KR101228626B1 - 인간 유래 단핵구 세포의 배양 배지, 배양된 단핵구 세포, 및 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단핵구 세포의 생존률과 신생혈관형성 능력을 향상시키기 위한 세포 배양 배지에 관한 것이며, 또한 본 발명은 상기 배양 배지에서 배양되어 신생혈관형성 능력과 생존 능력이 향상된 단핵구 세포 및 상기 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

인간 유래 단핵구 세포의 배양 배지, 배양된 단핵구 세포, 및 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물{Culture medium for mononuclear cell derived from human, cultured mononuclear cell, and composition for treating ischemic diseases comprising epithelial progenitor cells differentiated from the mononuclear cell}

본 발명은 세포 배양 배지에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 단핵구 세포의 생존률과 신생혈관형성 능력을 향상시키기 위한 세포 배양 배지에 관한 것이며, 또한 본 발명은 상기 배양 배지에서 배양되어 신생혈관형성 능력과 생존 능력이 향상된 단핵구 세포, 및 상기 배지에서의 배양 동안 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

치료 전략에서 많은 진전이 있었음에도 불구하고, 허혈성 심혈관 질환은 서구 사회에서 가장 생명을 위협하는 질환이다. 매년 거의 8천만 명이 심장 마비, 뇌졸중, 및 허혈성 심근증을 앓는다. 현재, 줄기 세포 생물학 분야가 확대됨에 따라, 세포 기반 치료법이 조직 재생을 위한 유망한 전략이 되어 왔다.

한편, 제대혈은 줄기 또는 전구 세포의 유용한 공급원으로서 널리 연구되어 왔다. 제대혈은 환자에서 유래한 골수에 비해 접근성, 비침입성 세포 수집, 많은 조혈 줄기 세포의 존재, 세포 내의 긴 텔로미어 및 낮은 바이러스 오염 빈도와 같은 여러 가지 잇점을 제공한다.

최근에는, 본 발명자들은 제대혈 유래 다능성 줄기 세포(MSC)를 이용한 동종이계 줄기 세포 요법을 통한 허혈성 사지 동물 모델 및 버거씨병의 성공적인 치료를 보고한 바 있다. 또한, 다른 실험 연구는 제대혈 유래 내피 전구 세포의 신생혈관형성 능력을 개시하여, 제대혈 세포가 경색된 심근으로 이동하여 신생혈관형성을 자극하였음을 입증하였다. 하지만, 세포 기반 치료의 기술적 개발은 허혈성 심장에 투여된 다능성 줄기 세포 또는 내피 전구 세포의 열등한 생착률(engraftment)과 이어지는 저조한 치료 효과로 인해 한계에 봉착해 있다. 이들 현상은 허혈성 환경에서 이식된 세포의 증가된 어팝토시스(apoptosis)와 열등한 생존능을 야기한다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 단핵구 세포의 신생혈관형성 능력 및 생존 능력을 향상시킬 수 있는 배양 조건을 찾기 위한 연구를 실시한 결과, 배양 배지에 성장 인자들의 특정 조합을 첨가함으로써 단핵구 세포의 생존, 부착 및 신생혈관형성 능력이 향상되며 이들 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포가 허혈성 사지 질환 동물 모델에서 임상적 예후를 개선함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 단핵구 세포(MNC)의 신생혈관형성 능력과 생존 능력을 향상시키는 세포 배양 배지의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 신생혈관형성 능력과 생존 능력이 향상된 단핵구 세포의 제공을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 배양 배지로 배양하는 동안 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물의 제공을 목적으로 한다.

일 태양에서, 본 발명은 단핵구 세포의 신생혈관형성 능력과 생존 능력을 향상시키는 세포 배양 배지를 제공한다.

본 발명자들은 단핵구 세포의 생존 능력과 신생혈관형성 능력을 향상시킬 수 있는 배양 배지를 찾기 위한 연구 결과, 단핵구 세포의 배양을 위한 기본 배지에 EGF(Epidermal growth factor), TPO(Thrombopoietin), Flt-3L, IGF(Insulin-like growth factor)-1 및 bFGF(basic Fibroblast growth factor)의 5가지 성장 인자를 첨가함으로써 단핵구 세포의 신생혈관형성 능력과 생존 능력이 크게 향상됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 배양 배지는 단핵구 세포를 위한 기본 배양 배지에 더하여 EGF(Epidermal growth factor), TPO(Thrombopoietin), Flt-3L, IGF(Insulin-like growth factor)-1 및 bFGF(basic Fibroblast growth factor)의 5가지 성장 인자를 추가로 포함한다. 본 발명에서 “단핵구 세포를 위한 기본 배양 배지”란 단핵구 세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배양 배지를 말하며, 예를 들어, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지, DMEM, MEM, alpha-MEM, M-199, 이글스 기본 배지, CMRL 배지, RPMI 1640 배지, Ham's F-10/12 배지, Fisher's 배지, McCoy's 5A 배지, Leibovitz's 배지, MCDB 배지 등의 통상적인 세포 배양 배지 등을 들 수 있으며, IMDM 배지가 바람직하다. 상기 EGF, TPO, Flt-3L, IGF 및 bFGF의 5가지 성장 인자는 각각 20-400 ng/ml의 농도로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 20 ng/ml의 농도로 첨가된다. 본 발명의 배양 배지는 또한 기본 배지와 상기 5가지 성장 인자에 더하여, 세포 배양에 필요한 것으로 당업계에 알려진 추가적인 성분을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 글루타민, FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 등을 더 포함할 수 있다. 바람직한 일 예로서, 본 발명의 배양 배지는 2 mM 글루타민, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml TPO, 20 ng/ml Flt-3L, 20 ng/ml IGF-1, 및 20 ng/ml bFGF로 보충된 IMDM 배지로 이루어진다. 상기 IMDM 배지, 및 성장 인자 등은 상업적 공급원으로부터 쉽게 구매하여 이용할 수 있다.

본 발명의 배양 배지로 배양할 수 있는 단핵구 세포는 임의의 단핵구 세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 단핵구 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 인간 골수 유래 단핵구 세포 등일 수 있다.

다른 태양에서, 본 발명은 상기한 본 발명의 배양 배지로 배양되어 생존 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포를 제공한다.

본 발명자들의 연구 결과, 상기한 5가지 성장 인자인 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml TPO, 20 ng/ml Flt-3L, 20 ng/ml IGF-1, 및 20 ng/ml bFGF로 보충된 IMDM 배지를 포함하는 본 발명의 배양 배지로 배양된 단핵구 세포는 상기 성장 인자 중 어느 것도 포함하지 않는 IMDM 배지 또는 EGF, TPO 및 Flt-3L의 3가지 성장 인자가 첨가된 IMDM 배지로 배양된 단핵구 세포에 비하여, 증식, 부착 및 생존 능력이 증가되고, 신생혈관형성 유전자들의 발현이 크게 증가됨이 확인되었으며, 본 발명의 배양된 단핵구 세포는 VEGF-A, 안지오포이에틴-1,2, HGF, IGF-1, FGF-2, PDGF-B, PIGF, IL-8, MMP-9, TGF-b, MCP-1, Akt-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현한다. 상기 단핵구 세포는 임의의 단핵구 세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 단핵구 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 및 인간 골수 유래 단핵구 세포 등이다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 배양 배지로 단핵구 세포를 배양하는 동안 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 배양 배지로 배양하는 동안 단핵구 세포는 생존 능력과 신생혈관형성 능력이 향상되고 내피전구세포로 분화되며, 이것을 허혈성 사지 동물 모델에서 허혈성 하지에 국소 주사한 결과, 손상된 조직이 더 잘 회복되었으며 신생혈관형성 인자들의 발현이 증가됨이 관찰되었다. 또한, 이식된 상기 내피전구세포는 대조군에 비하여 더 높은 생착률과 생존률을 가졌으며, 혈관 내피세포로의 전환분화(transdifferentiation) 능력이 명확히 입증되었다. 따라서, 본 발명의 배양 배지로 배양하는 동안 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포는 허혈성 질환의 치료를 위한 유용한 치료제로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 허혈성 질환 치료용 조성물은 본 발명의 배양 배지로 배양된 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 또는 인간 골수 유래 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 유효 성분으로 포함한다. 본 발명의 치료용 조성물로 치료될 수 있는 허혈성 질환의 예로는 당뇨 족부궤양, 버거씨병, 허혈성 하지 동맥질환, 허혈성 심근경색 등에 의한 혈관 질환을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 1 ml 당 1.0 x 10⁴ 개 내지 1.0 x 10⁸ 개, 바람직하게는 1.0 x 10⁵ 개 내지 1.0 x 10⁷ 개, 더욱 바람직하게는 1.0 x 10⁶ 개의 세포를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 통상적인 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 치료 효과를 나타낼 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 적합한 제형의 예로는 비경구 투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제 등을 들 수 있다. 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있다.

상기 약학 제제에는 유효 성분 외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 추가로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 약학 제제는 통상적인 투여 방법에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구적 투여 방법에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들어, 주사에 의해 투여되거나, 질환 부위에 직접 이식되거나 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.

본 발명의 세포의 1일 투여량은 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁷, 바람직하게는 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁶ 세포/kg체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 배양 배지는 단핵구 세포의 생존 능력과 신생혈관형성 능력을 향상시킬 수 있으며, 이러한 배지로 배양되는 동안 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포는 허혈성 질환을 가진 대상에게 투여될 경우, 향상된 생존 능력과 신생혈관형성 능력으로 허혈의 치료 효과를 나타낼 수 있어, 다양한 허혈성 질환의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a 내지 1j는 본 발명의 배양 배지로 배양된 단핵구 세포의 생존능, 증식, 어팝토시스, 부착 및 내피 분화를 보여준다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 배양 배지로 배양된 단핵구 세포의 특징과 다수의 신생혈관형성/항-어팝토시스 유전자 발현 패턴을 보여준다.
도 3a 내지 3d는 본 발명의 배양 배지로 배양된 단핵구 세포의 이식이 하지 허열 모델에서 허혈로부터의 회복을 촉진하며 조직을 보존함을 보여준다.
도 4a 내지 4c는 본 발명의 배양 배지로 배양된 단핵구 세포의 이식에 의해 인비보에서 신생혈관형성이 유도됨을 보여준다.
도 5a 내지 5f는 허혈성 사지에서 본 발명의 배양 배지로 배양된 단핵구 세포의 높은 생착률과 감소된 EC 어팝토시스를 보여준다.
도 6a 내지 6c는 허혈성 하지에서 이식된 단핵구 세포의 생착률 및 내피세포로의 분화를 보여준다.
도 7은 본 발명에 이용된 프라이머와 프로브의 염기 서열을 보여준다.

이하에서 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.

실시예.

실시예 1. 세포 배양

인간 제대혈 단핵구 세포(MNC)는 론자사(Lonza)(Walkersville, MD, USA)로부터 구입하였다. 각각의 제대혈 샘플을 2% 소 혈청 알부민(BSA, Life Technologies)을 함유한 동일한 부피의 포스페이트-완충 염수(PBS)(Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 희석하였다. 희석된 세포 현탁액을 히스토파크(Histopaque)(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 상에 계층화시키고 30분 동안 800 g에서 원심분리하였다. 계면으로부터 단핵구 세포를 수집하여 자기-활성화 세포 분류(MACS) 버퍼(0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 가진 PBS, pH 7.2)로 세척하였다. 단핵구 세포를 2 mM 글루타민, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신으로 보충된 IMDM 배지에서 플레이트 상에 1 X 10⁶/cm²의 밀도로 도말하였으며, 이것은 성장 인자가 없는 조건(0f)을 나타낸다. 3가지 성장 인자 조건(3f)은 2 mM 글루타민, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 25 ng/ml EGF, 20 ng/ml TPO 및 20 ng/ml Flt-3L로 보충된 IMDM 배지에서 세포가 성장한 변경된 조혈 배양물이다. 4가지 성장 인자 조건(4f)에서는, 세포가 2 mM 글루타민, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml TPO, 20 ng/ml Flt-3L 및 20 ng/ml IFG-1로 보충된 IMDM 배지에서 세포를 배양하였다. 5가지 성장 인자 조건(5f)에서는, 20 ng/ml bFGF로 보충된 4f 조건 배지에서 세포를 배양하였다. 세포를 5% CO₂에서 37 ℃에서 항온처리하였다. 모든 성장 인자는 R&D System(Minneapolis, MN)으로부터 구입하였다. 배지는 처음에는 24시간 후에 교환하였으며 그 후에는 3-4일마다 교환하였다. 세포는 37 ℃에서 10분 동안 0.05% 트립신-EDTA(Life Technoligies)로 항온처리하여 탈착시켰다. Ang-1 발현을 조사하기 위하여, 단핵구 세포를 2 mM 글루타민, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml bFGF 또는 40 ng/ml IGF-1로 보충된 IMDM 배지에서 각각 배양하였다. 0f 조건 배지는 대조군으로 이용하였다.

실시예 2. 락테이트 하이드로게나아제 ( LDH ), 생존능 및 증식의 측정

배양된 단핵구 세포의 세포 변화를 조사하기 위하여, 단핵구 세포를 무혈청 배지 내에 두고 60분 동안 H₂O₂(100 μM)로 처리하였다. H₂O₂는 무산소증 또는 허혈에 의해 야기된 것과 유사한 세포 반응을 유도하기 위한 산화제로 사용되었다. 세포 상층액 내의 LDH의 수준을 LDH 분석 키트(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)를 이용하여 340 nm에서 결정하였다. 그 결과, 5f-MNC는 H₂O₂로부터 유의하게 세포 사멸이 방지되었다(도 1c).

전체 세포 카운트와 세포 생존능은 트리판 블루 염색 후 자동화 세포 카운터(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 측정하였다. 어팝토틱 세포는 FITC-Annexin V(BD, San Jose, CA)로 염색하여 유세포 분석기로 정량하였다. 세포 증식 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 그리고 이전에 개시된 대로(Iwaguro H, Yamaguchi, J.Kalka C, Murasawa S, Masuda H, Yayashi S, et al. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration, Circulation 2002;105:732-8) MTS[3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨](Promega)를 이용하여 실시하였다. 간단히 요약하면, 5 x 10⁵ 세포/웰을 5% FBS를 함유한 DMEM에서 피브로넥틴-코팅된 96-웰 플레이트 상에 접종하였다. 72시간 후, 각각의 웰을 3시간 동안 Cell Titer 96 Aqueous One Solution(Promega, Madison, WI)으로 처리하였다. 생성된 포르마잔 생성물을 정량하기 위하여, 490 nm에서의 흡광도를 자동화 ELISA 플레이트 판독기(Bionetics Laboratory, Kensington, MD)에 의해 판독하였다.

부착성 분석은 이전에 개시된 방법의 변경된 버전을 이용하여 실시하였다(Ii M, Takenaka H, Asai J, Ibusuki K, Mizukami Y, Maruyama K, et al. Endothelial progenitor thrombospondin-1 mediates diabetes-induced delay in reendothelialization following arterial injury. Circ Res 2006;98:697-704). 요약하면, 1,1‘다이옥타데실-3,3,3’,3‘-테트라메틸인도카르보시아닌(Dil) 라벨된 2.5 x 10⁴ 세포/웰을 EGM-2 배지(Lonza) 내의 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐 타입 I 및 라미닌(Sigma-Aldrich)로 사전코팅된 96-웰 플레이트 상에 접종하고 24시간 동안 37 ℃ 및 5% CO₂에서 항온처리하였다. 3회 PBS 세척 후, 부착 세포를 형광 현미경으로 사진을 찍고 독립적인 맹검 조사자에 의해 카운트하였다.

실험 결과, 5f에서 단핵구 세포의 증식 속도는 3f 또는 대조군 0f에서의 속도보다 뚜렷하게 더 높았다(도 1a 및 b). 유사하게, 5f-MNC 그룹에서 생존 세포의 수는 대조군 또는 3f-MNC에서의 수보다 유의하게 더 높았다(도 1d). 유세포분석기로 결정할 때 대조군 또는 3-MNC에 비하여 5f-MNC에서 어팝토틱 세포의 수가 유의하게 적었다(도 1e). 인비트로에서 증식 활성을 조사하기 위하여, MTS 분석을 실시한 결과, 5f-MNC의 증식 속도가 다른 그룹에 비하여 훨씬 높았다(도 1f). 부착성 분석은 대표적인 세포외 매트릭스 단백질에 부착된 세포의 수가 대조군 또는 3f-MNC에서보다 5f-MNC에서 유의하게 높음을 밝혔다. (도 1g 및 h).

실시예 3. 내피전구세포( EPC ) 배양 분석 및 면역세포화학

배양된 MNC의 인비트로 내피 분화 특성을 조사하기 위하여 EPC 배양 분석을 이전에 개시된 대로 실시하였다(Asahara T, Takahashi T, Masuda H, Kalka C, Chen D, Iwaguro H, et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J 1999;18:3964-72). 요약하면, 1 x 10⁶ 세포/cm²를 7일 동안 3가지 상이한 배양 조건에서 0.1% 피브로넥틴/젤라틴-코팅된 플레이트에서 배양하였다. 세포를 1시간 동안 DiI-acLDL(1:500, Biomedical Technologies, Staughton, Massachusetts)로 항온처리하고, PBS로 세척하고 1% 파라포름알데히드에서 고정하고, FITC-접합된 UEA-1 렉틴(1:200, Sigma)으로 염색하였다. DiI-acLDL 흡수 및 UEA-1 렉틴 결합 이중-양성 세포를 카운트하였다. 그 결과, 초기 EPC의 수는 대조군 또는 3f-MNC에서보다 5f-MNC에서 유의하게 높았다.(도 1i 및 j).

실시예 4. 형광-활성화 세포 분류( FACS ) 분석

세포를 둘베코 PBS(Cellgro, Manassas, MD)에 재현탁시키고 20분 동안 PE- 또는 FITC-접합된 항체와 직접 4℃에서 항온처리하였다. 사용된 항체는 항-CD11b, 항-CD14, 항-CD34, 항-CD45, 항-CD117(c-키트), 및 항-CD146(모두 BD로부터 입수)이었다. 상응하는 아이소타입-동일성 IgG가 음성 대조군으로 작용하였다. 세포 염색 후, 정량성 FACS를 FACStar 유세포분석기(BD)에서 실시하였다.

FACS 분석 결과, 5f-MNC는 0f-MNC에 비하여 유의하게 더 낮은 수준의 CD45 및 CD11b/CD14를 발현하여(도 2a 및 b), 더 낮은 단핵구 또는 대식세포의 존재를 입증하였다. 흥미롭게도, 5f-MNC는 c-kit를 우선적으로 발현하여, 생존능 증진 및 다능성 전구 세포 또는 공통 골수 전구 세포의 존재를 나타냈다. 하지만, 비성숙 비만 세포 또는 인간 태정맥 내피 세포(HUVEC)를 비롯한 비전구세포 유형의 존재 가능성을 배제할 수 없었다. 하지만, 이들 세포도 비만 세포와 내피 세포의 마커인 CD34와 CD146을 1% 미만 발현하여, 비만 세포와 순환 내피 세포의 부재를 확인하였다. 따라서, 이들 데이터는 5f 배지가 MNC가 조혈 계통 세포(단핵구 또는 대식세포)로 분화하는 것을 방지하였으며, 오히려 전구-유사 세포를 유지하거나 전구-유사 세포로의 분화를 유도함을 나타낸다.

실시예 5. 정량적 RT - PCR ( qRT - PCR ) 분석

qRT-PCR 분석을 이전에 개시된 대로 실시하였다. 간단히 요약하면, RNA-stat 프로토콜(Iso-Tex Diagnostics, Friendswood, TX)을 이용하여 각 세포 유형으로부터 총 RNA를 분리하였다. 추출된 RNA를 이어서 cDNA 합성을 위하여 Taqman 역전사 시약(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 역전사시켰다. 실시간 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 위하여, 인간-특이적 프라이머와 프로브를 이용하였다. 이용된 프라이머와 프로브는 도 7에 나타난다. RNA의 양은 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템을 이용하여 정량하였다. 하우스키핑 대조 유전자 GAPDH에 정규화시키고 캘리브레이터에 상관시킨 후, 실험 샘플에서 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 식 Rel Exp=2^-ΔCT(배수 차이)를 이용하여 결정하였으며, 여기서 ΔCt = (표적 유전자의 Ct) - (내인성 대조 유전자, GAPDH의 Ct)이다. PCR 사이클의 수는 Lightcycler 3.5 소프트웨어(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)를 이용하여 측정하였다.

qRT-PCR 분석 결과, 안지오포이에틴(Ang)-1 및 간세포 성장 인자(HGF)는 비배양 MNC 그룹에 비하여 5f-MNC 그룹에서 16.2배 및 7.8배만큼 상당히 상승하였다(도 2c). Ang-2, FGF-2 및 태반 성장 인자(PIGF)와 같은 다른 신생혈관생성 인자 또한 다른 MNC 그룹의 각각에 비하여 5f-MNC에서 매우 상향조절되어, 높은 신생혈관형성 특성을 나타냈다.

실시예 6. 허혈성 하지 동물 모델에서 세포의 이식

모든 실험 프로토콜은 동아대학교 기관 동물 보호 및 이용 위원회에 의해 승인되었으며 모든 절차는 미국 국립보건원에 의해 발행된 실험 동물의 보호 및 이용을 위한 가이드(NIH Publication No.85-23, 1996 개정)에 따라 실시하였다.

6-9주령의, 무게가 18 내지 22 g인 무흉선 누드 마우스(중앙 랩 애니멀, 서울, 한국)을 이용하였다. 하지 허혈을 유도하기 위하여, 마우스를 마취시키고 우측 대퇴동맥을 절제하였다. 그 후 PBS 중의 1 X 10⁶ DiI-라벨된 세포를 수술 후 허혈성 하지 영역 내로 근육내로 주사하였다(각 이식을 위해 n=9). 안락사 직전에, 과용량(200 mg/kg)의 펜토바르비탈을 마우스에 주사하였다. 레이저 도플러 관류 이미지(LDPI) 분석기(Moor Instrument, Axminster, UK)를 이용하여 수술 후 허혈성 하지에서의 연속적 혈류를 측정하였다. 그 결과, 14일과 21일에 혈류의 속도는 0f-MNC, MNC 또는 PBS로 주사된 것과 비교하여 5f-MNC로 주사된 하지에서 유의하게 높았다(도 3a 및 b).

실시예 7. 허혈성 하지에서 세포 생착률의 정량 및 조직학적 분석

허혈성 하지에서 세포의 생착률을 정량하기 위하여, 조직학적 분석을 실시하였다. 요약하면, DiI-라벨된 세포를 누드 마우스의 허혈성 하지내로 주사하였다. 4주 후, 허혈성 하지를 수집하여 조직 절편을 매립하고 절편화하였다 4개의 조직 절편으로부터의 5개 부분을 임의로 선택하고, DiI-라벨된 세포의 수를 각 부분에서 카운트하였다. 또한, FACS 분석을 이전에 개시된 대로 실시하였다(Gao D, Nolan DJ, Mellick AS, Bambino K, McDonnell K, Mittal V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science 2008;319:195-8). 4주 후, 허혈성 하지를 수집하고 간 후 45-60분 동안 37 ℃에서 효소 칵테일(콜라게나아제 A, 엘라스타아제, 및 DNase I; Roche Applied Science, Indianapolis, IN)로 분해시켰다. 단세포 현탁액을 30-㎛ 스트레이너를 통한 여과에 의해 준비하였다. 라벨링된 세포 집단을 LSRII 유세포분석기(BD)를 이용하여 측정하고, FACS 데이터를 Flowjo 소프트웨어(Treestar, Ashland, OR)를 이용하여 분석하였다. FACS 분석을 위한 대조군은 비염색 샘플과 아이소타입 항체를 포함하였다.

실험 결과, 면역조직화학 결과는 5f-MNC가 0f-MNC(26.0±2.5) 및 비배양 MNC(10.6±2.1)에 비하여 유의하게 높은 생착능(45.6±8.0)을 나타냄을 보여주었다(도 5a 및 b). 또한, 효소 분해된 근육의 FACS 분석은 5f-MNC가 0f-MNC(4.9±0.8) 및 비배양 MNC(2.0±0.4)에 비하여 유의하게 더 높은 생착능(7.7±0.8)을 나타냄을 보여주었다(도 5c 및 d).

한편, 모세관 밀도 확인을 위하여 조직학적 분석을 실시하였다. 내전근을 파라포름알데히드에서 4시간 동안 고정시키고 15% 수크로스 용액에서 밤새 항온처리하였다. 조직을 OCT 배합물(Sakura Finetek USA, Torrance, CA)에서 매립하고, 액체 질소에서 순간 동결시키고 10에서 20 mm의 두께 증분으로 절편화하였다. 모세관 밀도 측정을 위하여, 각 그룹으로부터의 내전근으로부터의 허혈성 조직의 4개의 동결 절편을 비오틴화 아이소렉틴 B4(ILB4; 1:250, Vector laboratory Inc. Burlingame, CA) 및 α-SMA(1:400, Abcam, Cambridge, MA) 일차 항체 및 이어서 스트렙타비딘 Alexa Fluor 488(1:400, Invitrogen) 및 556(1:400, Invitrogen) 이차 항체로 염색하였다. 4개의 조직 절편으로부터의 5개 부분을 무작위로 선택하고, 모세관의 수를 각 부분에서 카운트하였다. 형광 도립현미경 또는 공초점 현미경을 이용하여 사진을 찍었다. 그 결과, 수술 후 28일에 허혈성 하지 내전근의 모세관 밀도와 혈관 성숙 또한 0f-MNC(61±7.2/HPF, 3±0.3/HPF) 및 PBS 그룹(29±4.3/HPF, 0.6±0.2/HPF)에서 보다 5f-MNC 그룹(97±10/HPF, 4.6±0.5/HPF 각각)에서 유의하게 더 높았다(P<0.05)(도 4a 및 b).

또한, 어팝토시스를 평가하기 위하여, TdT-매개 dUTP 닉-말단 라벨링(TUNEL) 반응을 플루오르세인 인시추 세포 사멸 검출 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 이용하여 실시하였다. TUNEL 분석 결과, 허혈성 하지에서 TUNEL-양성 핵의 수는 0f-MNC에서보다 5f-MNC에서 대략 3.5배 더 낮았다.

또한, 이식된 세포의 치료능력을 조사하기 위해 이전에 보고된 것을(Bonauer A, Carmona G, Iwasaki M, Mione M, Koyanagi M, Fischer A, et al. MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice. Science 2009;324:1710-3) 변경하여 사지 괴사/손실로 심각도를 평가한 결과, 5f-MNC(0.8±0.3)는 0f-MNC(1.7±0.4)(P<0.05) 또는 MNC(1.6±0.4)(P<0.05)보다 유의하게 낮은 사지 손실 점수를 가져 치료 효과가 확인되었다(도 3c 및 d).

한편, 치료 효과를 책임지는 기전을 조사하기 위하여, 신생혈관생성 인자의 mRNA 발현 수준을 하지 근육에서 측정한 결과, Ang-1, FGF-2, PDGF-B, 기질 세포-유래 인자(SDF)-1 및 CD31의 발현 수준이 각각 배양하지 않은 MNC-주사 사지와 비교하여 5f-MNC-주사 사지에서 5.2배, 5.8배, 2.8배, 5.3배 및 3.1배 더 높았다(도 4c). 또한, Ang-1, PDGF-B 및 SDF-1은 0f-MNC로 주사된 것과 비교하여 5f-MNC로 주사된 사지에서 매우 상향 조절되었다(도 4c).

실시예 8. 인비보 혈관생성에의 5f- MNC 의 기여

내피 세포 생성 및 혈관생성에 대한 MNC의 기여 가능성과 양을 조사한 결과, 누드 마우스의 허혈성 하지 내로 주사된 5f-MNC의 대부분이 혈관주위 또는 주연세포 영역에 집중되었으며(도 6a), 더 작은 MNC 서브세트는 주사 후 6-8주에 관 구조 내에서 내피 세포-특이적 마커인 아이소렉틴 B4(ILB4)를 나타냈다. 이들 ILB4- 및 DiI-라벨된 이중-양성 세포가 주사된 인간 MNC로부터 유래한 것인지 확인하기 위해, Cy3-접합된(Cambio, Cambridge, United Kingdom) 인간 γ 염색체 프로브를 이용하여 이전에 개시된 대로 형광 인시추 하이브리드화(FISH)를 실시한 결과, 이들 이중-양성 세포가 인간 공여체로부터 기원하였음을 보여주어, MNC의 내피 세포로의 분화를 확인하였다(도 6c).

<110> abc <120> Culture medium for mononuclear cell derived from human, cultured mononuclear cell, and composition for treating ischemic diseases comprising epithelial progenitor cells differentiated from the mononuclear cell <130> DP15360 <160> 57 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cagaaaacag tgggagaaga tataacc 27 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgccatcgtg ttctggaaga 20 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 tcaacatggg caatgtgcct acactttc 28 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttcctcctgc cagagatgga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgcacagcat tggacacgta 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 actgccgctc ttcttccagc cc 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 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ctggccgtgg ctctcttg 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cttggcaaaa ctgcaccttc a 21 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 18 agccttcctg atttc 15 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcaatcaatg ccccagtca 19 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcctctgcac tgagatcttc ctat 24 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 ctgctgttat aacttcacc 19 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggacgatgcc tgcaacgt 18 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 acaaatacag ctggttccca atc 23 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 24 atcttcgacg ccatcgcgg 19 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cattcccgag gagctttatg ag 22 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tccaactcgg ccccatct 18 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 accactcgat ccgctccttt gatgatc 27 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ctgacgttct ctcagcacgt tc 22 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ctcctttccg gcttcatctt c 21 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 30 tgcgaatgcc ggcctctgc 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gtgcccactg aggagtcca 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 tcctatgtgc tggccttggt 20 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 33 catcaccatg cagattatgc ggatcaaa 28 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ggtggtctcc tctgacttca aca 23 <210> 35 <211> 19 <212> DNA 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primer <400> 53 ccttccattg cagcattggt 20 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 54 ctgacttccg cttctcacct ctgtagcct 29 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 cgtgttccta cccccaatgt 20 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 tgtcatcata cttggcaggt ttct 24 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 57 tcgtggatct gacgtgccgc c 21

Claims (17)

1. 단핵구 세포의 기본 배양 배지에 더하여 EGF(Epidermal growth factor), TPO(Thrombopoietin), Flt-3L, IGF(Insulin-like growth factor)-1 및 bFGF(basic Fibroblast growth factor)의 5가지 성장 인자를 각각 20 - 400 ng/ml의 농도로 더 포함하는 단핵구 세포 배양 배지.
2. 제1항에 있어서, EGF(Epidermal growth factor), TPO(Thrombopoietin), Flt-3L, IGF(Insulin-like growth factor)-1 및 bFGF(basic Fibroblast growth factor)의 5가지 성장 인자는 각각 20 ng/ml의 농도로 포함되는 단핵구 세포 배양 배지.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 기본 배양 배지는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지, DMEM, MEM, alpha-MEM, M-199, 이글스 기본 배지, CMRL 배지, RPMI 1640 배지, Ham's F-10/12 배지, Fisher's 배지, McCoy's 5A 배지, Leibovitz's 배지, 및 MCDB 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 단핵구 세포 배양 배지.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단핵구 세포는 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 또는 인간 골수 유래 단핵구 세포인 단핵구 세포 배양 배지.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 글루타민, FBS, 페니실린, 및 스트렙토마이신 중 하나 이상을 추가로 포함하는 단핵구 세포 배양 배지.
6. 제3항에 있어서, 2 mM 글루타민, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml TPO, 20 ng/ml Flt-3L, 20 ng/ml IGF-1, 및 20 ng/ml bFGF로 보충된 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지로 이루어지는 단핵구 세포 배양 배지.
7. 제1항 또는 제2항의 배양 배지로 배양되어, IMDM 배지 또는 EGF, TPO 및 Flt-3L이 첨가된 IMDM 배지로 배양된 단핵구 세포에 비하여 생존 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포.
8. 제6항의 배양 배지로 배양되어, IMDM 배지 또는 EGF, TPO 및 Flt-3L이 첨가된 IMDM 배지로 배양된 단핵구 세포에 비하여 생존 능력과 신생혈관형성 능력이 향상된 단핵구 세포.
9. 제7항에 있어서, VEGF-A, 안지오포이에틴-1,2, HGF, IGF-1, FGF-2, PDGF-B, PIGF, IL-8, MMP-9, TGF-b, MCP-1, 및 Akt-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 단핵구 세포.
10. 제8항에 있어서, VEGF-A, 안지오포이에틴-1,2, HGF, IGF-1, FGF-2, PDGF-B, PIGF, IL-8, MMP-9, TGF-b, MCP-1, 및 Akt-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 단핵구 세포.
11. 제7항에 있어서, 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 및 인간 골수 유래 단핵구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단핵구 세포.
12. 제8항에 있어서, 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 및 인간 골수 유래 단핵구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단핵구 세포.
13. 제9항에 있어서, 인간 제대혈 유래 단핵구 세포, 인간 말초혈액 단핵구 세포, 및 인간 골수 유래 단핵구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단핵구 세포.
    
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