞群としては、CD206陽性である細胞群を含み、かつCD34陽性である細胞群を含む細胞群が好ましく、これらの発現が高い細胞群がより好ましい。具体的には、後述する分化型EPCと抗炎症性マクロファージを含む細胞群であることが望ましく、これらの細胞群をより多く含有する細胞群、すなわちこれらの細胞群を富化した細胞群であることがより望ましい。
ここで、ＥＰＣおよび／または抗炎症性マクロファージを富化した細胞群とは、上述した因子を含有する無血清培地で培養する前の単核球全体におけるそれぞれの比率に比べて、培養後の細胞群全体における各細胞の比率が、２倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上に増加することをいう。本発明の培養方法により得られる細胞群は、もとの単核球に比べてＥＰＣと抗炎症性マクロファージの比率が著しく高くなっているため、血管新生を顕著に促進すると共に、炎症を抑える効果を奏するのである。
ここで、ＥＰＣおよび／または抗炎症性マクロファージを富化した細胞群とは、上述した因子を含有する無血清培地で培養する前の単核球全体におけるそれぞれの比率に比べて、培養後の細胞群全体における各細胞の比率が、２倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上に増加することをいう。本発明の培養方法により得られる細胞群は、もとの単核球に比べてＥＰＣと抗炎症性マクロファージの比率が著しく高くなっているため、血管新生を顕著に促進すると共に、炎症を抑える効果を奏するのである。
本発明で用いられるＥＰＣとは血管内皮細胞に成り得る未分化な細胞であれば特に限定されない。ＥＰＣはさらに分化程度によって、直径２０〜５０μｍの細胞を主に含む分化型ＥＰＣコロニー（ＣＦＵ−Ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＣ、大型ＥＰＣコロニーともいう）及び直径２０μｍ以下の細胞を主に含む未分化型ＥＰＣコロニー（ＣＦＵ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ＥＣ、小型ＥＰＣコロニーともいう）の大きさの異なる２種類のコロニーから区別できる。早い段階で出現する未分化型（小型）ＥＰＣコロニーは、増殖能にすぐれた早期分化段階のＥＰＣコロニーと言え、また遅い段階で出現する分化型（大型）ＥＰＣコロニーは、血管発生にすぐれた晩期分化段階のＥＰＣコロニーであると言える（例えば、Masuda H. et al., Circulation Research, 109: 20-37 (2011)を参照）。本発明により得られる細胞群に含まれるＥＰＣは、ＣＤ３４／ＣＤ１３３による選別を行う場合と比較して未分化型ＥＰＣコロニー形成細胞数がほぼ同等なのに対して分化型ＥＰＣコロニー形成細胞数が著しく増加している。好ましくはＣＤ３４／ＣＤ１３３による選別を行う場合と比較して未分化型ＥＰＣ形成細胞数が変わらないのに対してその２倍以上の分化型ＥＰＣコロニー形成細胞が含まれる。さらに好ましくはＣＤ３４／ＣＤ１３３による選別を行う場合と比較して未分化型ＥＰＣコロニー形成細胞数が変わらないのに対してその４倍の、より好ましくは５倍の分化型ＥＰＣコロニー形成細胞が含まれる。
本発明により得られる細胞群に含まれる抗炎症性マクロファージとは、ＣＤ２０６陽性、抗炎症性で血管形成や修復に寄与するマクロファージである。好ましくはM２マクロファージであり、より好ましくはCD２０６陽性のM2マクロファージである。本発明により得られる細胞群は、血管内皮前駆細胞と共にこの細胞を含んでなるものであり、当該細胞群中の抗炎症性マクロファージの割合が無選別の場合の単核球に比べ通常２倍以上、好ましくは４倍以上に増加している。
上述した因子を含有する無血清培地で無選別単核球を培養するという予想だにしない方法によることで未分化型ＥＰＣコロニー形成細胞から分化型ＥＰＣコロニー形成細胞への分化あるいは増幅促進、血液系細胞の抗炎症性マクロファージの分化あるいは増幅促進または炎症性マクロファージの分化あるいは増幅抑制が可能となる。
上述した因子を含有する無血清培地で無選別単核球を培養することで生じる未分化型ＥＰＣコロニー形成細胞から分化型ＥＰＣコロニー形成細胞への分化促進あるいは分化型ＥＰＣコロニー形成細胞の増幅は、例えば、得られる細胞懸濁液の血管内皮前駆細胞コロニー形成能を測定することによって確認できる。
血管内皮前駆細胞コロニー形成能の測定は、生理活性物質、具体的には血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する、好ましくは上記因子に加え、さらに幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インスリン成長因子（ＩＧＦ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）からなる群より選択される１又は２以上、好ましくは３以上、より好ましくは全ての因子、並びにさらに必要に応じて血清および／またはヘパリンを含有するメチルセルロース培地を用いて実施することができる。特に好ましくは、約３０％の血清、約５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、約２Ｕ／ｍＬのへパリン、約５０ｎｇ／ｍＬのｂ−ＦＧＦ、約５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及び約５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦを含有するメチルセルロース培地で、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で通常１０日以上、例えば１４〜１８日間又はそれ以上培養して血管内皮前駆細胞コロニーを形成させる。コロニーの形成は目視で確認することができるが、得られるコロニーが本当に血管内皮前駆細胞で構成されているか否かは、アセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）の取り込み能やＵＥＡ−１レクチンとの結合能、ＶＥ−カドヘリン、ＫＤＲ、ｖＷＦの発現（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより、あるいは蛍光免疫組織化学的方法により）等を確認することによって行う。例えばＤｉＩで標識したアセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ−ＤｉＩ）(Biomedical Technologies)及びＦＩＴＣ標識したＵＥＡ−１レクチン（ＵＥＡ−１レクチン−ＦＩＴＣ）(Vector Lab)でコロニーを二重染色した場合に、血管内皮前駆細胞であれば共に染色される。
血管内皮前駆細胞コロニー形成能の測定はまた、市販のキットを使用して行うこともできる。このようなキットとしては、例えばステムセルテクノロジー社製のキット（カタログＮｏ．Ｈ４２３６）が市販されている。このキットの培地に上述した各因子を添加したものを用いることで、ＥＰＣコロニー形成能の簡便な測定が可能となる。
抗炎症性マクロファージあるいは炎症性マクロファージの分化あるいは増幅は例えば、抗炎症性マクロファージについてはＣＤ２０６、そして炎症性マクロファージについてはＣＣＲ２を、それらに親和性を有する抗体により標識し、フローサイトメータ解析により計測できる。
あるいは、本発明により得られる細胞群は、さらに抗炎症性のTh2細胞や、制御性T細胞を含みうる。したがって本発明により得られる細胞群は、ＥＰＣや抗炎症性マクロファージに加えて、さらに抗炎症性のTh2細胞や制御性T細胞が富化した細胞群でもあり得る。
これらの細胞群も、培養前と比較した各細胞の全細胞数に対する比率が、通常２倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上に増加している。
これらの細胞群も、培養前と比較した各細胞の全細胞数に対する比率が、通常２倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上に増加している。
本発明により得られる細胞群としては、好ましくは分化型EPCコロニー形成細胞を含むものであり、さらに好ましくは分化型EPCコロニー形成細胞と抗炎症性マクロファージ（CD206陽性のM２マクロファージ）を含むものである。この細胞群は、例えば潰瘍などの炎症部位において、血管を発生させるだけでなく、炎症をも抑えることができる点で極めて効果的である。
本発明はさらに、上述した因子を含有する無血清培地で無選別単核球を培養することで得られる血管内皮前駆細胞を血管内皮細胞に分化させることを含む、血管内皮細胞の調製方法を提供する。血管内皮前駆細胞の血管内皮細胞への分化は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、ＥＢＭ−２、ＥＧＭ２Ｖ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕｏｔｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）、自己血清等を用いる方法が挙げられる。
本発明の細胞群に含まれる、ＥＰＣ等の細胞は、適宜単離及び／又は精製できる。例えば血液血管芽細胞の細胞表面マーカーとしてＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＥＰＣの細胞表面マーカーとしてＫＤＲ、血管内皮細胞の表面マーカーとしてＫＤＲ、血管内皮カドヘリン（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｅｌｉａｌ ｃａｄｈｅｒｉｎ）、抗炎症性マクロファージの表面マーカーとしてＣＤ２０６が公知であるので、これらの細胞表面マーカーに対して親和性を有する物質（例えば、抗体）を用いて細胞分離法に付すことで、所望の細胞が分離できる。このような細胞分離法としては、例えば、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、蛍光細胞分離法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本発明の特徴はＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性選別を行わずに得られた単核球を上述した因子を含有する無血清培地で培養することにより分化型ＥＰＣコロニー形成細胞を含むＥＰＣ、抗炎症性マクロファージ、血管新生促進および線維化抑制細胞が増幅することにある。
より詳細にはＣＤ３４陽性選別をした単核球を本発明の培養方法で培養すると未分化型ＥＰＣコロニー形成細胞しか増幅されないが、無選別単核球を使用した場合は未分化型ＥＰＣコロニー形成細胞とともに分化型ＥＰＣコロニー形成細胞が増幅するし、さらに抗炎症性マクロファージまでが増幅する。さらに抗炎症性のTh2細胞や制御性T細胞までもが増幅するのである。
より詳細にはＣＤ３４陽性選別をした単核球を本発明の培養方法で培養すると未分化型ＥＰＣコロニー形成細胞しか増幅されないが、無選別単核球を使用した場合は未分化型ＥＰＣコロニー形成細胞とともに分化型ＥＰＣコロニー形成細胞が増幅するし、さらに抗炎症性マクロファージまでが増幅する。さらに抗炎症性のTh2細胞や制御性T細胞までもが増幅するのである。
本発明はまた、虚血性疾患の治療剤を提供する。
本発明の剤の有効成分である細胞群は、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞、抗炎症性マクロファージを含むため、本発明の治療剤は、血管新生により治療できる疾患に適用することができる。すなわち本発明の治療剤は、事実上の細胞移植により血管障害の治療に用いることができる。このような「血管新生により治療できる疾患」としては、例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症等の下肢虚血、バージャー（Ｂｕｒｇｅｒ）病）、血管損傷が挙げられる。また、皮膚潰瘍等の創傷を治癒するため、あるいは人工血管の作製に使用できる。細胞移植後の効果は、自体公知の方法により確認できる。例えば血管新生により治療できる疾患が下肢虚血性疾患である場合には、移植後の治療効果を例えば下肢血流量および壊死改善率を調べることによって評価することができる。血流量の増加の測定はレーザドップラーイメージング解析の値を測定することによって行うことができる。また壊死改善率はリムサルベージスコアとして目視により測定することができる。また、血管新生により治療できる疾患が虚血性心疾患である場合には、移植後の心機能を、例えば収縮能と拡張能とを調べることによって評価することができる。心臓の収縮能や拡張能の測定は当分野で実施されている種々の方法によって行うことができる。例えば収縮能の測定は僧帽弁逆流波形から算出される＋ｄｐ／ｄｔ値（収縮能が低下するにつれて値が下がる）や左室駆出率（％ＥＦ、収縮能が低下するにつれて値が下がる）等を、拡張能の測定であれば同様に僧帽弁逆流波形から算出される−ｄｐ／ｄｔ値（拡張能が低下するにつれて値が上がる）や拡張末期内径（ＥＤｄ）等を測定することなどによって行うことができる（例えば、FASEB Journal,18:1392-1394(2004)参照）。
本発明の剤は、有効成分たる本発明の細胞群そのものであってもよいし、液状媒体に懸濁されていてもよい。液体媒体はヒトに注入可能な液体であればいずれであってもよく、例えば、リン酸緩衝液や生理食塩水あるいは無血清培地であるＤＭＥＭなども利用可能である。また液体媒体にはアルブミンなど細胞の生存に好ましい化合物が含まれてもよい。好ましくはアルブミンを含む化合物として患者由来の血清があげられる。
本発明の剤の有効成分である細胞群は血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞、抗炎症性マクロファージ、血管新生促進および線維化抑制細胞を含む。
本発明はさらに、上述した因子を含有する無血清培地、並びにこの無血清培地を含む単核球の培養用試薬及びキットを提供する。
本発明のキットはさらに、ＥＰＣ等の細胞表面マーカーに特異的な親和性を有する物質（例えば、抗体）、並びに／あるいは血液血管芽細胞又はその分化細胞の分化誘導因子（例えば、ＥＰＣから血管内皮細胞への分化の誘導因子）を含んでいてもよい。かかるキットは、本発明の培養方法に好適に用いられる。
糖尿病（DM）患者EPCは組織修復・再生能の低下が認められ、DM患者の創傷治癒に対する自己EPC細胞移植療法の有効性は不十分である。しかしながら、本発明のQQc無血清培養法にて単核球を一週間程度培養することによって、糖尿病により組織修復・再生能の低下が認められる細胞群を、糖尿病環境から解放し、血管再生能を有し、また炎症を抑える作用を有する細胞群に再教育することができる。すなわち本発明の細胞群を用いることで、DM患者における難治性潰瘍や糖尿病関連疾患の治療の途が開けるのである。
繰り返し述べるように本発明により得られる細胞群は、血管内皮前駆細胞だけでなく抗炎症性マクロファージが富化した細胞群であり、さらに調節性Ｔ細胞も増加された細胞群であるため、免疫系が働くことにより発症する疾患（例えば糖尿病そのものや、糖尿病関連疾患など）の予防・治療にも有用であり得る。ここで糖尿病性関連疾患とは、糖尿病の発症と関連した血管障害に端を発する疾患全般をいい、このような疾患としては、例えば糖尿病虚血性疾患（心疾患、脳疾患、四肢虚血、難治性潰瘍、腎障害、網膜障害等）が挙げられる。
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を何ら限定するものではない。
以下の実施例において、結果の統計解析にはGraphPad Prism5ソフトウェア（GraphPad Prism5 software, Inc）を用いた。PBMNCおよびQQCの細胞数またはそれらの間の割合の解析にはウィルコクソンの符号付き順位検定を用いた。相関解析は線形回帰分析により行った。他のアッセイにおいてそれらの細胞の各種パラメータはマン・ホイットニーのＵ検定により解析した。
３群間の比較にはクラスカル・ウォリス検定を用いた。P<0.05を統計的に有意とした。全ての値は平均±標準誤差で表している。
３群間の比較にはクラスカル・ウォリス検定を用いた。P<0.05を統計的に有意とした。全ての値は平均±標準誤差で表している。
実施例１：末梢血由来単核球からのEPC増加
(1) PBMNC及びCD34陽性単核球の調製
20-55歳の健康なボランティアから50mlシリンジに装着されたヘパリン化翼状針を用いて末梢血を20-100ml採取した。採取は東海大学医学部医学調査委員会の承認の下で行い、得られた末梢血サンプルの取り扱いは、ヒトサンプルに対する生物学的ガイドラインに沿って行った。末梢血からのPBMNCの単離は、Asahara et al., Science, 275: 964-7 (1997)に記載の方法に従って、Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, #10771)を用いた密度勾配遠心法により行った。単離されたPBMNCをPBS-EDTAで洗浄後、緩衝液中に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。単離されたPBMNCにおいてCD34陽性率は0.23±0.03%、CD133陽性率は0.20±0.07%であった。また、末梢血100mlあたりのCD34陽性細胞数は(27.8±4.5)x104、CD133陽性細胞数は(23.2±6.9)x104であった。
(1) PBMNC及びCD34陽性単核球の調製
20-55歳の健康なボランティアから50mlシリンジに装着されたヘパリン化翼状針を用いて末梢血を20-100ml採取した。採取は東海大学医学部医学調査委員会の承認の下で行い、得られた末梢血サンプルの取り扱いは、ヒトサンプルに対する生物学的ガイドラインに沿って行った。末梢血からのPBMNCの単離は、Asahara et al., Science, 275: 964-7 (1997)に記載の方法に従って、Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, #10771)を用いた密度勾配遠心法により行った。単離されたPBMNCをPBS-EDTAで洗浄後、緩衝液中に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。単離されたPBMNCにおいてCD34陽性率は0.23±0.03%、CD133陽性率は0.20±0.07%であった。また、末梢血100mlあたりのCD34陽性細胞数は(27.8±4.5)x104、CD133陽性細胞数は(23.2±6.9)x104であった。
CD34陽性細胞の精製は、磁気ビーズをコートしたマウス抗ヒトCD34抗体、および説明書に従ってCD34 Cell isolation kit (Miltenyi Biotec, #130-046-702)を用い、autoMACS separator (Miltenyi Biotec)により行った。
(2) 無血清培地の調製
培養に用いる無血清培地（以下、QQ培地またはQQcm)は、stemlineTMII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma-Aldrich, Cat No. S0192)を用いて、表１に示す組成に基づいて作成した。即ち、表１に示す各成分を、所定の濃度となるように無血清培地に無菌的に添加した。
培養に用いる無血清培地（以下、QQ培地またはQQcm)は、stemlineTMII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Sigma-Aldrich, Cat No. S0192)を用いて、表１に示す組成に基づいて作成した。即ち、表１に示す各成分を、所定の濃度となるように無血清培地に無菌的に添加した。
(3) PBMNCの培養
上記方法により単離されたPBMNCを、Primaria Tissue culture plate (35-mm PrimariaTM tissue culture dish, BD Falcon, #353801)を用い、1ウェル当たり2x106細胞/2ml QQ培地の条件下、(2)で調製された無血清培地中で7日間培養した。QQ培地中の上記細胞密度は、末梢血1mlあたり約1x106 MNCに相当する。
培養の結果、培養開始前のPBMNCに対する上記培養後の細胞(以下、QQCといい、上記培養法をQQcという場合がある)の数は、全ての被験者について減少していた(平均で0.49倍; 図1)。一方、得られるQQC数は、線形回帰分析において、末梢血100mlあたりのPBMNC数と負の相関を示した。即ち、等量の末梢血から単離された全PBMNC数とは関係なく、100mlの末梢血から平均で約4x107個の細胞が得られた。
上記方法により単離されたPBMNCを、Primaria Tissue culture plate (35-mm PrimariaTM tissue culture dish, BD Falcon, #353801)を用い、1ウェル当たり2x106細胞/2ml QQ培地の条件下、(2)で調製された無血清培地中で7日間培養した。QQ培地中の上記細胞密度は、末梢血1mlあたり約1x106 MNCに相当する。
培養の結果、培養開始前のPBMNCに対する上記培養後の細胞(以下、QQCといい、上記培養法をQQcという場合がある)の数は、全ての被験者について減少していた(平均で0.49倍; 図1)。一方、得られるQQC数は、線形回帰分析において、末梢血100mlあたりのPBMNC数と負の相関を示した。即ち、等量の末梢血から単離された全PBMNC数とは関係なく、100mlの末梢血から平均で約4x107個の細胞が得られた。
(4) EPCコロニー形成アッセイ
元のPBMNCおよびQQCの血管形成能を調べるため、EPCコロニー形成アッセイ(EPC-CFA)により接着性EPCコロニーを定量した。EPC-CFAは、Masuda H. et al., Circulation research, 109: 20-37 (2011)に記載の方法に準じて行った。具体的には、35mm PrimariaTM dish (BD Falcon)中、表２に示す組成に基づいて作製した半固形培地中で細胞を培養し、培養開始から16-18日後に、位相差光学顕微鏡(Eclipse TE300, Nikon)下、ディッシュあたりの接着性コロニー数をgridded scoring dish (Stem Cell Tec.)を用いて測定した。未分化型EPCコロニー(PEPC-CFU (primitive EPC colony forming unit); 図2左)と分化型EPCコロニー(DEPC-CFU (definitive EPC colony forming unit); 図2右)とを別々にカウントした。
元のPBMNCおよびQQCの血管形成能を調べるため、EPCコロニー形成アッセイ(EPC-CFA)により接着性EPCコロニーを定量した。EPC-CFAは、Masuda H. et al., Circulation research, 109: 20-37 (2011)に記載の方法に準じて行った。具体的には、35mm PrimariaTM dish (BD Falcon)中、表２に示す組成に基づいて作製した半固形培地中で細胞を培養し、培養開始から16-18日後に、位相差光学顕微鏡(Eclipse TE300, Nikon)下、ディッシュあたりの接着性コロニー数をgridded scoring dish (Stem Cell Tec.)を用いて測定した。未分化型EPCコロニー(PEPC-CFU (primitive EPC colony forming unit); 図2左)と分化型EPCコロニー(DEPC-CFU (definitive EPC colony forming unit); 図2右)とを別々にカウントした。
EPC-CFAの結果、PBMNCと比較してQQCでは、ディッシュあたりの形成されたEPCコロニーの総数、および特に分化型EPCコロニー(DEPC-CFU)数について顕著な増加が観察された(それぞれ13.7倍、42倍; 図3)。分化型EPCコロニー形成細胞の頻度は強力な血管形成活性を反映していることが示されているため、この結果は、PBMNCに対してQQCは顕著に優れた血管再生能を有することを実証している。また、等量の血液に由来する分化型コロニー形成細胞数および総EPCコロニー形成細胞数はPBMNCとの比較でそれぞれ19倍、6.2倍増加した。EPCコロニー形成細胞の分化度についても、PBMNCではEPCコロニー形成細胞全体のうち未分化型コロニー形成細胞が66.4%、分化型コロニー形成細胞が33.6%であったのに対し、QQCでは未分化型コロニー形成細胞が8.4%、分化型コロニー形成細胞が91.6%と、分化型コロニー形成細胞の比率が大幅に増加していた。
更に、QQCにおける各EPCコロニー形成細胞の頻度とPBMNCにおける各EPCコロニー形成細胞の頻度との関係を線形回帰分析により調べたところ、1ディッシュあたりで、QQCの分化型EPCコロニー形成細胞数および総EPCコロニー形成細胞数はPBMNCの分化型EPCコロニー形成細胞数と相関していたが、QQCの未分化型EPCコロニー形成細胞数とPBMNCの未分化型EPCコロニー形成細胞数とは相関がなかった。一方、QQCの未分化型EPCコロニー形成細胞数または総EPCコロニー形成細胞数はPBMNCの分化型EPCコロニー形成細胞と相関がなかった。
要約すれば、QQCの総EPCコロニー形成細胞頻度はPBMNCのそれに依存していた。特に、QQCにおける分化型EPCコロニー形成細胞の頻度は、PBMNCにおける未分化型EPCコロニー形成細胞の頻度と関連しており、QQ培養によりPBMNC中の未分化型EPCコロニー形成細胞が分化したことを示している。以上のことから、QQ培養により、血管形成能が細胞の量的にも質的にも劇的に向上することが実証された。
更に、QQCにおける各EPCコロニー形成細胞の頻度とPBMNCにおける各EPCコロニー形成細胞の頻度との関係を線形回帰分析により調べたところ、1ディッシュあたりで、QQCの分化型EPCコロニー形成細胞数および総EPCコロニー形成細胞数はPBMNCの分化型EPCコロニー形成細胞数と相関していたが、QQCの未分化型EPCコロニー形成細胞数とPBMNCの未分化型EPCコロニー形成細胞数とは相関がなかった。一方、QQCの未分化型EPCコロニー形成細胞数または総EPCコロニー形成細胞数はPBMNCの分化型EPCコロニー形成細胞と相関がなかった。
要約すれば、QQCの総EPCコロニー形成細胞頻度はPBMNCのそれに依存していた。特に、QQCにおける分化型EPCコロニー形成細胞の頻度は、PBMNCにおける未分化型EPCコロニー形成細胞の頻度と関連しており、QQ培養によりPBMNC中の未分化型EPCコロニー形成細胞が分化したことを示している。以上のことから、QQ培養により、血管形成能が細胞の量的にも質的にも劇的に向上することが実証された。
一方、(1)で精製したCD34陽性細胞について(3)と同様に培養し、(4)と同様にEPC-CFAに供したところ、未分化型EPCコロニーのみが形成され、分化型EPCコロニーは形成されなかった(図4の中央のバー)。形成されたEPCコロニーの総数としても、CD34で分画しなかったPBMNCをQQ培養した場合より少なかった。また、CD34陰性細胞を同様に培養後、EPC-CFAに供した場合、EPCコロニーは形成されなかった(図4の左のバー)。CD34陽性細胞をCD34陰性細胞と混合してQQ培養し、同様にEPCコロニー形成アッセイを行ったところ、分化型EPCコロニー形成活性の顕著な向上が観察された(図4の右のバー)。これらの結果は、EPCコロニー形成活性に関与するのはCD34陽性細胞であるが、該活性、特に分化型EPCコロニー形成活性のためにはCD34陰性細胞の存在が重要であることを示唆している。
以上のことから、CD34の発現を指標にして選別することなく、PBMNCをQQ培養に供することによって、該選別を行った場合と比較して、EPC数および分化型EPCコロニー形成細胞数を顕著に増加させ得ることが分かった。この結果は、CD34陽性細胞が分離され単独でQQ培養されるより、CD34陰性細胞と共に単核球のままQQ培養する方が、分化型EPCコロニー形成細胞の割合を高めることが可能になり、血管再生能力の強い細胞群になることを意味する。元来EPCコロニー形成細胞の純度が非常に高いCD34陽性細胞（あるいはCD133陽性細胞）でQQ培養することでEPCコロニー形成細胞を増幅することは容易に予測され技術が確立されたものであるが、EPCの純度を高めるための細胞分離（CD34, CD133）をおこなわず単核球のまま培養することで、CD34陰性細胞を共培養として利用することでEPCコロニー形成細胞を増幅し分化させることが可能になるという技術開発は、医療科学技術知識からは想定外の成果である。
実施例２：細胞群のフローサイトメトリー解析
実施例１で得られた細胞群の特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリーにより、血液血管系の幹細胞、血液系細胞、または血管系細胞の細胞表面マーカーの発現を調べた。フローサイトメトリー解析は下記の通りに行った。
MACSバッファー中に懸濁した細胞(5x105細胞/200μl MACSバッファー)を10μlのFCブロッキング試薬の添加後に4℃で30分間培養し、その後の染色のために反応チューブ中に等量に分注した(100μl/チューブ)。各アリコートを2μlの各一次抗体と共に4℃で20分間培養した後、1mlのMACSバッファーで2回洗浄した。細胞をMACSバッファー中に懸濁した(200μlのMACSバッファーあたり2x105細胞)。フローメトリー解析はLSRFortessaTM cell analyzer (BD)およびFlowJoTMソフトウェア(Tomy Digital Biology)を用いて行った。抗体はいずれも市販のものを使用した。vWFの染色の際は、細胞を各一次抗体と培養後、ビオチン抱合ラット抗マウスIgG1と培養し、次いでストレプトアビジン-PE/Cy7にコンジュゲートさせた。
PBMNCまたはQQCの散布図をそれぞれ、細胞サイズにより3つの集団、即ちリンパ球サイズ、単球サイズ、および大型細胞サイズにゲートした（図5A）。PBMNCまたはQQCの各々の細胞陽性率を先ず各ゲートにおいて推定し、その後、各表面マーカーについて3つの細胞サイズ領域にゲートし測定することで、ゲートした全生存細胞画分における陽性率を計算した（図5A左側）。また、末梢血100mlあたりの陽性細胞数（図5A右側）についても、PBMNCまたはQQCの全生存細胞数と上記の累積された陽性率とを用いて算出した。
さらに、上記3集団にゲートした細胞の合計を100%とした場合の陽性率を算出し（図5B左側）、さらにこの場合のQQC前後の細胞全体における各マーカー発現細胞の%変化も算出した（図5B右側）。
実施例１で得られた細胞群の特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリーにより、血液血管系の幹細胞、血液系細胞、または血管系細胞の細胞表面マーカーの発現を調べた。フローサイトメトリー解析は下記の通りに行った。
MACSバッファー中に懸濁した細胞(5x105細胞/200μl MACSバッファー)を10μlのFCブロッキング試薬の添加後に4℃で30分間培養し、その後の染色のために反応チューブ中に等量に分注した(100μl/チューブ)。各アリコートを2μlの各一次抗体と共に4℃で20分間培養した後、1mlのMACSバッファーで2回洗浄した。細胞をMACSバッファー中に懸濁した(200μlのMACSバッファーあたり2x105細胞)。フローメトリー解析はLSRFortessaTM cell analyzer (BD)およびFlowJoTMソフトウェア(Tomy Digital Biology)を用いて行った。抗体はいずれも市販のものを使用した。vWFの染色の際は、細胞を各一次抗体と培養後、ビオチン抱合ラット抗マウスIgG1と培養し、次いでストレプトアビジン-PE/Cy7にコンジュゲートさせた。
PBMNCまたはQQCの散布図をそれぞれ、細胞サイズにより3つの集団、即ちリンパ球サイズ、単球サイズ、および大型細胞サイズにゲートした（図5A）。PBMNCまたはQQCの各々の細胞陽性率を先ず各ゲートにおいて推定し、その後、各表面マーカーについて3つの細胞サイズ領域にゲートし測定することで、ゲートした全生存細胞画分における陽性率を計算した（図5A左側）。また、末梢血100mlあたりの陽性細胞数（図5A右側）についても、PBMNCまたはQQCの全生存細胞数と上記の累積された陽性率とを用いて算出した。
さらに、上記3集団にゲートした細胞の合計を100%とした場合の陽性率を算出し（図5B左側）、さらにこの場合のQQC前後の細胞全体における各マーカー発現細胞の%変化も算出した（図5B右側）。
解析の結果、QQCでは、CD34陽性またはCD133陽性幹細胞の比率および数が、PBMNCに対して大幅に増加している一方(CD34陽性細胞について、頻度は5.31倍、数は1.96倍; CD133陽性細胞について、頻度は4.64倍、数は1.80倍)、殆どの造血系細胞マーカーについて陽性細胞の比率および数は減少していた(図5A)。内皮系細胞のマーカーの陽性率については、CD31で0.92倍、vWFで0.77倍とわずかに減少が見られ、VEGFR-2では0.56倍であった。逆にCD105またはCD146については、恐らくQQCにおける未分化型または分化型コロニー形成性EPCの富化を反映して、陽性率が増加していた。
注目すべきこととして、抗炎症性M2型マクロファージのパラメータ(CD206)が幹細胞集団の増加と同程度に増加し、逆に炎症性M1型マクロファージのパラメータ(CCR2）は明らかに減少していた(CD206陽性細胞について、頻度は4.71倍、細胞数は1.72倍; CCR2陽性細胞について、頻度は0.01倍、細胞数は0.01倍)。
この結果は上記3集団にゲートした細胞の合計を100%とした場合の陽性率でも同様の傾向であった。具体的には、PB-MNCに比較してQQ-MNCでは、
・未分化EPC分画(CD34+またはCD133+細胞)の同一生細胞数当たりの比率が上昇していた。また、生細胞全体における含有率も若干上昇した。これは、未分化EPC分画がQQcにより増幅されたことを意味する（図5B最上段四角内）。
・炎症性マクロファージ(CCR2+細胞)の同一生細胞数当たりの比率（左側）は減少しており、さらに生細胞全体における含有率（右側）は減少した。一方、抗炎症性マクロファージ(CD206+細胞)においては、いずれの指標も上昇した（図5B下段上側四角内）。
・また血管形成性T細胞（angiogenic T cell）の指標としてはCD3/CXCR4/CD31が挙げられるが、これについてもいずれの指標も上昇した（図5B下段下側四角内）。
注目すべきこととして、抗炎症性M2型マクロファージのパラメータ(CD206)が幹細胞集団の増加と同程度に増加し、逆に炎症性M1型マクロファージのパラメータ(CCR2）は明らかに減少していた(CD206陽性細胞について、頻度は4.71倍、細胞数は1.72倍; CCR2陽性細胞について、頻度は0.01倍、細胞数は0.01倍)。
この結果は上記3集団にゲートした細胞の合計を100%とした場合の陽性率でも同様の傾向であった。具体的には、PB-MNCに比較してQQ-MNCでは、
・未分化EPC分画(CD34+またはCD133+細胞)の同一生細胞数当たりの比率が上昇していた。また、生細胞全体における含有率も若干上昇した。これは、未分化EPC分画がQQcにより増幅されたことを意味する（図5B最上段四角内）。
・炎症性マクロファージ(CCR2+細胞)の同一生細胞数当たりの比率（左側）は減少しており、さらに生細胞全体における含有率（右側）は減少した。一方、抗炎症性マクロファージ(CD206+細胞)においては、いずれの指標も上昇した（図5B下段上側四角内）。
・また血管形成性T細胞（angiogenic T cell）の指標としてはCD3/CXCR4/CD31が挙げられるが、これについてもいずれの指標も上昇した（図5B下段下側四角内）。
さらに、上記指標について、PB-MNCに比較してQQ-MNCでは、炎症性Tリンパ球サブセット(Th1)の減少を認め、反対に抗炎症性Tリンパ球サブセット(Th2)及び制御性Tリンパ球サブセット(T reg)の上昇を認めた（図６）。左グラフは、各ThのＰＢＭＮＣ内含有率に対するＱＱＣ内含有率の比率を示す。炎症性Th1の減少(x 0.55倍) 及び抗炎症性サブセットの増幅(Th2= x 4.9倍、T reg= x5.81倍)が確認された。右グラフは、ＱＱＣのＰＢＭＮＣに対する各Tサブセット含有率の実数の増減を示す。左グラフと同様の変動を示した。N= 4〜6である。
以上のことから、QQcにより幹細胞集団が富化されるのと同時に、抗炎症性環境が提供されると考えられる。
以上のことから、QQcにより幹細胞集団が富化されるのと同時に、抗炎症性環境が提供されると考えられる。
実施例３：健常人と糖尿病患者におけるQQCの比較
糖尿病（DM）患者と健常人ボランティアから末梢血５０ｃｃを採血し、単核球を採取し、QQcにて一週間培養した。EPC-Colony Forming Assay法（EPC-CFA）、FACS、EPC AssayにてQQc前後の細胞における血管再生能力などを検討した。
糖尿病（DM）患者と健常人ボランティアから末梢血５０ｃｃを採血し、単核球を採取し、QQcにて一週間培養した。EPC-Colony Forming Assay法（EPC-CFA）、FACS、EPC AssayにてQQc前後の細胞における血管再生能力などを検討した。
結果：DM患者におけるEPC-CFAの結果は、QQc前では健常人に比べコロニー数が有意に低下していたものの、QQc後においては、健常人と同等のコロニー数を認めた（図９右側）。従ってDM患者におけるEPC血管再生能力は、QQcを行うことによって健常人同様に回復させることができると考えられる。
FACS（CD34抗体）によれば、QQc前後で全体の細胞数は共に減少するものの（図７左側）、DM患者においても健常人と同様にCD34陽性細胞の増幅を認めた（図７右側）。
また、FACS解析においてCD206陽性の抗炎症細胞であるM2マクロファージがDM患者と健常人においてQQc後に細胞数が優位に上昇し、CCR陽性細胞の炎症性細胞であるM1マクロファージ数が優位に低下する（図８）。
なお、糖尿病患者において実施例２と同様に散布図をとり３集団にゲートし、各表面マーカーの陽性率を計算して生細胞数あたりの比率や生細胞全体における含有率をカウントしたが、糖尿病患者でも健常人と同様の傾向を示した。
FACS（CD34抗体）によれば、QQc前後で全体の細胞数は共に減少するものの（図７左側）、DM患者においても健常人と同様にCD34陽性細胞の増幅を認めた（図７右側）。
また、FACS解析においてCD206陽性の抗炎症細胞であるM2マクロファージがDM患者と健常人においてQQc後に細胞数が優位に上昇し、CCR陽性細胞の炎症性細胞であるM1マクロファージ数が優位に低下する（図８）。
なお、糖尿病患者において実施例２と同様に散布図をとり３集団にゲートし、各表面マーカーの陽性率を計算して生細胞数あたりの比率や生細胞全体における含有率をカウントしたが、糖尿病患者でも健常人と同様の傾向を示した。
実施例４：細胞群のリアルタイムRT-PCR解析
リアルタイムRT-PCR法による細胞群の解析も行った。解析は以下の通りに行った。
トータルmRNAをTrizol (Invitrogen)により単離し、ゲノムDNAをDNase I処理により消化した。DNase I処理したmRNAをフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製した。500 ngの精製したmRNAをSuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)を用いたcDNA合成のために用いた。in vivoコロニーの解析のために、TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems)、および45nMのフォワードおよびリバースプライマーミクスチャーを用いてcDNAを増幅した。PCRで用いた増幅条件は以下の通りである：95℃で10分の後、95℃で10秒、60℃で4分を20サイクル。増幅したcDNAを10倍に希釈し、希釈したcDNAを、EagleTaq Master Mix (Roche)、cDNA増幅用のフォワードおよびリバースプライマー(0.3mM)、およびTaqManプローブ(Sigma Aldrich; 0.25mM)を用いたTaqMan RT-PCRのために使用した。全てのプライマーおよびTaqManプローブは市販のものを用いた。in vitroコロニーの解析のために、増幅工程なしで10倍に希釈されたcDNAをTaqMan RT-PCRのために使用した。遺伝子の発現レベルは全て、GAPDHに対して正規化した。
リアルタイムRT-PCR法による細胞群の解析も行った。解析は以下の通りに行った。
トータルmRNAをTrizol (Invitrogen)により単離し、ゲノムDNAをDNase I処理により消化した。DNase I処理したmRNAをフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製した。500 ngの精製したmRNAをSuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)を用いたcDNA合成のために用いた。in vivoコロニーの解析のために、TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems)、および45nMのフォワードおよびリバースプライマーミクスチャーを用いてcDNAを増幅した。PCRで用いた増幅条件は以下の通りである：95℃で10分の後、95℃で10秒、60℃で4分を20サイクル。増幅したcDNAを10倍に希釈し、希釈したcDNAを、EagleTaq Master Mix (Roche)、cDNA増幅用のフォワードおよびリバースプライマー(0.3mM)、およびTaqManプローブ(Sigma Aldrich; 0.25mM)を用いたTaqMan RT-PCRのために使用した。全てのプライマーおよびTaqManプローブは市販のものを用いた。in vitroコロニーの解析のために、増幅工程なしで10倍に希釈されたcDNAをTaqMan RT-PCRのために使用した。遺伝子の発現レベルは全て、GAPDHに対して正規化した。
解析の結果、PBMNCと比較してQQCにおいて、血管新生・血管形成、血管成熟、および抗炎症に関わる因子の発現が増強していた(図１０a, １０b)。血管新生・血管形成の成長因子またはサイトカインに関して、VEGF-Aの発現には減少傾向が見られたが、それを補うようにIGF-1および血管新生サイトカインであるレプチン、IL-8、IL-10の遺伝子発現が大幅に増強されていた(IGF-1について21.2倍、レプチンについて35.9倍、IL-8について6.3倍、IL-10について5.4倍)。血管成熟因子であるVEGF-BおよびAng-1の発現も増強されていた(VEGF-Bについて4.2倍、Ang-1について2.4倍)。一方、炎症性サイトカインについて、TNF-αの発現には変化は見られなかったが、IL-1βおよびTGF-βの発現は抑制されていた(IL-1βについて0.23倍、TGF-βについて0.44倍; 図１０c)。QQCにおける炎症性サイトカインの発現低下および抗炎症性サイトカインIL-10の発現上昇は、一部の損傷組織において抗炎症性環境をもたらすと考えられる。更に、血管新生や組織リモデリングにおいて重要な役割を果たすことが知られるマトリクス・メタロプロテアーゼMMP-2およびMMP-9の発現は、PBMNCに対してQQCで著しく上昇していた(MMP-2について22.1倍、MMP-9について189.4倍; 図１０d)。
また、糖尿病患者における各遺伝子の発現を上記と同様に解析した場合、VEGFの発現は健常人と比べて優位に増加し、またIL-10の発現も有意に増加していた。その他の遺伝子についても、血管新生サイトカインであるレプチンの遺伝子発現が大幅に増強されており、また血管成熟因子であるAng-1の発現も増強されていた。
実施例５：細胞群の血管形成能の評価
次に、本発明の方法で得られた、EPCを含む細胞群(QQC)の血管形成能を評価するために、in vitroでのマトリゲルアッセイを行った。アッセイは以下の通りに行った。
Masuda H. et al., Circulation research, 109: 20-37 (2011)に記載のように、37℃のCO2インキュベータ中で30分間、acLDL-DiI (20μg/ml; 500μl中に2-4x104)を添加したEBM-2/ 2% FBS (500μl)を含有する1.5mlチューブ中で細胞を培養した。4℃において400gで10分間遠心分離し、上清を吸引後、細胞ペレットを1ml PBSで洗浄し、EBM-2/ 2% FBS (50μl中に1.0x103細胞)で懸濁した。標識された各細胞をHUVECと共に再懸濁した(100μlのEBM-2/ 2% FBS中、EPC:HUVEC = 1x103:1.5x104細胞)。混合細胞の懸濁液を水浴中37℃で培養し、それを96ウェルプレートのウェル中に予め培養されたマトリゲル(BD Falcon, #354234; 50μl/ウェル)に対して各100μlの量で添加した。12時間の培養後、HUVECにより形成された閉じた領域の数を、位相差光学顕微鏡(x2 HPF)(Eclipse TE300, Nikon)により撮られた写真中でPhotoshopソフトウェアを用いてカウントした。更に、チューブ中に取り込まれた標識されたPBMNCまたはQQC数についても、蛍光顕微鏡(IX70, Olympus)により撮られた写真中でPhotoshopソフトウェアを用いてカウントした。チューブ数および細胞数のカウントは、盲検で2人により行った。
次に、本発明の方法で得られた、EPCを含む細胞群(QQC)の血管形成能を評価するために、in vitroでのマトリゲルアッセイを行った。アッセイは以下の通りに行った。
Masuda H. et al., Circulation research, 109: 20-37 (2011)に記載のように、37℃のCO2インキュベータ中で30分間、acLDL-DiI (20μg/ml; 500μl中に2-4x104)を添加したEBM-2/ 2% FBS (500μl)を含有する1.5mlチューブ中で細胞を培養した。4℃において400gで10分間遠心分離し、上清を吸引後、細胞ペレットを1ml PBSで洗浄し、EBM-2/ 2% FBS (50μl中に1.0x103細胞)で懸濁した。標識された各細胞をHUVECと共に再懸濁した(100μlのEBM-2/ 2% FBS中、EPC:HUVEC = 1x103:1.5x104細胞)。混合細胞の懸濁液を水浴中37℃で培養し、それを96ウェルプレートのウェル中に予め培養されたマトリゲル(BD Falcon, #354234; 50μl/ウェル)に対して各100μlの量で添加した。12時間の培養後、HUVECにより形成された閉じた領域の数を、位相差光学顕微鏡(x2 HPF)(Eclipse TE300, Nikon)により撮られた写真中でPhotoshopソフトウェアを用いてカウントした。更に、チューブ中に取り込まれた標識されたPBMNCまたはQQC数についても、蛍光顕微鏡(IX70, Olympus)により撮られた写真中でPhotoshopソフトウェアを用いてカウントした。チューブ数および細胞数のカウントは、盲検で2人により行った。
その結果、HUVECと共培養されたQQCは、HUVEC + PBMNCまたはHUVECのみの場合と比較して、細胞播種から12時間後に有意にチューブの形成を促進した(x2 HPFあたりのチューブ数 = 63.3±1.43 (HUVEC + QQC), 55.1±1.45 (HUVEC + PBMNC), または55.3±1.39 (HUVECのみ)(図１１)。
また、QQCは、PBMNCと比較して、チューブ内への取り込み能が顕著に高いことも分かった(x4 HPFあたりの、チューブ中に取り込まれたacLDL-DiI染色細胞数 = 38.5±8.30 (QQC), 8.72±1.89 (PBMNC))(図１２)。
以上のことから、本発明の方法で得られた細胞群は、PBMNCと比較して、血管形成能や血管内取り込みの増大を示すことが実証された。
また、QQCは、PBMNCと比較して、チューブ内への取り込み能が顕著に高いことも分かった(x4 HPFあたりの、チューブ中に取り込まれたacLDL-DiI染色細胞数 = 38.5±8.30 (QQC), 8.72±1.89 (PBMNC))(図１２)。
以上のことから、本発明の方法で得られた細胞群は、PBMNCと比較して、血管形成能や血管内取り込みの増大を示すことが実証された。
実施例６：虚血症モデルマウスへのヒトQQMNC細胞移植実験
本発明の方法で得られる細胞の細胞移植療法における有用性を評価するために、虚血症モデルマウスへの細胞移植実験を行った。全ての動物実験は、国および研究機関のガイドラインに沿って行った。また、実験プロトコルは、米国National Research CouncilのGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsに基づく東海大学医学部伊勢原キャンパスの動物実験委員会のガイドラインによる承認を得た。実験動物の痛みや不快感を軽減すべく、麻酔についても最大限の注意を払った。
実験では、既報(Sasaki K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 14537-14541 (2006))の通り、8-10週齢のBALB/cAJcl-nu/nuマウス(Charles River, 日本)を用いた。浅枝および深枝を含む左大腿動脈の近位部を縫合し、伏在動脈の近位部および遠位部をバイポーラの電気凝固鉗子(MERA, #N3-14)で閉塞した。その部分の皮膚を外科用ステープルで閉じた。このようにして虚血症後肢モデルマウスを作製した。
翌日、細胞をIMDM中に懸濁し、虚血症後肢の4つの部位、即ち大腿部または下肢についてそれぞれ2箇所に懸濁液を筋肉内注射した(2.5x103細胞/10μl/部位; 計1x104細胞/マウス)。特に、移植細胞のin vivoでの内皮系への分化の評価の目的では、より多量の細胞を注射した(5.0x104細胞/10μl/部位; 計2x105細胞/マウス)。
本発明の方法で得られる細胞の細胞移植療法における有用性を評価するために、虚血症モデルマウスへの細胞移植実験を行った。全ての動物実験は、国および研究機関のガイドラインに沿って行った。また、実験プロトコルは、米国National Research CouncilのGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsに基づく東海大学医学部伊勢原キャンパスの動物実験委員会のガイドラインによる承認を得た。実験動物の痛みや不快感を軽減すべく、麻酔についても最大限の注意を払った。
実験では、既報(Sasaki K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 14537-14541 (2006))の通り、8-10週齢のBALB/cAJcl-nu/nuマウス(Charles River, 日本)を用いた。浅枝および深枝を含む左大腿動脈の近位部を縫合し、伏在動脈の近位部および遠位部をバイポーラの電気凝固鉗子(MERA, #N3-14)で閉塞した。その部分の皮膚を外科用ステープルで閉じた。このようにして虚血症後肢モデルマウスを作製した。
翌日、細胞をIMDM中に懸濁し、虚血症後肢の4つの部位、即ち大腿部または下肢についてそれぞれ2箇所に懸濁液を筋肉内注射した(2.5x103細胞/10μl/部位; 計1x104細胞/マウス)。特に、移植細胞のin vivoでの内皮系への分化の評価の目的では、より多量の細胞を注射した(5.0x104細胞/10μl/部位; 計2x105細胞/マウス)。
Laser Doppler Perfusion Imaging (Moor Instruments)を用いて、術後3週間の連続血流測定を記録し、それをMoor ldi Mainソフトウェア(Moor Instruments)を用いて解析した。
その結果、虚血手術の21日後において、QQC移植動物では、コントロール(IMDM注射)またはPBMNC注射の動物と比較して、虚血症後肢における顕著な血流の回復が見られた(図１３)。反対の肢に対する虚血症の肢における血流の割合は、QQC移植群においてコントロール群またはPBMNC移植群と比べて1.85倍または1.80倍であった。また、虚血症により損傷した後肢の分類の分布において、QQC移植群では最も低い下肢壊死頻度であった一方(QQC移植群、コントロール、PBMNC移植群についてそれぞれ4.3%、15.8%、9.5%)、全残存頻度は最も高かった(QQC移植群、コントロール、PBMNC移植群についてそれぞれ21.7%、10.5%、9.5%)(図１４)。
以上のことから、本発明の方法で得られた細胞群を移植することにより、PBMNC移植または細胞移植なしの場合と比較して、虚血症動物に対して血流量の回復をもたらし、更に組織を壊死から守ることができることが実証された。従って、本発明の細胞群は虚血症治療に有効である。
その結果、虚血手術の21日後において、QQC移植動物では、コントロール(IMDM注射)またはPBMNC注射の動物と比較して、虚血症後肢における顕著な血流の回復が見られた(図１３)。反対の肢に対する虚血症の肢における血流の割合は、QQC移植群においてコントロール群またはPBMNC移植群と比べて1.85倍または1.80倍であった。また、虚血症により損傷した後肢の分類の分布において、QQC移植群では最も低い下肢壊死頻度であった一方(QQC移植群、コントロール、PBMNC移植群についてそれぞれ4.3%、15.8%、9.5%)、全残存頻度は最も高かった(QQC移植群、コントロール、PBMNC移植群についてそれぞれ21.7%、10.5%、9.5%)(図１４)。
以上のことから、本発明の方法で得られた細胞群を移植することにより、PBMNC移植または細胞移植なしの場合と比較して、虚血症動物に対して血流量の回復をもたらし、更に組織を壊死から守ることができることが実証された。従って、本発明の細胞群は虚血症治療に有効である。
実施例７：虚血症モデルマウスへのマウスQQMNC細胞移植実験
（１）EPCコロニーアッセイによるマウスQQMNCの血管再生能の評価
10-12週齢のC57BL6/N（雄）マウスにおいて、ペントバルビタール麻酔下にツベルクリン針を用いて心腔内ヘパリン採血を実施し、Histopaque-1083を用いた密度勾配法によりマウス単核球(MNC)を採取し、マウスPBMNCとして実験に用いた。実施例１におけるヒトQQCと同様の手法でQQ培養を行い、培養前後の細胞をEPC-CFAにてEPCコロニー産生能を評価した。QQ培養液= StemLine II, マウス遺伝子組み換えTPO、SCF、Flt-3 ligand、IL-6、VEGFを用いた。また、EPC-CFAについては、Stem Cell Tec社製MethoCultTM SF M3236を用い、10%FBSを添加し、ヒトEPC-CFA と同様のマウス遺伝子組み換え成長因子、サイトカインをヒトと同様の濃度で調整した。PBMNC及びQQC細胞(QQ培養3日、5日後)を各1x105個ずつ35mm Primaria dishに播種した。コロニーの算定は、細胞播種後8日目に行った。未分化型、分化型EPCコロニー(pEPC-CFU、dEPC-CFU)はいずれもQQ培養日数に従って漸増した（図１５）。
（１）EPCコロニーアッセイによるマウスQQMNCの血管再生能の評価
10-12週齢のC57BL6/N（雄）マウスにおいて、ペントバルビタール麻酔下にツベルクリン針を用いて心腔内ヘパリン採血を実施し、Histopaque-1083を用いた密度勾配法によりマウス単核球(MNC)を採取し、マウスPBMNCとして実験に用いた。実施例１におけるヒトQQCと同様の手法でQQ培養を行い、培養前後の細胞をEPC-CFAにてEPCコロニー産生能を評価した。QQ培養液= StemLine II, マウス遺伝子組み換えTPO、SCF、Flt-3 ligand、IL-6、VEGFを用いた。また、EPC-CFAについては、Stem Cell Tec社製MethoCultTM SF M3236を用い、10%FBSを添加し、ヒトEPC-CFA と同様のマウス遺伝子組み換え成長因子、サイトカインをヒトと同様の濃度で調整した。PBMNC及びQQC細胞(QQ培養3日、5日後)を各1x105個ずつ35mm Primaria dishに播種した。コロニーの算定は、細胞播種後8日目に行った。未分化型、分化型EPCコロニー(pEPC-CFU、dEPC-CFU)はいずれもQQ培養日数に従って漸増した（図１５）。
（２）day5 QQ-MNC の下肢虚血マウスへの移植による血流改善効果の評価
QQ培養day5の細胞をC57BL6/N（雄）マウス虚血モデル作成翌日に移植した。移植細胞数は、PB-MNC=1 x105/40 microL, QQ-MNC Low=1 x104/40 microL , QQ-MNC High=1 x105/40 microLとした。対照群は、細胞懸濁液のIMDMの培養液とした。20 microLずつを前脛骨筋及び腓腹筋に移植した。虚血作成後、14日後に、ヒトQQMNC実験例5と同様にLazer Doppler Perfusion Imagingによる血流測定を行った。対照群（IMDM）、PB-MNC移植(1x105/匹)群に比較して、QQC細胞移植群(Low= 1x104/匹、High=1x105/匹)は、各群N数が３のため、有意差が認められないものの血流改善傾向が観察された（図１６）。
QQ培養day5の細胞をC57BL6/N（雄）マウス虚血モデル作成翌日に移植した。移植細胞数は、PB-MNC=1 x105/40 microL, QQ-MNC Low=1 x104/40 microL , QQ-MNC High=1 x105/40 microLとした。対照群は、細胞懸濁液のIMDMの培養液とした。20 microLずつを前脛骨筋及び腓腹筋に移植した。虚血作成後、14日後に、ヒトQQMNC実験例5と同様にLazer Doppler Perfusion Imagingによる血流測定を行った。対照群（IMDM）、PB-MNC移植(1x105/匹)群に比較して、QQC細胞移植群(Low= 1x104/匹、High=1x105/匹)は、各群N数が３のため、有意差が認められないものの血流改善傾向が観察された（図１６）。
（３）微小血管密度及び壁細胞裏打ち効果の評価
虚血作成14日の血流測定後、isoectinB4-FITC (Vector Lab) 40 microLを尾静脈より注入し、in vivoにて微小血管を染色した後、十分量のPentobarbitalを腹腔内に投与し、麻酔下に左心室よりPBS及び4%パラホルムアルデヒド20 mLずつ注入し還流固定を行った。OCTコンパウンドに包埋後、液体窒素にて冷却したアセトンに浸潤し凍結標本を作製した。凍結標本から切片を作成し、smooth muscle alpha actin-Cy3(Sigma-Aldrich)の蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にてヒトと同様に、微小血管及び壁細胞を観察し定量評価した。QQ-MNC low, highともにPB-MNC、非細胞移植群(IMDM) に比較して微小血管密度の上昇（図１７左）及び壁細胞による裏打ち血管数の増加(細動脈化促進)（図１７右）が認められ、血管再生能がQQ培養により増強することが確認された。
虚血作成14日の血流測定後、isoectinB4-FITC (Vector Lab) 40 microLを尾静脈より注入し、in vivoにて微小血管を染色した後、十分量のPentobarbitalを腹腔内に投与し、麻酔下に左心室よりPBS及び4%パラホルムアルデヒド20 mLずつ注入し還流固定を行った。OCTコンパウンドに包埋後、液体窒素にて冷却したアセトンに浸潤し凍結標本を作製した。凍結標本から切片を作成し、smooth muscle alpha actin-Cy3(Sigma-Aldrich)の蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にてヒトと同様に、微小血管及び壁細胞を観察し定量評価した。QQ-MNC low, highともにPB-MNC、非細胞移植群(IMDM) に比較して微小血管密度の上昇（図１７左）及び壁細胞による裏打ち血管数の増加(細動脈化促進)（図１７右）が認められ、血管再生能がQQ培養により増強することが確認された。
実施例８：組織化学的評価
実施例６において移植実験に供されたマウスから組織切片を作製し、組織化学的評価を行った。そのプロトコルは下記の通りである。
(1) 評価用試料の作製
手術から3週間後、50μlのイソレクチンB4-FITCをインスリンシリンジを用いて尾静脈に注射した。注射の20分後に十分な麻酔下でマウスを安楽死させ、その直後に心臓穿刺により、20mlのPBSをかん流した後、4%パラホルムアルデヒドを含む等量のPBSに切り替えて固定を行った。その後、虚血症後肢を切除し、段階的な濃度のショ糖/PBS中に入れた。次いで、前脛骨筋を切除し、パラフィン中に包埋し、その後の評価に用いた。
(2) 微小血管密度(MVD)および周皮細胞のリクルートメントの評価
6-8μmの組織切片試料を筋肉の組織ブロックからスライスし、微小血管密度(MVD)および周皮細胞のリクルートメントの評価に用いた。
平滑筋αアクチン(SMαアクチン)の染色のために、組織切片を脱パラフィン化し、PBSで洗浄し、室温下10%ヤギ血清で30分間ブロッキングした後、希釈したCy3抱合SMαアクチン抗体(#C6198, Sigma-Aldrich)と共に室温下で2時間培養した。PBSでの洗浄後、切片をVECTASHIELD HardSet Mounting Medium (Vector Lab, #H-1400)を用いてマウントし、蛍光顕微鏡(Biorevo, #BZ-9000, Keyence)下で観察した。一次抗体を省いた同じプロトコルをネガティブコントロールとして行った。
ソフトウェア(VH analyzer, Keyence)を用い、撮像された各群のマウスあたり2-4の横断面中、イソレクチンB4-FITCでin vivo染色された毛細血管をカウントすることによりMVDを評価した。同時に、脈管構造中への周皮細胞のリクルートメントをSMαアクチン陽性細胞の領域をカウントすることにより評価した。
(3) 筋形成および間質線維の評価
H-E染色により中央に核が見られる筋線維を顕微鏡写真機(AX80, Olympus)で撮像し、VHanalyzerにより筋芽細胞(Pesce M et al., Circ. Res., 93: e51-62 (2003))をカウントした。肢部の間質線維をAzan染色を用いて形態学的に評価し、撮像した写真をVH analyzerにより解析した(Napoli C et al., Proc Natl Acad Sci USA, 102: 17202-17206 (2005); Sica V et al., Cell Cycle, 5: 2903-2908 (2006))。評価した組織切片の数は上記(3)と同じであった。また、定量的評価を盲検で2人により行った。
(4) 移植細胞の内皮系への分化の免疫組織化学的評価
脱パラフィン化後、蒸留水で希釈(1:10)したtarget retrieval solution (Dako, #S-1699)中(98℃)で10分間、組織切片をマイクロ線照射した。次いでStreptavidin/Biotin Blocking Kit (Vector Lab, #SP-2002)で処理して内因性ビオチンをブロッキングした後、切片を室温下で30分間、5% 正常ヤギ血清/PBSと培養し、次いで、ビオチン化ヤギ抗マウスIgGと予め反応させたマウス抗ヒトCD31抗体、およびマウス血清(Rockland, #D208)と4℃で一晩培養した。最後に、ストレプトアビジン-Alexa Fluor 594コンジュゲートと室温で1時間培養した後、切片をPBSで洗浄し、DABCO (Sigma Aldrich, #D2522-25G)/グリセロール/PBS中のTOTO-3 (Invitrogen, #T3604)を用いてマウントし、レーザー走査型顕微鏡(Carl Zeiss, LSM510META)により観察した。
実施例６において移植実験に供されたマウスから組織切片を作製し、組織化学的評価を行った。そのプロトコルは下記の通りである。
(1) 評価用試料の作製
手術から3週間後、50μlのイソレクチンB4-FITCをインスリンシリンジを用いて尾静脈に注射した。注射の20分後に十分な麻酔下でマウスを安楽死させ、その直後に心臓穿刺により、20mlのPBSをかん流した後、4%パラホルムアルデヒドを含む等量のPBSに切り替えて固定を行った。その後、虚血症後肢を切除し、段階的な濃度のショ糖/PBS中に入れた。次いで、前脛骨筋を切除し、パラフィン中に包埋し、その後の評価に用いた。
(2) 微小血管密度(MVD)および周皮細胞のリクルートメントの評価
6-8μmの組織切片試料を筋肉の組織ブロックからスライスし、微小血管密度(MVD)および周皮細胞のリクルートメントの評価に用いた。
平滑筋αアクチン(SMαアクチン)の染色のために、組織切片を脱パラフィン化し、PBSで洗浄し、室温下10%ヤギ血清で30分間ブロッキングした後、希釈したCy3抱合SMαアクチン抗体(#C6198, Sigma-Aldrich)と共に室温下で2時間培養した。PBSでの洗浄後、切片をVECTASHIELD HardSet Mounting Medium (Vector Lab, #H-1400)を用いてマウントし、蛍光顕微鏡(Biorevo, #BZ-9000, Keyence)下で観察した。一次抗体を省いた同じプロトコルをネガティブコントロールとして行った。
ソフトウェア(VH analyzer, Keyence)を用い、撮像された各群のマウスあたり2-4の横断面中、イソレクチンB4-FITCでin vivo染色された毛細血管をカウントすることによりMVDを評価した。同時に、脈管構造中への周皮細胞のリクルートメントをSMαアクチン陽性細胞の領域をカウントすることにより評価した。
(3) 筋形成および間質線維の評価
H-E染色により中央に核が見られる筋線維を顕微鏡写真機(AX80, Olympus)で撮像し、VHanalyzerにより筋芽細胞(Pesce M et al., Circ. Res., 93: e51-62 (2003))をカウントした。肢部の間質線維をAzan染色を用いて形態学的に評価し、撮像した写真をVH analyzerにより解析した(Napoli C et al., Proc Natl Acad Sci USA, 102: 17202-17206 (2005); Sica V et al., Cell Cycle, 5: 2903-2908 (2006))。評価した組織切片の数は上記(3)と同じであった。また、定量的評価を盲検で2人により行った。
(4) 移植細胞の内皮系への分化の免疫組織化学的評価
脱パラフィン化後、蒸留水で希釈(1:10)したtarget retrieval solution (Dako, #S-1699)中(98℃)で10分間、組織切片をマイクロ線照射した。次いでStreptavidin/Biotin Blocking Kit (Vector Lab, #SP-2002)で処理して内因性ビオチンをブロッキングした後、切片を室温下で30分間、5% 正常ヤギ血清/PBSと培養し、次いで、ビオチン化ヤギ抗マウスIgGと予め反応させたマウス抗ヒトCD31抗体、およびマウス血清(Rockland, #D208)と4℃で一晩培養した。最後に、ストレプトアビジン-Alexa Fluor 594コンジュゲートと室温で1時間培養した後、切片をPBSで洗浄し、DABCO (Sigma Aldrich, #D2522-25G)/グリセロール/PBS中のTOTO-3 (Invitrogen, #T3604)を用いてマウントし、レーザー走査型顕微鏡(Carl Zeiss, LSM510META)により観察した。
（結果）
微小血管密度(MVD)の組織化学的評価では、QQC移植群からの切片において、PBMNC移植群およびコントロール由来の切片と比較して、顕著に高いMVDが観察された(MVD/mm2はQQC移植群400.7±37.9、コントロール群98.7±15.8、PBMNC移植群118.9±20.1; 従って、コントロール群に対して4.1倍、PBMNC移植群に対して3.4倍)(図１８)。また、SMαアクチン陽性細胞で評価した周皮細胞のリクルートメントについても、QQC移植群ではコントロール群に対して2.6倍、PBMNC移植群に対して2.0倍であった(SMαアクチン陽性細胞数/mm2は、QQC移植群38.7±5.5、コントロール群15.0±2.7、PBMNC移植群19.8±4.3)(図１９)。更に、筋線維の頻度においても、QQC移植群ではコントロール群に対して1.95倍、PBMNC移植群に対して1.83倍であった(筋線維/mm2は、QQC移植群112.2±16.4、コントロール群57.6±7.0、PBMNC移植群61.3±6.8)(図２０)。
以上のことから、本発明の細胞群は、PBMNCやコントロールと比較して、顕著に高い血管新生能、動脈形成能、筋形成能を有することが実証された。
微小血管密度(MVD)の組織化学的評価では、QQC移植群からの切片において、PBMNC移植群およびコントロール由来の切片と比較して、顕著に高いMVDが観察された(MVD/mm2はQQC移植群400.7±37.9、コントロール群98.7±15.8、PBMNC移植群118.9±20.1; 従って、コントロール群に対して4.1倍、PBMNC移植群に対して3.4倍)(図１８)。また、SMαアクチン陽性細胞で評価した周皮細胞のリクルートメントについても、QQC移植群ではコントロール群に対して2.6倍、PBMNC移植群に対して2.0倍であった(SMαアクチン陽性細胞数/mm2は、QQC移植群38.7±5.5、コントロール群15.0±2.7、PBMNC移植群19.8±4.3)(図１９)。更に、筋線維の頻度においても、QQC移植群ではコントロール群に対して1.95倍、PBMNC移植群に対して1.83倍であった(筋線維/mm2は、QQC移植群112.2±16.4、コントロール群57.6±7.0、PBMNC移植群61.3±6.8)(図２０)。
以上のことから、本発明の細胞群は、PBMNCやコントロールと比較して、顕著に高い血管新生能、動脈形成能、筋形成能を有することが実証された。
更に、Azan染色を用いた間質線維の評価によれば、QQC移植群では、コントロール群に対して0.23倍、PBMNC移植群に対して0.33倍と線維性領域は有意に小さかった(線維性領域/mm2は、QQC移植群5.9±1.28、コントロール群25.2±7.57、PBMNC移植群17.7±3.18)(図２１)。
これは、QQCの移植は、PBMNCの移植やコントロールと比較して、線維化が有意に抑制されていることを示している。
これは、QQCの移植は、PBMNCの移植やコントロールと比較して、線維化が有意に抑制されていることを示している。
（５）抗炎症効果のiNOS発現による評価：
実施例７において移植実験に供されたマウスから組織切片を作製し、虚血作成14日の虚血筋肉組織をiNOS抗体(Abcam)で染色（茶色の被染色部分）した。iNOSは炎症細胞により発現が増強されており、コントロール虚血組織である非細胞移植群およびPB-MNC移植群でiNOS染色細胞が広範に確認されるが、QQ-MNC移植群では炎症細胞が有意に限局されていることが確認できた。非細胞移植群(IMDM)=10.6±1.6%、PB-MNC移植群=11.6±1.6%、QQCLow移植群6.8±0.6% , QQCHigh移植群4.6±0.8% 。＊、＊＊、＊＊＊は図に示された対象に対する有意差（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示す。（図２２）
実施例７において移植実験に供されたマウスから組織切片を作製し、虚血作成14日の虚血筋肉組織をiNOS抗体(Abcam)で染色（茶色の被染色部分）した。iNOSは炎症細胞により発現が増強されており、コントロール虚血組織である非細胞移植群およびPB-MNC移植群でiNOS染色細胞が広範に確認されるが、QQ-MNC移植群では炎症細胞が有意に限局されていることが確認できた。非細胞移植群(IMDM)=10.6±1.6%、PB-MNC移植群=11.6±1.6%、QQCLow移植群6.8±0.6% , QQCHigh移植群4.6±0.8% 。＊、＊＊、＊＊＊は図に示された対象に対する有意差（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示す。（図２２）
実施例９：潰瘍モデルへの効果
（方法）
糖尿病患者（５例）、健常人ボランティア（４例）から50mlの末梢血を採取し、Histopaque-1077を用いた密度勾配法によりヒト単核球(MNC)を採取しヒトMNCとして実験に用いた。全てのデータはN=3(人)にて取得した。Balb/cヌードマウスの背部に6mmパンチを用いて皮膚全層欠損潰瘍を作成し、シリコンステントを潰瘍周囲に６−０ナイロンを用いて縫合し、創収縮を抑制した潰瘍モデルを作成した。
実施例１と同様の方法でヒトMNCQQ培養を行い、培養前後の細胞を本潰瘍モデルに移植した。QQ培養液としては、実施例１と同様に StemLine II,ヒト遺伝子組み換えTPO、SCF、Flt-3 ligand、IL-6、VEGFを用いた。PBMNC及びQQC細胞1x10４個をPBS25ulに混濁して潰瘍底部に移植した。潰瘍作成後、Day0,3,7,10,14にてCanon Cyber shotにて撮影した写真にて潰瘍縮小率を計測し創治癒を比較した。Day14の潰瘍を採取しAnti-CD31染色にて組織内血管密度を解析した。
（結果）
糖尿病患者（DM）QQc後細胞移植群（A群）は、DMQQc前MNC細胞移植群（B群）及びPBS投与対照群（C群）に比較して有意に潰瘍の縮小を認めた（％縮小率; A群66.92±2.52vs B群84.16±3.29、C群65.61±4.19; p＜0.01）。組織学的評価ではCD31染色にてDMQQc後細胞移植群は他の群に比べ高い組織内血管形成を認めた。（CD３１陽性血管数; A群145±28 vs B群321±58、C群140±34; p＜0.05 ）
（方法）
糖尿病患者（５例）、健常人ボランティア（４例）から50mlの末梢血を採取し、Histopaque-1077を用いた密度勾配法によりヒト単核球(MNC)を採取しヒトMNCとして実験に用いた。全てのデータはN=3(人)にて取得した。Balb/cヌードマウスの背部に6mmパンチを用いて皮膚全層欠損潰瘍を作成し、シリコンステントを潰瘍周囲に６−０ナイロンを用いて縫合し、創収縮を抑制した潰瘍モデルを作成した。
実施例１と同様の方法でヒトMNCQQ培養を行い、培養前後の細胞を本潰瘍モデルに移植した。QQ培養液としては、実施例１と同様に StemLine II,ヒト遺伝子組み換えTPO、SCF、Flt-3 ligand、IL-6、VEGFを用いた。PBMNC及びQQC細胞1x10４個をPBS25ulに混濁して潰瘍底部に移植した。潰瘍作成後、Day0,3,7,10,14にてCanon Cyber shotにて撮影した写真にて潰瘍縮小率を計測し創治癒を比較した。Day14の潰瘍を採取しAnti-CD31染色にて組織内血管密度を解析した。
（結果）
糖尿病患者（DM）QQc後細胞移植群（A群）は、DMQQc前MNC細胞移植群（B群）及びPBS投与対照群（C群）に比較して有意に潰瘍の縮小を認めた（％縮小率; A群66.92±2.52vs B群84.16±3.29、C群65.61±4.19; p＜0.01）。組織学的評価ではCD31染色にてDMQQc後細胞移植群は他の群に比べ高い組織内血管形成を認めた。（CD３１陽性血管数; A群145±28 vs B群321±58、C群140±34; p＜0.05 ）
本発明の方法により増幅された細胞を移植することにより虚血性疾患の血流量および壊死改善率の改善がみられた。すなわち、本発明の方法は、内皮系細胞を質・量ともに産生する上で有用と考えられ、虚血性疾患等の血管障害を対象とした細胞移植療法の有用な方法となり得る。
本出願は日本で出願された特願２０１２−２１８２０６（出願日：２０１２年９月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (7)
- 糖尿病に罹患する哺乳動物から採取した生体試料から抽出された単核球分画を、ＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞の選別を行うことなく、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する無血清培地中で培養して得られる細胞群を含んでなる、前記糖尿病に罹患する哺乳動物における四肢虚血又は難治性潰瘍の治療剤。
- 細胞群が、血管内皮前駆細胞および抗炎症性マクロファージが富化した細胞群である、請求項１に記載の治療剤。
- 血管内皮前駆細胞が分化型ＥＰＣコロニー形成細胞である、請求項１または２に記載の治療剤。
- 抗炎症性マクロファージがM2マクロファージである、請求項２または３に記載の治療剤。
- 生体試料が末梢血、骨髄または臍帯血である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療剤。
- 哺乳動物がヒトである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療剤。
- 四肢虚血が、下肢虚血である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療剤。
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