CN111944894B - 用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用。用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物，是由hsa‑piR‑009228、hsa‑piR‑016659和hsa‑piR‑020496 3种piRNAs组成。所述的产前无创诊断的分子标志物在制备用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用。本发明首次发现并证实在孕妇血中piRNAs的基因表达异常与唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿的发生具有密切相关性，验证的样本量多，结果准确，为唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警和诊断提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用。
背景技术
唇腭裂、神经管缺陷和先天性心脏病等是我国常见重大胎儿发育畸形，包括在世界卫生组织常规监测的12种畸形之中，严重危害我国出生人口素质的提高。因此，研究这些出生缺陷的胚胎早期无创诊断的方法，使其能够在严重结构异常或不可逆损伤之前获得诊断，制定相应的胚胎早期治疗和预防新策略，是国内外出生缺陷研究的重点方向，对于减少畸形的致残率、提高人口素质具有极其重要意义。
建立无创的先天畸形早期筛查方法，一直是人们不断追求的理想目标，也是国家中长期科学和技术发展规划纲要中的重点资助领域和优先研究主题。虽然目前影像学技术(超声和MRI)的发展非常迅速，使一些有明显结构异常畸形的诊断时间获得提前，但目前影像学方法只能在畸形结构形成后给予诊断，已失去了最佳预防和治疗的时机，不能达到早期诊断的要求。羊膜穿刺、绒毛膜和胎儿血取样可以对一些明显染色体异常(Down综合征等)或单基因疾病进行早期诊断，但对于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病等复杂多基因疾病仍缺乏特异性检测指标。母体血清学检查是一种无创性产前诊断方法，孕妇易接受，适用于大范围产前筛查。因此，国内外许多学者都在致力于发现新的诊断特异性标志物的研究，但目前为止除了神经管畸形和Down综合症可以利用血清甲胎蛋白进行筛查外，其它出生缺陷尚没有有效的诊断分子标志物。
近年来，随着各种组学技术突飞猛进的发展，一系列新技术融入到高通量的组学研究中，使疾病诊断分子标志物筛查工作有了新的突破，也为目前大家非常重视的转化医学研究提供了极其重要的手段。利用高通量的组学技术可以充分考虑母体与胎儿两方面因素，从众多复杂的基因和蛋白质中筛选出一组(数十或数百个)改变明显的关键性分子，综合分析其变化规律，将有利于确定疾病早期诊断和预后判定的分子标志物，也是未来将复杂的分子标志物转化为临床应用的趋势所在。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物，是由hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496 3种piRNAs组成。
所述的分子标志物在制备用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用。
进一步地，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸，高通量测序平台，通过质谱技术、PCR、原位杂交、荧光原位杂交、免疫透射比浊法、放射免疫法等相关方法对与唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断相关的piRNA分子标志物进行检测。
进一步地，所述唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验的标本包括孕妇血液(及其外泌体)、尿液(及其外泌体)、羊水(及其外泌体)和胎儿标本等。
一种检测用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物的试剂在制备胎儿产前无创诊断工具中的应用。
进一步地，所述检测唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断分子标志物的试剂包括能够定量上述piRNA的试剂。
进一步地，所述能够定量上述piRNA的试剂可以是基因或转录本的特异性引物，也可以是特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
所述引物序列如SEQ ID NO.1-29所示。
一种用于用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警和诊断的工具，所述工具能够检测上述分子表达量。
进一步，所述工具包括能够定量与唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断piRNA分子标志物包括hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496。
进一步，所述用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警和诊断的工具包括芯片、试剂盒、试纸和高通量测序平台。
一种唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病产前筛查、预警和诊断的方法，所述方法包括如下步骤。
(1)获取受试者的样品。
(2)检测受试者样品中上述分子表达水平。
(3)将测得的上述分子表达水平变化趋势与受试者的疾病相关性关联起来。
(4)与正常对照相比，上述分子表达异常，表明受试者怀有唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿的风险高。
本发明中所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
本发明中引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
本发明中探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增来制备。
本发明的用于检测上述分子表达量的样品的获得是本领域的常规技术，优先选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。
所述的样品可以是但不限于孕妇血液、尿液、羊水和畸形胎儿或患儿标本。在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
本发明还提供了一种用于用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警和诊断的工具，所述工具能够检测上述分子表达量。
本发明中的高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知上述分子表达异常与唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病相关也属于使用了本发明的新用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于上述分子检测来判断唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病的试剂均包含在本发明范围内。
本发明中唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警和诊断包括判断受试者胎儿是否已经发生唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病，判断受试者胎儿是否存在患有唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病的风险。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
本发明首次发现并证实在孕妇血中piRNAs(包括hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496)的基因表达异常与唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿的发生具有密切相关性，验证的样本量多，结果准确。
本发明提供的用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断相关的piRNA标志物，提供唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前诊断或风险监控的服务，协作或独立地向医院和诊所销售诊断和预后的咨询服务。
本发明提供的用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断相关的piRNA标志物为唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警和诊断提供了新的途径。
附图说明
图1是血浆外泌体分离鉴定及全转录组测序结果。
图2是全转录组测序筛选出来的差异表达piRNA的生物信息学分析结果。
图3是利用定量PCR方法对全转录组测序筛选出来差异表达的12种piRNA在唇腭裂孕妇外周血浆和外泌体中进行小样本验证结果。
图4是利用定量PCR方法对全转录组测序筛选出来差异表达的另外12种piRNA在唇腭裂孕妇外周血浆和外泌体中进行小样本验证结果。
图5是利用定量PCR方法对全转录组测序和小样本验证筛选出来差异表达的6种piRNA在唇腭裂孕妇外周血血浆外泌体中进行大样本验证结果。
图6是利用定量PCR方法对经过上述筛选确定的4种差异表达piRNA在正常孕妇中筛选妊娠相关piRNA的结果。
图7是利用定量PCR方法对经过上述筛选确定的3种妊娠相关差异表达piRNA在正常孕妇进一步验证和在唇腭裂孕妇外周血血浆中进行验证的结果。
图8是最后确定的3种差异表达piRNA(hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496)在神经管畸形和先天性心脏病胎儿的孕妇外周血血浆外泌体中验证的结果，并利用ROC曲线对这三种piRNA分子标志物分别在唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿的孕妇中的诊断准确性、敏感性和特异性分析的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知，以下实施例仅为本发明的优选实施例，并不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例中所用孕妇外周血均来源于盛京出生队列样本库，并获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准(批准号：2017PS264K)。
实施例1唇腭裂胎儿母亲外周血的外泌体分离及piRNA测序。
1、分离血浆。
采集全血样品，于EDTA抗凝管中，轻柔颠倒混匀后，使用4℃低温离心机，1600×g离心10min，离心后收集上清(血浆)至新的EP管中，16000×g离心10min去除细胞碎片，将血浆分装到多个离心管中。
2、外泌体的分离和鉴定。
采用超高速离心的方法分离血浆外泌体。分离方法如下：10000×g离心1h，4℃，上清液移至新的超高速离心管后，按照100000×g离心4h，4℃。弃上清，用100μl冷的PBS重悬外泌体。采用三种标准方法(透射电镜、粒径分析和外泌体表面标志蛋白)鉴定分离得到的外泌体颗粒。
3、转录组测序和生物信息学分析。
纳入孕妇年龄和孕周相匹配的5名孕有唇腭裂胎儿的孕妇和5名孕有健康胎儿的孕妇。分离提取血浆和血浆外泌体，公司质检通过后，进行piRNA测序分析，并进行深入的生物信息学分析筛选唇腭裂孕妇产前诊断piRNA分子标志物。
4、外泌体鉴定与转录组测序结果。
1)外泌体鉴定：透射电镜显示具有完整外膜的外泌体，多数大小为125nm。粒径分析结果显示每毫升有2.0×1010个外泌体颗粒，平均直径为129.2nm。Western-blot结果显示分离的外泌体表达特有表面标志物ALIX、CD81和CD9，以及胎盘外泌体标志物PLAP。表明本研究的外泌体分离方法可以获得纯度较高的外泌体。
2)转录组测序：在血浆外泌体中共发现13674个差异表达piRNA，其中7155个piRNA为低表达，6519个piRNA为高表达。在13674个差异表达piRNA，只有29为已知的piRNA(包括18个piRNA低表达，11个piRNA高表达)。利用RNAhybrid和miRanda数据库预测差异表达piRNA的靶基因，并进行GO分析。高表达piRNA靶基因的GO分析结果，生物过程(BP)富集发育过程、解剖结构发育和多细胞器官发育等，细胞成分(CC)富集细胞内、细胞器和细胞基质等，分子功能(MF)富集苯二氮卓受体结合、序列结合和α-葡萄糖苷酶活性等。低表达piRNA靶基因的GO分析结果，生物过程(BP)富集腺体发生、乳房腺体发生和细胞氨基酸代谢过程等，细胞成分(CC)富集细胞基质、细胞质和细胞外囊泡等，分子功能(MF)富集酰胺结合、多肽结合和蛋白结合等。KEGG通路分析高表达piRNA靶基因有18个通路富集，而低表达piRNA靶基因有99个通路富集。
采用超高速离心的方法分离血浆外泌体，并完成外泌体相关鉴定工作。筛选孕妇年龄和孕周相匹配的样本送转录组测序，并结合生物信息学分析，初步筛选可能的piRNA标志物如图1-2所示。
实施例2利用定量PCR方法在唇腭裂胎儿孕妇外泌体中验证差异表达的piRNA。
1、piRNA引物设计合成。
根据目的基因的序列，piRNA引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。管家基因选择U6。hsa-piR-020492基因的正向引物为5’-GGGGCGGCGGCGGCGGTG-3’(SEQ IDNO.1)；hsa-piR-016792基因的正向引物为5’-CCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAG-3’(SEQ IDNO.2)；hsa-piR-009228基因的正向引物为5’-TAGTTGAACATGGGTCAGTCGGTCC-3’(SEQ IDNO.3)；hsa-piR-001311基因的正向引物为5’-ATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGC-3’(SEQ IDNO.4)；hsa-piR-004993基因的正向引物为5’-TCGCGAGTTCAAATCTCGCTGG-3’(SEQ IDNO.5)；hsa-piR-016659基因的正向引物为5’-CCCCCCACTGCTAAATTTGACTGG-3’(SEQ IDNO.6)；hsa-piR-016945基因的正向引物为5’-CGGCTAGCTCAGTCGGTAGAG-3’(SEQ ID NO.7)；hsa-piR-001040基因的正向引物为5’-TATATATAGGGGCCCGTGCCTTGG-3’(SEQ ID NO.8)；hsa-piR-019825基因的正向引物为5’-CGCATTGGTGGTTCAGTGGTAGAA-3’(SEQ ID NO.9)；hsa-piR-001170基因的正向引物为5’-CGCATAGGTTTGGTCCTAGCCTTTCTA-3’(SEQ IDNO.10)；hsa-piR-004152基因的正向引物为5’-TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATA-3’(SEQ IDNO.11)；hsa-piR-001101基因的正向引物为5’-ccgAGTAAGTGAAGATAAAGTGTGTCTGAGG-3’(SEQ ID NO.12)；hsa-piR-000586基因的正向引物为5’-gAGAACGTGTGGAAAACTAATGACTGAGC-3’(SEQ ID NO.13)；hsa-piR-019912基因的正向引物为5’-GCCCGGATGATCCTCAGTGG-3’(SEQ ID NO.14)；hsa-piR-020388基因的正向引物为5’-GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATT-3’(SEQ ID NO.15)；hsa-piR-009768基因的正向引物为5’-TGCAACAACAGTGCTACAAATGGAGC-3’(SEQ ID NO.16)；hsa-piR-016745基因的正向引物为5’-GCCGTAGTGTAGTGGTTATCACGTTC-3’(SEQ ID NO.17)；hsa-piR-008993基因的正向引物为5’-CAGAACCGAAATGACTACGAAAGTGGG-3’(SEQ ID NO.18)；hsa-piR-015149基因的正向引物为5’-TGTAATCCCAACACTTTGGGAGGCT-3’(SEQ ID NO.19)；hsa-piR-004309基因的正向引物为5’-CCTCCGTAGTGTAGTGGTTATCACGTT-3’(SEQ ID NO.20)；hsa-piR-021214基因的正向引物为5’-TATAACGCCAAGGTCGCGGG-3’(SEQ ID NO.21)；hsa-piR-004308基因的正向引物为5’-CCTCCAAATGACAGTGGGTATCAGTGA-3’(SEQ ID NO.22)；hsa-piR-001312基因的正向引物为5’-ATTGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCTG-3’(SEQ ID NO.23)；hsa-piR-000805基因的正向引物为5’-TATAGCCTGAGCAACATAGCGAGACC-3’(SEQ ID NO.24)；hsa-piR-000823基因的正向引物为5’-CGTTGGTGGTATAGTGGTGAGCA-3’(SEQ ID NO.25)；hsa-piR-019675基因的正向引物为5’-GGCAATAACAGGTCTGTGATGCCC-3’(SEQ ID NO.26)；hsa-piR-004150基因的正向引物为5’-CCTCCCTGGTAGTCTAGTGGTTAGG-3’(SEQ ID NO.27)；hsa-piR-016742基因的正向引物为5’-CCGGCTAGCTCAGTCGGTAG-3’(SEQ ID NO.28)；hsa-piR-020496基因的正向引物为5’-CCGGCTAGCTCAGTCGGTAG-3’(SEQ ID NO.29)。
2、定量PCR验证结果。
使用qRT-PCR方法对其中29个已知序列的piRNA(11个高表达，18个低表达)在20名孕有唇腭裂孕妇和20名健康对照孕妇的外泌体中的表达情况进行检测，结果显示6个piRNA(hsa-piR-001101、hsa-piR-009228、hsa-piR-016659、hsa-piR-019912、hsa-piR-020388、and hsa-piR-020496)在唇腭裂孕妇外泌体中表达异常，有统计学差异。18个piRNAs(hsa-piR-000805、hsa-piR-000823、hsa-piR-001040、hsa-piR-001311、hsa-piR-001312、hsa-piR-004150、hsa-piR-004152、hsa-piR-004309、hsa-piR-004993、hsa-piR-015149、hsa-piR-016742、hsa-piR-016745、hsa-piR-016792、hsa-piR-016945、hsa-piR-019675、hsa-piR-019825、hsa-piR-020492、and hsa-piR-021214)在唇腭裂孕妇外泌体中表达没有统计学差异。另外5个piRNAs(hsa-piR-000586、hsa-piR-001170、hsa-piR-004308、hsa-piR-008993和hsa-piR-009768)由于表达量很低，没有检测出来。
对上述piRNA测序结果发现的29个已知序列的差异表达piRNA，利用定量PCR方法在20例训练组唇腭裂孕妇和20例健康孕妇的血浆外泌体中进行验证，如图3-4所示。
实施例3扩大样本量在唇腭裂胎儿孕妇外泌体中验证上述方法筛选出的piRNA。
在实施例2的基础上继续扩大样本例数，增加唇腭裂孕妇和健康对照孕妇到各50例，进一步的验证上述筛选出来的6个piRNA(hsa-piR-001101、hsa-piR-009228、hsa-piR-016659、hsa-piR-019912、hsa-piR-020388和hsa-piR-020496)作为分子标志物的可能性。结果显示有4个piRNA(hsa-piR-009228、hsa-piR-016659、hsa-piR-019912和hsa-piR-020496)经过50对样本验证后仍有差异表达，因此纳入后续的研究中。另外2个piRNA(hsa-piRNA-001101和hsa-piR-020388)表达没有统计学差异，如图5所示。
实施例4筛选出的piRNA与妊娠的相关性和外泌体特异性验证。
1、纳入研究样本。
收集20名健康足月产孕妇分娩前(38-40周)和分娩后2小时的血浆，分离得到外泌体；纳入10名健康足月产孕妇，收集以下4个时间段的血浆：4-5周，24-26周，36-38周和产后42天左右；纳入24对唇腭裂孕妇和健康对照孕妇(24周)的血浆。
2、提取RNA，反转录并扩增。
qRT-PCR结果发现hsa-piR-019912表达水平不随妊娠事件的结束而改变，说明可能与妊娠不相关。另外3个piRNA(hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496)在唇腭发育的关键时间窗(4-5周)开始表达，在孕中期24周左右达到高峰，随后表达水平降低。这提示上述3个piRNA与妊娠和胚胎发育密切相关。hsa-piR-016659在唇腭裂孕妇的血浆外泌体和全血浆中均呈现低表达，而hsa-piR-009228和hsa-piR-020496只在唇腭裂孕妇血浆外泌体中低表达，而在唇腭裂孕妇和正常孕妇的全血浆中表达没有差异。说明hsa-piR-009228和hsa-piR-020496是外泌体特异性的差异表达分子。
对于上述筛选出的4个piRNA利用定量PCR方法检测其在不同孕期的正常孕妇外周血中表达水平变化情况，明确其是否为妊娠特异性分子标志物。同时在同一组孕妇的血浆和外泌体中分别检测上述筛选出来的妊娠相关piRNA的表达水平，以期验证是否是外泌体特异性表达的piRNA，如图6-7所示。
实施例5上述筛选的piRNA在唇腭裂、脊柱裂和先天性心脏病中的诊断效能。
1、纳入研究对象。
收集21例脊柱裂孕妇和21例健康对照孕妇；收集40例先天性心脏病孕妇和40例健康对照孕妇。
2、定量PCR检测。
分离外周血，提取外泌体，进行qRT-PCR检测3个piRNA在脊柱裂和先天性心脏病组中的表达情况，上述3个piRNA在脊柱裂组中均显著低表达。相比较于正常孕妇血浆来源的外泌体，hsa-piR-009228在先天性心脏病孕妇外泌体中低表达，而hsa-piR-020496则高表达。
3、ROC曲线分析三种piRNA分子标志物在唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿孕妇中的诊断效能ROC曲线分析结果得出hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496对于唇腭裂孕妇AUC值分别是0.831、0.726和0.843，而3个piRNA联合在唇腭裂中的诊断效能如下：AUC＝0.949；95％CI,0.886–0.983；P<0.0001；特异性和敏感性分别是92％和84％。hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496对于脊柱裂孕妇AUC值分别是0.989、1.000和0.984，而3个piRNA联合谱在脊柱裂中的诊断效能如下：AUC＝1.000；95％CI,0.916–1.000；P<0.0001；特异性和敏感性均是100％。在40例先天性心脏病孕妇只有hsa-piR-009228和hsa-piR-020496两个piRNA表达有统计学差异，其对先天性心脏病孕妇AUC值分别是0.639和0.776，而hsa-piR-009228和hsa-piR-020496联合在先天性心脏病中的诊断效能如下：AUC＝0.839；95％CI,0.740–0.911；P<0.0001；特异性和敏感性分别是85％和75％。
以上3个piRNA在唇腭裂孕妇外泌体中显著低表达，为了明确这3个piRNA是唇腭裂特异性诊断分子标志物，还是先天畸形特异性分子标志物，对21例脊柱裂和40例先天性心脏病胎儿母亲血浆外泌体的表达情况进行验证，并利用ROC曲线分析每个piRNA以及联合在上述3种畸形中的诊断效能，如图8所示。
序列表
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心病胎儿产前无创诊断的分子标志物及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GGGGCGGCGG CGGCGGTG 18
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CCTCCCAAAG TGCTGGGATT ACAG 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
TAGTTGAACA TGGGTCAGTC GGTCC 25
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ATTGGTGGTT CAGTGGTAGA ATTCTCGC 28
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TCGCGAGTTC AAATCTCGCT GG 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
CCCCCCACTG CTAAATTTGA CTGG 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
CGGCTAGCTC AGTCGGTAGA G 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
TATATATAGG GGCCCGTGCC TTGG 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
CGCATTGGTG GTTCAGTGGT AGAA 24
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
CGCATAGGTT TGGTCCTAGC CTTTCTA 27
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
TCCCTGGTGG TCTAGTGGTT AGGATA 26
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccgAGTAAGT GAAGATAAAG TGTGTCTGAG G 31
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gAGAACGTGT GGAAAACTAA TGACTGAGC 29
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
GCCCGGATGA TCCTCAGTGG 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
GGCTCGTTGG TCTAGGGGTA TGATT 25
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
TGCAACAACA GTGCTACAAA TGGAGC 26
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
GCCGTAGTGT AGTGGTTATC ACGTTC 26
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
CAGAACCGAA ATGACTACGA AAGTGGG 27
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
TGTAATCCCA ACACTTTGGG AGGCT 25
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
CCTCCGTAGT GTAGTGGTTA TCACGTT 27
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
TATAACGCCA AGGTCGCGGG 20
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
CCTCCAAATG ACAGTGGGTA TCAGTGA 27
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ATTGGTGGTT CAGTGGTAGA ATTCTCGCCT G 31
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
TATAGCCTGA GCAACATAGC GAGACC 26
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
CGTTGGTGGT ATAGTGGTGA GCA 23
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
GGCAATAACA GGTCTGTGAT GCCC 24
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
CCTCCCTGGT AGTCTAGTGG TTAGG 25
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
CCGGCTAGCT CAGTCGGTAG 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
CCGGCTAGCT CAGTCGGTAG 20
Claims (6)
1.一种定量检测产前无创诊断的分子标志物的试剂在制备用于唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验产品中的应用，其中唇腭裂、神经管畸形的标志物为hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496 3种piRNAs组成；先天性心脏病的标志物hsa-piR-009228和hsa-piR-020496；所述神经管畸形为脊柱裂。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台，通过质谱技术、PCR、原位杂交、荧光原位杂交、免疫透射比浊法、放射免疫法等相关方法对与唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断相关的piRNA分子标志物进行检测。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前筛查、预警、临床诊断和生化检验的标本包括孕妇血液、尿液、羊水和胎儿标本。
4.一种定量检测唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物的试剂在制备胎儿产前无创诊断工具中的应用，其中唇腭裂、神经管畸形的标志物为hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496 3种piRNAs组成；先天性心脏病的标志物hsa-piR-009228和hsa-piR-020496；所述神经管畸形为脊柱裂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述能够定量检测唇腭裂、神经管畸形和先天性心脏病胎儿产前无创诊断的分子标志物的试剂是基因或转录本的特异性引物，或是特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1-29所示。
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