CN112608900B - 通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法及结直肠癌细胞系 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法，利用类器官载体和驯化培养基对结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞进行多次驯化培养，在驯化培养过程中渐次降低类器官载体的使用量，使得结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞逐渐适应二维培养环境，并最终被驯化成永生化的结直肠癌细胞系。本公开创造性提出了一种全新的通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法，该方法能够显著缩短结直肠癌细胞系的建系时间、提升结直肠癌细胞系的建系成功率；此外，该方法的培养条件简单，容易实现，能够在体外低成本、高效率地从原代细胞建立人源结直肠癌细胞系。
Description
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法以及利用该方法培养得到的结直肠癌细胞系。
背景技术
肿瘤细胞系是体外研究肿瘤细胞生物学特性、癌变机理以及肿瘤治疗方案的良好模型。利用原发患者的肿瘤细胞培养得到的每个肿瘤细胞系都至少部分地保留有原发患者个体的致病信息，因此，建立的肿瘤细胞系越多，越有利于相关肿瘤的研究。与其它用于肿瘤研究的生物模型相比，肿瘤细胞系虽然丢失了很多与肿瘤组织相关的病理特征和遗传细节，但是其优势在于培养简单、培养条件易达成且易控、培养成本低并且生长迅速。
传统构建肿瘤细胞系的方法包括转入肿瘤驱动基因法和自发永生化法。转入肿瘤驱动基因法通过将诸如端粒酶基因、人乳头瘤病毒基因和SV40大T抗原基因等肿瘤驱动基因转入细胞中，使得细胞增殖形成永生化的细胞系，该方法引入了外源驱动基因，无法真正模拟肿瘤自身的发生机制。自发永生化法是对原代肿瘤细胞进行培养，待肿瘤细胞生长后，通过传代培养除去快速生长的成纤维细胞，这种方法存在操作程序复杂、培养时间长、去除成纤维细胞污染困难等缺陷，而且肿瘤细胞在培养过程中发生自发永生化的概率极低，肿瘤细胞系的建系困难。
发明内容
本公开的目的是提供一种通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法以及利用该方法驯化培养得到的结直肠癌细胞系，该方法的培养条件简单，能够在体外低成本、高效率地培养得到能够快速生长且遗传稳定性强的结直肠癌细胞系。
为了实现上述目的，本公开提供一种通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法，该方法包括：
将结直肠癌类器官团进行消化，得到结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞；其中，所述结直肠癌类器官团中含有类器官载体和结直肠癌单细胞，所述结直肠癌类器官团的直径不小于0.1mm，细胞团活力不小于80％；
依次利用掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基对所述结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞进行驯化培养，得到贴壁生长率大于60％且细胞活力不小于80％的结直肠癌细胞系，其中，在所述驯化培养过程中，渐次减少所述类器官载体在所述驯化培养基中的掺入比例至0体积％。
可选地，在所述掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基中，所述类器官载体的掺入比例至少包括第一掺入比例和第二掺入比例，所述第二掺入比例小于所述第一掺入比例，在所述驯化培养过程中，当与掺有第一掺入比例类器官载体的驯化培养基对应的第一驯化培养产物形成的单细胞悬液密度不小于3×105个/ml且细胞活力不小于80％时，利用掺有第二掺入比例类器官载体的驯化培养基对所述第一驯化培养产物继续进行驯化培养。
可选地，所述第一掺入比例不大于所述驯化培养基的5体积％。
可选地，在所述掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基中，所述类器官载体的掺入比例包括所述驯化培养基的5体积％、1体积％和0体积％。
可选地，针对掺有任一掺入比例类器官载体的驯化培养基，所述驯化培养包括：
利用掺有当前掺入比例类器官载体的驯化培养基对结直肠癌单细胞进行重悬，得到细胞浓度为3～4×104个/ml的结直肠癌单细胞悬液；
按照300～400μL/孔的接入量，将所述结直肠癌单细胞悬液接入细胞培养板的培养孔中，放置0.5～2h后，每孔加入100～200μL驯化培养基进行驯化培养，培养3～5天后得到驯化培养产物；
对所述驯化培养产物进行计数和细胞活力检测；
重复上述步骤，直至所述驯化培养产物形成的单细胞悬液密度不小于3×105个/ml且细胞活力不小于80％。
可选地，所述类器官载体包括Matrigel基质胶、3D多肽水性胶和固体支架中的至少一种。
可选地，所述驯化培养基包括2～10体积％的胎牛血清、0.1～0.5mg/ml的CaCl2、30～60ng/mL的表皮细胞生长因子、300～500nM的A83-01、5～15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1～5mM的Glutamax、5～15μM的人胃泌素、5～15mM的烟酰胺、0.5～2体积％的N2细胞培养添加剂、50～150U/mL的青霉素、50～150U/mL的链霉素以及余量的DMEM/F12培养基。
可选地，所述方法还包括利用结直肠癌离体组织培养所述结直肠癌类器官团的操作；
其中，所述利用结直肠癌离体组织培养所述结直肠癌类器官团，包括：
将所述结直肠癌离体组织进行酶解，得到结直肠癌组织单细胞；
将所述结直肠癌组织单细胞与类器官载体和结直肠癌类器官培养基混合，得到细胞浓度为3～4×104个/ml的结直肠癌组织细胞悬液，其中，所述类器官载体的用量为所述结直肠癌类器官培养基的5～10体积％；
按照300～400μL/孔的接入量，将所述结直肠癌组织细胞悬液接入细胞培养板的培养孔中，放置0.5～2h后，每孔加入100～200μL所述结直肠癌类器官培养基进行培养，在培养过程中，每隔3～5天添加150～200μL所述结直肠癌类器官培养基并继续培养，直至得到直径不小于0.1mm，细胞团活力不小于80％的所述结直肠癌类器官团。
可选地，所述结直肠癌类器官培养基包括5～15体积％的R-Spondin、20～30ng/mL的Recombinant Human Noggin、5～15μM的SB202190、5～15μM的Y-27632、30～60ng/mL的表皮细胞生长因子、300～500nM的A83-01、5～15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1～5mM的Glutamax、5～15μM的人胃泌素、5～15mM的烟酰胺、0.5～2体积％的N2、50～150U/mL的青霉素、50～150U/mL的链霉素以及余量的DMEM/F12培养基。
本公开还提供本公开实施例中任意一项所述的方法通过类器官驯化培养得到的结直肠癌细胞系。
通过上述技术方案，本公开利用类器官载体和驯化培养基对结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞进行多次驯化培养，在驯化培养过程中渐次降低驯化培养基中的类器官载体的使用量，使得结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞逐渐适应二维平面培养环境，并最终被驯化成永生化的结直肠癌细胞系。由于结直肠癌类器官是由来自患者的结直肠癌单细胞增殖形成的，其中的结直肠癌单细胞与患者体内的结直肠癌单细胞具有相似的生物学特性和基因突变特性，因此，本公开利用结直肠癌类器官驯化培养得到的结直肠癌细胞系也具有类似的生物学特性和基因突变特性，能够较好地模拟结直肠癌的发病机制，具有较强的遗传稳定性；结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞的增殖速率和遗传稳定性均存在差异，通过筛选和驯化可得到在增殖速率和遗传稳定性上存在优势的结直肠癌单细胞，并使其逐渐适应二维培养环境，得到便于开展实验操作的稳定永生化细胞系。
本公开创造性提出了一种全新的通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法，该方法能够显著缩短结直肠癌细胞系的建系时间、提升结直肠癌细胞系的建系成功率；此外，该方法的培养条件简单，容易实现，能够在体外低成本、高效率地从原代细胞建立人源结直肠癌细胞系。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供一种通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法，该方法包括：将结直肠癌类器官团进行消化，得到结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞；其中，所述结直肠癌类器官团中含有类器官载体和结直肠癌单细胞，所述结直肠癌类器官团的直径不小于0.1mm，细胞团活力不小于80％；依次利用掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基对所述结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞进行驯化培养，得到贴壁生长率大于60％且细胞活力不小于80％的结直肠癌细胞系，其中，在所述驯化培养过程中，渐次减少所述类器官载体在所述驯化培养基中的掺入比例至0体积％。
在本公开实施例中，利用掺有类器官载体的驯化培养基对结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞进行多次驯化培养，在驯化培养过程中渐次降低驯化培养基中的类器官载体的掺入比例，使得结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞逐渐适应二维培养环境，并最终被驯化成永生化的结直肠癌细胞系。由于结直肠癌类器官是由来自患者的结直肠癌单细胞增殖形成的，其中的结直肠癌单细胞与患者体内的结直肠癌单细胞具有相似的生物学特性和基因突变特性，因此，本公开利用结直肠癌类器官驯化培养得到的结直肠癌细胞系也具有类似的生物学特性和基因突变特性，能够较好地模拟结直肠癌的发病机制，具有较强的遗传稳定性；结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞的增殖速率和遗传稳定性均存在差异，通过筛选和驯化可得到在增殖速率和遗传稳定性上存在优势的结直肠癌单细胞，并使其逐渐适应二维培养环境，得到便于开展实验操作的稳定永生化细胞系。
本公开创造性提出了一种全新的通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法，该方法能够显著缩短结直肠癌细胞系的建系时间、提升结直肠癌细胞系的建系成功率；此外，该方法的培养条件简单，容易实现，能够在体外低成本、高效率地从原代细胞建立人源结直肠癌细胞系。
根据本公开，在所述掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基中，所述类器官载体的掺入比例至少包括第一掺入比例和第二掺入比例，所述第二掺入比例小于所述第一掺入比例，在所述驯化培养过程中，当与掺有第一掺入比例类器官载体的驯化培养基对应的第一驯化培养产物形成的单细胞悬液密度不小于3×105个/ml且细胞活力不小于80％时，利用掺有第二掺入比例类器官载体的驯化培养基对所述第一驯化培养产物继续进行驯化培养。
根据本公开，类器官载体在驯化培养基中的掺入比例可以在一定的范围内变化，例如，类器官载体在驯化培养基中的所述第一掺入比例不大于所述驯化培养基的5体积％。
在本公开实施例中，具体的，类器官载体在驯化培养基中的掺入比例可以随着驯化培养的进行而呈梯度递减，在本公开的一个优选实施方式中，在所述掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基中，所述类器官载体的掺入比例可以包括所述驯化培养基的5体积％、1体积％和0体积％。
根据本公开，针对掺有任一掺入比例类器官载体的驯化培养基，所述驯化培养可以包括：利用掺有当前掺入比例类器官载体的驯化培养基对结直肠癌单细胞进行重悬，得到细胞浓度为3～4×104个/ml的结直肠癌单细胞悬液；按照300～400μL/孔的接入量，将所述结直肠癌单细胞悬液接入细胞培养板的培养孔中，放置0.5～2h后，每孔加入100～200μL驯化培养基进行驯化培养，培养3～5天后得到驯化培养产物；对所述驯化培养产物进行计数和细胞活力检测；重复上述步骤，直至所述驯化培养产物形成的单细胞悬液密度不小于3×105个/ml且细胞活力不小于80％。
在本公开实施例中，具体地，所述细胞培养板例如可以是24孔细胞培养板。
根据本公开，能够用于肿瘤类器官培养的类器官载体均可用于本公开，例如，所述类器官载体可以包括Matrigel基质胶、3D多肽水性胶和固体支架中的至少一种。
根据本公开，所述驯化培养基可以在一定的范围内选择，例如，所述驯化培养基可以包括2～10体积％的胎牛血清、0.1～0.5mg/ml的CaCl2、30～60ng/mL的表皮细胞生长因子、300～500nM的A83-01、5～15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1～5mM的Glutamax、5～15μM的人胃泌素、5～15mM的烟酰胺、0.5～2体积％的N2细胞培养添加剂、50～150U/mL的青霉素、50～150U/mL的链霉素以及余量的DMEM/F12培养基。
其中，本公开实施例提供的驯化培养基中含有胎牛血清和CaCl2，能够有效促进结直肠癌单细胞的贴壁生长。
根据本公开，所述方法还可以包括利用结直肠癌离体组织培养所述结直肠癌类器官团的操作；其中，所述利用结直肠癌离体组织培养所述结直肠癌类器官团，包括：将所述结直肠癌离体组织进行酶解，得到结直肠癌组织单细胞；将所述结直肠癌组织单细胞与类器官载体和结直肠癌类器官培养基混合，得到细胞浓度为3～4×104个/ml的结直肠癌组织细胞悬液，其中，所述类器官载体的用量为所述结直肠癌类器官培养基的5～10体积％；按照300～400μL/孔的接入量，将所述结直肠癌组织细胞悬液接入细胞培养板的培养孔中，放置0.5～2h后，每孔加入100～200μL所述结直肠癌类器官培养基进行培养，在培养过程中，每隔3～5天添加150～200μL所述结直肠癌类器官培养基并继续培养，直至得到直径不小于0.1mm，细胞团活力不小于80％的所述结直肠癌类器官团。
在本公开实施例中，具体地，所述细胞培养板例如可以是24孔细胞培养板。
在本公开实施例中，具体地，结直肠癌离体组织可以是取自结直肠癌患者手术治疗后或者穿刺活检后留下的废弃结直肠癌组织。结直肠癌组织单细胞中除了含有肿瘤细胞外，还含有其它间质细胞，因此，利用结直肠癌组织单细胞培养得到的结直肠癌类器官团能够较好地保留结直肠癌组织的异质性、组织特性及基因突变信息。
根据本公开，所述结直肠癌类器官培养基可以在一定的范围选择，例如，所述结直肠癌类器官培养基可以包括5～15体积％的R-Spondin、20～30ng/mL的Recombinant HumanNoggin、5～15μM的SB202190、5～15μM的Y-27632、30～60ng/mL的表皮细胞生长因子、300～500nM的A83-01、5～15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1～5mM的Glutamax、5～15μM的人胃泌素、5～15mM的烟酰胺、0.5～2体积％的N2、50～150U/mL的青霉素、50～150U/mL的链霉素以及余量的DMEM/F12培养基。
本公开的第二方面提供本公开第一方面实施例中任意一项所述的方法通过类器官驯化培养得到的结直肠癌细胞系。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得，此外，在本公开实施例中未注明具体实验温度时，实验温度均为室温(20-25℃)。
本公开实施例中所采用的结直肠癌类器官培养基包括：10体积％的R-Spondin、25ng/mL的Recombinant Human Noggin、10μM的SB202190、10μM的Y-27632、50ng/mL的表皮细胞生长因子、500nM的A83-01、10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、5mM的Glutamax、10μM的人胃泌素、10mM的烟酰胺、1体积％的N2、100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素以及余量的DMEM/F12培养基。
本公开实施例中所采用的驯化培养基包括：5体积％的胎牛血清、0.2mg/ml的CaCl2、50ng/mL的表皮细胞生长因子、500nM的A83-01、10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、5mM的Glutamax、10μM的人胃泌素、10mM的烟酰胺、1体积％的N2细胞培养添加剂、100U/mL的青霉素、100U/mL的链霉素以及余量的DMEM/F12培养基。
本公开实施例中涉及试剂的来源如下：DMEM/F12培养基(货号12634010)、胎牛血清(FBS，货号10100147)、Ⅰ型胶原酶(货号C21900)均购自Gibco，R-Spondin(货号P00147)购自Solarbio，Recombinant Human Noggin(货号CYT-475)、人胃泌素(货号HOR-252)购自ProSpec，表皮细胞生长因子(EGF，货号4022-500)购自BioVision，A83-01(货号SF7917-10mM)购自碧云天，Y-27632(货号146986-50-7)购自MCE，SB202190(货号152121-30-7)购自AbMole，penicillin G-链霉素(货号15070063)、Glutamax(货号35050061)和N2(货号17502-048)购自Invitrogen，烟酰胺(Nicotinamide，货号98-92-0)购自AccuStandard，Matrigel基质胶(货号356234)购自BD。
实施例1
本实施例用于说明利用结直肠癌离体组织培养结直肠癌类器官团的方法。
1、结直肠癌离体组织的获取
将结直肠癌患者手术治疗或者穿刺活检后的废弃结直肠癌离体组织置于含1体积％Hibernate A、1体积％GlutaMax、1体积％PenStrep和1体积％Amphotericin B的H+GPSA培养基中，于48h内低温运输至操作室。
2、结直肠癌离体组织的酶解
将结直肠癌离体组织取出置于无菌环境中，采用新鲜配制的含1体积％HibernateA、1体积％GlutaMax、1体积％PenStrep和1体积％Amphotericin B的H+GPSA培养基清洗3遍，剔除组织中的血块和坏死组织等杂质。
使用无菌器械将清洗后的结直肠癌离体组织剪切成1mm2大小的组织块，并加入10mL含1.5mg/mLⅠ型胶原酶、1体积％Penicillin-Streptomycin Solution和10体积％FBS的DMEM培养基，然后在摇床上于80rpm转速、37℃条件下酶解1-2h，得到结直肠癌组织单细胞。
3、结直肠癌类器官团的培养
取上述结直肠癌组织单细胞，通过70μm细胞筛过滤后取滤液，于300g条件下离心5min，细胞沉淀利用PBS清洗2遍，然后加入掺有10体积％Matrigel基质胶的结直肠癌类器官培养基，得到细胞浓度为3×104个/mL的细胞悬液。
将上述得到的细胞悬液按照300μL/孔的接种量接种至24孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养0.5-2h，然后沿板壁缓慢向每孔中补充200μL结直肠癌类器官培养基，继续培养，培养期间每隔3-5d向培养孔中添加200μL结直肠癌类器官培养基，并检查培养系统中的细胞团直径及细胞活力，直至得到直径不小于0.1mm、细胞活力不小于80％的结直肠癌类器官团。
实施例2
本实施例用于说明利用结直肠癌类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法。
(1)取实施例1培养得到的结直肠癌类器官团，于300g条件下离心5min，得到的细胞沉淀利用Accutase进行消化，待细胞沉淀中的细胞团分散成单细胞悬液后，于300g条件下离心5min，获得结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞沉淀；
(2)利用掺有5体积％Matrigel基质胶的驯化培养基重悬结直肠癌单细胞沉淀，得到细胞浓度为3×104个/mL的结直肠癌单细胞悬液；
(3)将上述得到的结直肠癌单细胞悬液按照300μL/孔的接种量接种至24孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养0.5-2h，然后沿板壁缓慢向每孔中补充200μL驯化培养基，进行驯化培养5天后对驯化培养产物进行细胞计数和细胞活力检测；
(4)每5天对步骤(3)的驯化培养产物进行消化，并进行一次步骤(2)和(3)的操作，直至驯化培养5天后，驯化培养产物形成的单细胞悬液密度不小于3×105个/ml且细胞活力不小于80％，得到第一驯化培养产物；
(5)对第一驯化培养产物进行消化，并利用掺有1体积％Matrigel基质胶的驯化培养基，对消化得到的结直肠癌单细胞沉淀进行步骤(2)～(4)的操作，直至得到单细胞悬液密度不小于3×105个/ml且细胞活力不小于80％的第二驯化培养产物；
(6)对第二驯化培养产物进行消化，并利用纯净的驯化培养基对消化得到的结直肠癌单细胞沉淀进行步骤(2)～(4)的操作，直至得到细胞密度不小于3×105个/ml、贴壁生长率大于60％且细胞活力不小于80％的结直肠癌细胞系。
本实施例培养得到的结直肠癌细胞系可以1×106个/ml的密度冻存于-80℃低温的冰箱中，次日转至液氮罐中保存。
对比例1
按照实施例2的方法，利用实施例1培养得到的结直肠癌类器官进行驯化培养结直肠癌细胞系，不同的是：本对比例所使用的驯化培养基中不含有胎牛血清和CaCl2。
对比例2
按照实施例2的方法驯化培养结直肠癌细胞系，不同的是：本对比例中使用结直肠癌组织单细胞代替结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞。
对比例3
按照如下方法驯化培养结直肠癌细胞系：
(1)取实施例1培养得到的结直肠癌类器官团，于300g条件下离心5min，得到的细胞沉淀利用Accutase进行消化，待细胞沉淀中的细胞团分散成单细胞悬液后，于300g条件下离心5min，获得结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞沉淀；
(2)利用纯净的驯化培养基重悬结直肠癌单细胞沉淀，得到细胞浓度为3×104个/mL的结直肠癌单细胞悬液；
(3)将上述得到的结直肠癌单细胞悬液按照300μL/孔的接种量接种至24孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养0.5-2h，然后沿板壁缓慢向每孔中补充200μL驯化培养基，进行驯化培养5天后对驯化培养产物进行细胞计数和细胞活力检测；
(4)每5天对步骤(3)的驯化培养产物进行消化，并进行一次步骤(2)和(3)的操作，直至驯化培养5天后，驯化培养产物的细胞密度不小于3×105个/ml，贴壁生长率大于60％且细胞活力不小于80％，得到结直肠癌细胞系。
对比例4
使用常规结直肠癌细胞培养法对酶解得到的结直肠癌组织单细胞进行培养，待结直肠癌细胞成长后，通过反复贴壁法去除培养系统中的成纤维细胞，得到结直肠癌细胞系。
测试例
选取10例经临床确诊为结直肠癌的患者，在其各自手术治疗或穿刺活检结束后，获取结直肠癌离体组织，然后按照实施例1的方法，分别培养与各患者对应的结直肠癌类器官。
1、结直肠癌细胞系驯化成功率及培养周期验证
针对每个患者，分别利用与之对应的结直肠癌类器官或结直肠癌离体组织单细胞，按照实施例2以及对比例1～4的方法驯化培养结直肠癌细胞系，以在二维条件下可连续传代三次，每次传代细胞活率在80％以上，作为成功驯化培养结直肠癌细胞系的标准，并统计每种培养方法培养成功的例数，以及每个成功例所花费的时间。
培养结束后，计算每种方法培养结直肠癌细胞系的成功率，以及每种方法成功培养结直肠癌细胞系所需的平均培养时间，结果见表1。其中：
成功率＝成功例数/10×100％
平均培养时间＝所有成功例所需总时间/成功例数×100％
表1
由表1可以看出，本公开的方法能够显著缩短驯化培养结直肠癌细胞系的时间，并显著提升驯化培养的成功率。
2、结直肠癌相关标志物表达检测
从实施例2和对比例3的培养结果中，分别选取1例对应同一患者且培养成功的结直肠癌细胞系，利用实时荧光定量PCR法分别检测结直肠癌类器官、结直肠癌组织单细胞及结直肠癌细胞系中，结直肠癌标志物CEA和肠上皮细胞标志物CK20的表达，同时以β-actin作为内标基因，以结直肠癌组织单细胞作为参照因子，通过下列公式计算CEA mRNA和CK20mRNA的相对表达量：
目标基因相对表达量＝2-ΔΔCT，
其中，ΔΔCT表示目标基因的CT值与内标基因的CT值之差。检测结果如表2和表3所示。
表2
表3
由表2和表3可以看出，相较于常规培养方法，本公开的方法能够在驯化培养过程中，维持结直肠癌细胞中细胞标志物的稳定表达。
3、结直肠癌细胞系遗传稳定性验证
选取1例存在KRAS G12D突变的结直肠癌离体组织，按照实施例1的方法培养结直肠癌类器官后，分别按照实施例2和对比例3的方法驯化结直肠癌细胞系，在驯化过程中及驯化成功后，收集不同代次的传代细胞，采用DNA提取试剂盒提取各代次细胞的总DNA，利用二代测序方法检测各代次细胞中KRAS G12D突变的维持情况，检测结果见表4。
表4
由表4可以看出，在结直肠癌细胞系的驯化过程中，本公开的方法能够维持结直肠癌细胞中的基因突变情况基本不变，培养得到的结直肠癌细胞系具有较强的遗传稳定性。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (5)
1.一种通过类器官驯化培养结直肠癌细胞系的方法，其特征在于，该方法包括：
将结直肠癌类器官团进行消化，得到结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞；其中，所述结直肠癌类器官团中含有类器官载体和结直肠癌单细胞，所述结直肠癌类器官团的直径不小于0.1mm，细胞团活力不小于80％；
依次利用掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基对所述结直肠癌类器官中的结直肠癌单细胞进行驯化培养，得到贴壁生长率大于60％且细胞活力不小于80％的结直肠癌细胞系，其中，在所述驯化培养过程中，渐次减少所述类器官载体在所述驯化培养基中的掺入比例至0体积％；
所述类器官载体包括Matrigel基质胶；
所述掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基中，所述类器官载体的掺入比例至少包括第一掺入比例和第二掺入比例，所述第二掺入比例小于所述第一掺入比例，在所述驯化培养过程中，当与掺有第一掺入比例类器官载体的驯化培养基对应的第一驯化培养产物形成的单细胞悬液密度不小于3×105个/ml且细胞活力不小于80％时，利用掺有第二掺入比例类器官载体的驯化培养基对所述第一驯化培养产物继续进行驯化培养；
在所述掺有不同掺入比例类器官载体的驯化培养基中，所述类器官载体的掺入比例包括所述驯化培养基的5体积％、1体积％和0体积％；
所述驯化培养基包括2～10体积％的胎牛血清、0.1～0.5mg/ml的CaCl2、30～60ng/mL的表皮细胞生长因子、300～500nM的A83-01、5～15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1～5mM的Glutamax、5～15μM的人胃泌素、5～15mM的烟酰胺、0.5～2体积％的N2细胞培养添加剂、50～150U/mL的青霉素、50～150U/mL的链霉素以及余量的DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1中任意一项所述的方法，其特征在于，针对掺有任一掺入比例类器官载体的驯化培养基，所述驯化培养包括：
利用掺有当前掺入比例类器官载体的驯化培养基对结直肠癌单细胞进行重悬，得到细胞浓度为3～4×104个/ml的结直肠癌单细胞悬液；
按照300～400μL/孔的接入量，将所述结直肠癌单细胞悬液接入细胞培养板的培养孔中，放置0.5～2h后，每孔加入100～200μL驯化培养基进行驯化培养，培养3～5天后得到驯化培养产物；
对所述驯化培养产物进行计数和细胞活力检测；
重复上述步骤，直至所述驯化培养产物形成的单细胞悬液密度不小于3×105个/ml且细胞活力不小于80％。
3.根据权利要求1～2中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括利用结直肠癌离体组织培养所述结直肠癌类器官团的操作；
其中，所述利用结直肠癌离体组织培养所述结直肠癌类器官团，包括：
将所述结直肠癌离体组织进行酶解，得到结直肠癌组织单细胞；
将所述结直肠癌组织单细胞与类器官载体和结直肠癌类器官培养基混合，得到细胞浓度为3～4×104个/ml的结直肠癌组织细胞悬液，其中，所述类器官载体的用量为所述结直肠癌类器官培养基的5～10体积％；
按照300～400μL/孔的接入量，将所述结直肠癌组织细胞悬液接入细胞培养板的培养孔中，放置0.5～2h后，每孔加入100～200μL所述结直肠癌类器官培养基进行培养，在培养过程中，每隔3～5天添加150～200μL所述结直肠癌类器官培养基并继续培养，直至得到直径不小于0.1mm，细胞团活力不小于80％的所述结直肠癌类器官团。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述结直肠癌类器官培养基包括5～15体积％的R-Spondin、20～30ng/mL的Recombinant Human Noggin、5～15μM的SB202190、5～15μM的Y-27632、30～60ng/mL的表皮细胞生长因子、300～500nM的A83-01、5～15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1～5mM的Glutamax、5～15μM的人胃泌素、5～15mM的烟酰胺、0.5～2体积％的N2、50～150U/mL的青霉素、50～150U/mL的链霉素以及余量的DMEM/F12培养基。
5.权利要求1～4中任意一项所述的方法通过类器官驯化培养得到的结直肠癌细胞系。
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| 类器官模型在结直肠肿瘤研究中的作用与进展;孙家亮等;《中国普通外科杂志》;20171031(第10期);全文 * |
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