CN110016504A - CDR1as在神经管畸形产前筛查中的应用、神经管畸形产前筛查的产品和方法 - Google Patents

CDR1as在神经管畸形产前筛查中的应用、神经管畸形产前筛查的产品和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种CDR1as在神经管畸形产前筛查中的应用、神经管畸形产前筛查的产品和方法，涉及临床诊断的技术领域，包括提供circRNA‑CDR1as在作为神经管畸形产前筛查标志物中的应用。通过研究发现，circRNA‑CDR1as在NTDs患儿组织中显著高表达，circRNA‑CDR1as可以单独或联合其他标志物用于怀孕早期先天畸形的常规筛查，对于家庭和社会都具有重大的意义。神经管畸形产前筛查的产品及方法，通过检测circRNA‑CDR1as的表达量对NTDs进行诊断，检测成本低而且灵敏快捷，在怀孕早期即可诊断NTDs。

Description

CDR1as在神经管畸形产前筛查中的应用、神经管畸形产前筛 查的产品和方法
技术领域
本发明涉及临床诊断技术领域，尤其是涉及一种CDR1as在神经管畸形产前筛查中的应用、神经管畸形产前筛查的产品和方法。
背景技术
神经管畸形(neural tube defects，NTDs)是最常见的先天性出生缺陷之一，它是胚胎发育早期神经管不能正常关闭所导致的一系列影响大脑和脊髓的神经管缺陷。最常见的NTDs是无脑儿和脊柱畸形，无脑儿一般在出生前就已经在子宫里死亡，形成“死胎”或“死产”，即使出生下来，也会在短时间内死亡，一经确诊，几乎无一例存活。那些脊柱畸形患者则有严重的终身残疾，给家庭带来巨大的精神和经济负担。通过预防性干预防止NTDs的发生，或通过产前筛查而适时终止妊娠，是应对NTDs挑战的重要策略。比如孕妇在孕前l个月至孕后4个月内，坚持口服叶酸，可使胎儿神经管畸形发生率降低70％；而对于产前筛查检出的严重神经管畸形，终止妊娠也不失为一种明智的选择。NTDs是遗传因素和环境因素相互作用的结果，目前对其发病机制所知甚少。
非编码RNA是指不能编码蛋白质的RNA，它包含了miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA)等多种类型。基因组超过70％的序列均能转录非编码RNA，它们在基因调控、染色质重塑和细胞命运等过程中均发挥了关键作用，因而对神经系统正常发育和神经系统疾病发生具有重要影响。circRNA以首尾相连的闭环形式存在。直到最近，随着测序技术的发展人们才发现其在哺乳动物中分布广泛。circRNA的发现重塑了分子生物学的基本框架，它为我们研究和认识疾病的分子生物机制提供了全新的视角。
目前最常用的手段是通过B超进行形态学检查。但该项技术一方面过于依赖操作者的技术，另一方面在出现明显形态学变化之前也不能分辨，因而不能在怀孕早期实施诊断。因此，尚需开发更为灵敏便捷的早期检测手段。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供circRNA-CDR1as在制备神经管畸形产前筛查产品中的应用，以缓解了现有技术中缺少可以在怀孕早期准确诊断NTDs的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种神经管畸形产前筛查的产品，本发明的第三目的在于提供一种神经管畸形产前筛查的产品的使用方法，以缓解现有技术中缺少一种可以简单快速无创在怀孕早期筛查神经管畸形的技术问题。
本发明提供的circRNA-CDR1as在制备神经管畸形产前筛查产品中的应用，所述circRNA-CDR1as具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
进一步的，所述神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂或脊膜膨出中的至少一种。
进一步的，所述产品包括试剂或试剂盒。
一种神经管畸形产前筛查的产品，所述产品包括检测circRNA-CDR1as表达水平的物质。
进一步的，所述检测circRNA-CDR1as表达水平的物质包括PCR扩增circRNA-CDR1as反转录cDNA特异性片段的引物；
进一步的，所述引物为：
CDR1as-F：
5’-tgcacctgtgtcaaggtcttttcaagagaaagaccttgacacaggtgcttttttc-3’(SEQ IDNO.2)；
CDR1as-R：
5’-tggtcttccagcgacttcaattcaagagattgaagtcgctggaagacca-3’(SEQ ID NO.3)。
进一步的，所述神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂或脊膜膨出中的至少一种。
进一步的，所述产品包括试剂或试剂盒。
一种神经管畸形产前筛查的产品的使用方法，将生物样品和对照样品中的circRNA-CDR1as表达量进行对比，生物样品的circRNA-CDR1as表达量为对照样品的circRNA-CDR1as表达量5倍以上时鉴定为神经管畸形。
进一步的，所述生物样品包括孕妇血液、孕妇尿液、羊水或胎儿标本。
本发明提供circRNA-CDR1as在作为神经管畸形产前筛查标志物中的应用。通过研究发现，circRNA-CDR1as在NTDs组织中显著高表达，因此circRNA-CDR1as可以单独或联合其他标志物用于怀孕早期先天畸形的常规筛查，对于家庭和社会都具有重大的意义。神经管畸形产前筛查的产品及其使用方法可以简单快速的对circRNA-CDR1as进行检测，该产品及其使用方法通过对circRNA-CDR1as表达量的诊断即可胎儿判断是否患有神经管畸形，对操作人员专业要求低，普适性广，检测成本低而且灵敏快捷，在怀孕早期即可诊断NTDs。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的RT-PCR检测统计结果；
图2为本发明实施例2提供的神经干细胞增殖生长曲线；
图3为本发明实施例2提供的神经干细胞增殖生长曲线；
图4为本发明实施例3提供的TRIM-71表达量western blot检测结果；
图5为本发明实施例3提供的TRIM-71表达量western blot检测结果；
图6为本发明实施例4提供的CDR1as分子对p53蛋白表达水平的影响；
图7为本发明实施例4提供的CDR1as分子对p53蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供circRNA-CDR1as在制备神经管畸形产前筛查产品中的应用，其中，circRNA-CDR1as具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
circRNA-CDR1as的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
cttccaaccaagccatgtcttccagaaaatccacgtcttccagaaaatatatgtcttccaactaagctacgtcttccaacaaatccatgtcttcctatatctccaggtcttccagcatctccagggcttccagcatctgctcgtcttccaacatctccacgtcttccagcatctctgtgtcttccagcatcttcatgtcttccaacaactacccagtcttccatcaactggctcaatatccatgtcttccaacgtctccagtgtgctgatcttctgacattcaggtcttccagtgtctgcaatatccagggtttccgatggcacctgtgtcaaggtcttccaacaactccgggtcttccagcgacttcaagtcttccaataatctcaaggtcttccagataatcctgagcttccagaaaatccacatcttccagacaatccatgtcttccggacaatccatgtcttccaagaagctccaagtcttccagtaaatcaagtcttccagcaaatccagtcttccagcaattactggtcttccaccaaatccagatcttccaggaaaatccacgtcttccaggaaatccatgtcttccaataatttcaaggtcttccatcaaatacagatcttccagctaatccatgtcttccagaaaaatctgtgtcttccaccaaatccaagtcttccagtaaatctagttcttccagaaaaatctagatcttccagtcaatcagtgtcttccagaaagaaatccaggtcttccagtcaatcagtgtcttccagaaagaaatccaggtcttccagtcagtcagtgtcttccagaaaaatctacgtcttccaccaaatccaggtcttccagtcaatccacatcttccggaaaaaatccaggtcttccagccaatatatgtcttcctgaagatccacgtcttccagaaaatccatgtcttccagaaaatccatgtcttccagtaacctcccagtcttccagaaaatccacgtcttcccaacaatccaagtcttccggataatttgggtcttcctgaaaatctacgtcttccaaaaaagccatgtcttccagaaaatccacatcttccaatggcctccaggtcttccagactatccatgtcttccagaaaatccttgtcttcccttaaatctatagcttccaaaaaatccgggtcttccaggaaatccgtgtcttccagcaagtccacgtcttccaacaaagccatgtcttccagactatccatgtcttccagaaaatccttgtcttccctcaaatccatagcttccgaaaaatccaggtcttccaggaaatccgtgtcttccagcaaatccacgtcttccaacaaagccatgtcttccatcaaattaatgtcttccagcctacttgcgtcttccaacaaaggtacgtcttccaacaaaggtacgtcttccaacaaaggtatgtcttccaacaaaggtacgtcttccagaaaatccacgtctctttccgccatctttccgcgccgccacaatggtgcgcatgaatgtcctggcagatgctctcaagagtatcaacaatgccgaaaagagaggcaaacgccaggtgcttattaggccgtgctccaaagtcatcgtccggtttctcactgtgatgatgaagcatggttacattggcgaatttgaaatcattgatgaccacagagctgggaaaattgttgtgaacctcacaggcaggctaaacaagtgtggggtgatcagccccagatttgacgtgcaactcaaagacctggaaaaatggcagaataatctgcttccatcccgccagtttggtttcattgtactgacaacctcagctggcatcatggaccatgaagaagcaagacgaaaacacacaggagggaaaatcctgggattctttttctagggatgtaatacatatatttacaaataaaatgcctcatggactctggtgcttcc。
适时终止妊娠可以避免NTDs患儿的出生，所以产前筛查手段的有效性就具有重要的意义。但是目前的技术手段很难在怀孕早期对NTDs进行有效的诊断，如果可以在孕妇，尤其是怀孕早期的孕妇生物样本中进行NTDs筛查，可以实现早发现早决策的目的。本发明通过试验研究发现circRNA-CDR1as在NTDs组织中显著高表达，circRNA-CDR1as可以作为一种分子标志物，利用孕妇的生物样本实现在怀孕早期对NTDs进行无创诊断。circRNA-CDR1as可以单独或联合其他标志物(例如但不限于NTDs的蛋白质标志物、miRNA标志物等)用于怀孕早期先天畸形的常规筛查，对于家庭和社会都具有重大的意义。
在一些实施方式中，上述神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂或脊膜膨出等中的至少一种。
在一些实施方式中，产品包括试剂或试剂盒。具体包括神经管畸形产前筛查或临床诊断的试剂或试剂盒。
本发明又提供一种神经管畸形产前筛查的产品，该产品包括检测circRNA-CDR1as表达水平的物质。通过对circRNA-CDR1as表达水平进行检测可以知道胎儿发育是否正常，可以简单快速灵敏的对神经管畸形进行筛查。
在优选地实施方式中，检测circRNA-CDR1as表达水平的物质包括PCR扩增circRNA-CDR1as反转录cDNA特异性片段的引物。
在优选地实施方式中，引物为：
CDR1as-F：
5’-tgcacctgtgtcaaggtcttttcaagagaaagaccttgacacaggtgcttttttc-3’(SEQ IDNO.2)；
CDR1as-R：
5’-tggtcttccagcgacttcaattcaagagattgaagtcgctggaagacca-3’(SEQ ID NO.3)。
上述的产品产前筛查神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂或脊膜膨出等中的至少一种。
在优选地实施方式中，产品包括试剂或试剂盒。具体包括神经管畸形产前筛查或临床诊断的试剂或试剂盒。
在优选地实施方式中，神经管畸形产前筛查的试剂盒还包括逆转录待测样本中RNA的试剂、检测PCR扩增circRNA-CDR1as反转录cDNA特异性片段的引物、反应缓冲液、dNTPS等。
本发明又提供一种神经管畸形产前筛查的的产品的使用方法，将生物样品和对照样品中的circRNA-CDR1as表达量进行对比，生物样品的circRNA-CDR1as表达量为对照样品的circRNA-CDR1as表达量5倍以上时鉴定为神经管畸形。该方法通过对生物样品和对照样品的circRNA-CDR1as表达量差异进行筛查，快速简单灵敏并且成本低。
在一些实施方式中，生物样品包括孕妇血液、孕妇尿液、羊水或胎儿标本。
此外，本研究通过试验证实circRNA-CDR1as对神经干细胞增殖具有促进作用，从而导致神经管畸形的发生。同时证明circRNA-CDR1as与TRIM-71和p53蛋白相互作用，说明circRNA-CDR1as通过调控TRIM-71和p53蛋白促进神经管畸形的形成。
实施例1标志物的筛选
收集10组NTDs患儿的神经管组织样本(试验样本)和10组年龄接近的正常新鲜神经管组织组织样本(对照样本)，液氮研磨破碎后利用ThermoFisher组织RNA分离试剂盒提取total RNA，用circular RNA芯片进行测序，并进行微阵列分析，挑选差异倍数最大的5种circular RNA，其中包括circRNA-CDR1as、Circ-TTBL C2、Circ-MYLK、CZNF292和CircRNA100876。
针对试验样本和对照样本，将提取的total RNA用反转录试剂盒随机引物反转录，设计circRNA-CDR1as引物，通过RT-PCR检测CDR1as在试验样本和对照样本中的表达水平，统计并明确CDR1as在试验样本中的升高程度。结果如图1所示，其中，circRNA-CDR1as的表达差异最为显著。
其中，circRNA-CDR1as引物如下：
CDR1as-F：
5’-tgcacctgtgtcaaggtcttttcaagagaaagaccttgacacaggtgcttttttc-3’(SEQ IDNO.2)；
CDR1as-R：
5’-tggtcttccagcgacttcaattcaagagattgaagtcgctggaagacca-3’(SEQ ID NO.3)。
实施例2 circRNA-CDR1as对细胞增殖的影响
利用pcDNA3.1构建表达circRNA-CDR1as的质粒，利用lipo2000瞬转胚胎干细胞，再用5uM RA进行诱导，成功诱导分化成神经干细胞，构建circRNA-CDR1as过表达的神经干细胞。诱导分化后的神经干细胞开展以下实验：用CCK8孵育神经干细胞，分别检测第1，2，3，4，5，6天细胞450nm吸光度，做细胞增殖与生长曲线反应增殖情况。结果如图2所示，circRNA-CDR1as过表达的神经干细胞较空转pcDNA3.1质粒的神经干细胞增殖更快，说明circRNA-CDR1as可以促进细胞增殖。
设计并且从锐博生物科技有限公司购买circRNA-CDR1as的siRNA，利用lipo2000瞬转胚胎干细胞，用5uM RA进行诱导，成功诱导分化成神经干细胞，构建干扰circRNA-CDR1as表达的神经干细胞。诱导分化后的神经干细胞开展以下实验：用CCK8孵育神经干细胞，分别检测第1，2，3，4，5，6天细胞450nm吸光度，做细胞增殖与生长曲线反应增殖情况。结果如图3所示，circRNA-CDR1as表达干扰的神经干细胞较正常的神经干细胞增殖更慢，说明circRNA-CDR1as表达受到干扰会影响细胞的增殖。
上述实验证明了circRNA-CDR1as确实对细胞的增殖具有促进作用，在胎儿中，circRNA-CDR1as异常高表达会促进神经管畸形的产生。
实施例3 circRNA-CDR1as对TRIM-71表达水平的影响
参照实施例2中的试验，得到circRNA-CDR1as过表达的神经干细胞和空转pcDNA3.1质粒的神经干细胞，并分别采用含有或没有放线菌酮(Dactinomycin)培养基培养处理上述两种细胞。利用全蛋白提取试剂盒提取细胞中的总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后，将各组稀释到同一浓度加入上样buffer变性，用western blot进行检测，实验中以GAPDH作为内参，比较细胞中TRIM-71表达差异情况。结果如图4所示，circRNA-CDR1as过表达的神经干细胞中TRIM71的蛋白量少于空转pcDNA3.1质粒的神经干细胞，放线菌酮处理后，二者的TRIM71的蛋白量相近，说明circRNA-CDR1as会抑制TRIM71的表达量。
参照实施例2中的试验，得到circRNA-CDR1as表达干扰的神经干细胞，同时得到正常神经干细胞，并分别采用含有或没有放线菌酮(Dactinomycin)培养基培养处理上述两种细胞。利用全蛋白提取试剂盒提取细胞中的总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后，将各组稀释到同一浓度加入上样buffer变性，用western blot进行检测，实验中以GAPDH作为内参，比较细胞中TRIM-71表达差异情况。结果如图5所示，circRNA-CDR1as表达感染的神经干细胞中TRIM71的蛋白量高于正常的神经干细胞，放线菌酮处理后，二者的TRIM71的蛋白量相近，说明circRNA-CDR1as会抑制TRIM71的表达量。
实施例4 CDR1as分子对p53蛋白表达水平的影响
利用RIP并结合RNA-seq分析神经干细胞中与p53结合的多种RNA分子，其中，包括circRNA-CDR1as。
应用RIP技术结合RT-PCR及RNA pull-down进一步验证神经干细胞中circRNA-CDR1as与P53相互结合。结果如图6和图7所示，通过p53和circRNA-CDR1as RNA探针检测p53和circRNA-CDR1as在神经干细胞中的表达和定位。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> CDR1as在神经管畸形产前筛查中的应用、神经管畸形产前筛查的产品和方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1961
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttccaacca agccatgtct tccagaaaat ccacgtcttc cagaaaatat atgtcttcca 60
actaagctac gtcttccaac aaatccatgt cttcctatat ctccaggtct tccagcatct 120
ccagggcttc cagcatctgc tcgtcttcca acatctccac gtcttccagc atctctgtgt 180
cttccagcat cttcatgtct tccaacaact acccagtctt ccatcaactg gctcaatatc 240
catgtcttcc aacgtctcca gtgtgctgat cttctgacat tcaggtcttc cagtgtctgc 300
aatatccagg gtttccgatg gcacctgtgt caaggtcttc caacaactcc gggtcttcca 360
gcgacttcaa gtcttccaat aatctcaagg tcttccagat aatcctgagc ttccagaaaa 420
tccacatctt ccagacaatc catgtcttcc ggacaatcca tgtcttccaa gaagctccaa 480
gtcttccagt aaatcaagtc ttccagcaaa tccagtcttc cagcaattac tggtcttcca 540
ccaaatccag atcttccagg aaaatccacg tcttccagga aatccatgtc ttccaataat 600
ttcaaggtct tccatcaaat acagatcttc cagctaatcc atgtcttcca gaaaaatctg 660
tgtcttccac caaatccaag tcttccagta aatctagttc ttccagaaaa atctagatct 720
tccagtcaat cagtgtcttc cagaaagaaa tccaggtctt ccagtcaatc agtgtcttcc 780
agaaagaaat ccaggtcttc cagtcagtca gtgtcttcca gaaaaatcta cgtcttccac 840
caaatccagg tcttccagtc aatccacatc ttccggaaaa aatccaggtc ttccagccaa 900
tatatgtctt cctgaagatc cacgtcttcc agaaaatcca tgtcttccag aaaatccatg 960
tcttccagta acctcccagt cttccagaaa atccacgtct tcccaacaat ccaagtcttc 1020
cggataattt gggtcttcct gaaaatctac gtcttccaaa aaagccatgt cttccagaaa 1080
atccacatct tccaatggcc tccaggtctt ccagactatc catgtcttcc agaaaatcct 1140
tgtcttccct taaatctata gcttccaaaa aatccgggtc ttccaggaaa tccgtgtctt 1200
ccagcaagtc cacgtcttcc aacaaagcca tgtcttccag actatccatg tcttccagaa 1260
aatccttgtc ttccctcaaa tccatagctt ccgaaaaatc caggtcttcc aggaaatccg 1320
tgtcttccag caaatccacg tcttccaaca aagccatgtc ttccatcaaa ttaatgtctt 1380
ccagcctact tgcgtcttcc aacaaaggta cgtcttccaa caaaggtacg tcttccaaca 1440
aaggtatgtc ttccaacaaa ggtacgtctt ccagaaaatc cacgtctctt tccgccatct 1500
ttccgcgccg ccacaatggt gcgcatgaat gtcctggcag atgctctcaa gagtatcaac 1560
aatgccgaaa agagaggcaa acgccaggtg cttattaggc cgtgctccaa agtcatcgtc 1620
cggtttctca ctgtgatgat gaagcatggt tacattggcg aatttgaaat cattgatgac 1680
cacagagctg ggaaaattgt tgtgaacctc acaggcaggc taaacaagtg tggggtgatc 1740
agccccagat ttgacgtgca actcaaagac ctggaaaaat ggcagaataa tctgcttcca 1800
tcccgccagt ttggtttcat tgtactgaca acctcagctg gcatcatgga ccatgaagaa 1860
gcaagacgaa aacacacagg agggaaaatc ctgggattct ttttctaggg atgtaataca 1920
tatatttaca aataaaatgc ctcatggact ctggtgcttc c 1961
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgcacctgtg tcaaggtctt ttcaagagaa agaccttgac acaggtgctt ttttc 55
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggtcttcca gcgacttcaa ttcaagagat tgaagtcgct ggaagacca 49

Claims (10)

1.circRNA-CDR1as在制备神经管畸形产前筛查产品中的应用，所述circRNA-CDR1as具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂或脊膜膨出中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
4.一种神经管畸形产前筛查的产品，其特征在于，所述产品包括检测circRNA-CDR1as表达水平的物质。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述检测circRNA-CDR1as表达水平的物质包括PCR扩增circRNA-CDR1as反转录cDNA特异性片段的引物。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述引物为：
CDR1as-F：
5’-tgcacctgtgtcaaggtcttttcaagagaaagaccttgacacaggtgcttttttc-3’(SEQ IDNO.2)；
CDR1as-R：
5’-tggtcttccagcgacttcaattcaagagattgaagtcgctggaagacca-3’(SEQ ID NO.3)。
7.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述神经管畸形包括无脑畸形、脑膨出、脑积水、脊柱裂或脊膜膨出中的至少一种。
8.根据权利要求4-7任一项所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
9.一种神经管畸形产前筛查的产品的使用方法，其特征在于，将生物样品和对照样品中的circRNA-CDR1as表达量进行对比，生物样品的circRNA-CDR1as表达量为对照样品的circRNA-CDR1as表达量5倍以上时鉴定为神经管畸形。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物样品包括孕妇血液、孕妇尿液、羊水或胎儿标本。
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