CN108060138A - 一种无创产前基因检测质控标准品及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学领域的一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于采集梭形原代贴壁羊水细胞，增以SV40LT预转染后再行传代扩增，使易被转染也易在传代中死亡的原代羊水细胞经预转染后因整合了SV40LT而转变为易于传代的细胞系，并增以0.25％胰蛋白酶分别消化0.05、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h且在这些不同的消化时间点分别取细胞悬液，再次以SV40LT转染，从而使不同蛋白结构的胞壁都能较好地适应于SV40LT的转染，使羊水细胞株构建的成功率显著提高，用以按质控所需配制8.0％DNA高限、5.0％DNA高值、3.5％DNA中值和2.0％DNA低值以及30％、50％和70％嵌合体的质控标准品。

Description

一种无创产前基因检测质控标准品及其制备
技术领域
本发明涉及一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，主要应用于医学领域中胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测(NIPT)的室内质控和室间质评。
背景技术
染色体非整倍体是指染色体数目非单倍体的整数倍增加或减少，临床上常见的非整倍体包括21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征以及一些性染色体三体型及X单体型。其中21-三体综合征(唐氏综合征或先天愚型)发病率约为1/800，18-三体综合征(爱德华氏综合征)和13-三体综合征(帕陶氏综合征)的发病率分别为1/5000和1/7000，是临床上比较常见的染色体疾病。
染色体非整倍体的无创产前基因检测，是对母体外周血中游离的胎儿DNA，采用高通量测序技术进行染色体非整倍体检测的一项新兴技术，与可致宫腔内感染、胎儿流产、胎死宫内等严重后果的绒毛活检、羊水穿刺、脐血穿刺以及胎儿组织活检的有创产前诊断方法相比，具有流程简便、安全性高(无创)、检测时间早、快速、可靠等特点，目前已广泛应用于国内外的产前诊断领域。
产前诊断的质量控制是确保诊断结果准确性的前提，[卫医发]1997第31号文件、《临床实验室管理办法》、《医院评审标准实施细则》等均指出，实验室必须有规范的质量控制标准。产前诊断的质量控制也是许多学者致力于研究的重要课题。Sikkema-Raddatz B等研究了产前细胞遗传学诊断的细胞培养及制片过程的影响因素，提出了室内质量控制的方法。Fries N和Merz E等提出了影像学产前诊断的质量控制方法。Pihlk等认为必须加强产前筛查的质量控制。Bastien P等在2002～2004年期间对法国23家实验室作了弓形虫产前分子诊断的室间质量评价，认为室间质评对促进实验室间的技术交流、发现问题、提高实验诊断质量起到重要的作用。国内也有较多的产前诊断质控物研究的文献报道，包括以EB病毒转染疑难染色体异常细胞而构建染色体核型分析的质控细胞株、以EB病毒转染或以脂质体介导SV40和/或hTERT基因转染染色体数目异常细胞而构建染色体非整倍体荧光原位杂交检测的质控细胞株，但这些方法由于质控细胞株构建的成功率低下等原因，难以满足胎儿染色体非整倍体无创产前基因检测(NIPT)的室内质控和室间质评的需求。
发明内容
为了解决染色体非整倍体无创产前基因检测无质控细胞株及其质控标准品的问题，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要提供一种无创产前基因检测质控标准品，另一目的是要提供质控标准品的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：SV40DNA质粒模板的高保真PCR扩增产物与pLXSN经双酶切、连接和测序验证，构建SV40LT/pLXSN重组逆转录病毒载体，以磷酸钙沉淀法转染至对数生长期的PT67细胞，经G418药物筛选、阳性克隆扩增以及SV40LT病毒滴度测试，获得产生SV40LT的包装细胞系PT67，收集PT67细胞培养液，预转染生长密度为80％的非整倍体羊水细胞48h，以0.25％胰蛋白酶消化并传代扩增至足够的细胞量，再在每个培养瓶内加0.25％胰蛋白酶3.0mL，分别在消化0.05、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h时各取0.5mL消化细胞悬液，清洗残留的胰酶后，以含SV40LT的PT67细胞培养液转种12孔板，转染48h，以100、200、300、400mg/L G418筛选阳性克隆，扩增和配制成定值质控细胞和/或定值质控DNA。
因各相关实验室开展无创产前基因检测的室内和室间质控需要大量的同种类非整倍体细胞，而这种原代非整倍体羊水细胞很难传代扩增且很难获取，造成了该质控细胞的缺乏而限制了该项质控的开展。所以将产前诊断后剩余的羊水细胞转化为能无限扩增的细胞株是解决质控细胞缺乏的理想方法。因传统的细胞株构建方法成功率低而易使珍贵的异常核型建株失败，我们发现成功率低的原因是因为原代羊水细胞不易被传代且由多种不同性质的细胞组成，某些原代羊水细胞虽易被SV40LT转染而建株但不易传代，通常会在转染前的常规传代扩增中死亡，为此我们在传代扩增前对原代羊水细胞增加了1次SV40LT预转染，再行常规传代扩增，使易被转染也易在传代中死亡的原代羊水细胞经预转染后因整合了SV40LT而转变为易于传代的细胞系，获得这部分细胞的成功建系。我们还发现是否易被SV40LT转染而建株与不同细胞壁的结构有关，所以我们对经预转染后首次传代扩增的羊水细胞，又以0.25％胰蛋白酶分别消化0.05、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，使羊水细胞壁蛋白不同程度地被胰蛋白酶消化，并在这些不同的消化时间点分别取细胞悬液，再次以SV40LT转染，从而使不同蛋白结构的胞壁都能较好地适应于SV40LT的转染。本发明在传统建株的基础上增以被转染细胞常规传代扩增前的SV40LT预转染以及经预转染并传代扩增后的胰蛋白酶梯度消化步骤，从而使转染的成功率从传统方法的10.3％(3/29)提高到37.5％(3/8)，并在此基础上将所构建的细胞株配制成定值质控细胞和定值质控DNA。
具体实施方式
图1是本发明精选的用于制备细胞株的梭形贴壁生长的原代羊水细胞。
图2是本发明的原代羊水细胞在成功转染SV40LT后经G418筛选得到的阳性细胞克隆。
图3是本发明的传至第45代时的阳性克隆细胞株在倒置显微镜下的生长状态。
图4是本发明的细胞株中第18、X、Y染色体的荧光原位杂交检测结果。
如图1，在进行本发明染色体异常羊水细胞建株前，应选择梭形或含有梭形细胞的羊水原代细胞进行建株，以提高建株的成功率，而呈多角扁平的羊水细胞通常不易被SV40LT转染而易致建株失败。
如图2，原代羊水细胞在成功转染SV40LT后，经合适浓度的G418筛选，能获得阳性细胞克隆。因为未被SV40LT转染的细胞在G418筛选中被杀死，而成功转染SV40LT的细胞不被一定浓度的G418杀死而生长，形成了克隆性生长的细胞集团。
如图3，原代羊水细胞不能多次传代培养，通常传数代后就会死亡，只有永生化后的羊水细胞系才能无限传代、永久生存。图3中羊水细胞系传至第45代时仍呈梭形生长，能无限扩增、产业制备质控细胞并满足质量控制的应用需求。
如图4，为某个视野中每个细胞内都含有分别代表18、X、Y染色体的蓝色、绿色和红色的信号点，说明所有的18、X、Y染色体都能被检出。在质控试验中，如果这些信号点没有显示或不完全显示，被检染色体的比例没被准确检出，说明人员、设备、试剂等检测系统有质量问题，需做整改，这是本发明的另一用途。
下面结合图1、图2、图3和图4，对本发明的实施方案作具体的描述。
1、染色体非整倍体原代羊水细胞的采集
采集已确诊为染色体非整倍体并已发出诊断报告的约为60％生长汇合度的贴壁梭形而非多角扁平的羊水细胞，包括21-三体、18-三体、13-三体、48，XXYY、45，X和47，XXY。
2、实验试剂
(1)SV40LT/pLXSN重组载体：以SV40DNA(strain 776)为模板，以高保真PCR扩增SV40LT，与pLXSN经双酶切、连接和测序验证，获得含SV40LT/pLXSN重组逆转录病毒载体。
(2)SV40LT基因：以磷酸钙沉淀法将SV40LT/pLXSN重组载体转染至对数生长期的PT67细胞，72h后，用500mg/L G418进行药物筛选，挑取细胞克隆，扩增培养，获得产生SV40LT的包装细胞系PT67，收集PT67培养液，以胚胎成纤维细胞(NIH3T3)测试SV40LT病毒滴度(6.0×105 CFU/mL以上)。
(3)转染试剂：0.25％胰蛋白酶(Gibco Co.)，胎牛血清(Gibco Co.)，DMEM(GibcoCo.)。
3、染色体非整倍体原代羊水细胞的SV40LT预转染
当细胞生长的汇合度约为80％时，更换含SV40LT基因的PT67细胞培养液，37℃5％C02条件下培养转染24h至48h。
4、羊水细胞经SV40LT预转染后的传代扩增
以0.25％胰蛋白酶消化3-5分钟，以含10％胎牛血清的DMEM培养液中和，离心清洗残留的胰蛋白酶，分瓶扩增培养3-5天。
5、羊水细胞的胰蛋白酶连续梯度消化和SV40LT转染
在每个培养瓶内加0.25％胰蛋白酶3.0mL，分别在消化0.05、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h时各取0.5mL消化细胞悬液，清洗残留的胰酶，以含SV40LT的PT67细胞培养液转种12孔板(转种孔数据细胞量而定)进行培养转染24h至48h。
6、羊水细胞的G418筛选
当细胞生长的汇合度为50％至60％时，分别以50、100、200、300、400或500mg/L的G418进行梯度筛选，隔天更换新的G418进行梯度筛选，筛选培养6天左右发现大量的细胞死亡时，可以增加血清浓度(如将原来10％血清增加到20％)，培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力，筛选约14天后可见有抗性克隆出现，在高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板或培养瓶内培养。
7、G418阳性克隆细胞的传代培养和鉴定
细胞大量扩增后，提取总RNA，采用RT-PCR检测目的基因的表达，或采用western检测目的基因，然后进一步扩增培养，用于制备定值质控标准品(细胞或DNA)，或冻存备用。
8、定值质控标准品(细胞或DNA)的制备
(1)高限质控标准品的制备
高限质控细胞：由制备者分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，准确测定其DNA含量，按DNA含量配制相应的细胞浓度，并行验证和分装，使每个包装的质控细胞能被提取的T21、T18和T13的DNA准确含量分别为8.0％，用户以接收定值质控细胞并自行提取其中的DNA进行质量控制。
高限质控DNA：由制备者分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，继之准确配制DNA含量为8.0％的定值质控DNA，用户直接以定值质控DNA进行质量控制。
(2)高值质控标准品的制备
高值质控细胞：由制备者分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，准确测定其DNA含量，按DNA含量配制相应的细胞浓度，并行验证和分装，使每个包装的质控细胞能被提取的T21、T18和T13的DNA准确含量分别为5.0％，用户以接收定值质控细胞并自行提取其中的DNA进行质量控制。
高值质控DNA：由制备者分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，继之准确配制DNA含量为5.0％的定值质控DNA。用户直接以定值质控DNA进行质量控制。
(3)中值质控标准品的制备
中值质控细胞：由制备者分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，准确测定其DNA含量，按DNA含量配制相应的细胞浓度，并行验证和分装，使每个包装的质控细胞能被提取的T21、T18和T13的DNA准确含量分别为3.5％，用户以接收定值质控细胞并自行提取其中的DNA进行质量控制。
中值质控DNA：由制备者分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，继之准确配制DNA含量为3.5％的定值质控DNA。用户直接以定值质控DNA进行质量控制。
(4)低值质控标准品的制备
低值质控细胞：由制备者分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，准确测定其DNA含量，按DNA含量配制相应的细胞浓度，并行验证和分装，使每个包装的质控细胞能被提取的T21、T18和T13的DNA准确含量分别为2.0％，用户以接收定值质控细胞并自行提取其中的DNA进行质量控制。
低值质控DNA：由制备者分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，继之准确配制DNA含量为2.0％的定值质控DNA。用户直接以定值质控DNA进行质量控制。
(5)嵌合体质控细胞的制备
分别将T21、T18和T13质控细胞配制成30％、50％和70％的嵌合体比例，使嵌合体细胞中可提取的被测嵌合体DNA浓度为5.0％-8.0％，经准确测定验证并进行分装；或分别提取T21、T18和T13质控细胞的DNA，将DNA配制成30％、50％和70％的嵌合体比例，并将被测嵌合体DNA浓度配制为5.0％-8.0％进行分装。
(6)其他染色体非整倍体质控细胞的制备
同上所述制备T3、T4、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T14、T15、T16、T17、T20、T22、XXX以及X0、XXYY染色体非整倍体的定值质控标准品。
9、质控细胞的应用
(1)检测方法：质控品与被检测标本在相同的条件下检测
将高限(DNA含量为8.0％)、高值(DNA含量为5.0％)、中值(DNA含量为3.5％)和低值(DNA含量为2.0％)的T21、T18和T13质控细胞与被检测孕妇标本在相同的条件下进行DNA提取、文库构建(DNA末端修复、接头连接、PCR扩增)、测序和数据分析(以胎儿染色体非整倍体基因检测软件计算Z值，Z值≥3时报告为阳性，Z值＜3时报告为阴性)。
将高限、高值、中值和低值的T21、T18和T13质控DNA与被检测孕妇标本在相同的条件下进行文库构建(DNA末端修复、接头连接、PCR扩增)、测序和数据分析(以胎儿染色体非整倍体基因检测软件计算Z值，Z值≥3时报告为阳性，Z值＜3时报告为阴性)。
嵌合体质控细胞或质控DNA与被检测孕妇标本在相同的条件下进行文库构建(DNA末端修复、接头连接、PCR扩增)、测序和数据分析(以胎儿染色体非整倍体基因检测软件计算Z值，Z值≥3时报告为阳性，Z值＜3时报告为阴性)。
(2)检测结果：质控品与被检测标本在相同的条件下检测的结果
高限(8.0％DNA)T21、T18和T13质控品(质控细胞和/或质控DNA)：在标本测试前应分别重复检测高限T21、T18和T13质控品10次，结果应均为阳性，且10次检测结果一致。
高值(5.0％DNA)T21、T18和T13质控品(质控细胞和/或质控DNA)：与被测标本的同步检测结果应为阳性。
中值(3.5％DNA)T21、T18和T13质控品(质控细胞和/或质控DNA)：与被测标本的同步检测结果可为阳性或阴性。
低值(2.0％DNA)T21、T18和T13质控品(质控细胞和/或质控DNA)：与被测标本的同步检测结果应为阴性。
嵌合体(30％或70％)T21、T18和T13质控细胞或质控DNA：嵌合比例为70％、50％和30％的T21、T18和T13样本与被测标本的同步检测结果，70％嵌合比例样本的检出率应达到100％，而30％嵌合比例样本可以未检出，50％嵌合比例样本检出率越高灵敏度越高。
10、质控细胞在荧光原位杂交检测中的应用
用于18、X、Y染色体荧光原位杂交检测的质量评价：如图4为某个视野中每个细胞内都含有分别代表18、X、Y染色体的蓝色、绿色和红色的信号点，说明所有的18、X、Y染色体都能被检出，如果荧光信号弱或不显示，则表明没有准确检出相应的染色体，说明检测系统的质量有问题。所以本发明的质控细胞也可用于染色体荧光原位杂交检测的质量评价。

Claims (8)

1.一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于，以0.25％胰蛋白酶介导SV40LT转染梭形羊水细胞，使羊水细胞建株成功率显著提高，用以制备质控标准品。
2.根据权利要求1所述的一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于，所述胰蛋白酶介导SV40LT转染羊水细胞指以0.25％胰蛋白酶梯度消化待转染羊水细胞。
3.根据权利要求1和2所述的一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于，所述胰蛋白酶梯度消化指以0.25％胰蛋白酶分别消化待转染羊水细胞0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。
4.根据权利要求1、2和3所述的一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于，所述待转染羊水细胞为经过传代扩增的羊水细胞。
5.根据权利要求1和4所述的一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于，所述经传代扩增的羊水细胞指经过SV40LT预转染的羊水细胞。
6.根据权利要求1和5所述的一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于，所述SV40LT预转染指对生长密度为80％的染色体非整倍体羊水细胞进行SV40LT预转染后传代。
7.根据权利要求1所述的一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于，所述SV40LT取自PT67包装细胞。
8.根据权利要求1所述的一种无创产前基因检测质控标准品及其制备，其特征在于，所述质控标准品指取自染色体非整倍体羊水细胞株或其DNA，配成8.0％DNA高限、5.0％DNA高值、3.5％DNA中值和2.0％DNA低值以及30％、50％和70％嵌合体的质控所需浓度。
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