CN101942413A

CN101942413A - 出生缺陷细胞库及其构建方法

Info

Publication number: CN101942413A
Application number: CN2009101522578A
Authority: CN
Inventors: 翁炳焕
Original assignee: 翁炳焕
Current assignee: Hangzhou co Genesis Laboratory Laboratory Limited
Priority date: 2009-07-07
Filing date: 2009-07-07
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2029-07-07
Also published as: CN101942413B

Abstract

本发明涉及用于医学领域的出生缺陷细胞库及其构建方法，其主要特征是以BamH I、SV40 DNA、T4 DNA连接酶和基因载体pcDNA3.1构建SV40T/pcDNA3.1重组子，经感受态大肠杆菌扩增、纯化后，以脂质体转染法将重组子导入经0.01％胶原酶II消化的离体悬液状出生缺陷细胞或在含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的培养液中处于将进入或刚进入对数生长期、梭形细胞占90％以上、汇合率达55％～65％的贴壁生长状出生缺陷细胞，并与之DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞和EB病毒转染的细胞作传代、扩增培养，构建出生缺陷细胞系并冻存于液氮中，以出生缺陷(Birth Defect)及其病种的第一个英文字母命名并标明相关资料信息，用以集中保存出生缺陷的活细胞资源，解决其科研材料贫乏和无专一出生缺陷细胞库的问题。

Description

出生缺陷细胞库及其构建方法

本发明涉及出生缺陷细胞库及其构建方法，主要用于医学研究领域中出生缺陷资源的集中、永久保存并为出生缺陷病的研究提供科研材料。

出生缺陷是指胎儿在出生前即已存在的结构或功能异常。占出生婴儿4-6％，达1万多种，其中最常见的有先天性心脏病、先天愚型(唐氏综合症、21三体综合症)，无脑儿、唇腭裂、聋哑等。

中华人民共和国[国家主席令(1994)33号]令“成立卫生部及各省市产前诊断中心、自1995年6月1日起施行全国性出生缺陷产前筛查和产前诊断”。此后，还确定每年9月12日为“中国预防出生缺陷日”，出生缺陷的干预及其诊断方法学的研究被列入“重大专项或优先主题”等各类研究课题，国家投入了大量的人力物力，但至今尚未取得突破性的进展，其诊断方法几乎还停留在当初的水平。如最主要的产前诊断方法还在沿用上世纪70年代就已开展的、工作效率很低的、可导致0.5-1％孕妇流产的有创性羊水穿刺染色体分析技术；其中危害性最大的出生缺陷(21-三体综合症)的产前筛查结果假阴性率为0.05％(群体总体发病率为0.1-0.15％)，即漏诊率高达35％；而其假阳性率高达99％，而且还只能预防约65％的21-三体综合征患儿的出生。所以，目前产前筛查和诊断的技术滞后，远不能满足产前诊断的要求。

究其原因，主要是目前还没有一种良好的方法能集中收集并永久保存出生缺陷标本，造成其研究材料贫乏。患有严重出生缺陷的胚胎或胎儿，往往是在子宫内死亡后由孕妇自行丢弃或经医生处理后丢弃。

在其他的医学研究领域，为了确保更加充足的科研资源，近年来，已有越来越多的国内外学者和学术机构致力于各类细胞库的建立，以此保存了大量的正常或具有病理特征的细胞资源。在美国、英国和日本等都已建有各种类型的细胞库。如美国已建成“标准细胞库(ATCC)”、“人类遗传突变细胞库(HGMR)”、“细胞衰老细胞库(CAR)”等；英国已建成“胚胎干细胞库”等；日本已建成“乳牙干细胞研究库”、“诱导多功能干细胞”等；我国已建成了“中国重要医学生物资源保藏库”、“中国不同民族永生细胞库”、“中国人类遗传资源平台”、“人髁突软骨细胞库”、“人类胎盘干细胞库”、“人角质形成细胞库”、“脐带间充质干细胞库”、“精神分裂症永生细胞库”、“T细胞库”、“脐血干细胞库”、“造血干细胞库”、“人胚腺垂体细胞库”、“肿瘤细胞库”、“瘢痕疙瘩家系外周血永生细胞库”、“长寿老人永生细胞库”等。

在这些不同的细胞库中各自保存了不同的细胞。如“人肺腺癌细胞、人T淋巴细胞白血病细胞、野生型人C-KIT受体细胞株(B类)、人胶质母细胞瘤细胞、人黑色素瘤、人肺腺癌细胞、人肺腺癌紫杉醇耐药株、耐药细胞株、人横纹癌细胞、人黑色素瘤、人前列腺癌细胞、人卵巢癌细胞、人肾癌细胞、人APP-PS1双基因转染细胞株(HEK293)、人绒毛膜肿瘤细胞、CNE1-1mp′1人转基因鼻咽癌细胞系、CNE1-1mp-NF-KB人转基因鼻咽癌细胞系、CW-2人结肠腺癌细胞、Daudi人B淋巴细胞瘤、DMF7双位点HC-KIT受体细胞株(B类)、F2-2人5-8转基因鼻咽癌细胞系、C33，ASP2人胚胎肾细胞转化细胞、FGC人前列腺癌细胞、FG牙鲆细胞、F56人腺癌细胞、Gpc-1人前列腺癌细胞、GLC-82人肺腺癌细胞、GT1.1人垂体瘤细胞、GBC-SD人胆囊癌细胞、HK-2C人胚肾上皮细胞、HK-2人肾小管上皮细胞、H9人T淋巴细胞、H292人表皮肺癌细胞、HB人口腔癌细胞、HBE人支气管上皮细胞、BL-100人乳腺细胞、HBZY-1人肾小球髓母细胞系、HLF-02人胚肺二倍体细胞、HUVEC人脐静脉内皮细胞、HaCat人永生化表皮细胞、HuT 78人T细胞白血病细胞、Hurt-78人T细胞淋巴瘤、HaCAT人永生化表皮细胞、JAR人胎盘绒毛癌细胞、Jurket77人T淋巴瘤细胞亚系、LCC9人乳腺癌抗雌激素耐药株、LCC2人乳腺癌Tamoxifen耐药株、10104人淋巴瘤细胞(B类)、7WCY1.0人APP-PSI双基因转染细胞株(CHO)(B类)、7WD10人APP基因转染细胞株(CHO)(B类)、人-PS1(M146L)双基因转染细胞株(CHO)(B类)、7WPS1人APP-PS1双基因转染细胞株(CHO)(B类)、95-C人低转移肺癌细胞、95-D人高转移肺癌细胞、973人肺腺癌细胞、5637人膀胱癌细胞、8910PM卵巢腺癌、T-CEM人T细胞白血病细胞等。

这些在不同的细胞库中保存的不同细胞或细胞系，因各类细胞性质各异，其构建细胞系的方法和条件也各不相同，如有EB病毒诱导法、端粒酶诱导法、乳头瘤病毒诱导法、腺病毒E1A基因诱导法、猿猴肉瘤病毒(SV40)诱导法。但目前绝大多数细胞库中的细胞，都是根据人外周血B淋巴细胞表面具有EB病毒受体的特点，用EB病毒感染人外周血B淋巴细胞使期成为永生化B淋巴细胞细胞系，然后冻存于液氮中而构建成细胞库。这种用EB病毒构建B淋巴细胞系的实验方法和标本采集方法都较为方便，得到了较普遍的应用，但仅局限于对有EB病毒受体的B淋巴细胞建系，对没有EB病毒受体的细胞如T淋巴细胞、白细胞、组织细胞等均不能用EB病毒来建立细胞系或细胞库。如出生缺陷的死胎或活胎的组织细胞和老化脱落于羊水中的胎儿脱落细胞就不能用EB病毒来构建永生化细胞系而保存于细胞库中。

目前，尚未见国内外以EB病毒或猿猴肉瘤病毒(SV40)等构建出生缺陷组织细胞系的文献报道，也尚未见国内外关于构建出生缺陷细胞库并用以集中收集、永久保存出生缺陷组织细胞的文献报道。为了解决上述问题，提出了本发明。

本发明的目的是要提供能集中保存各种出生缺陷资源并能为其研究提供科研材料的出生缺陷细胞库及其构建方法。

本发明的目的是这样实现的：以BamH I、SV40DNA、T4DNA连接酶和基因载体pcDNA3.1构建SV40T/pcDNA3.1重组子，经感受态大肠杆菌扩增、纯化，以脂质体转染法导入经0.01％胶原酶II消化的离体悬液细胞或在含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的培养液中处于将进入或刚进入对数生长期、梭形细胞占90％以上、汇合率达55％～65％的贴壁生长细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞和EB病毒转染的细胞，作传代、扩大培养，构建出生缺陷细胞系并冻存于液氮中，以出生缺陷(Birth Defect)及其病种的第一个英文字母命名并标明相关资料信息，构建出生缺陷细胞系和细胞库。

本发明以提纯的SV40大T抗原基因经基因载体pcDNA3.1导入出生缺陷细胞而构建细胞系，其中出生缺陷组织细胞用0.01％胶原酶II消化而不用常规的胰蛋白酶消化，以仅使引起细胞粘连的胶原被消化或使细胞悬浮，减少了细胞壁的蛋白质被消化而伤及细胞，使细胞培养的成功率由一般的约85％提高到95％以上；选用了含20mL/L胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的特定培养基，使细胞不会生长过快而影响SV40大T抗原基因的整合，也不会因缺少营养或细胞生长刺激因子而使细胞在未达到要求的汇合率、未进入对数生长期前就过早死亡，或对数生长期缩短；制备的细胞系在-196℃液氮中冻存1个月后复苏培养，均能生长出贴壁细胞；在作细胞系染色体鉴定时，秋水仙素的用量及作用时间是常规的5～10倍，使染色体分裂相增加，足以计数和分析。由此建成的出生缺陷细胞系及其细胞库，集中保存了出生缺陷的活细胞资源，为各类出生缺陷的研究提供科研材料，为加速出生缺陷诊断方法的研究、改进和创新奠定基础，并解决目前国内外出生缺陷科研材料贫乏和无专一出生缺陷细胞库的问题。

下面详细说明实现本发明的实施方法：

1、SV40大T抗原DNA的提取：①SV40DNA酶切：从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉或SV40质粒，溶解于适量的H₂O或TE缓冲液中，加2uL10×酶切缓冲液和18uL H₂O，加限制性内切酶BamH I(1-5U/ugDNA)，37℃温育1h，75℃加热15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol/L EDTA)终止反应以备电泳。②SV40DNA电泳：取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10％琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的10×加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的DNA分子量标准对照物，接通电极，使DNA向阳极移动，在1-10V/cm凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。③从琼脂糖中分离约2600 bp SV40大T抗原DNA：在300-360nm长波紫外光源下(使用长波紫外光源以防止DNA损伤)将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中，向透析袋内加入2ml电泳缓冲液，使之浸没凝胶，并排空汽泡，将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行)，加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7mm)，接通电源，150伏电洗，在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶，改变电场方向继续通电1分钟，从透析袋中吸出缓冲液于1-5ml Eppendorf管中，加入1.5倍体积正丁醇，混匀抽提去EB，在台式离心机上最高速2分钟，吸去上层正丁醇溶液，如此重复二次，自下层言DNA的溶液中加入等体积酚氯仿(2个)抽提2次，上清转入另一Eppendorf管中加入1/10倍体积3M NaAc、2倍体积预冷无水乙醇，于20℃过夜，12000g，4℃下离心10分钟，得DNA沉淀，弃上清，加入70％乙醇洗涤2次后弃干乙醇，加入50μl TE溶解DNA。此外，还可用低熔点琼脂糖凝胶法、DNA滤膜插片法等将目的DNA片段从凝胶中分离、纯化出来。

2、SV40大T抗原DNA与pcDNA3.1基因载体的连接：取9μl上述DNA成份(0.1-5μg)、10μl 2×连接缓冲液、1μl 10mmol/L ATP、T4DNA连接酶(20～500粘性末端单位)或大肠杆菌DNA连接酶、pcDNA3.1空载体混合，15℃温育24h，构建成SV40T/pcDNA3.1重组子。

3、SV40T/pcDNA3.1重组子的扩增、分离与鉴定：①大肠杆菌感受态的制备：其基本方法是用冰预冷的CaCl₂或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化，用CaCl₂制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌，本法适用于大多数大肠杆菌菌株，操作过程简述如下：从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52)，或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养约2～3h(旋转摇床200～300r/min)，每隔20～30min测量OD600值≈0.4，在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min，于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl₂重悬每份沉淀，放于冰上，于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min，以回收细胞，倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽，每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用，用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl，DNA≤50ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min，将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min，每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。②重组子的筛选、扩增与提取：用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌的LB培养基或丰富培养基(如超级肉汤或TB超级肉汤培养基)中，培养过夜后，再加入到500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中，再于37℃培养至饱和状态(OD₆₀₀≈4，为提高产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度，振摇速度应大于400r/min)，于4℃，6000g离心10min，用4mL GTL溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20mL的高速离心管中(细菌沉淀可以在-20℃或-70℃无限期保存)，加入1mL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重悬沉淀，于室温放置10min，加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10min，于4℃，20 000g离心10min，将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中，如果有可见的飘浮物可用数层纱布过滤，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5～10min，于室温，1500g离心10min，加入2mL 70％乙醇轻轻洗涤沉淀，然后短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4℃长期保存)。③重组子的鉴定：上述从感受态大肠杆菌中提取的DNA(含重组子SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性内切酶BamH I进行酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得大小约2600bp及5600bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。

4、SV40T/pcDNA3.1重组子导入出生缺陷细胞及其阳性克隆的筛选与扩增：①出生缺陷细胞的收集、处理与预培养：以无菌操作提取患有出生缺陷需以医学手段坠胎或自然坠胎的绒毛、胎儿组织细胞以及在出生缺陷病诊断中存余的淋巴细胞、胎儿羊水脱落细胞，其中绒毛或组织细胞用无菌生理盐水漂洗数次，然后剪成接近于单个细胞，或在低温下冰冻后研碎，以含0.01％胶原酶II的37℃生理盐水消化10分钟左右，使成单个细胞，离心去上清液，以无菌生理盐水或细胞培养基悬浮细胞，再离心去上清液，清洗2至3次后，以细胞终浓度约为1×10⁵/mL备用，取上述呈单个分散的细胞或经处理后成为单个分散的细胞接种于含5～10nmol/L胰岛素、20％胎牛血清的RPMI 1640液中或接种于含20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中，置于37℃，体积分数5％CO2培养箱内，细胞贴壁培养约3～4天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10％、贴壁细胞的汇合率达75％～85％、处于刚进入对数生长期时，即考虑收集培养细胞，先吸干净培养瓶中的培养液，加入1-2ml 0.01％的胶原酶II液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)，静置2-10min(显微镜下动态监测)，吸去胶原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI 1640培养液，用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液，转入离心管离心沉淀，去上清液，细胞沉淀用上述培养液清洗2次后，制成悬液，用作重组子导入。②SV40T/pcDNA3.1的导入：方法1：在上述出生缺陷细胞中，选用脂质体转染法，将上述2×10⁵个细胞接种于35mm培养皿中，在37℃CO₂培养箱培养24～36h，使细胞生成单层、细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10％小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55％～65％、处于将进入或刚进入对数生长期时，即考虑转染重组子SV40T/pcDNA3.1，在1.5ml微量离心管中制备下列溶液：管A，将SV40T/pcDNA3.1溶于100μl无血清培养液中；管B，将20μl Lipofectamine溶于80μl无血清培养液中，将管A和管B混匀，室温下置45min，吸去细胞培养液后，用无血清培养液洗涤细胞2次，在Lipofectamine-SV40T/pcDNA3.1混合物中加入1ml无血清培养液，轻轻混匀，再滴加至细胞培养皿内，然后加入1ml无血清培养液，在CO₂培养箱培养10h，吸出转染液，加4ml完全培养液继续培养16h，弃去培养液，更换浓度为400mg·L^-1的G418培养液继续培养，8～10天后选择单个细胞集落进行亚克隆，扩大培养后再加大G418浓度到800mg·L^-1，将能在高浓度的G418环境中稳定生长的克隆进行传代扩增，另外出生缺陷细胞与SV40或EB病毒共同培养后，感染了病毒DNA并发生整合的出生缺陷细胞进行传代扩增。方法2：吸取1/10-1/40细胞悬液，配制成终浓度为1×10⁵/mL细胞悬液，接种于培养瓶内，选择低糖DMEM或RPMI 1640培养基，其中含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰岛素，培养48h后，使细胞生成单层、细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10％小园形细胞、贴壁细胞汇合率达55％～65％、处于将进入或刚进入对数生长期时，采用脂质体转染的方法，将重组子SV40T/pcDNA3.1转染至出生缺陷细胞内，或将SV40直接感染至出生缺陷细胞内，用含700mg/L G418的培养液筛选1wk，将G418浓度改为300mg/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养；方法3：将上述的细胞悬液以低糖DMEM或RPMI 1640培养液配成5×10⁸/L终浓度的细胞悬液接种于24孔培养板，待细胞长至90％左右融合时用于转染，将0.2μg含量的重组子SV40T/pcDNA3.1，用DMEM或RPMI 1640调整体积为50μl，室温放置5min；脂质体6μl，用DMEM调整体积为50μl，室温放置5min，两种试剂轻轻混匀，室温放置20min，同时将24孔板内的细胞用DMEM洗3次，每孔加培养液100μl，加脂质体-SV40T/pcDNA3.1混合液，轻轻在细胞表面铺均匀，于37℃CO2培养箱放置6h，随后用0.01g/L胶原酶将细胞消化，转入6孔板内，加入完全培养基，次日加G418抗生素使终浓度为500mg/L，直到有单克隆细胞长出。约10d后有单克隆细胞集落长出，挑出置于24孔板内继续培养，以300mg/L的G418维持并稳定传代扩增培养。

5、出生缺陷细胞系的传代、扩增：收集上述经脂质体转染法导入SV40大T抗原基因的阳性单克隆细胞集落，以低糖DMEM或RPMI 1640培养基配成约1×10⁵/mL的细胞悬液，接种于数瓶20～50cm²培养瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰岛素的低糖DMEM或RPMI 1640培养基，至细胞贴壁生长、汇合率达80～85％、处于对数生长期的前期时收集细胞，再按上述步骤传代培养，如此反复传代接种、培养，记录代数并观察细胞生长特点。

6、出生缺陷细胞系的鉴定方法：使用SV40建立细胞系后，鉴定的关键问题有：一是要求该细胞具有持续的增殖能力，即T抗原在细胞系中稳定表达；二是要求其形态、基本生理功能等表型保持不变。①形态学观察：在倒置光学显微镜下每日观察细胞是否呈典型的上皮细胞样贴壁生长、细胞增殖速度是否较快、生长特性是否呈永生化细胞系典型的“S”特征或“穹隆”形成；用透射电镜观察细胞的形态与结构，包括细胞核仁是否增大、胞内是否含有丰富的糖原颗粒。②免疫组织化学检测：SV40转染的细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入细胞内。③SV40T抗原的检测：利用RT-PCR检测T抗原在细胞中的表达，其中T抗原的引物：上游引物(A4239)5’-GTT ATG ATT ATAACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5’-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3’；扩增产物长度为268bp，扩增条件为94℃，5min，即：(94℃，1min；55℃，1min，-0.5℃/循环；72℃，1min)×30、(94℃，30S；40℃，30S，72℃，30S)×15，扩增体系为50μl：[Mg²⁺]2mmol/L、dNTPs 200μmol/L、引物浓度0.4μmol/L、Taq 1U、模板5μl；实验组以第19代细胞的cDNA为模板(参照市售cDNA第一链合成试剂盒进行cDNA第一链合成，产物-20℃保存)；阴性对照设两个，分别以无菌水、原代细胞的cDNA做模板，阳性对照以SV40DNA为模板(参照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因为SV40病毒无包膜，不使用SDS破膜，取5μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其余-20℃保存备用)；T抗原mRNA RT-PCR产物测序：取100μl体系的扩增产物，用凝胶回收试剂盒(Takara，日本)回收产物，取2μl DNA溶液稀释100倍，测浓度，余下的DNA及上、下游引物各10μl进行测序。④流式细胞术检测：检测第19代细胞系中合成、分裂的细胞比例，如果其增殖能力明显比未建系的正常细胞增强，说明是SV40大T抗原整合、表达的结果。⑤用限制性内切酶鉴定：用限制性内切酶BamH I进行酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得符合GenBank中SV40T片段的、大小约2600bp的条带。⑥恶性增殖的排除：通过染色体核型分析鉴定，如果染色体核型组成为二倍体“46，XX”或“46，XY”，或与未建系细胞的核型相同，则说明该细胞系没有发生恶性转化(同时可用流式细胞仪分析细胞系中是否出现异常的DNA群体，如果没有，也说明细胞系未出现瘤性特征)。染色体核型分析方法是：在细胞生长密度达85-95％(其中小园形细胞占10％)、处于对数生长期的培养物中按5mL培养液中加入预热的250ug/ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时，吸干培养液，加入预热的2-3mL EDTA-胰酶消化液，37℃作用5分钟，终止消化，洗下贴壁细胞，经离心、低渗、固定、制片、G显带后分析染色体核型。

7、出生缺陷细胞系的保存方法：取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞，经过消化、终止和离心分离(1200r/min，6min)，用含二甲亚砜的冻存液0.5～1ml重悬细胞，细胞密度为5×10⁵个/ml，加入冻存管，经4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜，入-196℃液氮保存。

8、出生缺陷细胞库(Birth Defect Cell Bank，BDCB)：以不同时期、各个地区、各种出生缺陷病种的组织细胞，按本发明构建成出生缺陷细胞系，并集中保存。出生缺陷细胞库(Birth Defect Cell Bank)亦可分别取其第一个英文字母称之为“BDCB”；各种具体的出生缺陷细胞系以出生缺陷(Birth Defect)的第一个英文字母(BD)加具体病种的第一个英文字母称之，并作出编号、标明供细胞者的资料信息。其出生缺陷细胞系能保留原有生物学特性并能永久生存，性能稳定，集中保存了出生缺陷的遗传资源，为各类出生缺陷的研究提供可靠的科研材料，为出生缺陷的干预和加速其诊断方法的研究、改进和创新奠定基础。

Claims

1.一种用于医学领域的出生缺陷细胞库及其构建方法，其主要特征是以BamH I、SV40DNA、T4 DNA连接酶和基因载体pcDNA3.1构建SV40T/pcDNA3.1重组子，经感受态大肠杆菌扩增、纯化，以脂质体转染法导入，SV40感染出生缺陷组织细胞，并与之DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞和EB病毒转染的细胞作传代、扩增培养，构建出生缺陷细胞系并冻存于液氮中，以集中保存出生缺陷活细胞资源，解决其科研材料贫乏和无专一出生缺陷细胞库的问题。

2.根据权利要求1所述的出生缺陷细胞库及其构建方法，其特征是出生缺陷组织细胞是指因患有出生缺陷而以医学手段坠胎或自然坠胎的绒毛、胎儿组织细胞以及在出生缺陷病诊断中存余的淋巴细胞、胎儿羊水脱落细胞。

3.根据权利要求1所述的出生缺陷细胞库及其构建方法，其特征是主要试剂为含有20％胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的RPMI 1640或含有20mL/L胎牛血清、5～10nmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液、EB病毒。

4.根据权利要求1所述的出生缺陷细胞库及其构建方法，其特征是用作传代培养以备脂质体转染法导入重组子的出生缺陷组织细胞，在原代扩增培养中，其收集指标是细胞贴壁培养约3～4天、细胞形态为梭形、小园形细胞不到10％、贴壁细胞的汇合率达75％～85％、处于刚进入对数生长期时收集细胞；用作脂质体转染法导入重组子的传代出生缺陷组织细胞，其时机选择的指标是细胞形态为梭形、尚未见或仅见少于10％小园形细胞、贴壁细胞的汇合率达55％～65％、处于将进入或刚进入对数生长期时的培养细胞；传代细胞系收集的指标是选择细胞贴壁生长的汇合率达80～85％、处于对数生长期的前期时收集细胞；染色体核型分析细胞收集的指标是细胞生长密度达85-95％、小园形细胞占10％以上、处于对数生长期的细胞。

5.根据权利要求1所述的出生缺陷细胞库及其构建方法，其特征是以0.01％胶原酶II消化出生缺陷组织细胞；作染色体核型分析时，每5mL培养液中加入250ug/ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时。

6.根据权利要求1所述的出生缺陷细胞库及其构建方法，其特征是出生缺陷细胞系的冻存程序为4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜，入-196℃液氮保存。