CN104060329A - 一种染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于医疗领域的染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法，其主要特征是取因诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为疑难染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，以转基因技术导入借T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA所构建的SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，使重组子与细胞DNA整合，以G418筛选整合有重组子的永生化细胞，作传代扩增后冻存活细胞，然后提取数例各自制备的不同病例的细胞，按质控所需比例混合，使原先每例细胞只有一种染色体异常转变为含有不同比例的、易于误诊的多种染色体异常，增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将废弃的多余细胞转化为有效的质控材料。

Description

一种染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法，主要应用于医学领域的细胞遗传学诊断实验室作染色体核型分析的技术考核、室内质控和室间质评。

背景技术

染色体是细胞核中的遗传物质，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为决定男女性别的性染色体。染色体上载有遗传信息的基因，其中DNA占90％以上，RNA含量随细胞周期及生长情况而有所变化，一般占1％～10％。

染色体结构异常、数目异常及嵌合体，临床上表现为染色体病，属于常见的出生缺陷，如先天愚型、原发性闭经、两性畸型等。染色体结构异常包括染色体易位、缺失、倒位、环状等；染色体数目异常指多1条或数条染色体、多1条或数条染色体片段；嵌合体核型是指同一病例个体并存数种染色体核型。目前分析染色体核型的常规方法是用被检的组织或细胞，经过常规细胞培养、0.02μl/ml秋水仙素终止细胞生长、分离中期细胞、0.075mol/L KCl低渗、甲醇-冰乙酸(3∶1)固定等染色体制片程序后，最后用胰酶消化、染色显带，从而作出染色体结构和数目是否异常的判断。目前通过染色体分析来诊断染色体病已被各级产前诊断中心或医院检验科普遍地开展，并广泛应用于产前、胚胎植入前染色体病的诊断以及作为异常妊娠、血液病、肿瘤等临床诊断或发病机理研究的重要指标。

作为所开展的各类实验诊断项目，均应有相应规范的质量控制措施。实验室的质量控制是确保实验诊断结果准确性的前提，已成为政府行为。为了加强实验室的质量控制，我国于1982年成立了卫生部临床检验中心，下设室间质评办公室，专职从事于实验诊断项目的质量控制。卫生部[卫医发]1997第31号文件、《临床实验室管理办法》、《医院评审标准实施细则》以及大量的文献均指出，实验室必须有规范的质量控制标准，所开展的实验诊断项目必须参加卫生部临床检验中心组织的室间质评。自1982年以来，在临床检验学科先后开展了临床实验的室内质控、室间质评。包括了对各检验项目的实验前、中、后以及仪器、试剂和实验人员的质量控制。质量控制已渗透到临检、生化、微生物、免疫、基因、细胞形态学诊断等各个实验项目。实验室的质量控制已成为开展实验诊断项目的准入制度、成为医院等级评审的重要标准。

产前诊断的质量控制已引起日益重视。随着我国对生殖健康和出生缺陷工作的是益重视，近年来各省市均建立了产前诊断中心，开展了21三体综合症、18三体综合征、神经管畸形等重大出生缺陷的产前筛查和产前诊断，其中与重大出生缺陷相关的胎儿羊水染色体异常的诊断已成为目前产前诊断的主要项目。由于产前诊断是新开展的学科，大多专业人员的技术经验较为缺乏，特别是对于疑难、罕见病例、国内外首报病例以及如猫叫综合症等染色体异常不明显但临床后果严重的病例，误诊现象时有发生。我国国家主席令(1994年10月27日第三十三号)公布的“产前诊断法规标准”以及国务院办公厅[国发办(1999)15号]转发卫生部“关于做好提高出生人口素质工作意见”的通知中均强调指出，“各省、市产前诊断中心必须加强产前诊断的质量控制、严把质量关”。

产前诊断的质量控制是许多学者致力于研究的重要课题。国外有较多的文献报道了产前诊断质量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等对产前细胞遗传学诊断的细胞培养及制片过程的影响因素作了深入的研究，提出了室内质量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像学产前诊断的质量控制方法；Pihlk等认为必须加强产前筛查的质量控制；在2002～2004年期间，Bastien P等对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间质量评价，认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重要的作用。

研制可行的质控物，是开展产前细胞遗传学诊断室间质评和室内质控的关键环节。虽然我国行政主管部门以及学术界十分重视产前诊断的质量控制(包括室内质控和室间质评)，但因没有可行的质控物，所以无法开展实质性的质量控制。也就是说，要开展产前细胞遗传学诊断的室间质评，首先必须要有质控物。这是质量管理人员以及本专业的技术人员长期以来想方设法解决但始终没有解决的难题。

我们经长期的研究和探索，设想如果能成功研发疑难、罕见、易于误诊的染色体异常永生化质控细胞，就能解决长期困扰的产前细胞遗传学诊断无质控物的问题。由于产前细胞遗传学诊断主要是诊断病理细胞的染色体数目和结构是否异常，所以，如果能从不同环节收集到各种疑难、罕见、易于误诊的染色体异常病例细胞，通过制成可以无限地人为复制、扩增的永生细胞，再将这种细胞由主管部门分发到各级产前诊断实验室，同步于产前诊断的染色体病诊断，使几乎每位产前诊断专业人员能共享这些疑难、罕见、易于误诊的染色体异常病例细胞的诊断，并用于考核各实验人员对疑难、罕见、易于误诊染色体病的能力，以此开展室间质评，对增加专业人员对疑难病例的诊断经验，从而减少误诊的发生、提高产前诊断的准确性，具有重要的意义。

国外文献报道，猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态。

发明内容

为了解决在产前细胞遗传学诊断中无可行质控物的问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种用于医学领域的细胞遗传学诊断实验室作染色体核型分析质量控制的染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法。

本发明的目的是这样实现的：取因临床诊治需要而作常规染色体病实验诊断后并已确诊为疑难、罕见染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，以转基因技术导入借T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA所构建的SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，使重组子与细胞DNA整合，以G418筛选整合有重组子的永生化细胞，作传代扩增后冻存活细胞，然后提取数例各自制备的不同病例的细胞，按质控所需比例混合，使原先每例细胞只有一种染色体异常转变为含有不同比例的、易于误诊的多种染色体异常，集中保存，备作染色体核型分析的质量控制之用。

本发明取自因临床诊治需要而作常规染色体病实验诊断后并已确诊为疑难、罕见染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，以转基因技术导入SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，使重组子与细胞DNA整合而成为可永久生存、无限扩增的永生化细胞后，再作反复传代、大量扩增细胞、收获贴壁细胞，制备原液质控细胞，然后将各自制备的不同例次的原液质控细胞按质控需要比例混合，使之成为应用质控细胞，所制备的质控细胞不但数量足够的多，具有取之不尽、反复复制使用的特点，而且使原先一般每份原液质控细胞中只有一种染色体异常核型转变为具有在同一份应用质控细胞中同时含有多种不同比例的、不同类型的易误诊染色体异常核型的特征，从而在本来就易误诊的基础上更加增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将废弃的多余细胞转化为可用于染色体核型分析的技术考核、室内质控及室间质评，对及时发现质量问题、制定改进预案、提高诊断水平具有意想不到的效果。

附图说明

图1是本发明制备的一种染色体核型为46，XY，15P+的疑难病例羊水组织细胞(代表性细胞)的传代至第55代、贴壁生长至第7天的质控细胞。

如图1，细胞传代至第55代、培养至第7天时，呈圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达95％以上。

具体实施方式

1、原始细胞：所用的原始细胞来源于因临床诊治需要而作常规染色体病实验诊断后并已确诊为疑难、罕见染色体异常、发出诊断报告后的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，细胞类型为胎儿羊水、绒毛组织等细胞。

2、SV40大T抗原DNA(SV40LTag DNA)的提取：①SV40DNA酶切：从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉或SV40质粒，溶解于适量的H₂O或TE缓冲液中，加2uL10×酶切缓冲液和18uL H₂O，加限制性内切酶BamH I(1-5U/ugDNA)，37℃温育1h，75℃加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol/LEDTA)终止反应以备电泳。②SV40DNA电泳：取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10％琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的10×加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的DNA分子量标准对照物，接通电极，使DNA向阳极移动，在1-10V/cm凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。③从琼脂糖中分离约2600bp SV40大T抗原DNA：在300-360nm长波紫外光源下(使用长波紫外光源以防止DNA损伤)将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶，改变电场方向继续通电1分钟，从透析袋中吸出缓冲液于1-5mlEppcndorf管中，加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次，上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc、2倍体积预冷无水乙醇，于20℃过夜，12000g，4℃下离心10分钟，得DNA沉淀，弃上清，加入70％乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50μl TE溶解DNA。

3、SV40大T抗原DNA与pcDNA3.1基因载体的连接：取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl2×连接缓冲液、1μl10mmol/L ATP、T4DNA连接酶(20～500粘性末端单位)或大肠杆菌DNA连接酶、pcDNA3.1空载体混合，15℃温育24h，构建成SV40T/pcDNA3.1重组子。

4、SV40T/pcDNA3.1重组子的扩增、分离与鉴定：①大肠杆菌感受态的制备：其基本方法是用冰预冷的CaCl₂或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl₂制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下：从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约2～3h(旋转摇床200～300r/min)，每隔20～30min测量OD600值≈0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl₂重悬每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用，用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl，DNA≤50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min，每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。②重组子的筛选、扩增与提取：用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37℃培养至饱和状态(OD₆₀₀≈4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r/min)，于4℃，6000g离心10min，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20000g离心10min，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5～10min，于室温，1500g离心10min，加入2mL70％7醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃长期保存)。③重组子的鉴定：上述从感受态大肠杆菌中提取的DNA(含重组子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性内切酶BamH I进行酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约2600bp及5600bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。

5、SV40T/pcDNA3.1重组子导入染色体异常组织细胞及其阳性克隆的筛选与扩增：①染色体异常组织细胞的收集与培养：以无菌操作提取在作其他实验或其他检查后多余、废弃的染色体异常组织细胞，以细胞终浓度约为1×10⁵/mL备用，取上述呈单个分散的细胞或经处理后成为单个分散的细胞接种于含5～10nmol/L胰岛素、20％胎牛血清的RPMI1640液中或接种于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，置于37℃，体积分数5％CO2培养箱内，细胞贴壁培养约3～4天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10％、贴壁细胞的汇合率达75％～85％、处于刚进入对数生长期时，即考虑收集培养细胞，先吸干净培养瓶中的培养液，加入1-2ml0.01％的胶原酶II液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)，静置2-10min(显微镜下动态监测)，吸去胶原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培养液，用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液，转入离心管离心沉淀，去上清液，细胞沉淀用上述培养液清洗2次后，制成悬液，用作重组子导入。②SV40T/pcDNA3.1的导入：方法1：在上法分离所得细胞中，选用脂质体转染法，将上述2×10⁵个细胞接种于35mm培养皿中，在37℃CO₂培养箱培养24～36h，使细胞生成单层、细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10％小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55％～65％、处于将进入或刚进入对数生长期时，即转染重组子SV40T/pcDNA3.1，在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将SV40T/pcDNA3.1溶于100μl无血清培养液中；管B，将20μl Lipofectamine溶于80μl无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下置45min，吸去细胞培养液后，用无血清培养液洗涤细胞2次，在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml无血清培养液，轻轻混匀，再滴加至细胞培养皿内，然后加入1ml无血清培养液，在CO₂培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液继续培养16h，弃去培养液，更换浓度为400mg·L^-1的G418培养液继续培养，8～10天后选择单个细胞集落进行亚克隆，扩大培养后再加大G418浓度到800mg·L^-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的克隆进行传代扩增，另外染色体异常组织细胞与SV40或EB病毒共同培养后，感染了病毒DNA并发生整合的染色体异常组织细胞进行传代扩增。方法2：吸取1/10-1/40细胞悬液，配制成终浓度为1×10⁵/mL细胞悬液，接种于培养瓶内，选择低糖DMEM或RPMI1640培养基，其中含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰岛素，培养48h后，使细胞生成单层、细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10％小园形细胞、贴壁细胞汇合率达55％～65％、处于将进入或刚进入对数生长期时，采用脂质体转染的方法，将重组子SV40T/pcDNA3.1转染至染色体异常组织细胞内，或将SV40直接感染至染色体异常组织细胞内，用含700mg/L G418的培养液筛选1wk，将G418浓度改为300mg/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养；方法3：将上述的细胞悬液以低糖DMEM或RPMI1640培养液配成5×10⁸/L终浓度的细胞悬液接种于24孔培养板，当细胞长至90％融合率时，将0.2μg含量的重组子SV40T/pcDNA3.1，用DMEM或RPMI1640调整体积为50μl，室温放置5min；脂质体6μl，用DMEM调整体积为50μl，室温放置5min，两种试剂轻轻混匀，室温放置20min，同时将24孔板内的细胞用DMEM洗3次后，再在每孔加培养液100μl，加脂质体-SV40T/pcDNA3.1混合液，轻轻在细胞表面铺均匀，于37℃CO2培养箱放置6h，随后用0.01g/L胶原酶将细胞消化，转入6孔板内，加入完全培养基，次日加G418抗生素使终浓度为500mg/L，直到有单克隆细胞长出。约10d后有单克隆细胞集落长出，挑出置于24孔板内继续培养，以300mg/L的G418维持并稳定传代扩增培养。

6、染色体异常组织细胞系的传代、扩增：收集上述经脂质体转染法导入SV40大T抗原基因的阳性单克隆细胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培养基配成约1×10⁵/mL的细胞悬液，接种于数瓶20～50cm²培养瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰岛素的低糖DMEM或RPMI1640培养基，至细胞贴壁生长、汇合率达80～85％、处于对数生长期的前期时收集细胞，再按上述步骤传代培养，如此反复传代接种、培养，记录代数并观察细胞生长特点。如图1所示，细胞传代至第55代、培养至第7天时，呈圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达95％以上；在第56代后继续传代，细胞生长力减弱，生长变慢，贴壁稀疏。

7、原液质控细胞的制备：(1)原液活质控细胞株的制备：取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞，经过消化、终止和离心分离(1200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5～1ml重悬细胞，细胞密度为5×10⁵个/ml，加入冻存管，经4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜，入-196℃液氮冻存。(2)原液固定质控细胞的制备：(1)终止培养、收获细胞前2～3h，加入浓度为20μg/ml的秋水仙素，每5ml培养基中用7号针头，加3～4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后，再放入恒温箱内，继续培养2～3h，以积累较多停止在中期的分裂象。(2)收获细胞：由恒温箱取出培养瓶，以0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞5分钟，每次收获1瓶，用吸管充分吹打培养瓶瓶壁，使细胞全部脱离瓶壁，然后将细胞液移至锥形离心管内，1500转/min，离心10min，去上清液。(3)低渗处理：加入37℃预温的0.075mol/LKCl8ml，反复吹打(约一百次)后，置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。(4)预固定：加入新鲜制备固定液1ml(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)，轻轻混匀。(5)离心：2000转/min，离心10min，吸弃上清液。(6)固定：沿离心管壁慢慢加入固定液8ml，轻轻混匀，固定10min。(7)离心：同上，吸去上清液。(8)再固定：加固定液8ml，混匀，固定10min。(9)离心：同上，吸去上清液。(10)制备原液质控细胞悬液：根据细胞量多少，加入适量固定液，充分混匀，制成浓度为10⁵/ml的细胞悬液，保存备用。

8、应用质控细胞的制备：(1)应用活质控细胞株的制备：提取数例在不同时间制备的、冻存于-196℃液氮中的不同病例的疑难染色体异常核型的原液活质控细胞株，按1例原液活质控细胞株分别与另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1～50例原液活质控细胞株以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶1～20的体积比例或细胞数比例进行混合，混合后的应用活质控细胞株含有不同类型和比例的染色体异常细胞，但作为同一例次的质控细胞。(2)应用固定质控细胞的制备：提取数例在不同时间制备的、不同病例的疑难染色体异常核型的原液固定质控细胞，按1例原液固定质控细胞分别与另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1～50例原液固定质控细胞以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶1～20的体积比例或细胞数比例进行混合，混合后的应用固定质控细胞含有不同类型和比例的染色体异常细胞，但作为同一例次的质控细胞。经如此传代扩增细胞、收获细胞、混合不同病例的染色体异常细胞所制备的质控细胞，不但数量足够的多，而且使原先一般每份原液质控细胞中只有一种染色体异常核型转变为具有在同一份应用质控细胞中同时含有多种不同比例的、不同类型的易误诊染色体异常核型的特征，从而在本来就易误诊的基础上更加增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将废弃的多余细胞转化为可用于染色体核型分析的技术考核、室内质控及室间质评，在室内质量控制、室间质量评价、提高诊断水平的应用中具有意想不到的效果。

9、染色体核型分析永生化质控细胞库的建立：将上述在不同时间制备的固定质控细胞(原液固定质控细胞和应用固定质控细胞)以(甲醇∶冰醋酸＝3∶1的)固定液配成浓度为10⁵/ml的细胞悬液，经分装、加满固定液至管口和封口后，按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号，集中保存于-20℃，备作染色体核型分析的质量控制之用。同时将相应的各种染色体异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以及标本来源地址的大写英文字母编号录入计算机管理系统，使用时从计算机中抽取待用质控细胞编号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞作质量评价；活质控细胞株(原液活质控细胞株和应用活质控细胞株)以冻存液(5％二甲亚砜、95％胎牛血清)配成浓度为10⁵/ml的细胞悬液，经每管1ml分装后，按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号，集中保存于-196℃液氮中，备作染色体核型分析的质量控制之用。同时将相应的各种染色体异常核型的标准描述、按照年、月、日的制备日期以及标本来源地址的大写英文字母编号录入计算机管理系统，使用时从计算机中抽取待用质控细胞编号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞作质量评价

10、室间质评中的应用：从计算机中抽取待用质控细胞编号，然后从质控细胞库中找出相应的质控细胞，发送到各实验室或相关专业技术人员，在收到质控细胞后，各室按常规作染色体制片、烤片干燥、胰蛋白酶消化分带、G显带、常规染色体核型分析、按时反馈染色体核型诊断结果，组织者或考核者评价各受试对象所汇总的诊断结果的准确性、误诊情况，分析原因、定期讨论、改正存在问题，以增加技术人员的见识和经验，提高诊断质量。也可取质控细胞送交被考核者，以书面、口头、当场考核被考核者诊断技术水平。

11、室间质评调查举例：我们按本发明的应用思路，使用1个组合单位的染色体异常质控细胞并建立了质控细胞库，每个组合单位含有6种染色体异常核型，其核型分别为46，X，t(Y；5)(q12；q21)、46，XY，15P⁺、46，XX，t(13；18)(q12；q21)、46，X，r(Xp)、46，X，t(Y；Y)和46，XX，t(9；20)(P13；p13)，均属较为疑难、罕见的异常核型，并作了细胞遗传学诊断的室间质评试验。我们向35个实验室各发放了1个组合单位的染色体异常质控细胞，共计35个组合单位，各受试者作染色体核型分析后所回报的结果，相对应于46，X，t(Y；5)(q12；q21)、46，XY，15P⁺、46，XX，t(13；18)(q12；q21)、46，X，r(Xp)、46，X，t(Y；Y)和46，XX，t(9；20)(P13；p13)的6种染色体异常核型排序的结果，其完全正确率分别为82.2％、92.0％、84.5％、80.9％、86.1％、74.2％，完全错误率分别为10.7％、8.0％、11.5％、19.2％、13.8％、18.5％，总的完全正确率、部分正确率、部分错误率和完全错误率分别为83.2％、0.6％、2.5％和13.7％。表明各受试者的细胞遗传学诊断结果存在较高的误诊率。这可能是因为：1、以染色体异常核型作室间质评，对特别疑难、罕见的异常核型难以作进一步的鉴定；2、被选择的室间质评对象偏向于基层单位；3、染色体核型分析是近年才被普遍开展起来的，技术人员缺乏对疑难罕见染色体病例的实验诊断经验；4、初次参与室间质评，缺乏相关的室间质评经验；5、没有按统一标准规范化地描述染色体核型的结构；6、本室间质评方法所确定的质评标准偏高。我们所发现的室间质评中的误诊情况是，其中有5例46，X，t(Y；5)(q12；q21)被误诊为46，X，t(5；15)，前者除了生育功能可能会有影响外，临床体症一般正常，但后者表现为原发性闭经的性异常；有7例46，XY，15P⁺被误诊为46，XY，t(15；21)，前者一般为临床体症正常的多态性核型，但后者为先天愚型的核型；有2例46，XX，t(13；18)(q12；q21)被误诊断为46，XX，-18，+mar、1例被误诊为46，XX，del(18)[1]，前者在生育子代时易发生流产，其本人临床体症一般正常，但后者表现为染色体缺失的症状，一般不会活到出生；有3例46，X，r(Xp)被误诊为46，X，+mar、2例被误诊为45，X、被误诊为46，XY和46，X，Xp各1例，特别是被误诊为46，XY后，就要采取外科手术切除“隐睾”以防恶变；有4例46，X，t(Y；Y)被误诊为46，X，-Y+11、3例被误诊为46，X，-Y，+del(11)，原核型多了1个Y染色体，误诊后却没有Y染色体了；46，XX，t(9；20)被误诊为46，XX，-20，+17、和46，XX，del(9)各1例，原核型属染色体易位，在生育子代时易发生自然流产，本人临床体症一般正常，但误诊后的46，XX为正常核型、另外2种核型一般都不会成活到出生。我们对于在室间质评中发现的误诊问题，作了分析讨讨和逐一纠正。

由此可见，在疑难、罕见核型的细胞遗传学诊断中所存在的问题及其误诊所产生的较为严重的后果。说明使用本发明制作的染色体异常核型室间质控细胞并用于开展细胞遗传学诊断室间质评的必要性和可行性，对发现问题、及时纠正、提高诊断水平具有重要的意义。

Claims (5)

1.一种用于医疗领域的染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法，其主要特征是取因诊治需要而作染色体病诊断后并已确诊为疑难染色体异常的剩余的呈贴壁生长的原代或传代活细胞，以转基因技术导入借T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA所构建的SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组质粒，使重组子与细胞DNA整合，以G418筛选整合有重组子的永生化细胞，作传代扩增后冻存活细胞，然后提取数例各自制备的不同病例的细胞，按质控所需比例混合，经如此传代扩增细胞、收获细胞、混合不同病例的染色体异常细胞所制备的质控细胞，不但数量足够的多，而且使原先一般每份质控细胞中只有一种染色体异常核型转变为具有在同一份质控细胞中同时含有多种不同比例的、不同类型的易误诊染色体异常核型的特征，从而在本来就易误诊的基础上更加增加了鉴别诊断、染色体嵌合体诊断的难度和复杂性，标本易得且将废弃的多余细胞转化为实用、有效的染色体核型分析技术考核、室内质控及室间质评的质控细胞。

2.根据权利要求1所述的一种用于医疗领域的染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法，其特征是SV40LTag DNA与疑难染色体异常组织细胞DNA整合、制成了传代至第55代、培养至第7天仍能呈圆形、梭形、铺满瓶底、细胞生长汇合率达95％以上质控细胞株。

3.根据权利要求1、2所述的一种用于医疗领域的染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法，其特征是应用活质控细胞株由1例原液活质控细胞株分别与另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1～50例原液活质控细胞株以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶1～20的体积比例或细胞数比例混合构成。

4.根据权利要求1、3所述的一种用于医疗领域的染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法，其特征是应用固定质控细胞由1例原液固定质控细胞分别与另外1例、2例、3例、4例、5例、6例、7例、8例、9例、10例、11例、12例、14例、15例、16例、17例、18例、19例、20例、1～50例原液固定质控细胞以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶1～20的体积比例或细胞数比例混合构成。

5.根据权利要求1所述的一种用于医疗领域的染色体核型分析永生化质控细胞库及其构建方法，其特征是质控细胞库包含：以固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1的)为媒介的、-20℃保存的、按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号的、疑难染色体异常永生化细胞浓度为10⁵/ml的、由原液固定质控细胞和应用固定质控细胞构成的固定质控细胞；以冻存液(5％二甲亚砜、95％胎牛血清)为媒介的、-196℃液氮保存的、按年、月、日的制备日期及标本来源地址的大写英文字母编号的、疑难染色体异常永生化细胞浓度为10⁵/ml的、由原液活质控细胞株和应用活质控细胞系构成的活质控细胞株。