CN113621695B

CN113621695B - Rif患者的子宫内膜容受性的标志物及其应用和检测试剂盒

Info

Publication number: CN113621695B
Application number: CN202110393458.8A
Authority: CN
Inventors: 陈现; 王晓晖; 姚志鸿; 曾勇; 刁梁辉
Original assignee: Shenzhen Zhongshan Urology Hospital; Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center Co ltd
Current assignee: Shenzhen Zhongshan Urology Hospital; Shenzhen Jinxin Medical Technology Innovation Center Co ltd
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2021-04-13
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2041-04-13
Also published as: CN113621695A

Abstract

本发明公开了RIF患者的子宫内膜容受性的标志物及其应用和检测试剂盒，涉及生物医学领域。本发明公开了基因作为生物标志物在制备用于检测RIF患者子宫内膜容受性的试剂中的应用。本发明公开了一种新的RIF患者子宫内膜容受性的生物标志物，采用本发明提供的生物标志物检测子宫内膜容受性具有更好的准确率和精确度。

Description

RIF患者的子宫内膜容受性的标志物及其应用和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及RIF患者的子宫内膜容受性的标志物及其应用和检测试剂盒。

背景技术

全球不孕不育人群已达到1.86亿，占育龄夫妇的10％左右。人口协会发布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，我国不孕不育发病率为15％左右，以25岁至30岁人数居多，呈年轻化趋势，而辅助生殖技术(assisted reproduction technology,ART)是目前不孕症治疗的主要手段之一。在排除遗传、感染、内分泌和子宫结构异常等因素后，发现有一部分患者在经过IVF-ET治疗中3次以上优质胚胎移植后的妊娠失败或多次移植10个以上胚胎后仍妊娠失败，这类患者所患疾病称为反复种植失败(Repeated implantation failed,RIF)。胚胎反复种植失败与多种因素有关，例如母体年龄、内分泌异常、感染、遗传、母体子宫解剖结构异常和免疫调节紊乱等。其发病机制存在着极大的异质性，在排除以上病因后，仍有40％-50％的RIF患者病因尚不明确。

既往研究表明，建立植入能力的胚胎通过识别定位、黏附和植入才能在容受性的子宫成功着床。胚胎与子宫之间的理化交互是正常着床乃至成功妊娠的必要条件，而两者在着床期间受到干扰会对随后胚胎的发育和子宫内膜的形态变化包括蜕膜化和胎盘形成严重的不利影响，甚至导致妊娠失败。这也提示，子宫内膜容受性是影响胚胎成功着床最关键的因素。子宫内膜容受性(Endometrial receptivity,ER)是指子宫内膜对胚胎的接受能力，即允许胚胎黏附其上直至植入完成的特定阶段，具有严格的时空限制，一般仅为排卵后的6-10天。子宫内膜在雌孕激素调节下产生许多容受性相关因子，包括细胞因子、生长因子和黏附分子等，这些均在胚胎成功着床过程中起关键作用。细胞因子通过与细胞表面受体结合，在母体-胚胎之间起到信号转导作用。目前随着ART技术的提高，RIF患者往往都能获得优质的胚胎，因此，如何改善RIF患者子宫内膜的容受性是提高RIF患者受孕成功率亟待解决的关键问题。

评估RIF患者子宫内膜状态的主要手段包括评估子宫内膜形态学指标和检测影响内膜容受性的调控因子。其中形态学指标包括超声指标和胞饮突等。而目前发现的影响内膜容受性的调控因子主要包括性激素及其受体、整合素、白血病抑制因子和同源框基因HOXA10等基因及因子。其中，整合素在细胞粘附中发挥重要作用，其表达量呈周期性变化，峰值出现时间与种植窗一致；白血病抑制因子是一中具有多重功效的细胞因子，能够诱导细胞增殖、分化、维持细胞生存等，在胚胎发育及移植中发挥重要作用。研究表明不孕女性宫腔冲洗液中白血病抑制因子的表达高于妊娠组；同源框基因参与调控基因的表达和控制器官发生与细胞分化；另外胰岛素样生长因子结合蛋白、表皮生长因子和基质金属蛋白酶等因子或蛋白均参与调控内膜容受性。尽管高分辨率经阴道多普勒超声评价子宫内膜状态具有无创、直观、实时、精确性高以及可重复等特点，但由于超声检测指标目前仍无明确定论。形态学指标评估主观性强，对评估者的经验要求高，且容易出现错误识别和漏辨等风险。因而超声检测在大规模不孕症内膜容受性筛查中受到极大限制。另外，虽然影响内膜容受性的一些相关标志物陆续被发现甚至被应用于临床探索，但采用单一的容受性标志物检测准确率有限且特异性不高。也有研究将一些内膜容受性相关因子进行简单组合，在一定程度上解决了部分子宫内膜种植状态受损患者的临床问题，但由于疾病发展的个体化差异，尤其是RIF患者具有高度异质性，这些单指标检测的特异性和灵敏性受限，仍有许多未知的功能分子有待进一步挖掘与开发。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供RIF患者的子宫内膜容受性的标志物及其应用和检测试剂盒。本发明提供了一种新的RIF患者子宫内膜容受性的生物标志物，采用本发明提供的生物标志物检测子宫内膜容受性具有更高的准确率和精确度。

本发明是这样实现的：

转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。因此转录组谱可以提供特定条件下某些基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。通过基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。转录组学研究技术不仅可应用于临床疾病的分型和诊断，尤其是对原发性恶性肿瘤，通过转录组差异表达谱的建立，可以详细描绘出患者的生存期以及对药物的反应等；同时转录组学技术常被用于筛选不同样本间的差异表达基因，结合差异基因GO功能分析及KEGG Pathway分析等生物信息学分析手段来揭示样本间的差异，以解析造成样本间差异的分子机制。虽然此前有报道研究影响RIF子宫内膜容受性的分子，但都属于单一的标志物，检测通量较低、准确率有限。而采用多种生物标志物对RIF患者子宫内膜容受性进行判断，可以从参与蛋白翻译、细胞黏附、细胞迁徙、能量代谢和免疫调节等多个方面综合评价种植窗期子宫内膜的状态，并以此判断RIF患者子宫内膜容受性。如检测到患者多种生物标志物中出现细胞黏附相关的生物标志物的异常表达，说明患者的子宫内膜的细胞黏附功能可能出现异常，进而影响子宫内膜容受性。因此，采用多种生物标志物评估子宫内膜容受性具有更高的准确率和精确度。

本发明通过RAN-seq技术对正常可孕女性和RIF患者胚胎种植窗期(黄体中期)子宫内膜中的基因的表达量进行测定和分析，并根据分析结果筛选出在RIF人群的子宫内膜中表达量绝对值差异倍数大的基因，并从中确定了与子宫内膜容受性相关的基因，将其作为检测RIF患者子宫内膜容受性的生物标志物，具有更高的准确率和精确度。

基于此，一方面，本发明提供基因作为生物标志物在制备用于检测RIF患者子宫内膜容受性的试剂中的应用，所述基因选自ITGA6、TEKT3、ITGA7、ALOX12、NEO1、SEMA4D和PML中的至少一种。

不同的生物标志物在RIF患者和正常可孕女性的子宫内膜的表达量具有很大差异，具有显著差异的判断具体需要通过统计学进行判断，通常当表达量的差异大于或等于1倍时认为具有显著差异。因此不能通过简单的检测某种差异基因的表达量的绝对值而判断其表达量的高低。本发明通过转录组学分析(RNA-Seq)可得到与子宫内膜状态相关的生物标志物，以解决现有技术的不足。

本发明通过RNA-Seq技术检测正常可孕女性和RIF人群子宫内膜的基因表达谱，以差异倍数(fold change,FC)和P值(P-value)来筛选RIF患者和正常可孕女性的差异基因，进一步验证并筛选出评估RIF人群子宫内膜容受性的特征基因，这些特征基因可以作为生物标志物用于准确检测或判断RIF人群的子宫内膜容受性。

本发明提出的上述特征基因在正常可孕女性和RIF患者的子宫内膜组织中存在显著的差异表达，本发明首次将这些特征基因作为检测RIF患者子宫内膜容受性的生物标志物，预测RIF患者子宫内膜容受性，具有更高的准确率和精确度；本发明为RIF子宫内膜容受性标志物的筛选开辟了一条新的途径，为RIF患者的早期发现和诊断提供一种高效、快捷、特异性强、敏感性高的检测评估手段。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述基因选自ITGA6和TEKT3中的至少一种。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述基因选自ITGA7、ALOX12、NEO1、SEMA4D和PML中的至少一种。

另一方面，本发明提供检测基因表达的试剂在制备检测RIF患者子宫内膜容受性的试剂盒中的应用，所述基因选自ITGA6、TEKT3、ITGA7、ALOX12、NEO1、SEMA4D和PML中的至少一种。

基于上述基因能够作为RIF患者子宫内膜容受性检测的生物标志物的前提下，检测这些基因表达的试剂具有了新的用途，可以用于制备检测RIF患者子宫内膜容受性的试剂盒，为RIF患者子宫内膜容受性的检测提供了一种新的检测手段。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂通过实时荧光定量PCR和高通量测序中的一种或几种方法的组合对所述基因的表达进行检测。

基于本发明公开的内容，本领域技术人员能够容易想到采用本领域熟知的方法例如实时荧光定量PCR和高通量测序等实现对上述基因表达水平的检测，因此，任何适用于这些检测方法的试剂都可以用于制备成上述试剂盒。且这些试剂是本领域技术人员容易获得的。

可选地，在本发明的一些实施方案中，当所述试剂通过实时定量PCR对所述基因的表达进行检测时，所述试剂包括特异性扩增所述基因的引物。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述引物包括SEQ ID NO.1-14所示的引物。

其中，SEQ ID NO.1-2用于检测ITGA6基因的表达水平；

SEQ ID NO.3-4用于检测TEKT3、基因的表达水平；

SEQ ID NO.5-6用于检测ITGA7基因的表达水平；

SEQ ID NO.7-8用于检测ALOX12基因的表达水平；

SEQ ID NO.9-10用于检测NEO1基因的表达水平；

SEQ ID NO.11-12用于检测SEMA4D基因的表达水平；

SEQ ID NO.13-14用于检测PML基因的表达水平。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒的检测样本为RIF患者的子宫内膜组织。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述样本为RIF患者胚胎种植窗期的子宫内膜组织。

再一方面，本发明提供一种RIF患者子宫内膜容受性的检测试剂盒，其包括：检测目标基因表达的试剂；所述目标基因选自ITGA6、TEKT3、ITGA7、ALOX12、NEO1、SEMA4D和PML中的至少一种。

再一方面，本发明提供一种RIF患者子宫内膜容受性的检测方法，其包括：检测待测RIF患者的目标基因的表达水平，所述目标基因选自ITGA6、TEKT3、ITGA7、ALOX12、NEO1、SEMA4D和PML中的至少一种。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述检测方法还包括：将所述基因的表达水平与参考值比较，若所述基因的表达水平在所述参考值范围内，则指示该RIF患者的子宫内膜容受性良好；若所述基因的表达水平在所述参考值范围之外，则指示该RIF患者的子宫内膜容受性差。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中正常可孕女性和RIF患者子宫内膜差异表达基因热图。

图2为表1中的特征基因在正常可孕女性和RIF患者子宫内膜中的差异表达热图。

图3为基于qPCR验证正常可孕女性(control，n＝12)和RIF患者(RIF，n＝11)子宫内膜中差异基因mRNA表达水平。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

生物标志物的筛选

(1)根据入组标准，本方案共招募正常可孕女性和RIF患者各3例，患者基本信息如表1所示：

表1患者基本信息

(2)总RNA的提取，取RIF患者和正常可孕女性的黄体中期的子宫内膜组织，采用Trizol法提取子宫内膜组织样品的总RNA。具体步骤如下：

1)将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆仪进行匀浆处理；

2)将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟，使组织完全裂解同时核酸蛋白复合物完全分离；

3)每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；

4)4℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要集中在上层水相；

5)把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟；

6)4℃10000×g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状RNA沉淀；

7)用75％乙醇洗涤RNA沉淀。

8)室温放置使RNA沉淀干燥，大约晾5-10分钟即可。加入水55-60℃放置10分钟使RNA溶解。-70℃保存供后续测序。

(3)文库构建与质检：建库起始RNA为total RNA，总量≥1μg。建库中使用的建库试剂盒为Illumina的UltraTM RNA Library Prep Kit。通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，随后在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模板，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNApolymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复，经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选200bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。文库构建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/μl，随后使用Agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nM)，以保证文库质量。

(4)上机测序：库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序，并产生150bp配对末端读数。测序的基本原理是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

(5)数据分析：高通量测序仪测得的图像数据经转换后进行质控分析、序列比对、新转录本预测、基因表达水平定量、差异表达分析、差异基因富集分析、差异基因蛋白网络互作分析、可变剪切分析以及SNP分析，具体分析步骤如下：

a.数据质控：测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)，文件为fastq格式，其中主要包含测序片段的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads。为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对原始数据进行过滤。主要包括去除带接头(adapter)的reads、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、去除低质量reads(Qphred≤20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。同时，对clean data进行Q20，Q30和GC含量计算。后续所有分析均是基于clean data进行的高质量分析。

b.序列比对到参考基因组

直接从基因组网站下载参考基因组和基因模型注释文件。使用HISAT2v2.0.5构建参考基因组的索引，并使用HISAT2 v2.0.5将配对末端clean reads与参照基因组比对。我们选择HISAT2作为比对工具，因为HISAT2可以基于基因模型注释文件生成拼接连接的数据库，因此比其他非拼接比对工具有更好的比对效果。

c.新转录本预测:采用StringTie(Mihaela Pertea.et al.2015)进行新基因预测。StringTie应用网络流算法以及可选的从头组装来拼接转录本。

d.基因表达水平定量:featureCounts用于计算映射到每个基因的读数。然后根据基因的长度计算每个基因的FPKM，并计算映射到该基因的读数。FPKM指每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量。

e.差异表达分析:使用DESeq2 R软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析(每个组两个生物学重复)。DESeq2提供了统计程序，用于使用基于负二项式分布的模型来确定数字基因表达数据中的差异表达。使用Benjamini和Hochberg的方法来调整所得P值以控制错误发现率。通过DESeq2发现调整的P值<0.05的基因被分配为差异表达的。(对于没有生物学重复的采用edgeR)在进行差异基因表达分析之前，对于每个测序文库，通过一个比例归一化因子通过edgeR程序包调整读取计数。两个条件的差异表达分析使用edgeR R软件包(3.18.1)进行。使用Benjamini&Hochberg方法调整P值。校正后的P值以及|log2foldchange|作为显著差异表达的阈值。

f.差异基因富集分析:通过cluster Profiler R软件实现差异表达基因的GO富集分析，其中修正了基因长度偏差。考虑具有小于0.05的校正的P值的GO term通过差异表达基因显著富集。

g.差异基因蛋白网络互作分析:差异表达基因的PPI分析基于已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的STRING数据库。对于数据库中存在的物种，我们通过从数据库中提取目标基因列表来构建网络；否则，使用diamond(0.9.13)将目标基因序列与选择的参考蛋白序列进行比对，然后根据所选参考物种的已知相互作用建立网络。

h.可变剪切分析:选择性剪接是调控基因表达和蛋白质变量的重要机制。使用rMATS(3.2.5)软件分析AS事件，主要包括SE、RI、MXE、A5SS、A3SS五种可变剪接事件。

i.SNP分析:使用GATK软件对样本数据进行变异位点分析，并用SnpEff软件对变异位点进行注释。

(6)分别对所述正常可孕组和RIF组的样品进行RNA-Seq检测与数据分析，得到结果如下：

与正常可孕组相比，RIF组中鉴定到的表达量绝对值差异在2.0倍以上的内膜差异基因共3913个，其中上调基因1861个，下调基因2052个，图1为上述差异基因热图。

对上述步骤中得到的差异基因进行筛选，在表达量绝对值差异倍数大于或者的等于2倍的差异基因中，结合差异基因GO功能分析及KEGG Pathway分析等生物信息学分析手段来揭示各差异基的特性，筛选出能够反应正常可孕女性和RIF患者的内膜状态的差异性特征的特征基因，该组特征基因包括7个差异基因，其中上调基因2个(U1～U2)，下调基因5个(D1～D5)，具体的基因及表达量比值如表2所示，图2为上述差异基因的表达热图。

表2差异基因在正常可孕女性和RIF组的表达量绝对值的比值的对数值

其中，ITGA6，gene ID为ENSG00000091409，基因注释为Integrin Subunit Alpha6，中文名称为整合素α6；

TEKT3，gene ID为ENSG00000125409，基因注释为Tektin 3，中文名称为筑丝蛋白3；

ITGA7，gene ID为ENSG00000135424，基因注释为Integrin Subunit Alpha 7，中文名称为整合素α7；

ALOX12，gene ID为ENSG00000108839，基因注释为Arachidonate12-Lipoxygenase，12S Type，中文名称为花生四烯酸12酯氧合酶12型；

NEO1，gene ID为ENSG00000067141，基因注释为Neogenin 1，中文名称为再生蛋白1；

SEMA4D，gene ID为ENSG00000187764，基因注释为Semaphorin 4D，中文名称为轴突导向因子4D；

PML，gene ID为ENSG00000140464，基因注释为PML Nuclear Body Scaffold，中文名称为PML蛋白核体支架。

本实施例通过RNA-Seq技术检测正常可孕女性和RIF人群子宫内膜的基因表达谱，以差异倍数(fold change,FC)和P值(P-value)来筛选RIF患者和正常可孕女性的差异基因，进一步验证并筛选出评估RIF人群子宫内膜容受性的特征基因，因此，这些差异基因(表2)可以作为生物标志物用于准确检测或判断RIF人群的子宫内膜容受性。

实施例2

实施例1得到的差异基因作为生物标志物检测RIF人群的子宫内膜容受性中的应用。

方法如下：

(1)总RNA的提取

参考实施例1的方法，以待测RIF患者的黄体中期的子宫内膜组织作为样品，提取总RNA。

(2)cDNA合成

1)去除基因组DNA反应

a)在0.5ml微量离心管中，分别加入5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl，gDNA Eraser1.0μl，总RNA 1-2μg，加RNase Free dH₂O使总体积达10μl，轻轻混匀，离心。

b)于PCR仪进行反应，反应条件为42℃，2min。

2)反转录反应

a)在0.5ml微量离心管中，分别加入步骤1)的反应液10μl，PrimeScript RTEnzyme Mix I 1.0μl，RT Primer Mix 4.0μl，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0μl，RNase Free dH₂O 1.0μl，总反应体积为20μl，轻轻混匀，离心。各基因所用的正向引物和反向如下：

b)于QuantStudio 5实时荧光PCR仪上反应，反应条件为：37℃，15min；85℃，5s。

c)待PCR反应结束后，将PCR产物于4℃保存，用于下一步的qPCR实验。

3)实时荧光PCR检测

a)反应体系的配制：在384孔板中每孔加入Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)(2×)10μl，PCR正向引物(10μM)1.0μl，PCR反向引物(10μM)1.0μl，RT反应液(cDNA溶液)2.0μl，dH 2O(灭菌蒸馏水)8.5μl，总反应体系为25μl。

b)采用两步法PCR扩增标准程序。第一步预变性，95℃30s，反应1次；第二步为PCR反应，95℃5s，60℃30s，共循环40次。融解曲线分析。

c)实验结果分析。反应结束后确认RT-PCR的扩增曲线和融解曲，根据2^-△△Ct计算各差异基因的相对表达水平。

(3)判断方法：

将检测的差异基因表达水平与参考值相比较，根据比较结果进行判断：

(a)当选用ITGA6或TEKT3基因作为标志物时，如果检测的基因表达水平高于参考值(该值为多名正常可孕女性的相应标志物的表达水平的平均值)，则预测该待测RIF患者的子宫内膜容受性差，如果检测的基因表达水平与参考值无显著差异，则预测该待测RIF患者的子宫内膜容受性良好。

(b)当选用ITGA7、ALOX12、NEO1、SEMA4D或PML基因作为标志物时，如果检测的基因表达水平低于参考值，则预测该RIF患者的子宫内膜容受性差，如果检测的基因表达水平与参考值无显著差异，则预测该待测RIF患者的子宫内膜容受性良好。

图3显示了基于qPCR验证正常可孕女性组(n＝12)和RIF患者组(n＝11)子宫内膜中差异基因的平均表达水平，可以看出，上调类基因ITGA6和TEKT3在RIF组中均明显高于正常可孕女性组，下调类基因ITGA7、ALOX12、NEO1、SEMA4D和PML在RIF组中均明显低于正常可孕女性组。说明，采用TGA6、TEKT3、ITGA7、ALOX12、NEO1、SEMA4D和PML中的任意一种基因作为标志物预测RIF患者的子宫内膜容受性具有较高的准确性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市锦欣医疗科技创新中心有限公司

深圳中山泌尿外科医院

<120> RIF患者的子宫内膜容受性的标志物及其应用和检测试剂盒

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacatctcct ccctgagcac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tatcttgcca cccatccttg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctaccccac taaacatcac a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacattctcg ggctacctga a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctgactccat gttcgggatc a 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cacctgtgaa ggtttggcg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctctggagat ggccctcaaa 20

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acctgtgctc actgccttat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtggccact gttgagagtc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttgtggctg gtgcatgttc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gagaagcagc atgaggtgta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgacggatg tgtagctgtg 20

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgccctggat aacgtctttt t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctcgcactca aagcaccaga 20

Claims

1.基因作为生物标志物在制备用于检测RIF患者子宫内膜容受性的试剂中的应用，其特征在于，所述基因包括SEMA4D。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因还包括ITGA6、TEKT3、ITGA7、ALOX12、NEO1和PML中的至少一种。

3.检测基因表达的试剂在制备检测RIF患者子宫内膜容受性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述基因为SEMA4D。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因还包括ITGA6、TEKT3、ITGA7、ALOX12、NEO1和PML中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂通过实时荧光定量PCR和高通量测序中的一种或几种方法的组合对所述基因的表达进行检测。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当所述试剂通过RT-PCR或实时定量PCR对所述基因的表达进行检测时，所述试剂包括特异性扩增所述基因的引物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物包括SEQ ID NO.1-14所示的引物。

8.根据权利要求3-7任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为RIF患者的子宫内膜组织。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样本为RIF患者胚胎种植窗期的子宫内膜组织。

10.一种RIF患者子宫内膜容受性的检测试剂盒，其特征在于，其包括：检测目标基因表达的试剂；所述目标基因包括SEMA4D；

所述目标基因还包括ITGA6、TEKT3、ITGA7、ALOX12、NEO1和PML中的至少一种。