CN114525252A - 一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用 - Google Patents
一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114525252A CN114525252A CN202210229827.4A CN202210229827A CN114525252A CN 114525252 A CN114525252 A CN 114525252A CN 202210229827 A CN202210229827 A CN 202210229827A CN 114525252 A CN114525252 A CN 114525252A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- medium
- monoclonal
- culture
- mda
- single cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 36
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 17
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 14
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 6
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 claims description 5
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 claims description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 claims 3
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims 1
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000012956 testing procedure Methods 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- -1 F12K Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 201000007741 female breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000002276 female breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0631—Mammary cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
- C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种提高MDA‑MB‑231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用，成分包括基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸，还可以包括氢化可的松和/或抗坏血酸；采用所述的单克隆增强培养基，MDA‑MB‑231细胞可以在37℃和5％CO2的常规环境下进行正常培养，更主要的是显著提高了MDA‑MB‑231细胞的单细胞克隆形成效率，由此得到的MDA‑MB‑231单细胞克隆可在三阴性乳腺癌的研究、基因编辑、筛选抗肿瘤药物中得到广泛应用。本发明优点包括：本发明培养基适用5％CO2的常规培养环境，在成本和管理操作上具有优势；本发明方法实现单细胞克隆形成率高、生长状态好从而提高基因编辑细胞株的制备效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及MDA-MB-231单细胞克隆的制备技术。
背景技术
MDA-MB-231细胞是分离自一名51岁的女性乳腺癌患者的胸水的人乳腺癌细胞。MDA-MB-231是具有高度侵入性和分化程度低的三阴性乳腺癌 (TNBC)细胞系，三阴性指缺乏雌激素受体(ER)和雌激素受体(PR)表达，以及HER2(人类表皮生长因子受体2)过表达。与其他侵入性癌细胞系类似， MDA-MB-231细胞的侵入性通过细胞外基质的蛋白质降解进行调解。
MDA-MB-231被广泛用于三阴性乳腺癌的相关研究。通过ZFN、TALEN、 CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，从而建立基因敲除、敲入、点突变等细胞株是常用的研究手段。然而，MDA-MB-231细胞在进行基因编辑的必经环节—单细胞克隆培养实验时，单细胞克隆形成率以及单细胞克隆培养状态都是不太理想，需要铺大量的板，才能筛到足够的克隆数进行鉴定。依照ATCC等权威细胞库的培养条件，MDA-MB-231细胞在含10％胎牛血清(FBS)的Leibovitz’s L-15 培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，这一环境区别于绝大多数细胞的环境条件(37℃、5％CO2),需要配备专用培养箱单独进行培养，在成本及管理操作上都没有优势，更重要的是，这个培养条件虽然可以对MDA-MB-231细胞系进行常规培养，如复苏、传代、冻存等，但是对于MDA-MB-231极限稀释或分选后获得的单细胞克隆培养，单细胞克隆形成效率较低，制约基因编辑细胞株的制备效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用，以解决现有技术中MDA-MB-231细胞培养成本高，以及因单细胞克隆形成效率低而制约基因编辑细胞株的制备问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，所述单克隆增强培养基成分包括基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸；
所述基础培养基是由Leibovitz’s L-15培养基和DMEM培养基混合所得，或是由Leibovitz’s L-15培养基和RPMI-1640培养基混合所得。
进一步地，所述单克隆增强培养基成分还包括氢化可的松和/或抗坏血酸。
进一步地，所述基础培养基是由Leibovitz’s L-15培养基和DMEM培养基按体积比1：1混合所得，或是由Leibovitz’s L-15培养基和RPMI-1640培养基按体积比1：1混合所得。
进一步地，所述基础培养基、胎牛血清的体积比是90：10。
进一步地，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸的终浓度均为100μM。
进一步地，所述氢化可的松的浓度范围为0.5～1μg/ml，抗坏血酸的浓度范围为30～50μg/ml。
一种应用所述单克隆增强培养基的MDA-MB-231单细胞克隆培养方法，步骤包括：将MDA-MB-231细胞加入到培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的Leibovitz’s L-15 培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％CO2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。
更优地，步骤包括：将MDA-MB-231细胞消化成单细胞悬液后，以有限稀释法将单细胞悬液逐级稀释至浓度为1个细胞/100μL的细胞悬液，然后将稀释后的细胞悬液按100μL每孔加入到96孔细胞培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的Leibovitz’ s L-15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％CO2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。
本发明还提供一种所述培养方法得到的MDA-MB-231单细胞克隆在研究三阴性乳腺癌或基因编辑中的应用。
本发明还提供一种所述培养方法得到的MDA-MB-231单细胞克隆在筛选抗肿瘤药物中的应用。
本发明的优点包括：
1.本发明的培养基适用5％CO2的常规培养环境，不需要配备专用培养箱，在成本和管理操作上具有优势，在管理及操作上大大提升效率；
2.本发明的MDA-MB-231单细胞克隆形成效率高，单细胞克隆生长状态好，容易获得足够的单细胞克隆进行基因型鉴定，大大提高基因编辑细胞株的制备效率。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1A是实施例一对照组采用ATCC培养方法培养7d的MDA-MB-231细胞的单细胞克隆形态实验图；B是实施例二采用单克隆增强培养基B4培养7d的单细胞克隆形态实验图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例一
非必需氨基酸购自MEM Non-EssentialAminoAcids Solution(100X)(厂家：thermofisher货号：11140050)，其包括的氨基酸具体有：甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸。
选择4种常用培养基：DMEM、F12K、RPMI-1640、MEM，分别与Leibovitz’s L-15培养基(简称L15)按体积比1：1混合后作为基础培养基；再按照基础培养基：胎牛血清＝90：10的体积比，分别往各基础培养基中添加胎牛血清(FBS)，然后按非必需氨基酸：添加有胎牛血清的基础培养基＝1：99的体积比，分别往各添加有胎牛血清的基础培养基中添加非必需氨基酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸的终浓度均为100μM，得到4个不同的单克隆增强培养基A1-A4，如表1所示。
将上述得到的4个培养基分别按37℃、5％CO2常规环境进行MDA-MB-231 细胞的培养测试，与ATCC培养方法不同的是在细胞培养过程的24h至48h间分别采用单克隆增强培养基A1-A4按37℃、5％CO2常规环境培养MDA-MB-231 细胞，对应组别序号为组A1-A4。组A1采用单克隆增强培养基A1的培养测试过程如下：
将MDA-MB-231细胞消化成单细胞悬液后，以有限稀释法将单细胞悬液逐级稀释至浓度为1个细胞/100μL的细胞悬液，然后将稀释后的细胞悬液按100μL 每孔加入到96孔细胞培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清(FBS)的Leibovitz’s L-15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基 A1，在37℃和5％CO2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基A1，直至形成可传代的单细胞克隆。
采用单克隆增强培养基A2-4的培养测试过程参照采用单克隆增强培养基 A1的培养测试过程。
同时设置对照组，对照组采用ATCC培养方法来培养MDA-MB-231细胞。各组单细胞克隆培养24h-48h阶段的具体培养条件、情况记录如表1所示：
表1
除特别说明外，表1中的比例指的是体积比，百分数指的是体积百分数。
测试组A1和组A3培养体系与对照组的体系相比，MDA-MB-231单细胞克隆形成及单细胞克隆生长状态存在差异。结果显示组A1单细胞克隆形成率18％，组A3单细胞克隆形成率16.5％，相比对照组单细胞克隆形成率13％，都有一定的提升，组A1的效果比组A3的稍高。如图1A所示是对照组采用ATCC培养方法培养7d的MDA-MB-231细胞的单细胞克隆形态实验图。
实施例2
本实施例期望通过在单克隆增强培养基A1的基础上添加特殊添加剂，进一步提高单细胞克隆形成率。特殊添加剂是氢化可的松和/或抗坏血酸(L-ascorbic acid)，得到3个不同的单克隆增强培养基B2-B4。
分别采用单克隆增强培养基B2-B4进行培养测试的过程参照实施例1中采用单克隆增强培养基A1的培养测试过程，对应组别序号为组B2-B4，各组单细胞克隆培养24h-48h阶段的具体培养条件、情况如表2所示：
表2
除特别说明外，表2中的比例指的是体积比，百分数指的是体积百分数。
测试结果显示两者同时添加，效果更佳。单克隆增强培养基B4选为最佳 MDA-MB-231单克隆增强培养基，其中氢化可的松的最佳浓度范围为 0.5～1μg/ml，抗坏血酸的最佳浓度范围为30～50μg/ml。如图1B所示是组B4培养7d 的单细胞克隆形态实验图，培养15d后形成可传代的单细胞克隆。可见采用单克隆增强培养基B4来培养的单细胞克隆形成率大大高于ATCC培养方法的单细胞克隆形成率。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：
所述单克隆增强培养基成分包括基础培养基、胎牛血清、非必需氨基酸；
所述基础培养基是由Leibovitz’s L-15培养基和DMEM培养基混合所得，或是由Leibovitz’s L-15培养基和RPMI-1640培养基混合所得。
2.根据权利要求1所述的一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：
所述单克隆增强培养基成分还包括氢化可的松和/或抗坏血酸。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：
所述基础培养基是由Leibovitz’s L-15培养基和DMEM培养基按体积比1：1混合所得，或是由Leibovitz’s L-15培养基和RPMI-1640培养基按体积比1：1混合所得。
4.根据权利要求1或2所述的一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：
所述基础培养基、胎牛血清的体积比是90：10。
5.根据权利要求1或2所述的一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：
所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸，甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸的终浓度均为100μM。
6.根据权利要求2所述的一种提高MDA-MB-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基，其特征在于：
所述氢化可的松的浓度范围为0.5～1μg/ml，抗坏血酸的浓度范围为30～50μg/ml。
7.一种应用如权利要求1-6任一所述单克隆增强培养基的MDA-MB-231单细胞克隆培养方法，其特征在于：
步骤包括：将MDA-MB-231细胞加入到培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的Leibovitz’s L-15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％CO2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。
8.一种如权利要求7所述MDA-MB-231单细胞克隆培养方法，其特征在于：
步骤包括：将MDA-MB-231细胞消化成单细胞悬液后，以有限稀释法将单细胞悬液逐级稀释至浓度为1个细胞/100μL的细胞悬液，然后将稀释后的细胞悬液按100μL每孔加入到96孔细胞培养板中进行单细胞克隆培养，以开始培养单细胞克隆为时间点0h，0h至24h间在含10％胎牛血清的Leibovitz’s L-15培养基、37℃、空气环境中进行贴壁培养，24h至48h间更换为单克隆增强培养基，在37℃和5％CO2的环境下培养，每5d更换新鲜单克隆增强培养基，直至形成可传代的单细胞克隆。
9.一种如权利要求7或8所述培养方法得到的MDA-MB-231单细胞克隆在研究三阴性乳腺癌或基因编辑中的应用。
10.一种如权利要求7或8所述培养方法得到的MDA-MB-231单细胞克隆在筛选抗肿瘤药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210229827.4A CN114525252B (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210229827.4A CN114525252B (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114525252A true CN114525252A (zh) | 2022-05-24 |
| CN114525252B CN114525252B (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=81627585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210229827.4A Active CN114525252B (zh) | 2022-03-10 | 2022-03-10 | 一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114525252B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114561337A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-05-31 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法 |
Citations (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2600821A1 (en) * | 1998-12-16 | 2000-06-22 | Nora Sarvetnick | An animal model for identifying a common stem/progenitor to liver cells and pancreatic cells |
| JP2000512128A (ja) * | 1997-03-12 | 2000-09-19 | ユニバーシティ・オブ・ピッツバーグ | 哺乳類細胞用の細胞培養培地 |
| US20030060434A1 (en) * | 1997-02-18 | 2003-03-27 | Loretta Nielsen | Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms |
| CN1960753A (zh) * | 2004-03-25 | 2007-05-09 | 森托科尔公司 | 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子拮抗剂在治疗过度血管发生相关疾病中的用途 |
| CN101223287A (zh) * | 2005-06-09 | 2008-07-16 | 拜奥默里克斯公司 | 用于乳腺癌的诊断/预后的方法 |
| US20100124569A1 (en) * | 2008-11-19 | 2010-05-20 | Abbot Stewart | Amnion derived adherent cells |
| KR101228626B1 (ko) * | 2011-11-30 | 2013-01-31 | 동아대학교 산학협력단 | 인간 유래 단핵구 세포의 배양 배지, 배양된 단핵구 세포, 및 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 |
| AU2013203200A1 (en) * | 2008-11-19 | 2013-05-02 | Anthrogenesis Corporation | Amnion derived adherent cells |
| CN103484424A (zh) * | 2013-10-10 | 2014-01-01 | 山东农业大学 | 一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法 |
| CN104830775A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-08-12 | 上海中医药大学附属龙华医院 | 一种三阴性乳腺癌顺铂耐药细胞株及其制备方法和用途 |
| CN106117321A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-11-16 | 大连医科大学 | 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用 |
| CN106170554A (zh) * | 2014-01-29 | 2016-11-30 | 美国安进公司 | 过表达n‑糖基化途径调节基因以调节重组蛋白的糖基化 |
| CN106939318A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-11 | 上海诺百生物科技有限公司 | 一种单细胞克隆分离方法 |
| CN107841481A (zh) * | 2016-09-19 | 2018-03-27 | 深圳华大方舟生物技术有限公司 | 一种用于单细胞培养的培养基及其制备方法和应用 |
| JP2019158777A (ja) * | 2018-03-16 | 2019-09-19 | 東ソー株式会社 | 腫瘍マーカーならびに腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して回収および検出する方法 |
| CN110373380A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-10-25 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
| CN111108114A (zh) * | 2017-04-03 | 2020-05-05 | 塔基迪有限公司 | 衍生自clpb的蛋白质及其用途 |
| CN111808966A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-10-23 | 温州医科大学 | miRNA在诊断乳腺癌患病风险的应用 |
| CN112391335A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-02-23 | 天康生物股份有限公司 | 单克隆细胞培养基、应用及培养单克隆细胞的方法 |
| CN113249325A (zh) * | 2020-02-11 | 2021-08-13 | 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 | 食管鳞癌原代细胞的培养基及培养方法 |
| WO2021188907A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Amathus Therapeutics, Inc. | Pyridinesulfonamide derivatives as trap1 modulators and uses thereof |
| CN114057883A (zh) * | 2020-07-31 | 2022-02-18 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双特异性抗原结合分子及其医药用途 |
| CN114561358A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-05-31 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种提高细胞慢病毒感染率的增强感染培养基及方法 |
| CN115466779A (zh) * | 2022-09-22 | 2022-12-13 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种单克隆鉴定试剂盒及鉴定单克隆细胞基因型的方法 |
| WO2022266660A1 (en) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Amberstone Biosciences, Inc. | Anti-cd3 constructs and uses thereof |
| TW202310850A (zh) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | 國立成功大學 | 標靶治療組合物及其於抑制乳癌細胞增生、移行或侵入之用途 |
-
2022
- 2022-03-10 CN CN202210229827.4A patent/CN114525252B/zh active Active
Patent Citations (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030060434A1 (en) * | 1997-02-18 | 2003-03-27 | Loretta Nielsen | Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms |
| JP2000512128A (ja) * | 1997-03-12 | 2000-09-19 | ユニバーシティ・オブ・ピッツバーグ | 哺乳類細胞用の細胞培養培地 |
| CA2600821A1 (en) * | 1998-12-16 | 2000-06-22 | Nora Sarvetnick | An animal model for identifying a common stem/progenitor to liver cells and pancreatic cells |
| CN1960753A (zh) * | 2004-03-25 | 2007-05-09 | 森托科尔公司 | 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子拮抗剂在治疗过度血管发生相关疾病中的用途 |
| CN101223287A (zh) * | 2005-06-09 | 2008-07-16 | 拜奥默里克斯公司 | 用于乳腺癌的诊断/预后的方法 |
| US20100124569A1 (en) * | 2008-11-19 | 2010-05-20 | Abbot Stewart | Amnion derived adherent cells |
| CN107201337A (zh) * | 2008-11-19 | 2017-09-26 | 人类起源公司 | 羊膜来源的贴壁细胞 |
| AU2013203200A1 (en) * | 2008-11-19 | 2013-05-02 | Anthrogenesis Corporation | Amnion derived adherent cells |
| KR101228626B1 (ko) * | 2011-11-30 | 2013-01-31 | 동아대학교 산학협력단 | 인간 유래 단핵구 세포의 배양 배지, 배양된 단핵구 세포, 및 단핵구 세포로부터 분화된 내피전구세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 |
| CN103484424A (zh) * | 2013-10-10 | 2014-01-01 | 山东农业大学 | 一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法 |
| CN106170554A (zh) * | 2014-01-29 | 2016-11-30 | 美国安进公司 | 过表达n‑糖基化途径调节基因以调节重组蛋白的糖基化 |
| CN104830775A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-08-12 | 上海中医药大学附属龙华医院 | 一种三阴性乳腺癌顺铂耐药细胞株及其制备方法和用途 |
| CN106117321A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-11-16 | 大连医科大学 | 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用 |
| CN107841481A (zh) * | 2016-09-19 | 2018-03-27 | 深圳华大方舟生物技术有限公司 | 一种用于单细胞培养的培养基及其制备方法和应用 |
| CN111108114A (zh) * | 2017-04-03 | 2020-05-05 | 塔基迪有限公司 | 衍生自clpb的蛋白质及其用途 |
| CN106939318A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-07-11 | 上海诺百生物科技有限公司 | 一种单细胞克隆分离方法 |
| JP2019158777A (ja) * | 2018-03-16 | 2019-09-19 | 東ソー株式会社 | 腫瘍マーカーならびに腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して回収および検出する方法 |
| CN110373380A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-10-25 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种肝脏类器官模型及其建立方法和应用 |
| CN113249325A (zh) * | 2020-02-11 | 2021-08-13 | 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 | 食管鳞癌原代细胞的培养基及培养方法 |
| WO2021188907A1 (en) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | Amathus Therapeutics, Inc. | Pyridinesulfonamide derivatives as trap1 modulators and uses thereof |
| CN114057883A (zh) * | 2020-07-31 | 2022-02-18 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 双特异性抗原结合分子及其医药用途 |
| CN111808966A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-10-23 | 温州医科大学 | miRNA在诊断乳腺癌患病风险的应用 |
| CN112391335A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-02-23 | 天康生物股份有限公司 | 单克隆细胞培养基、应用及培养单克隆细胞的方法 |
| WO2022266660A1 (en) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Amberstone Biosciences, Inc. | Anti-cd3 constructs and uses thereof |
| TW202310850A (zh) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | 國立成功大學 | 標靶治療組合物及其於抑制乳癌細胞增生、移行或侵入之用途 |
| CN114561358A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-05-31 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种提高细胞慢病毒感染率的增强感染培养基及方法 |
| CN115466779A (zh) * | 2022-09-22 | 2022-12-13 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种单克隆鉴定试剂盒及鉴定单克隆细胞基因型的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LIN YU 等: "SND1 Acts Downstream of TGFb1 and Upstream of Smurf1 to Promote Breast Cancer Metastasis", 《CANCER RESEARCH》 * |
| 张宏;刘玉琴;: "培养基的正确制备及使用", 基础医学与临床, no. 04 * |
| 陈亚军;钟警;杨靖;文格波;: "PRMT2剪接体在乳腺癌细胞株中的表达", 中华疾病控制杂志, no. 05 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114561337A (zh) * | 2022-03-09 | 2022-05-31 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法 |
| CN114561337B (zh) * | 2022-03-09 | 2023-10-03 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114525252B (zh) | 2023-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109082420B (zh) | 金属有机框架材料固定化β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用 | |
| CN114292816B (zh) | 肺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
| CN114525252A (zh) | 一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用 | |
| Goldstein et al. | Rescue of senescent human fibroblasts by hybridization with hamster cells in vitro | |
| CN114561358B (zh) | 一种提高细胞慢病毒感染率的增强感染培养基及方法 | |
| CN101768615A (zh) | 一种黄原胶的制备方法 | |
| CN103923900A (zh) | 一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用 | |
| CN109628385B (zh) | 一种人卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法 | |
| CN106754657B (zh) | 一种猴胚胎干细胞的无血清培养基 | |
| CN114317399B (zh) | 一种甲状腺类器官培养基、甲状腺类器官培养及传代方法 | |
| CN101591637A (zh) | 新型牛卵母细胞体外成熟培养液 | |
| CN114525239A (zh) | 一种无血清细胞培养基及其制备方法 | |
| CN110684721B (zh) | 一种利用培养基进行胚胎质量的检测方法 | |
| CN111471644B (zh) | Chok1悬浮驯化无血清培养基及悬浮驯化方法 | |
| CN113106052A (zh) | 一种提升短双歧杆菌增殖效率的肽及其应用 | |
| CN111218442A (zh) | 具有遗传稳定性的米曲霉的诱变处理方法 | |
| CN108588160B (zh) | 一种提高抗体多聚体比例的细胞培养工艺 | |
| CN116836933B (zh) | 肝胆癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 | |
| CN113755423B (zh) | 胚胎癌性细胞在制备3d细胞培养基质中的应用、制备方法及3d细胞培养基质 | |
| CN110592040A (zh) | 一种用于生产upd糖基转移酶的重组枯草芽孢杆菌的工艺 | |
| CN113943712B (zh) | 一种电融合缓冲液、其制备方法及电融合方法 | |
| CN104651297A (zh) | 用于人胚胎肾细胞高密度大规模悬浮培养的培养基及其制备方法和用途 | |
| CN109503709B (zh) | 一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白α亚基的方法 | |
| CN112126626B (zh) | 一种角膜缘干细胞培养基及培养方法 | |
| CN116814551B (zh) | 胰腺癌类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |