CN111471644B - Chok1悬浮驯化无血清培养基及悬浮驯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种CHOK1悬浮驯化无血清培养基及悬浮驯化方法，无血清培养基中包含EmCD CHO Medium、Glutamine、HT及抗结团剂，基于该培养基可实现15天完成基本驯化，细胞活率大于95％。自接种至含EmCD CHO Medium的驯化培养基进行摇床悬浮培养至完成基本驯化，再至稳定传代，整个过程仅需24天。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CHOK1悬浮驯化无血清培养基及悬浮驯化方法。
背景技术
CHOK1(也称CHO-K1)为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHOK1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。该细胞可从各大保藏中心采购或者个人实验室保存的细胞获得。CHOK1细胞系通常是在含10％的优质胎牛血清(fetal bovine serum，简称FBS)的培养基中进行贴壁培养，培养成本较高，且由于血清中很容易携带外源病毒、补体等物质而导致细胞的培养效果不稳定或者引入安全风险。所以，在现在生物医药开发中，通常将贴壁血清培养的CHOK1细胞悬浮驯化至无血清悬浮高密度生长。但由于目前没有效果突出的驯化培养基及驯化方法，导致贴壁悬浮驯化过程漫长(5-10个月)且存在较大的失败概率，即使驯化成功，也容易出现细胞易结团、活率低、倍增时间长等缺点，中国专利文献(申请号为201811054625.0)中公开的CHO-K1悬浮驯化培养基及驯化方法，虽然悬浮培养时间缩短，但过程较复杂。
发明内容
为了克服上述现有技术中的问题，本发明提供一种驯化时间短，细胞活率高的CHOK1细胞悬浮驯化方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种CHOK1悬浮驯化无血清培养基，包括如下重量组分：
一种CHOK1细胞悬浮驯化方法，包括如下步骤：
步骤1，贴壁转悬浮：使用F-12K+10％FBS培养细胞，细胞汇合度达到70-80％，加胰酶消化，缓慢吹打混匀，按0.5×106cells/ml接种至含10％FBS的F-12K培养基中摇瓶传代，2天后细胞密度达到1×106cells/ml，水平离心5±1min收集细胞；
步骤2，悬浮驯化恢复：将步骤1中摇床摇床传代后收集的细胞以0.5×106cells/ml密度接种到如上所述的CHOK1悬浮驯化无血清培养基，继续摇床悬浮培养，5天后细胞增殖为1.6×106cells/ml，细胞活率达到88.88％，直接取悬液以0.5×106cells/ml传代，4天后细胞活率为92.6％，接下来取悬液以0.8×106cells/ml密度传代，连续传3代后，完成CHOK1细胞基本驯化；接下来以0.3×106cells/ml传代，每3天传代一次，连续传3代，细胞倍增时间稳定在23～24h，细胞悬浮驯化完成。
进一步的，步骤1中摇瓶传代培养条件为于37±0.5℃，5±0.5％CO2，125±5rpm摇床中悬浮培养。
进一步的，步骤1中细胞收集方法为取细胞密度达到1×106cells/ml的细胞悬液，水平离心5±1min后，收集细胞沉淀。
与现有技术相比，本发明取得的技术效果为：15天完成基本驯化，细胞活率大于95％。自接种至含EmCD CHO Medium的驯化培养基进行摇床悬浮培养至完成基本驯化，再至稳定传代(即CHOK1细胞悬浮驯化完成)，整个过程仅需24天。
附图说明
图1为本发明实施例1中CHOK1细胞在含EmCD CHO Medium的CHOK1悬浮驯化无血清培养基中的驯化数据。
图2为本发明实施例1中经悬浮驯化至稳定传代后CHOK1悬浮驯化无血清培养基中的细胞状态图。
具体实施方式
本发明下面结合实施例作进一步详述：
实施例1：
贴壁转悬浮：使用F-12K+10％FBS培养细胞，在显微镜下观察细胞汇合度达到70-80％，加胰酶消化，缓慢吹打混匀，用细胞计数仪计数后以0.5×106cells/ml接种至30ml含10％FBS的F-12K培养基中摇瓶传代，培养条件37℃，5％CO2，125rpm摇床中悬浮培养，2天后细胞密度达到1.18×106cells/ml，200g水平离心5min收集细胞，以0.5×106cells/ml密度接种到CHOK1悬浮驯化无血清培养基，继续摇床悬浮培养，培养条件为37℃，5％CO2，125rpm；
悬浮驯化恢复：细胞在CHOK1悬浮驯化无血清培养基中悬浮驯化培养，起初细胞活率下降，细胞增殖缓慢，5天后细胞增殖为1.6×106cells/ml，细胞活率达到88.88％(图1)，直接取悬液以0.5×106cells/ml传代，4天后活细胞密度为1.6×106cells/ml，细胞活率为92.6％，接下来取悬液以0.8×106cells/ml传代，2天后活细胞密度为2.3×106cells/ml，细胞活率为86.91％，接下来取悬液以0.8×106cells/ml传代，3天后活细胞密度为4.64×106cells/ml，细胞活率为94.39％，接下来取悬液以1.0×106cells/ml传代，1天后活细胞密度为2.08×106cells/ml，细胞活率为97.77％，(图1)，细胞活率大于95％，以此认为CHOK1细胞驯化基本完成，用时15天。接下来以0.3×106cells/ml传代，每3天传代一次，连续传3代，细胞倍增时间稳定在23～24h，细胞悬浮驯化成功。自接种至含EmCD CHO Medium的驯化培养基进行摇床悬浮培养至完成基本驯化，再至稳定传代(即CHOK1细胞悬浮驯化完成)，整个过程仅需24天(图1)。
见图2，为本实施例中经悬浮驯化至稳定传代后CHOK1悬浮驯化无血清培养基中的细胞状态图，从图中可以看出细胞圆润，无结团现象。
上述CHOK1悬浮驯化无血清培养基可以为如下组分：
本实施例中试验试剂及细胞株生产厂家及型号见表1：
表1实验试剂及细胞株
| 品名 | 品牌 | 货号 | 级别 |
| CHOK1 | ATCC | CCL-61 | NA |
| EmCD CHO Medium | Eminence | L10400 | 细胞培养级 |
| FBS | Gibco | 10099 | NA |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | 细胞培养级 |
| F-12k | Gibco | 21127-022 | 细胞培养级 |
| HT | Gibco | 110670-030 | 细胞培养级 |
| 抗结团剂 | Gibco | 0010057DG | 细胞培养级 |
本实施例中主要仪器设备的生产厂家及型号见表2：
表2仪器设备
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种CHOK1细胞悬浮驯化方法，其特征在于：
包括如下步骤：
步骤1，贴壁转悬浮：使用F-12K+10%FBS培养细胞，细胞汇合度达到70-80%，加胰酶消化，缓慢吹打混匀，按0.5×106cells/ml接种至含10%FBS的F-12K培养基中摇瓶传代，2天后细胞密度达到1×106cells/ml，水平离心5±1min收集细胞；
步骤2，悬浮驯化恢复：将步骤1中摇瓶传代后收集的细胞以0.5×106cells/ml密度接种到CHOK1悬浮驯化无血清培养基，继续摇床悬浮培养，5天后细胞增殖为1.6×106cells/ml，细胞活率达到88.88%，直接取悬液以0.5×106cells/ml传代，4天后细胞活率为92.6%，接下来取悬液以0.8×106cells/ml密度传代，连续传3代后，完成CHOK1细胞基本驯化；接下来以0.3×106cells/ml传代，每3天传代一次，连续传3代，细胞倍增时间稳定在23～24h，细胞悬浮驯化完成，细胞活率大于95%；
所述CHOK1悬浮驯化无血清培养基包括如下重量组分：
EmCD CHO Medium：98% 97-98份；
Glutamine：6mM 0.8-1.2份；
HT-1X 0.8-1.2份；
抗结团剂：0.5% 0.4-0.6份；
步骤1中摇瓶传代培养条件为于37±0.5℃，5±0.5%CO2，125±5rpm摇床中悬浮培养；步骤1中细胞收集方法为取细胞密度达到1×106cells/ml的细胞悬液，水平离心5±1min后，收集细胞沉淀。
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