JP6513622B2 - 非侵襲的出生前診断に有用な母体試料由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物 - Google Patents

非侵襲的出生前診断に有用な母体試料由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物 Download PDF

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Description

関連特許出願
本願は、２００９年９月１６日に出願された米国特許出願１２／５６１，２４１の継続出願であり、この出願は、本願と同じ発明の名称を有し、そして代理人整理番号は、ＳＥＱ−６０２２−ＵＴである。この出願はまた、２００８年９月１６日に出願された米国仮特許出願６１／１９２，２６４（代理人整理番号はＳＥＱ−６０２２−ＰＶである）の利益を主張する。上述の特許出願の全体の内容は、あらゆる文章、図面および表を含めて、本明細書中に参考として援用される。
分野
本技術は、一部において、出生前診断および富化方法に関する。
背景
非侵襲的な出生前検査は、関心が急速に増している分野になっている。妊娠中の合併症および胎児の遺伝的欠陥を含めた妊娠に関連する状態を早期検出することは、それにより、母親および胎児の両方の安全性のために必要である早期の医療介入が可能になるので、決定的に重要である。出生前診断は、絨毛採取（ＣＶＳ）または羊水穿刺などの手順によって胎児から単離された細胞を使用して行われている。しかし、これらの従来の方法は侵襲性であり、母親および胎児の両方に対してかなりの危険性を生じさせる。Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅは現在、侵襲性の羊水穿刺検査および絨毛採取（ＣＶＳ）検査後の１〜２パーセントの流産率に言及している。
母体の血漿および血清中の循環している無細胞の胎児核酸を検出することができることが発見された後、これらの侵襲性の手法の代替が、出生前スクリーニングのため、例えば、胎児の異常を検出するために開発されてきた（非特許文献１；および特許文献１）。循環している無細胞胎児核酸（ｃｆｆＮＡ）は、それを非侵襲的な出生前検査に適用可能にする、いくつかの有利な点を有する。例えば、無細胞核酸は、胎児の細胞よりも高いレベルで、かつ遺伝子解析するために十分な濃度で存在する。同様に、ｃｆｆＮＡは、送達後数時間のうちに母体の血流から取り除かれ、以前の妊娠からのコンタミネーションが防がれている。
母体の血漿または血清中の胎児のＤＮＡを検出することによって実施される出生前検査の例としては、胎児のアカゲザルＤ（ＲｈＤ）遺伝子型決定（非特許文献２）、胎児の性別決定（非特許文献３）、およびいくつかの胎児障害の診断（非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）が挙げられる。さらに、子癇前症（非特許文献７および非特許文献８）、胎児の２１トリソミー（非特許文献９および非特許文献１０）および妊娠悪阻（非特許文献１１）における母体の血漿／血清中の胎児のＤＮＡの定量的な異常が報告されている。
米国特許第６，２５８，５４０号明細書
Ｌｏら、Ｌａｎｃｅｔ３５０巻：４８５〜４８７頁、１９９７年 Ｌｏら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９巻：１７３４〜１７３８頁、１９９８年 Ｃｏｓｔａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６巻：１５０２頁、２００２年 Ａｍｉｃｕｃｃｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６巻：３０１〜３０２頁、２０００年 Ｓａｉｔｏら、Ｌａｎｃｅｔ、３５６巻：１１７０頁、２０００年 Ｃｈｉｕら、Ｌａｎｃｅｔ ３６０巻：９９８〜１０００頁、２００２年 Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５巻：１８４〜１８８頁、１９９９年 Ｚｈｏｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８４巻：４１４〜４１９頁、２００１年 Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５巻：１７４７〜１７５１頁、１９９９年 Ｚｈｏｎｇら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２０巻：７９５〜７９８頁、２０００年 Ｓｅｋｉｚａｗａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７巻：２１６４〜２１６５頁、２００１年
要旨
本発明は、とりわけ、これらに限定されないが、胎児核酸の存在または非存在、胎児核酸の絶対量または相対量、胎児の性別、および異数性などの胎児の染色体異常を含めた胎児の遺伝形質を非侵襲的に検出するために有用なヒトの後成的なバイオマーカーを提供する。本発明のヒトの後成的なバイオマーカーは、胎児と母親との間で示差的なＣｐＧメチル化パターンを示すゲノムＤＮＡを意味する。本発明の組成物およびプロセスにより、前記試料中の核酸のメチル化状態に基づいて母体試料中の胎児核酸を検出し、定量化することが可能になる。より詳細には、母体試料に由来する胎児核酸の量を、存在する核酸の総量と比較して決定し、それによって試料中の胎児核酸の百分率をもたらすことができる。さらに、胎児核酸の量を、配列特異的に（または遺伝子座に特異的に）、かつ正確な染色体量（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｄｏｓａｇｅ）分析（例えば、胎児の異数性の存在または非存在を検出するために）を可能にするために十分な感度で決定することができる。
本発明の第１の態様では、胎児核酸と母体核酸との間の示差的なメチル化に基づいて、母体の生体試料に由来する胎児核酸を富化するための方法であって、（ａ）試料に由来する標的核酸、および試料に由来する対照核酸を、メチル化特異的結合性タンパク質に結合させる工程と；（ｂ）メチル化状態に基づいて結合した核酸を溶出させる工程であって、示差的にメチル化された核酸が少なくとも一部、別々の画分に溶出される工程とを含む方法が提供される。ある実施形態では、核酸配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上を含む。配列番号１〜２６１は表４Ａ〜４Ｃに提供されている。本発明は、配列番号１〜２６１の配列、およびそれらの変形を含む。ある実施形態では、工程（ａ）に対照核酸は含まれない。
関連する実施形態では、母体試料に由来する胎児核酸を富化するための方法であって、（ａ）女性から生体試料を得る工程と；（ｂ）試料中のＣｐＧを含有するゲノム配列のメチル化状態に基づいて胎児核酸と母体核酸を分離する工程であって、胎児に由来するゲノム配列と女性に由来するゲノム配列が示差的にメチル化されていて、それによって試料中の女性に由来するゲノム配列と胎児に由来するゲノム配列を区別する工程とを含む方法が提供される。ある実施形態では、ゲノム配列は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、少なくとも１つのシトシンを含み、さらに、その領域は、（１）表１Ａ〜１Ｃから選択されるゲノム遺伝子座；および（２）その遺伝子座からわずか１０ｋｂ上流のＤＮＡ配列および／または下流のＤＮＡ配列からなる。この態様および本発明の全ての態様に関して、女性から生体試料を得る工程は、本発明の範囲を限定するものではない。前記得る工程は、女性から試料を実際に抜き取ること（例えば、採血）、または他の所から試料を受け取ること（例えば、診療所または病院から）、および方法の残りの工程を実施することを指してよい。
関連する実施形態では、母体試料に由来する胎児核酸を富化するための方法であって、（ａ）女性から生体試料を得る工程と；（ｂ）試料中のＣｐＧを含有するゲノム配列のメチル化状態に基づいて母体核酸を消化または除去する工程であって、胎児に由来するゲノム配列および女性に由来するゲノム配列が示差的にメチル化されていて、それによって試料中の胎児に由来するゲノム配列を富化する工程とを含む方法が提供される。母体核酸は、母体核酸を、そのメチル化状態に基づいて選択的に消化または切断する１種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して消化することができる。ある実施形態では、ゲノム配列は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、少なくとも１つのシトシンを含み、さらに、その領域は、（１）表１Ａ〜１Ｃから選択されるゲノム遺伝子座；および（２）その遺伝子座からわずか１０ｋｂ上流のＤＮＡ配列および／または下流のＤＮＡ配列からなる。
本発明の第２の態様では、胎児核酸のヌクレオチド配列を有する核酸を調製するための方法であって、（ａ）妊婦に由来する試料を提供する工程と；（ｂ）妊婦の試料に由来する胎児核酸を母体核酸から、胎児核酸とその母体核酸の等価物との間のメチル化状態の違いによって分離する工程であって、胎児核酸のヌクレオチド配列が、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含有する遺伝子または遺伝子座に由来するポリヌクレオチド配列内の配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む工程と；（ｃ）パート（ｂ）において分離された胎児核酸を鋳型として利用する増幅プロセスによって胎児核酸のヌクレオチド配列を含む核酸を調製する工程とを含む方法が提供される。ある実施形態では、胎児核酸のヌクレオチド配列を有する核酸を調製するための方法であって、（ａ）妊婦に由来する試料を提供する工程と；（ｂ）胎児核酸とその母体核酸の等価物との間のメチル化状態の違いによって妊婦の試料から母体核酸を消化または除去する工程であって、胎児核酸のヌクレオチド配列が、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含有する遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列内の配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む工程と；（ｃ）胎児核酸のヌクレオチド配列を含む核酸を調製する工程とを含む方法が提供される。工程（ｃ）の調製プロセスは、ハイブリダイゼーションプロセス、捕捉プロセス、またはパート（ｂ）において分離された胎児核酸を鋳型として利用する増幅プロセスであってよい。また、上記の母体核酸を消化する実施形態では、母体核酸は、母体核酸をそのメチル化状態に基づいて選択的に消化または切断する１種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して消化することができる。いずれの実施形態でも、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含有するＣｐＧ島に由来するポリヌクレオチド配列内にあってよい。配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１で提供されるポリヌクレオチド配列とオーバーラップしているＣｐＧ島の同定を含めて、本明細書の表１〜３においてさらに特徴付けられている。ある実施形態では、パート（ｃ）で調製された核酸は溶液中にある。さらなる実施形態では、方法は、工程（ｃ）の増幅プロセスからの胎児核酸を数量化することをさらに含む。
本発明の第３の態様では、妊婦に由来する試料からの胎児核酸を母体核酸に対して富化するための方法であって、（ａ）妊婦に由来する試料を提供する工程と；（ｂ）妊婦の試料に由来する母体核酸から胎児核酸を胎児核酸と母体核酸との間のメチル化状態の違いに従って分離または捕捉する工程であって、胎児核酸のヌクレオチド配列が、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含有する遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列内の配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む工程とを含む方法が提供される。ある実施形態では、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含有するＣｐＧ島に由来するポリヌクレオチド配列内にあってよい。配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、本明細書の表１Ａ〜１Ｃにおいて特徴付けられている。ある実施形態では、パート（ｂ）で分離された核酸は溶液中にある。さらなる実施形態では、方法は、工程（ｂ）の分離プロセスからの胎児核酸を増幅および／または数量化する工程をさらに含む。
本発明の第４の態様では、妊婦の胎児から単離された核酸を含む組成物であって、核酸のヌクレオチド配列が、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上を含む組成物が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、遺伝子のヌクレオチド配列、またはその部分から本質的になる。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣｐＧ島のヌクレオチド配列、またはその部分から本質的になる。配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、表１Ａ〜１Ｃにおいてさらに特徴付けられている。ある実施形態では、核酸は溶液中にある。ある実施形態では、母体核酸に対して胎児に由来する核酸を富化する。ある実施形態では、組成物は、メチル化されたヌクレオチドに結合する作用剤をさらに含む。例えば、作用剤は、メチル−ＣｐＧ結合性タンパク質（ＭＢＤ）またはその断片であってよい。
本発明の第５の態様では、妊婦の胎児から単離された核酸を含む組成物であって、核酸のヌクレオチド配列が、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含有する遺伝子、またはその部分に由来するポリヌクレオチド配列内の配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む組成物が提供される。ある実施形態では、核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含有するＣｐＧ島、またはその部分に由来するポリヌクレオチド配列内の配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む。配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、表１Ａ〜１Ｃにおいてさらに特徴付けられている。ある実施形態では、核酸は溶液中にある。ある実施形態では、母体核酸に対して胎児に由来する核酸を富化する。本発明の高メチル化核酸配列および低メチル化核酸配列は表１Ａ〜１Ｃにおいて同定される。ある実施形態では、組成物は、メチル化されたヌクレオチドに結合する作用剤をさらに含む。例えば、作用剤は、メチル−ＣｐＧ結合性タンパク質（ＭＢＤ）またはその断片であってよい。
一部の実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、３つ以上のＣｐＧ部位を含む。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、５つ以上のＣｐＧ部位を含む。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＰＲＣ２ドメインを含む遺伝子領域由来である（表３参照）。ある実施形態では、ヌクレオチド配列は、発生に関与する遺伝子領域由来である。例えば、本発明の後成的なマーカーであるＳＯＸ１４（表１参照）は、胚発生の制御および細胞の運命の決定に関与する転写因子であるＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧ−ボックス）ファミリーのメンバーである。
一部の実施形態では、女性に由来するゲノム配列はメチル化されており、胎児に由来するゲノム配列はメチル化されていない。他の実施形態では、女性に由来するゲノム配列はメチル化されておらず、胎児に由来するゲノム配列はメチル化されている。ある実施形態では、胎児に由来するゲノム配列は、母親に由来するゲノム配列に対して高メチル化されている。母体のゲノム配列に対して高メチル化されていることが見いだされた胎児のゲノム配列が配列番号１〜５９、９０〜１６３、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９、および２６１に提供されている。あるいは、胎児に由来するゲノム配列は母親に由来するゲノム配列に対して低メチル化されている。母体のゲノム配列に対して低メチル化されていることが見いだされた胎児のゲノム配列が配列番号６０〜８５、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１８１、１８２、１８３、１８５、１８６、１８７、１９２、１９４、１９６、１９７、２０４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２２、２２４、２２７、２２８、２２９、２３０、２３４、２３６、２３７、２３８、２４０、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、および２６０に提供されている。本発明のメチル化感受性制限酵素は、低メチル化核酸または高メチル化核酸に対して感受性であってよい。
ある実施形態では、胎児核酸は細胞外核酸である。一般に細胞外胎児核酸は約５００ヌクレオチド塩基、４００ヌクレオチド塩基、３００ヌクレオチド塩基、２５０ヌクレオチド塩基、２００ヌクレオチド塩基または１５０ヌクレオチド塩基（またはその間の任意の数のヌクレオチド塩基）以下である。ある実施形態では、消化された母体核酸は、約９０塩基対、１００塩基対、１１０塩基対、１２０塩基対、１３０塩基対、１４０塩基対または１５０塩基対未満である。関連する実施形態では、消化された母体核酸から、またはこれに対して相対的に、胎児核酸をサイズに基づいて選択的に増幅、捕捉または分離する。例えば、ＰＣＲプライマーを、約７５塩基対、８０塩基対、８５塩基対、９０塩基対、９５塩基対、１００塩基対、１０５塩基対、１１０塩基対、１１５塩基対または１２０塩基対（またはその間の任意の数の塩基対）を超える核酸を増幅するために設計し、それによって胎児核酸および消化されなかった母体核酸を増幅することができる。ある実施形態では、本発明の方法に先立って、核酸を断片化に供する。核酸を断片する方法の例としては、これらに限定されないが、超音波処理および制限酵素消化が挙げられる。一部の実施形態では、胎児核酸は胎盤から得られる。他の実施形態では、胎児核酸はアポトーシス性である。
一部の実施形態では、本発明は、試料が以下から選択されるメンバーである方法を提供する：母体の全血、母体の血漿または血清、羊水、絨毛膜絨毛試料、着床前胚からの生検材料、母体の血液、母体の尿、母体の唾液、女性生殖器系の洗液から単離した胎児有核細胞または胎児細胞残留物、および腹腔穿刺または肺洗浄によって得られる試料。特定の実施形態では、生体試料は母体の血液である。一部の実施形態では、生体試料は絨毛膜絨毛試料である。特定の実施形態では、本発明の方法に先立って、母体試料を胎児核酸について富化する。胎児の富化方法の例がＰＣＴ特許出願公開ＷＯ／２００７１４０４１７Ａ２、ＷＯ２００９／０３２７８１Ａ２および米国特許出願公開第２００５０１６４２４１号に提供されている。
一部の実施形態では、本発明の方法を実施する前に、試料から有核細胞集団および無核細胞集団の全てを除去する。一部の実施形態では、試料は、試料中に存在する胎児核酸の質の劣化を最小限にするための当業者に公知の様式で採取、貯蔵または輸送する。
試料は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト、哺乳動物、爬虫類、ウシ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ブタ（ｐｉｇ）、サル、類人猿、ゴリラ、雄ウシ、雌ウシ、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラ、およびサメを含めた任意の動物、または検出可能な、妊娠に伴う障害または染色体異常を有し得る任意の動物または生物体由来であってよい。
一部の実施形態では、試料を、メチル化されたＤＮＡとメチル化されていないＤＮＡを示差的に修飾する試薬で処理する。例えば、試薬は、亜硫酸水素塩を含んでよい；または試薬は、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断する１種以上の酵素を含んでよい；または試薬は、メチル化されていないＤＮＡを優先的に切断する１種以上の酵素を含んでよい。メチル化感受性制限酵素の例としては、これらに限定されないが、ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩが挙げられる。
一実施形態では、胎児核酸を、胎児核酸内のメチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって母体核酸から分離する。ある実施形態では、胎児核酸を、その母体核酸の等価物内のメチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって母体核酸から分離または除去する。ある実施形態では、メチル化されたヌクレオチドに結合する作用剤はメチル−ＣｐＧ結合性タンパク質（ＭＢＤ）またはその断片である。
本発明の第６の態様では、示差的にメチル化された母体のＤＮＡと胎児のＤＮＡを含む母体試料中の胎児のＤＮＡの量またはコピー数を決定するための方法が提供される。方法は、ａ）示差的なメチル化状態に基づいて母体のＤＮＡと胎児のＤＮＡを識別する工程と；ｂ）工程ａ）の胎児のＤＮＡを数量化する工程とによって実施される。特定の実施形態では、方法は、ａ）母体試料中の母体のＤＮＡを、１種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して消化し、それによって胎児のＤＮＡを富化する工程と；ｂ）工程ａ）からの胎児のＤＮＡの量を決定する工程とを含む。胎児のＤＮＡの量は、とりわけ、胎児核酸の存在または非存在を確認するため、胎児の性別を決定するため、胎児疾患もしくは妊娠に伴う障害を診断するために使用することができる、または感度または特異性を改善するために他の胎児の診断方法と併せて使用することができる。一実施形態では、胎児のＤＮＡの量を決定するための方法は、多型配列の使用を必要としない。例えば、工程ｂ）において、胎児のＤＮＡを数量化するために対立遺伝子の比率を使用しない。ある実施形態では、胎児のＤＮＡの量を決定するための方法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理してシトシン残基をウラシルに変換することを必要としない。亜硫酸水素塩はＤＮＡを分解し、それによって、母体試料中に存在する、すでに限られている胎児核酸をさらに低下させることが公知である。一実施形態では、工程ｂ）における胎児のＤＮＡの量の決定は、１種以上の競合剤を既知濃度で導入することによって行う。ある実施形態では、工程ｂ）における胎児のＤＮＡの量の決定は、ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー伸長、配列決定または計数によって行う。関連する実施形態では、核酸の量を、米国特許出願公開ＵＳ２００７００６５８２３に記載のＢＥＡＭｉｎｇ技術を使用して決定する。別の関連する実施形態では、核酸の量を、米国特許出願公開ＵＳ２００９００２９３７７（米国特許出願第１２／１７８，１８１号）に記載のショットガン配列決定技術、またはその変形を使用して決定する。ある実施形態では、制限効率を決定し、効率比を使用して胎児のＤＮＡの量をさらに決定する。例示的な示差的にメチル化された核酸が、配列番号１〜２６１に提供されている。
本発明の第７の態様では、示差的にメチル化された母体のＤＮＡおよび胎児のＤＮＡを含む母体試料中の胎児のＤＮＡの濃度を決定するための方法であって、ａ）母体試料中に存在するＤＮＡの総量を決定する工程と；ｂ）母体試料中の母体のＤＮＡを、１種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して選択的に消化し、それによって胎児のＤＮＡを富化する工程と；ｃ）工程ｂ）からの胎児のＤＮＡの量を決定する工程と；ｄ）工程ｃ）からの胎児のＤＮＡの量を工程ａ）からのＤＮＡの総量と比較し、それによって母体試料中の胎児のＤＮＡの濃度を決定する工程と含む方法が提供される。胎児のＤＮＡの濃度は、とりわけ、感度または特異性を改善するために、他の胎児の診断方法と併せて使用することができる。一実施形態では、胎児のＤＮＡの量を決定するための方法は、多型配列の使用を必要としない。例えば、工程ｂ）において、胎児のＤＮＡを数量化するために対立遺伝子の比率を使用しない。ある実施形態では、胎児のＤＮＡの量を決定するための方法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理してシトシン残基をウラシルに変換することを必要としない。一実施形態では、工程ｂ）における胎児のＤＮＡの量の決定は、１種以上の競合剤を既知濃度で導入することによって行う。ある実施形態では、工程ｂ）における胎児のＤＮＡの量の決定は、ＲＴ−ＰＣＲ、配列決定または計数によって行う。ある実施形態では、制限効率を決定し、総ＤＮＡおよび胎児のＤＮＡの量をさらに決定するために使用する。例示的な示差的にメチル化された核酸が配列番号１〜２６１に提供されている。
本発明の第８の態様では、示差的にメチル化された母体のＤＮＡおよび胎児のＤＮＡを含む母体試料に由来する胎児のＤＮＡを使用して胎児の異数性の存在または非存在を決定するための方法であって、ａ）母体試料中の母体のＤＮＡを、１種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して選択的に消化し、それによって胎児のＤＮＡを富化する工程と；ｂ）標的染色体に由来する胎児のＤＮＡの量を決定する工程と；ｃ）参照染色体に由来する胎児のＤＮＡの量を決定する工程と；ｄ）工程ｂ）からの胎児のＤＮＡの量を工程ｃ）からの胎児のＤＮＡの量と比較する工程であって、標的の胎児のＤＮＡの量と参照の胎児のＤＮＡの量との間の生物学的または統計的な有意差により、胎児の異数性の存在が示される工程とを含む方法が提供される。一実施形態では、胎児のＤＮＡの量を決定するための方法は、多型配列の使用を必要としない。例えば、工程ｂ）において、胎児のＤＮＡを数量化するために対立遺伝子の比率を使用しない。ある実施形態では、胎児のＤＮＡの量を決定するための方法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理してシトシン残基をウラシルに変換することを必要としない。一実施形態では、工程ｂ）およびｃ）における胎児のＤＮＡの量の決定は、１種以上の競合剤を既知濃度で導入することによって行う。ある実施形態では、工程ｂ）およびｃ）における胎児のＤＮＡの量の決定は、ＲＴ−ＰＣＲ、配列決定または計数によって行う。ある実施形態では、工程ｂ）において決定された標的染色体に由来する胎児のＤＮＡの量を、標準の対照、例えば、正倍数性妊娠に由来する標的染色体に由来する胎児のＤＮＡの量と比較する。ある実施形態では、制限効率を決定し、標的染色体に由来する胎児のＤＮＡの量および参照染色体に由来する胎児のＤＮＡの量をさらに決定するために使用する。例示的な示差的にメチル化された核酸が配列番号１〜２６１に提供されている。
本発明の第９の態様では、示差的にメチル化された核酸の試料に由来する標的核酸および対照核酸の量またはコピー数を分析することによって染色体異常の存在または非存在を検出する方法であって、（ａ）試料に由来する標的核酸、および試料に由来する対照核酸を、そのメチル化状態に基づいて富化する工程と；（ｂ）画分の少なくとも１つにおいて、富化された標的核酸のコピー数解析を実施する工程と；（ｃ）画分の少なくとも１つにおいて、富化された対照核酸のコピー数解析を実施する工程と；（ｄ）工程（ｂ）からのコピー数を工程（ｃ）からのコピー数と比較する工程と；（ｅ）工程（ｄ）における比較に基づいて染色体異常が存在するかどうかを決定する工程であって、標的核酸と対照核酸が同じまたは実質的に同じメチル化状態を有する工程とを含む方法が提供される。関連する実施形態では、示差的にメチル化された核酸の試料に由来する標的核酸および対照核酸の量またはコピー数を分析することによって染色体異常の存在または非存在を検出するための方法であって、（ａ）試料に由来する標的核酸、および試料に由来する対照核酸を、結合剤に結合させる工程と；（ｂ）メチル化状態に基づいて結合した核酸を溶出させる工程であって、示差的にメチル化された核酸が少なくとも一部、別々の画分に溶出される工程と；（ｃ）画分の少なくとも１つにおいて、溶出した標的核酸のコピー数解析を実施する工程と；（ｄ）画分の少なくとも１つにおいて、溶出した対照核酸のコピー数解析を実施する工程と；（ｅ）工程（ｃ）からのコピー数を工程（ｄ）からのコピー数と比較する工程と；（ｆ）工程（ｅ）における比較に基づいて、染色体異常が存在するかどうかを決定する工程であって、標的核酸と対照核酸が同じまたは実質的に同じメチル化状態を有する工程とを含む方法が提供される。示差的にメチル化された核酸が配列番号１〜２６１に提供されている。
本発明の第１０の態様では、示差的にメチル化された核酸の試料に由来する標的核酸および対照核酸の対立遺伝子の比率を分析することによって、染色体異常の存在または非存在を検出するための方法であって、（ａ）試料に由来する標的核酸、および試料に由来する対照核酸を、結合剤に結合させる工程と；（ｂ）メチル化状態に基づいて結合した核酸を溶出させる工程であって、示差的にメチル化された核酸が少なくとも一部、別々の画分に溶出される工程と；（ｃ）画分の少なくとも１つにおいて、溶出した標的核酸の対立遺伝子の比率の解析を実施する工程と；（ｄ）画分の少なくとも１つにおいて、溶出した対照核酸の対立遺伝子の比率の解析を実施する工程と；（ｅ）工程ｃからの対立遺伝子の比率を工程ｄからの全てと比較する工程と；（ｆ）工程（ｅ）における比較に基づいて染色体異常が存在するかどうかを決定する工程であって、標的核酸と対照核酸が同じまたは実質的に同じメチル化状態を有する工程とを含む方法が提供される。示差的にメチル化された核酸が配列番号１〜２６１に提供され、示差的にメチル化された核酸内のＳＮＰが表２において提供されている。方法は、妊娠に伴う障害を検出するために有用であり得る。
本発明の第１１の態様では、母体核酸の量を、本発明のメチル化に基づく方法を使用して決定する。例えば、試料中の母体核酸から胎児核酸を分離する（例えば、メチル化感受性酵素を使用して消化する）ことができ、本発明の方法を使用して母体核酸を数量化することができる。母体核酸の量が決定されたら、その量を試料中の核酸の総量から引いて胎児核酸の量を決定することができる。本明細書に記載のように、胎児核酸の量を使用して、胎児の異数性を含めた胎児の形質を検出することができる。
本明細書に記載の本発明の態様および実施形態の全てに関して、方法は、妊娠に伴う障害を検出するために有用であり得る。一部の実施形態では、試料は、胎児核酸、または胎児核酸および母体核酸を含む。試料が胎児核酸および母体核酸を含む場合では、胎児核酸および母体核酸は、異なるメチル化状態を有してよい。メチル化状態が異なる核酸種は、当技術分野で公知の任意の方法によって弁別することができる。ある実施形態では、メチル化感受性制限酵素による母体核酸の選択的な消化によって胎児核酸を富化する。ある実施形態では、同じアッセイにおいて２種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して母体核酸を選択的に消化することによって胎児核酸を富化する。ある実施形態では、標的核酸および対照核酸は、どちらも胎児由来である。ある実施形態では、胎児核酸の平均サイズは、長さで約１００塩基〜約５００塩基である。ある実施形態では染色体異常は２１トリソミーなどの異数性である。一部の実施形態では、標的核酸は、異常であり得る染色体の少なくとも一部分であり、対照核酸は異常であることがめったにない染色体の少なくとも一部分である。例えば、標的核酸が第２１染色体由来である場合、対照核酸は、第２１染色体以外の染色体−好ましくは別の常染色体由来である。ある実施形態では、結合剤は、ＭＢＤ−Ｆｃなどのメチル化特異的結合性タンパク質である。また、富化または溶出した核酸を当技術分野で公知の任意の方法によって増幅／または数量化する。ある実施形態では、多型配列の使用を必要としない方法を使用して胎児のＤＮＡを数量化する。例えば、胎児のＤＮＡを数量化するために対立遺伝子の比率を使用しない。ある実施形態では、胎児のＤＮＡの量を数量化するための方法は、ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理してシトシン残基をウラシルに変換することを必要としない。
一部の実施形態では、本発明の方法は、試料中の１種以上のＹ染色体特異的な配列の量を決定する追加的な工程を含む。関連する実施形態では、本発明のメチル化に基づく方法を使用することによって決定された試料中の胎児核酸の量を、存在するＹ染色体核酸の量と比較する。
メチル化状態に基づいて核酸を区別するための方法としては、これらに限定されないが、例えばＭＢＤ２−Ｆｃ断片を使用するメチル化感受性捕捉；亜硫酸水素塩変換法、例えば、ＭＳＰ（メチル化感受性ＰＣＲ）、ＣＯＢＲＡ、メチル化感受性一塩基プライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）またはＳｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（商標）技術；およびメチル化感受性制限酵素の使用が挙げられる。明記されている場合を除いて、メチル化状態に基づいて核酸を区別するための任意の方法は、本発明の組成物および方法と一緒に使用することができる。
一部の実施形態では、本発明の方法は、増幅工程をさらに含んでよい。増幅工程は、メチル化特異的ＰＣＲなどのＰＣＲによって実施することができる。ある実施形態では、増幅反応は、単一の分子において、例えば、どちらもこれによって参照により組み込まれる米国特許第６，１４３，４９６号および同第６，４４０，７０６号にさらに記載されているデジタルＰＣＲによって実施する。他の実施形態では、方法は、増幅を必要としない。例えば、富化された胎児のＤＮＡの量は、胎児のＤＮＡ（またはそれに付着した配列タグ）を、フローサイトメーターを用いて、または増幅を必要としない配列決定手段によって計数することによって決定することができる。ある実施形態では、消化された母体核酸よりも大きなアンプリコンを生成する増幅反応によって胎児のＤＮＡの量を決定し、それによって胎児核酸をさらに富化する。
一部の実施形態では、胎児核酸（単独で、または母体核酸と組み合わせて）は、１種以上の検出部分を含む。一実施形態では、検出部分は、任意のコンポマー、糖、ペプチド、タンパク質、抗体、化学物質（例えば、ビオチン）、質量タグ（例えば、金属イオンまたは化学基）、蛍光タグ、電荷タグ（例えば、ポリアミンまたは荷電した色素など）および疎水性タグの１つ以上であってよい。関連する実施形態では、検出部分は、質量で識別可能な生成物（ＭＤＰ）、または、質量分析によって検出されるＭＤＰの一部分である。特定の実施形態では、検出部分は、質量分析によって検出される蛍光タグまたは標識である。一部の実施形態では、検出部分は、検出器オリゴヌクレオチドの５’末端にある、検出部分は、検出器オリゴヌクレオチドの非相補的領域に付着している、または、検出部分は、非相補配列の５’末端にある。特定の実施形態では、検出部分は、内部のヌクレオチドまたは検出器オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドに組み込まれる、または連結される。一部の実施形態では、１種以上の検出部分を、単独で、または組み合わせてのいずれかで使用する。例えば、米国特許出願ＵＳ２００８０３０５４７９およびＵＳ２００９０１１１７１２を参照されたい。特定の実施形態では、検出部分を、例えば、米国特許出願第１２／７２６，２４６号に記載の制限エンドヌクレアーゼによって切断する。一部の実施形態では、特異的な標的染色体を特異的な検出部分で標識し、１種以上の非標的染色体を異なる検出部分で標識し、それによって標的染色体の量を非標的染色体の量と比較することができる。
配列解析を必要とする実施形態に関して、以下の配列決定技術の任意の１つを使用することができる：プライマー伸長法（例えば、ｉＰＬＥＸ（登録商標）；Ｓｅｑｕｅｎｏｍ、Ｉｎｃ．）、直接ＤＮＡ配列決定、制限断片長多型（ＲＦＬＰ解析）、例えば「ＳＴＡＲ」（スケーラブル転写解析ルーチン（Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｏｕｔｉｎｅ））技術（米国特許第７，０８１，３３９号を参照されたい）、またはその変形を使用するリアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰＣＲ）、ピロシーケンス分析、アシクロプライム（ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ）分析、逆ドットブロット、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブおよびロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン、インターカレート色素、ＦＲＥＴプライマー、蛍光タグを付けたｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）、多重ミニ配列決定、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＧＯＯＤアッセイ、マイクロアレイミニ配列決定、アレイ化プライマー伸長（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸長、タグアレイ、コード化ミクロスフェア、鋳型定方向組み込み（ＴＤＩ）、蛍光偏光、比色定量オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、配列コード化ＯＬＡ、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ、少なくとも１つのプローブを使用するハイブリダイゼーション、少なくとも１つの蛍光標識したプローブを使用するハイブリダイゼーション、電気泳動、例えば４５４プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｍ．ら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ、４３７巻、３７６〜３８０頁）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（もしくはＳｏｌｅｘａプラットフォーム）もしくはＳＯＬｉＤ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実施されるクローニングおよび配列決定、またはＨｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ単一分子ＤＮＡ配列決定技術（Ｈａｒｒｉｓ Ｔ Ｄら、２００８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０巻、１０６〜１０９頁）、単一分子、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのリアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術、または、例えば、ＤＮＡの個々の塩基に関連する電荷を、各塩基が試料ウェルの底部のごく小さな孔を通過するにしたがって測定するＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔイオンセンサーを使用するナノポアに基づく配列決定（Ｓｏｎｉ ＧＶおよびＭｅｌｌｅｒ Ａ．２００７年Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、５３巻：１９９６〜２００１頁）、または、ＤＮＡの個々の単位に関連する電荷を測定するためにナノポアを使用するＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅデバイス、およびそれらの組み合わせ。ナノポアに基づく方法は、ナノポアを使用して核酸を配列決定する工程、または、例えば、配列情報を決定しない場合には、サイズに基づいてナノポアを使用して核酸分子を計数する工程を含んでよい。
１つ以上の核酸の絶対的なコピー数を、例えば、絶対的なコピー数を測定するための競合的なＰＣＲ手法を使用するシステムである質量分析を使用して決定することができる。例えば、どちらもこれによって参照により組み込まれるＤｉｎｇ Ｃ、Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ（２００３年）Ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ＭＳ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００巻：３０５９〜３０６４頁、および米国特許出願公開第２００４００８１９９３号として公開された米国特許出願第１０／６５５７６２号を参照されたい。
一部の実施形態では、ゲノム配列の量を、標準の対照と比較し、そこで、標準の対照からの増加または減少によって妊娠に伴う障害の存在または進行が示される。例えば、胎児核酸の量を試料中に存在するＤＮＡの総量と比較することができる。または、胎児の異数性の存在または非存在を検出する場合、標的染色体に由来する胎児核酸の量を参照染色体に由来する胎児核酸の量と比較することができる。参照染色体は、異数性が低率である別の常染色体であることが好ましい。標的胎児核酸と参照胎児核酸の比を、正常な、正倍数性の妊娠に由来する同じ比と比較することができる。例えば、対照の比率を、染色体異常を有さない健康な胎児を保有している女性から得たＤＮＡ試料から決定することができる。対照試料のパネルを使用することが好ましい。特定の染色体異形が公知である場合では、特異的な疾患または状態を示す標準物質を有してもよい。したがって、例えば、妊婦の母体血漿中の３つの異なる染色体の異数性をスクリーニングするために、例えば、第１３染色体、第１８染色体または第２１染色体のトリソミーを有する胎児を保有することが公知である母親、および染色体異常を有さない胎児を持つ妊娠中の母親から単離した対照ＤＮＡのパネルを使用することが好ましい。
一部の実施形態では、本発明は、標的核酸に由来する対立遺伝子および対照核酸に由来する対立遺伝子を配列の変形によって弁別する方法を提供する。配列の変形は、一塩基多型（ＳＮＰ）または挿入／欠失多型であってよい。ある実施形態では、胎児核酸は、染色体異常の存在または非存在を査定するために核酸の対立遺伝子の比率を決定することを可能にする、少なくとも１つの高頻度ヘテロ接合性多型（例えば、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％またはそれ以上の頻度率）を含むべきである。例示的なＳＮＰの一覧が表２に提供されているが、これは本発明の一部として使用することができる多型対立遺伝子の完全な一覧を表していない。以下の判断基準を満たす任意のＳＮＰも考えることができる：（ａ）約２％を超えるヘテロ接合性頻度を有するＳＮＰ（さまざまな異なる集団にわたることが好ましい）、（ｂ）ＳＮＰがヘテロ接合性遺伝子座である；および（ｃ）（ｉ）ＳＮＰが本明細書に記載の核酸配列内にある、または（ｃ）（ｉｉｉ）ＳＮＰが、本明細書に記載のＳＮＰの約５〜約２０００塩基対内にある（例えば、本明細書に記載のＳＮＰの約５塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、３０塩基対、４０塩基対、５０塩基対、６０塩基対、７０塩基対、８０塩基対、９０塩基対、１００塩基対、２００塩基対、３００塩基対、４００塩基対、５００塩基対、６００塩基対、７００塩基対、８００塩基対、９００塩基対、１０００塩基対、１２５０塩基対、１５００塩基対、１７５０塩基対または２０００塩基対の範囲内にある）。
他の実施形態では、配列の変形は、短いタンデム反復（ＳＴＲ）多型である。一部の実施形態では、配列の変形は制限部位に入り、それによって１つの対立遺伝子は制限酵素による消化を受けやすく、１つ以上の他の対立遺伝子はそうではない。一部の実施形態では、配列の変形は、メチル化部位である。
一部の実施形態では、対立遺伝子の比率分析の実施は、妊娠中の女性から胎児核酸を含有する核酸含有生体試料を得ることによって、妊娠中の女性の胎児に由来する標的核酸と対照核酸の対立遺伝子の比率を決定する工程と、示差的なメチル化に基づいて部分的に、または完全に母体核酸から胎児核酸を分離する工程と、標的核酸に由来する対立遺伝子と対照核酸に由来する対立遺伝子を識別する工程と、その後に対立遺伝子の比率を決定する工程と、対立遺伝子の比率に基づいて胎児における染色体障害の存在または非存在を検出する工程であって、比率が正常な、正倍数性の比率を上回る、または下回ることにより、染色体障害が示される工程とを含む。一実施形態では、標的核酸は、疑わしい異数性染色体（例えば、第２１染色体）由来であり、対照核酸は、同じ胎児に由来する正倍数性染色体由来である。
一部の実施形態では、本発明を他の胎児のマーカーと組み合わせて、多数の染色体異常の存在または非存在検出し、ここで染色体異常は以下から選択される：２１トリソミー、１８トリソミーおよび１３トリソミー、またはそれらの組み合わせ。一部の実施形態では、染色体障害は、Ｘ染色体またはＹ染色体に関係する。
一部の実施形態では、組成物またはプロセスを単一反応において多重化することができる。例えば、ゲノム全体にわたって、多数の遺伝子座において胎児核酸の量を決定することができる。または、胎児の異数性の存在または非存在を検出する場合、１つ以上の標的染色体（例えば、第１３染色体、第１８染色体または第２１染色体）上の多数の遺伝子座および１つ以上の参照染色体上の多数の遺伝子座において胎児核酸の量を決定することができる。対立遺伝子の比率を使用している場合、表２の１つ以上の対立遺伝子を同時に検出し、識別することができる。対立遺伝子の比率を決定する際、多型遺伝子座における遺伝子型が公知でない場合、多重化実施形態が特に重要である。ある場合には、例えば、母親および小児が多型遺伝子座においてホモ接合性である場合、アッセイは情報価値がない可能性がある。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２００、３００または５００を超える、および任意の中間のレベルの本発明のポリヌクレオチド配列を本発明の方法に従って富化、分離および／または検査する。標的核酸および対照核酸のコピー数を解析することによって染色体異常を検出する場合、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個未満のポリヌクレオチド配列を解析して染色体異常の存在または非存在を正確に検出する必要があり得る。ある実施形態では、本発明の組成物またはプロセスを使用して、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、５０回、１００回またはそれ以上の反復実験分、または単一分子等価物に分けた試料をアッセイすることができる。母体試料に由来する胎児核酸を、単一分子解析を含めた反復実験で解析するための方法が、これによって参照により組み込まれる、米国特許出願公開ＵＳ２００７−０２０７４６６Ａ１として公開された米国特許出願第１１／３６４，２９４号に提供されている。
別の実施形態では、本発明は、比較工程により、標的核酸の対立遺伝子の比率または絶対的なコピー数が、標準の対照配列からの１標準偏差よりも高い、または低い場合に、胎児が染色体障害を有する危険性の増加が示される方法を提供する。一部の実施形態では、比較工程により、標的核酸の対立遺伝子の比率または絶対的なコピー数が、標準の対照配列からの２標準偏差よりも高い、または低い場合に、胎児が染色体障害を有する危険性の増加が示される。いくつかの他の実施形態では、比較工程により、標的核酸の対立遺伝子の比率または絶対的なコピー数が、標準の対照配列からの３標準偏差よりも高い、または低い場合に、胎児が染色体障害を有する危険性の増加が示される。一部の実施形態では、比較工程により、標的核酸の対立遺伝子の比率または絶対的なコピー数が標準の対照からの統計的に有意な標準偏差よりも高い、または低い場合に、胎児が染色体障害を有する危険性の増加が示される。一実施形態では、標準の対照は母体の参照であり、ある実施形態では、標準の対照は胎児の参照染色体（例えば、トリソミーではない常染色体）である。
一部の実施形態では、本発明の方法は、染色体異常を診断するための他の方法と組み合わせることができる。例えば、女の胎児についての性別検査、またはＲｈＤ陰性の母親においてＲｈＤ陰性の女の胎児を確認することなどの非侵襲的な診断方法は、胎児核酸の存在または非存在を確認することを必要とする場合がある。ある実施形態では、胎児核酸の百分率が既知であることを必要とする別の診断方法を可能にするために、本発明の組成物および方法を使用して、母体試料中の胎児核酸の百分率を決定することができる。例えば、試料が特定の閾値濃度要件を満たしているかどうか。母体試料から胎児の異数性を診断するために対立遺伝子の比率を決定する際、所与の感度および特異性を伴って診断するために胎児核酸の量または濃度が必要になる場合がある。他の実施形態では、染色体異常を検出するための本発明の組成物および方法は、他の公知の方法と組み合わせ、それによって検出方法の全体的な感度および特異性を改善することができる。例えば、数学的モデルにより、母体の年齢（ＭＡ）、項部浮腫（ＮＴ）の厚さ、無血清のベータ−ｈＣＧ、および血清ＰＡＰＰ−Ａを利用する組み合わせの最初の三半期のスクリーニングプログラムにより、５％の侵襲的な試験速度に対してダウン症候群の胎児の８０％超が検出されることが示唆された（ＷａｌｄおよびＨａｃｋｓｈａｗ、Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ、１７巻（９号）：９２１〜９頁（１９９７年））。しかし、非侵襲的な遊離の胎児核酸に基づく本明細書に記載の方法と組み合わせた一般に使用される異数性検出方法の組み合わせにより、偽陽性率を低くしながら正確度を改善することをもたらすことができる。組み合わせた診断方法の例が、これによって参照により組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２００８１５７２６４Ａ２（出願者に譲渡されている）に提供されている。一部の実施形態では、本発明の方法は、胎児の細胞を侵襲的に、または非侵襲的に得る、細胞に基づく方法と組み合わせることができる。
特定の実施形態では、染色体異常の危険性の増加は、本明細書において提供される組成物または方法によってもたらされる転帰または結果（複数可）に基づく。転帰の例は、染色体の異数性の存在を示す、正倍数性の絶対的なコピー数または対立遺伝子の比率からの偏差である。この、標準の対照からの絶対的なコピー数または比率における増加または減少により、染色体異常（例えば、２１トリソミー）を持つ胎児を有する危険性の増加が示される。転帰、結果、またはトリソミーまたは異数性の危険性などの、本明細書に記載の方法に関する情報は、例えば、任意の適切な媒体に固定、訳出、記録および／または表示することができる。例えば、転帰を媒体に固定して保存、蓄積、共有、伝達すること、またはその他の方法で転帰を分析することができる。媒体は、有形（例えば、紙）または無形（例えば、電子媒体）であってよく、媒体の例としては、これらに限定されないが、コンピュータ媒体、データベース、チャート、患者のチャート、記録、患者の記録、グラフおよび表、および任意の他の表現媒体が挙げられる。情報は、時にはコンピュータ可読の形態に蓄積および／または訳出し、時にはデータベースに蓄積および組織化する。特定の実施形態では、物理的な媒体（例えば、紙）またはコンピュータ可読の媒体（例えば、光学的な記憶媒体または伝送媒体および／または磁気の記憶媒体または伝送媒体、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリー、コンピュータの処理装置、ファクシミリ信号、衛星信号、インターネットを通じた伝送または ワールドワイドウェブを通じた伝送）を使用して、情報を１つの場所から別の場所へ移動させることができる。
上記の全ての態様の範囲内で本発明を実施することにおいて、ある場合では、ＣｐＧを含有するゲノム配列としてＣｐＧ島を使用することができ、他の場合ではＣｐＧを含有するゲノム配列は、ＣｐＧ島でなくてよい。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。キットの構成成分の１つは、メチル化感受性結合剤である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
胎児核酸を調製するための方法であって、
ａ）妊婦に由来する試料を提供する工程と；
ｂ）該妊婦の該試料に由来する胎児核酸を母体核酸から、該胎児核酸と該母体核酸の等価物との間のメチル化状態の違いによって分離する工程であって、該胎児核酸が、配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む工程と；
ｃ）パート（ｂ）において分離された胎児核酸を鋳型として利用するプロセスによって胎児核酸を含む核酸を調製する工程と
を含む方法。
（項目２）
メチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目１に記載の方法。
（項目３）
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤がメチル−ＣｐＧ結合性タンパク質（ＭＢＤ）またはその断片である、項目２に記載の方法。
（項目４）
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤が、メチル化された胎児核酸に結合する、項目２に記載の方法。
（項目５）
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤が、メチル化された母体核酸に結合する、項目２に記載の方法。
（項目６）
メチル化されていないヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目２に記載の方法。
（項目７）
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目１に記載の方法。
（項目８）
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する前記作用剤が、メチル化感受性制限酵素である、項目７に記載の方法。
（項目９）
２種以上のメチル化感受性制限酵素を同じ反応において使用する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
工程ｃ）の前記プロセスが増幅反応である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
工程ｃ）の前記プロセスが、胎児核酸の絶対量を決定するための方法である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の３つ以上を調製する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料中の胎児核酸の絶対量を決定するための方法であって、
ａ）１種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって、配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む該胎児核酸を富化する工程と；
ｂ）多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して、工程ａ）からの胎児核酸の絶対量を決定する工程と
を含む方法。
（項目１４）
胎児核酸の所与の絶対量または濃度が特定の臨床的感度要件または臨床的特異性要件を満たす必要がある、胎児の形質を決定するための診断方法と併せて、胎児核酸の絶対量または濃度を使用する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料中の胎児核酸の濃度を決定するための方法であって、
ａ）該母体試料中に存在する核酸の総量を決定する工程と；
ｂ）メチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって該胎児核酸を富化する工程と；
ｃ）配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、工程ｂ）からの胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｄ）工程ａ）からの核酸の総量を、工程ｃ）からの胎児核酸の量と比較し、それによって該母体試料中の胎児核酸の濃度を決定する工程と
を含む方法。
（項目１６）
胎児核酸の所与の絶対量または濃度が特定の臨床的感度要件または臨床的特異性要件を満たす必要がある、胎児の形質を決定するための診断方法と併せて、胎児核酸の絶対量または濃度を使用する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料に由来する胎児核酸を使用して胎児の異数性の存在または非存在を決定するための方法であって、
ａ）メチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって該胎児核酸を富化する工程と；
ｂ）配列番号１６４〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、標的染色体に由来する胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｃ）配列番号９０〜１６３のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、参照染色体に由来する胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｄ）工程ｂ）からの胎児核酸の量を、工程ｃ）からの胎児核酸の量に対して比較する工程であって、標的胎児核酸の量と参照胎児核酸の量との間の統計的有意差により、胎児の異数性の存在が示される工程と
を含む方法。
（項目１８）
前記標的染色体および参照染色体のそれぞれの３〜１５個の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２０）
前記定量化を実施するための、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない方法が、胎児核酸の量を決定するための競合剤ベースの方法を使用する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２１）
母体試料中に存在するＹ染色体核酸の存在または非存在を決定する工程をさらに含む、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２２）
男の胎児について、母体試料中に存在するＹ染色体核酸の量を決定する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
胎児核酸の量を、Ｙ染色体核酸の量と比較する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、または５０個超の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目１３または１５に記載の方法。
（項目２５）
母体試料中に存在する核酸の総量を決定する、項目１３または１７に記載の方法。
（項目２６）
核酸の総量と、男の胎児についてＹ染色体核酸の量とを決定する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２７）
核酸の総量と、男の胎児についてＹ染色体核酸の量と、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率とを全て決定する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２８）
核酸の総量を決定するために２種以上のアッセイを使用し、男の胎児についてＹ染色体核酸の量を決定するために１種以上のアッセイを使用し、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定するために１種以上のアッセイを使用する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
３つ以上の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
消化された母体核酸の平均長よりも大きなアンプリコンを生成する増幅反応によって前記胎児核酸の量を決定し、それによって該胎児核酸をさらに富化する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
図１は、示差的にメチル化されたＤＮＡを分離するために使用する組換えＭＢＤ−Ｆｃタンパク質の設計を示す。 図２は、ＣｐＧジヌクレオチドにおいてメチル化されているＤＮＡであることが好ましい「抗原」に対して高い親和性および高いアビディティを有するメチル−ＣｐＧ−結合性の抗体様タンパク質を示す。 図３は、それらのメチル化状態にかかわらず全てのＤＮＡ分子に結合するＭＢＤ−ＦＣのメチル結合ドメインを示す。このタンパク質／ＤＮＡ相互作用の強度は、ＤＮＡのメチル化のレベルによって定義される。ゲノムＤＮＡに結合させた後、塩濃度を増加させた溶出液を使用して、メチル化されていないＤＮＡおよびメチル化されたＤＮＡを分画することができ、これによって調節分離が可能になる。 図４は、組換えＭＢＤ−Ｆｃタンパク質およびマイクロアレイを使用して胎児および母親から、示差的にメチル化されたＤＮＡを同定するために使用する実験を示す。 図５は、図４に例示されている実験から生成した結果を検証するために使用したＳｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）法によって生成した典型的な結果を示す。 図６は、マイクロアレイ解析（Ｘ軸）によって得られた対数比間の相関およびＥｐｉＴＹＰＥＲ分析（ｙ軸）によって得られたメチル化の差を示す。各データポイントは、１つの領域についての測定した試料全てにわたる平均を表す。マイクロアレイ解析は、母体のＤＮＡの高度にメチル化された画分を胎盤のＤＮＡの高度にメチル化された画分とハイブリダイズさせるので、本質的に比較的である。正の値により、胎盤試料が高度にメチル化していることが示される。質量分析において、各試料を個々に測定する。まず、胎盤のメチル化の値から母体のメチル化の値を引くことによって、メチル化における差を算出した。結果をマイクロアレイデータと比較するために、全ての母体／胎盤のＤＮＡ対についての差の平均を算出した。 説明なし。 図８は、予測されたｇＤＮＡ分子の数と質量分析と、組み合わせた競合的なＰＣＲによって測定された分子の数との間の相関を示す。本実験では、全血から得たＤＮＡ（黒いプラス記号）および市販の完全にメチル化されたＤＮＡ（赤い十字記号）を９０対１０の比率で使用した。ＭＢＤ−Ｆｃ融合タンパク質を、ＤＮＡのメチル化されていない画分およびメチル化された画分を分離するために使用した。各画分を、競合的な質量分析読み取りを用いたＰＣＲ分析に供した。コピー数の変動を解析するための方法がこれまでに記載されており、遺伝子発現解析用に市販されている。この手法により、既知濃度の合成オリゴヌクレオチドの補助を用い、ＤＮＡ分子を絶対的に数量化することが可能になる。本実験では、本発明において使用した全血試料においてメチル化されていないＭＧＭＴ遺伝子座を標的とした。３００個の全ｇＤＮＡコピーを投入して、２７０コピーのメチル化されていないＤＮＡおよび３０コピーのメチル化されたＤＮＡを測定することを見込んだ。測定されたコピー数は、大部分は予測値と一致した。６００コピーの投入ＤＮＡにおけるデータ点により、反応に偏りが示され、この最初の概念実証実験は、アッセイを使用することができるようになる前にさらなる開発研究で追跡する必要があることが示されている。しかし、この最初のデータにより、メチル化されたＤＮＡの少数のコピーを、過剰なメチル化されていないＤＮＡ種の存在下で捕捉し数量化するための手法の実現性が示されている。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図９Ａ〜９Ｃは、マイクロアレイ解析（色の濃い棒）および質量分析（薄い灰色の棒）から得たメチル化の差の、それらの遺伝子位置に対する棒グラフのプロットを示す。マイクロアレイによって示差的にメチル化されていることが同定された８５領域のそれぞれについて、個々のプロットが提供されている。各プロットのｘ軸はその領域の染色体位置を示す。ｙ軸は対数割り当て（ｌｏｇ ｒａｔｉｏｎ）（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差（質量分析の結果の場合）を示す。マイクロアレイについて、領域内の各ハイブリダイゼーションプローブが単黒色の（または濃い灰色）棒として示されている。質量分析の結果について、各ＣｐＧ部位が薄い灰色の棒として示されている。ゼロを超える値を示す棒は、母体のＤＮＡと比較して胎盤試料においてＤＮＡのメチル化が高度であることを示す。いくつかの遺伝子について、差は小さいが（すなわちＲＢ１またはＤＳＣＲ６）それでも統計的に有意である。これらの領域は、胎児のＤＮＡ富化戦略にあまり適さない。 図１０は、胎児数量化器方法（Ｆｅｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ）の一実施形態を示す。母体核酸を選択的に消化し、残りの胎児核酸を、既知濃度の競合剤を使用して数量化する。この図式では、質量分光計によって被検体を分離し、数量化する。 図１１は、メチル化に基づく胎児の診断方法の一実施形態を示す。３つの異なる染色体（１３、１８および２１）について、母体核酸を選択的に消化し、残りの胎児核酸を数量化する。図のパート２およびパート３は、消化前および消化後の試料中の核酸のサイズ分布を例示している。増幅反応は、消化された母体核酸と比較して長い消化されなかった胎児核酸の方が選ばれ、それによって胎児核酸がさらに富化されるようにサイズ特異的であってよい（例えば、１００塩基対のアンプリコンを超える）。図の下部のスペクトルにより、２１トリソミーを示す胎児核酸の第２１染色体の量が増加したことが示されている。 図１２は、妊娠していない女性の血液から単離した４つの異なるＤＮＡ試料に由来する増幅可能なゲノムのコピーの総数を示す。各試料を、反応当たりおよそ２５００コピー、１２５０コピー、６２５コピーまたは３１３コピーを含有するように希釈した。２つの全コピー数アッセイ（表ＸのＡＬＢおよびＲＮアーゼＰ）から得たＤＮＡ／競合剤の比率の平均を取ることによって各測定値を得た。図１２に示されているように、全コピー数が異なる試料の全てにわたって正確かつ安定であり、したがって競合剤に基づく手法の有用性が検証されている。 図１３ＡおよびＢは、一定数の母体のメチル化されていないＤＮＡを含有し、さまざまな量の男児の胎盤のメチル化されたＤＮＡをスパイクして創出したモデル系を示す。試料に、母体のメチル化されていないＤＮＡに対しておよそ０％〜２５％の範囲の男児の胎盤の量をスパイクした。胎盤のＤＮＡの割合を、全コピー数アッセイと比較したメチル化アッセイ（図１３Ａ）およびＹ染色体マーカー（図１３Ｂ）から得た比率を使用して算出した。メチル化およびＹ染色体マーカーが表Ｘに提供されている。 図１３ＡおよびＢは、一定数の母体のメチル化されていないＤＮＡを含有し、さまざまな量の男児の胎盤のメチル化されたＤＮＡをスパイクして創出したモデル系を示す。試料に、母体のメチル化されていないＤＮＡに対しておよそ０％〜２５％の範囲の男児の胎盤の量をスパイクした。胎盤のＤＮＡの割合を、全コピー数アッセイと比較したメチル化アッセイ（図１３Ａ）およびＹ染色体マーカー（図１３Ｂ）から得た比率を使用して算出した。メチル化およびＹ染色体マーカーが表Ｘに提供されている。 図１４ＡおよびＢは、血漿試料からの全コピー数アッセイの結果を示す。図１４Ａには、各試料についてのコピー数が示されている。２つの試料（２５番および２６番）は他の全ての試料よりも有意に高い全コピー数を有する。血漿１ｍｌ当たり平均およそ１３００個の増幅可能なコピーを得た（７６６〜２０５５個にわたる）。図１４Ｂは、結果を要約している所与の値の箱ひげ図を示す。 図１５ＡおよびＢは、男の胎児を持つ妊娠中の女性から取得した３３個の種々の血漿試料に由来する胎児核酸の量（またはコピー数）がプロットされている。得られたコピー数を、表Ｘに提供されるアッセイを使用して、メチル化マーカーおよびＹ染色体特異的なマーカーを使用して算出した。図１５Ｂにおいて見ることができるように、所与の値の箱ひげ図により、２つの異なる測定値間の最小の差が示され、したがって方法の正確度および安定性が検証されている。 図１６は、図１５Ａからの、メチル化マーカーを使用して得られた結果とＹ染色体マーカーを使用して得られた結果の対応のある相関を示す。 図１７は、対照対競合剤についての消化の比を使用し、この値を平均全コピー数アッセイと比較した、制限酵素の消化効率を示す。試料２６以外の全ての反応で効率が約９９％を上回ることが示されている。 図１８は、試料中の胎児のＤＮＡの割合（または濃度）を、男児の妊娠についてのＹ染色体特異的なマーカーおよび全妊娠（胎児の性別にかかわらず）についてのメチル化された画分の平均を使用して算出するための特定の方法を提供する。 図１９は、試料中の胎児のＤＮＡの割合（または濃度）を、Ｙ染色体特異的なマーカーを用いずに算出するための特定の方法を提供する。その代わりに、胎児のＤＮＡの濃度を決定するために、メチル化を数量化するためのアッセイのみを使用した。 図２０は、本発明の方法を使用して２１トリソミー診断をシミュレートするための検出力計算ｔ検定を示す。この図により、ｘ軸の変動係数（ＣＶ）と単純なｔ検定を使用してアッセイ集団を識別する検出力（ｙ軸）との間に関連性が示される。データにより、全事例の９９％において、５％以下のＣＶの条件で、０．００１の有意水準で２つの集団（正倍数性対異数性）を識別することができることが示されている。
定義
本出願において使用される「妊娠に伴う障害」という用語は、妊娠中の女性、胎児、または女性および胎児の両方に影響を及ぼす可能性がある任意の状態または疾患を指す。そのような状態または疾患は、その症状が、限られた期間中に、例えば、妊娠中または分娩の間に顕在化する可能性がある、または胎児が誕生した後、その一生涯続く可能性がある。いくつかの妊娠に伴う障害の例としては、異所性の妊娠、子癇前症、早期分娩、ＲｈＤ不適合、２１トリソミーなどの胎児の染色体異常、および嚢胞性線維症などの遺伝性の胎児障害、ベータサラセミアまたは他の単一遺伝子障害が挙げられる。本明細書に記載の組成物およびプロセスは、これらに限定されないが、子癇前症（Ｌｏら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、４５巻：１８４〜１８８頁、１９９９年およびＺｈｏｎｇら、Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１８４巻：４１４〜４１９頁、２００１年）、胎児のトリソミー（Ｌｏら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、４５巻：１７４７〜１７５１頁、１９９９年およびＺｈｏｎｇら、Ｐｒｅｎａｔ． Ｄｉａｇｎ．、２０巻：７９５〜７９８頁、２０００年）および妊娠悪阻（Ｓｅｋｉｚａｗａら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、４７巻：２１６４〜２１６５頁、２００１年）を含めた母体の血漿／血清中の胎児のＤＮＡの定量的な異常に関連する妊娠に伴う障害を診断、予後判定およびモニターするために特に有用である。例えば、母体の血液中の胎児核酸のレベルの上昇（正常な妊娠（複数可）と比較して）により、子癇前症妊娠が示され得る。さらに、母体試料から胎児核酸を富化することができることが、以前は母体の血漿に基づく非トリソミー出生前診断に対する難題として認識されていた出来事である、母親と父親が同一の病因性突然変異を共有する症例などの常染色体劣性疾患を非侵襲的に出生前診断するために特に有用であることが証明され得る。
本明細書で使用される「染色体異常」または「異数性」という用語は、対象の染色体と正常な相同染色体の構造間の偏差を指す。「正常な」という用語は、優性の核型または特定の種の健康な個体に見られる横縞模様、例えば、正倍数性ゲノム（ヒトでは、４６ＸＸまたは４６ＸＹ）を指す。染色体異常は数値的または構造的であってよく、これらに限定されないが、異数性、倍数性、逆位、トリソミー、モノソミー、複製物、欠失、染色体の一部の欠失、付加、染色体の一部の付加、挿入、染色体の断片、染色体の領域、染色体の再配置、および移行を含む。染色体異常は、１つ以上の染色体の一部分が、例えば染色体移行に起因して、通常の一倍数の正確な倍数でない染色体異常の状態を指す場合もある。染色体移行（例えば、第１４染色体のいくつかが余分の第２１染色体で置き換わっている第２１染色体と第１４染色体との間の移行）により、部分的な２１トリソミーが引き起こされ得る。染色体異常は、病的状態が存在すること、または病的状態を発生させる素因と相関し得る。染色体異常は、核酸を定量的に分析することによって検出することができる。
「核酸」および「核酸分子」という用語は、本開示全体を通して互換的に使用することができる。この用語は、ＤＮＡ（例えば、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、胎児または胎盤で高度に発現されるＲＮＡなど）、および／またはＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体および／または非ネイティブな主鎖などを含有する）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよびポリアミド核酸（ＰＮＡ）などからの任意の組成の核酸を指し、その全てが一本鎖または二本鎖の形態であってよく、他に限定がない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然のヌクレオチドの公知の類似体を包含してよい。例えば、配列番号１〜２６１で提供される核酸（表４Ａ〜４Ｃ参照）は、本明細書におけるプロセスを行うために有用な任意の形態であってよい（例えば、直鎖状、環状、高次コイル、一本鎖、二本鎖など）、または、本発明の一部としてのそれらの有用性を変化させない変形（例えば、挿入、欠失または置換）を含んでよい。核酸は、特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、または宿主細胞、細胞、細胞核または細胞質において複製することができる、または複製されるプラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、または他の核酸であってよい、またはそれ由来であってよい。一部の実施形態では、鋳型核酸は単一の染色体由来であってよい（例えば、核酸試料は、二倍体の生物体から得た試料の１つの染色体由来であってよい）。特に限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、暗黙のうちに、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補配列ならびに明示された配列も包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ、８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子にコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。この用語は、ヌクレオチド類似体から合成されたＲＮＡまたはＤＮＡの等価物、誘導体、変異体および類似体として、一本鎖ポリヌクレオチド（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」読み枠または「リバース」読み枠）および二本鎖ポリヌクレオチドも包含してよい。デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが挙げられる。ＲＮＡについては、シトシン塩基がウラシルと交換されている。鋳型核酸は、対象から鋳型として得た核酸を使用して調製することができる。
本明細書で使用される「１つ以上のＣｐＧ部位を含む核酸」または「ＣｐＧを含有するゲノム配列」は、ヒト胎児または妊娠中の女性などの個体のゲノム内の定義済みの場所にあるＤＮＡ配列のセグメントを指す。一般には、「ＣｐＧを含有するゲノム配列」は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであり、少なくとも１つのシトシンを含有する。好ましくは、「ＣｐＧを含有するゲノム配列」は長さが少なくとも３０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、または３００ヌクレオチドであり、少なくとも２個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、または３０個のシトシンを含有する。所与の場所に、例えば、所与の遺伝子座を中心とする領域内の「ＣｐＧを含有するゲノム配列」のいずれについても（表１Ａ〜１Ｃ参照）、ヌクレオチド配列の変形が、個体間、および同じ個体についてさえ対立遺伝子間に存在する。一般には、そのような定義済みの遺伝子座（例えば、ＣｐＧ島）を中心とする領域は、遺伝子座ならびに上流の配列および／または下流の配列を含有する。上流の配列または下流の配列のそれぞれ（それぞれ遺伝子座の５’の境界または３’の境界から数えて）は、１０ｋｂと同じくらいの長さであってよく、他の場合では、５ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、２００ｂｐ、または１００ｂｐと同じくらいの長さであってよい。さらに、「ＣｐＧを含有するゲノム配列」は、タンパク質産生のために転写されるヌクレオチド配列または転写されないヌクレオチド配列を包含してよく、ヌクレオチド配列は、遺伝子間配列、遺伝子内配列、タンパク質をコードする配列、タンパク質をコードしない配列（転写プロモーターなど）、またはそれらの組み合わせであてよい。
本明細書で使用される、「メチル化されたヌクレオチド」または「メチル化されたヌクレオチド塩基」は、認められている典型的なクレオチド塩基内にメチル部分が存在しない場合に、ヌクレオチド塩基にメチル部分が存在することを指す。例えば、シトシンは、そのピリミジン環上にメチル部分を含有しないが、５−メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含有する。したがって、シトシンは、メチル化されたヌクレオチドではなく、５−メチルシトシンは、メチル化されたヌクレオチドである。別の例では、チミンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含有するが、本明細書の目的に関して、チミンは、ＤＮＡの典型的なヌクレオチド塩基であるので、ＤＮＡ中に存在する場合にチミンはメチル化されたヌクレオチドであるとみなされない。ＤＮＡの典型的なヌクレオシド塩基は、チミン、アデニン、シトシンおよびグアニンである。ＲＮＡの典型的な塩基はウラシル、アデニン、シトシンおよびグアニンである。同様に「メチル化部位」は、メチル化が起こっている、または起こる可能性がある、標的遺伝子の核酸領域内の場所である。例えば、ＣｐＧを含有する場所は、メチル化部位であり、そこでシトシンはメチル化されていても、されていなくてもよい。
本明細書で使用される、「ＣｐＧ部位」または「メチル化部位」は、天然に起こるｉｎ
ｖｉｖｏ事象、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでヌクレオチドを化学的にメチル化するために開始される事象のいずれかによってメチル化を受けやすい核酸内のヌクレオチドである。
本明細書で使用される、「メチル化された核酸分子」は、メチル化された１つ以上のメチル化されたヌクレオチドを含有する核酸分子を指す。
本明細書で使用される、「ＣｐＧ島」は、機能的に、または構造的に逸脱したＣｐＧ密度を含むＤＮＡ配列のセグメントを説明する。例えば、Ｙａｍａｄａら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４巻：２４７〜２６６頁、２００４年）は、ＣｐＧ島を決定するための標準物質のセットについて記載している：ＣｐＧ島は長さが少なくとも４００ヌクレオチドでなければならず、５０％を超えるＧＣ含有量および０．６を超えるＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する。他者（Ｔａｋａｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９巻：３７４０〜３７４５頁、２００２年）は、ＣｐＧ島を、それよりも緩く、長さが少なくとも２００ヌクレオチドであり、５０％を超えるＧＣ含有量および０．６を超えるＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する配列と定義している。
本明細書で使用される、「後成的な状況」または「後成的な状態」という用語は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の分子レベルにおける一次ヌクレオチド配列以外の任意の構造的な特徴を指す。例えば、ゲノムＤＮＡの後成的な状況は、例えば、そのメチル化パターンまたはその細胞タンパク質との関連によって決定または影響されるその二次構造または三次構造を含んでよい。
ゲノム配列のメチル化状態について記載するために本明細書で使用される「メチル化プロファイル」、「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ）」または「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ）」という用語は、メチル化に関連性の特定のゲノム遺伝子座にあるＤＮＡセグメントの特性を指す。そのような特性としては、これらに限定されないが、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のいずれかがメチル化されているかどうか、メチル化されたＣ残基（複数可）の場所、任意の特定の残基のひと続きにおけるメチル化されたＣの百分率、および、例えば対立遺伝子の起源の違いに起因する対立遺伝子のメチル化の差が挙げられる。「メチル化プロファイル」または「メチル化状態」という用語は、生体試料中の任意の特定の残基のひと続きにおけるメチル化されたＣまたはメチル化されていないＣの相対的な濃度または絶対的な濃度も指す。例えば、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されている場合、それは「高メチル化された」と称することができ、それに対してＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されていない場合、それは「低メチル化された」と称することができる。同様に、ＤＮＡ配列（例えば、胎児核酸）内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が異なる領域または異なる個体に由来する別の配列と比較して（例えば、母体核酸と比較して）メチル化されている場合、その配列は他の配列と比較して高メチル化されているとみなされる。あるいは、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が異なる領域または異なる個体（例えば、母親）に由来する別の配列と比較してメチル化されていない場合、その配列は、他の配列と比較して低メチル化されているとみなされる。これらの配列は、「示差的にメチル化されている」と言われており、より詳細には、メチル化状態が母親と胎児との間で異なる場合、配列は、「示差的にメチル化された母体核酸と胎児核酸」とみなされる。
本明細書で使用される「メチル化されたヌクレオチドに結合する作用剤」という用語は、メチル化された核酸に結合することができる物質を指す。作用剤は、天然に存在してよい、または合成であってよく、修飾されていてよい、または修飾されていなくてよい。一実施形態では、作用剤により、異なる核酸種をそれらのそれぞれのメチル化状態に従って分離することが可能になる。メチル化されたヌクレオチドに結合する作用剤の例は、ＷＯ０６０５６４８０Ａ２として公開され、これによって参照により組み込まれるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２７０７に記載されている。記載されている作用剤は、メチル−ＣｐＧ結合性タンパク質（ＭＢＤ）のファミリーに属するタンパク質のＤＮＡ結合性ドメインおよび抗体のＦｃ部分を含む二機能性ポリペプチドである（図１参照）。組換えメチル−ＣｐＧ−結合性の抗体様タンパク質は、ＣｐＧのメチル化されたＤＮＡに抗体の様に結合することが好ましい場合がある。これは、メチル−ＣｐＧ−結合性の抗体様タンパク質が、ＣｐＧジヌクレオチドにおいてメチル化されているＤＮＡであることが好ましいその「抗原」に対して高い親和性および高いアビディティを有することを意味する。作用剤は、多価のＭＢＤであってもよい（図２参照）。
本明細書で使用される「多型」という用語は、同じゲノム配列の異なる対立遺伝子内の配列の変形を指す。多型を含有する配列は、「多型配列」とみなされる。１つ以上の多型を検出することにより、単一のゲノム配列の異なる対立遺伝子または２種以上の個体間の異なる対立遺伝子を弁別することが可能になる。本明細書で使用される、「多型的なマーカー」または「多型配列」という用語は、個体間でＤＮＡ配列に遺伝的変異を示すゲノムＤＮＡのセグメントを指す。そのようなマーカーとしては、これらに限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復またはテトラヌクレオチド反復などの短いタンデム反復（ＳＴＲ）などが挙げられる。本発明による多型マーカーを使用して、富化された胎児核酸試料中の母系対立遺伝子と父系対立遺伝子を特異的に弁別することができる。
本明細書で使用される、「一塩基多型」または「ＳＮＰ」という用語は、同じゲノム配列の異なる対立遺伝子内の一塩基残基に存在するポリヌクレオチド配列の変形を指す。この変形は、タンパク質が産生される間にゲノム配列が転写される場合、ゲノム配列のコード領域内または非コード領域内（すなわち、プロモーターまたはイントロンの領域内）に生じ得る。１つ以上のＳＮＰを検出することにより、単一のゲノム配列の異なる対立遺伝子または２種以上の個体間の異なる対立遺伝子を弁別することが可能になる。
本明細書で使用される「対立遺伝子」という用語は、染色体上の同じ位置を占有するＤＮＡの遺伝子または非コード領域いくつかの代替の形態の１つである。対立遺伝子という用語は、これらに限定されないが、細菌、ウイルス、真菌、原生生物、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物、および古細菌を含めた任意の生物体に由来するＤＮＡを説明するために使用することができる。
本明細書で使用される「対立遺伝子の比率（ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｌｅｌｅｓ）」または「対立遺伝子の比率（ａｌｌｅｌｉｃ ｒａｔｉｏ）」という用語は、試料中の一方の対立遺伝子の集団と他方の対立遺伝子の集団の比率を指す。いくつかのトリソミーの症例では、胎児の特定の遺伝子座が三対立遺伝子である可能性がある。そのような場合では、「対立遺伝子の比率」という用語は、いずれか１つの対立遺伝子の集団の、他の対立遺伝子の１つに対する比率、またはいずれか１つの対立遺伝子の、他の２つの対立遺伝子に対する集団の比率を指す。
本明細書で使用される「多型に基づかない定量的方法」という用語は、被検体（例えば、全核酸、Ｙ染色体核酸、または胎児核酸）の量を決定するための、多型マーカーまたは多型配列の使用を必要としない方法を指す。多型は配列に存在し得るが、前記多型は、配列を数量化するために必要ない。多型に基づかない定量的方法の例としては、これらに限定されないが、ＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、アレイに基づく方法、配列決定方法、ナノポアに基づく方法、核酸が結合したビーズに基づく計数方法および競合剤ベースの方法が挙げられ、そこでは１つ以上の被検体の量を決定するために、１つ以上の競合剤を既知濃度（複数可）で導入する。一部の実施形態では、上記の典型的な方法（例えば、配列決定）のいくつかは、１つ以上の多型を調べないように積極的に改変または設計することを必要とする場合がある。
本明細書で使用される「絶対量」または「コピー数」という用語は、被検体（例えば、全核酸または胎児核酸）の量または数量を指す。本発明は、混合母体試料中の胎児核酸の絶対量を決定するための組成物およびプロセスを提供する。絶対量またはコピー数は、検出するために利用可能な分子の数を表し、単位当たりのゲノム等価物として表すことができる。「濃度」という用語は、混合物または溶液中の物質の量または割合（例えば、母体核酸および胎児核酸の混合物を含む母体試料中の胎児核酸の量）を指す。濃度は、ある数量が、別の数量に対してどのくらい大きいか／小さいかを１００分の１として表すために使用する百分率として表すことができる。被検体（例えば、標的核酸）の数量または量を決定するためのプラットフォームとしては、これらに限定されないが、質量分析、デジタルＰＣＲ、合成プラットフォーム（例えば、ピロシーケンス）による配列決定、蛍光分光法およびフローサイトメトリーが挙げられる。
本明細書で使用される「試料」という用語は、核酸を含有する検体を指す。試料の例としては、これらに限定されないが、組織、体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、腹腔液、腹水、膣分泌物、乳汁、母乳、リンパ液、脳脊髄液または粘膜分泌物）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚、２細胞の胚、４細胞の胚、８細胞の胚、１６細胞の胚、３２細胞の胚、６４細胞の胚、１２８細胞の胚、２５６細胞の胚、５１２細胞の胚、１０２４細胞の胚、胚組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、または他の体滲出液、排泄物、個々の細胞またはその細胞の核酸を含有する供給源の抽出物、およびミトコンドリアなどの細胞下組織が挙げられ、当技術分野でよく確立されたプロトコールを使用する。
胎児のＤＮＡは、これらに限定されないが、母体の血液、母体の血清、母体の血漿、胎児の細胞、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、尿、唾液、肺洗浄液、細胞または組織を含めた供給源から得ることができる。
本明細書で使用される「血液」という用語は、妊娠中の女性または妊娠の可能性について検査されている女性からの血液試料または調製物を指す。この用語は、血清および血漿などの全血または血液の任意の画分を包含し、慣習的に定義される。
本明細書で使用される「亜硫酸水素塩」という用語は、メチル化されたシトシンを化学的に修飾せずに、シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に化学的に変換することができ、したがって、ＤＮＡのメチル化状態に基づいてＤＮＡ配列を示差的に修飾するために使用することができる、亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸水素塩の全種類を包含する。
本明細書で使用される、メチル化されたＤＮＡまたはメチル化されていないＤＮＡを「示差的に修飾する」試薬は、メチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡに由来する産物を区別することができるプロセスにおいて、メチル化されたＤＮＡおよび／またはメチル化されていないＤＮＡを修飾し、それによってＤＮＡのメチル化状態を同定することを可能にする任意の試薬を包含する。そのようなプロセスとしては、これらに限定されないが、化学反応（例えば、亜硫酸水素塩によるＣ．ｆｗｄａｒｗ．Ｕ変換など）および酵素処理（例えばメチル化依存性エンドヌクレアーゼによる切断）を挙げることができる。したがって、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断または消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化されている場合に、ＤＮＡ分子をはるかに高効率で切断または消化することができる酵素であり、一方、メチル化されていないＤＮＡを優先的に切断または消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化されていない場合に有意に高い効率を示す。
本明細書で使用される「亜硫酸水素塩に基づかない方法」および「亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法」という用語は、メチルされた核酸またはメチル化されていない核酸を数量化するための、亜硫酸水素塩の使用を必要としない任意の方法を指す。この用語は、数量化される核酸を調製するための、亜硫酸水素塩処理を必要としない方法も指す。亜硫酸水素塩に基づかない方法の例としては、これらに限定されないが、１つ以上のメチル化感受性酵素を使用して核酸を消化するための方法、およびメチル化状態に基づいて核酸に結合する作用剤を使用して核酸を分離するための方法が挙げられる。
「メチル感受性酵素」および「メチル化感受性制限酵素」という用語は、活性がそれらのＤＮＡ認識部位のメチル化状態に左右されるＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼである。例えば、それらのＤＮＡ認識配列がメチル化されていない場合にのみ、そこで切断または消化するメチル感受性酵素がある。したがって、メチル化されていないＤＮＡ試料は、メチル化されたＤＮＡ試料よりも小さな断片に切り取られる。同様に、高メチル化されたＤＮＡ試料は切断されない。対照的に、それらのＤＮＡ認識配列がメチル化されている場合にのみ、そこで切断するメチル感受性酵素がある。本明細書で使用される「切断する」、「切り取る」および「消化する」という用語は互換的に使用される。
本明細書で使用される「標的核酸」という用語は、核酸が妊娠に関連する障害または染色体異常の一部分であるかどうかを決定するために、本明細書に開示されている方法を使用して検査される核酸を指す。例えば、ダウン症候群を検出するために、第２１染色体に由来する標的核酸を本発明の方法を使用して検査することができる。
本明細書で使用される「対照核酸」という用語は、核酸が染色体異常の一部分であるかどうかを決定するために、本明細書に開示されている方法に従って参照核酸として使用する核酸を指す。例えば、第２１染色体以外の染色体に由来する対照核酸（本発明において「参照染色」と称される）は、ダウン症候群を検出するための参照配列であってよい。一部の実施形態では、対照配列は既知数量または所定の数量である。
本明細書で使用される「配列特異的な」または「遺伝子座に特異的な方法」という用語は、核酸を、ゲノム内の特定の場所（または遺伝子座）において配列組成に基づいて調べる（例えば、数量化する）方法を指す。配列特異的または遺伝子座に特異的な方法により、特定の領域または染色体を数量化することが可能になる。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の制御に関与するコード領域（リーダーおよびトレーラー）の前の領域および後ろの領域、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。
本出願では、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーにあてはまる。本明細書で使用される場合、この用語は、全長のタンパク質（すなわち、抗原）を含めた任意の長さのアミノ酸の鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は、共有結合性のペプチド結合によって連結されている。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマカルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。
アミノ酸は、本明細書では一般に公知の３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎよって推奨されている１文字記号のいずれかで称することができる。ヌクレオチドは、同様にそれらの一般に認められている１文字コードで称することができる。
本明細書で使用される「プライマー」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅方法において、例えば、第２１染色体上のＣｐＧ島ＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９Ａ、またはＣＧＩ００９内にさまざまなメチル化状態で位置するゲノム配列などの特定のゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列に基づいてヌクレオチド配列を増幅するために使用することができるオリゴヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列を増幅するための少なくとも１つのＰＣＲプライマーは、その配列に対して配列特異的である。「鋳型」という用語は、本発明において増幅のために使用することができる任意の核酸分子を指す。天然では二本鎖でないＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして使用するために二本鎖ＤＮＡにすることができる。多数の異なる二本鎖ＤＮＡ分子を含有する任意の二本鎖ＤＮＡまたは調製物を、鋳型ＤＮＡに含有される対象の遺伝子座（複数可）を増幅するための鋳型ＤＮＡとして使用することができる。
本明細書で使用される「増幅反応」という用語は、核酸を１回または複数回コピーするためのプロセスを指す。実施形態において、増幅方法は、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応、自家持続配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の急速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅、鎖置換増幅またはスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応を含む。一部の実施形態では、例えばデジタルＰＣＲによって核酸の単一分子を増幅する。
本明細書で使用される「感度」という用語は、真陽性の数を、真陽性の数と偽陰性の数を足した数で割った数を指し、感度（ｓｅｎｓ）は０≦ｓｅｎｓ≦１の範囲内になり得る。理想的には、本明細書における方法の実施形態は、ゼロと等しい、またはゼロとほぼ等しい偽陰性の数を有し、したがって、対象が実際に少なくとも１つの染色体異常または他の遺伝的障害を有する場合に、少なくとも１つの染色体異常または他の遺伝的障害を有さないと間違って同定される対象はいない。逆に、査定は多くの場合、感度に対する補完的な測定である、陰性を正確に分類するための予測アルゴリズムの能力で成り立っている。本明細書で使用される「特異性」という用語は、真陰性の数を、真陰性の数と偽陽性の数を足した数で割った数を指し、感度（ｓｐｅｃ）は、０≦ｓｐｅｃ≦１の範囲内であり得る。理想的には、本明細書における方法の実施形態は、ゼロと等しい、またはゼロとほぼ等しい偽陽性の数を有し、したがって、対象が、査定されている染色体異常、他の遺伝的障害を有さない場合に、少なくとも１つの染色体異常、他の遺伝的障害を有すると間違って同定される対象はいない。したがって、１と等しい、または１００％の感度および特異性を有する方法を時には選択する。
１つ以上の予測アルゴリズムを使用して、有意性を決定すること、または、互いと独立して、または互いに依存的に考量することができる可変条件下で収集された検出データを意味づけることができる。本明細書で使用される「可変性の」という用語は、値または値のセットを有するアルゴリズムの因子、数量、または機能を指す。例えば、変数は、増幅する核酸種のセットの設計、増幅する核酸種のセットの数、試験する胎児の遺伝的寄与の百分率、試験する母体の遺伝的寄与の百分率、アッセイする染色体異常の種類、アッセイする遺伝的障害の種類、アッセイする伴性異常の種類、母親の年齢などであってよい。本明細書で使用される「独立した」という用語は、他者の影響を受けていないこと、または他者によって調節されていないことを指す。本明細書で使用される「依存的な」という用語は、他者影響を受けていること、または他者によって調節されていることを指す。例えば、特定の染色体と、その特定の染色体に起こっている生存可能な存在物をもたらすトリソミー事象は、互いに依存的な変数である。
当業者は、本発明のデータに許容できる感度および／または特異性の範囲で有意性を与えるために、任意の種類の方法または予測アルゴリズムを使用することができる。例えば、カイ二乗検定、ｚ検定、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ（分散分析）、回帰分析、神経回路網、ファジー論理、隠れマルコフモデル、多重モデル状態推定などの予測アルゴリズムを使用することができる。本発明の異なる独立した変数および／または依存的な変数を有するデータに有意性を与えるように、１つ以上の方法または予測アルゴリズムを決定することができる。また、本発明の異なる独立した変数および／または依存的な変数を有するデータに有意性を与えないように、１つ以上の方法または予測アルゴリズムを決定することができる。１つ以上の予測アルゴリズムの結果に基づいて、本明細書に記載の方法の異なる変数のパラメータを設計または変更することができる（例えば、分析するセットの数、各セット内のヌクレオチド種の種類）。例えば、検出データにカイ二乗検定を適用することにより、特定の範囲の母体の年齢が、特定の染色体異常を持つ出生児を有する可能性が高いことと相関があり、したがって、母体の年齢変数を、他の変数と同じように考量するのと対照して、異なるように考量してよいことが示唆され得る。
特定の実施形態では、いくつかのアルゴリズムを選択して試験することができる。これらのアルゴリズムを、生のデータを用いて訓練することができる。新しい生データ試料のそれぞれについて、訓練されたアルゴリズムにより、その試料に分類が割り当てられる（すなわちトリソミーまたは正常）。新しい生データ試料の分類に基づいて、訓練されたアルゴリズムの性能を感度および特異性に基づいて査定することができる。最終的に、感度および／または特異性が最も高いアルゴリズムまたはその組み合わせを同定することができる。
詳細な説明
諸言
母体の血漿中の胎児核酸の存在は、１９９７年に最初に報告され、それにより単に母体の血液試料を分析することによる、非侵襲的な出生前診断の可能性が提供されている（Ｌｏら、Ｌａｎｃｅｔ、３５０巻：４８５〜４８７頁、１９９７年）。現在まで、多数の潜在的な臨床的適用が開発されてきた。具体的には、胎児核酸、例えばＤＮＡの定量的な異常、母体の血漿中の濃度が、子癇前症、早期分娩、分娩前出血、侵襲的な胎盤形成、胎児のダウン症候群、および他の胎児の染色体異数性を含めたいくつもの妊娠に伴う障害に関連することが見いだされた。したがって、母体の血漿中の胎児核酸を分析することにより、胎児母体の良好な状態をモニターするための有力な機構が表される。
しかし、胎児のＤＮＡは、バックラウンドの母体の血漿中の母体のＤＮＡと共存している。したがって、大部分の報告された適用は、Ｙ染色体の配列が、母体のＤＮＡから最も都合よく区別可能であるので、Ｙ染色体の配列を検出することに頼っている。そのような手法では、現存するアッセイの適用性が全妊娠の５０％のみ、すなわち、男の胎児の妊娠に限られている。したがって、母体試料に由来する胎児核酸を富化し、分析するための性別に依存しない組成物および方法の開発が大いに必要とされている。また、胎児核酸を数量化するために多型マーカーに頼る方法は、異なる民族性にわたって、さまざまなヘテロ接合率を受けやすく、それによってそれらの適用性が限定される可能性がある（例えば、必要とされるマーカーの数が増加することにより）。
胎児のＤＮＡおよび母体のＤＮＡを、それらのメチル化状態の差によって区別することができることが以前実証された（これによって参照により組み込まれる米国特許第６，９２７，０２８号）。メチル化は、後成的な現象であり、ＤＮＡ配列の変化を伴わずに表現型を変化させるプロセスを指す。母親と胎児との間のＤＮＡのメチル化状態の差を利用することによって、母体核酸のバックラウンドの中で胎児核酸を首尾よく検出し、分析することができる。
本出願人らは、胎児に由来する胎児のＤＮＡ（例えば、胎盤由来）と母親由来、例えば末梢血細胞に由来する母体のＤＮＡとの間で示差的にメチル化されている新規のゲノムポリヌクレオチドを提供する。したがって、この発見により、非侵襲的な出生前診断のために使用することができる、胎児のゲノムＤＮＡと母体のゲノムＤＮＡを区別するための新しい手法、および胎児核酸を正確に数量化する新しい方法が提供される。
方法体系
本発明の実施には、分子生物学の分野における常套的な技法を利用する。本発明において使用する一般的な方法が開示されている基本的なテキストとしては、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年））が挙げられる。
核酸に関して、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで示されている。これらは、配列決定された核酸から、または公開されているＤＮＡ配列から、アガロースゲル電気泳動またはアクリルアミドゲル電気泳動で得られる推定値である。タンパク質に関して、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基の数で示されている。タンパク質のサイズは、配列決定されたタンパク質から、誘導アミノ酸配列、または公開されているタンパク質配列からの、ゲル電気泳動での推定値である。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２２巻：１８５９〜１８６２頁（１９８１年）に最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２巻：６１５９〜６１６８頁（１９８４年）に記載の自動合成機を使用して化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の当技術分野で認められている戦略、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｒｅａｎｉｅｒ、Ｊ． Ｃｈｒｏｍ．、２５５巻：１３７〜１４９頁（１９８３年）に記載のネイティブなアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して実施する。
血液試料の取得およびＤＮＡの抽出
本発明は、妊娠に付随する状態または障害の存在を検出するための、および／またはその進行をモニターするための非侵襲的な手段として、母体の血液中に見られる胎児のＤＮＡを分離、富化および分析することに関する。したがって、本発明の実施の最初の工程は、妊娠中の女性から血液試料を得、試料からＤＮＡを抽出することである。
Ａ．血液試料の取得
血液試料を、本発明の方法を使用して試験するために適した妊娠期間にある妊娠中の女性から得る。適切な妊娠期間は、以下に考察するように、試験される障害に応じて変動し得る。女性からの採血を、病院または診療所が一般に従う標準のプロトコールに従って実施する。適量、例えば、一般には５〜５０ｍｌの末梢血を採取し、さらに調製する前に標準手順に従って貯蔵することができる。血液試料は、試料中に存在する核酸の質の劣化を最小限にするための当業者に公知の様式で採取、貯蔵または輸送する。
Ｂ．血液試料の調製
本発明による母体の血液中に見られる胎児のＤＮＡの分析は、例えば、全血、血清、または血漿を使用して実施することができる。母体の血液から血清または血漿を調製するための方法は当業者に周知である。例えば、妊娠中の女性の血液は、血液凝固を予防するためにＥＤＴＡを含有するチューブまたはＶａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）などの専門の市販品の中に置き、次いで、遠心分離によって全血から血漿を得ることができる。他方では、血清は、血液凝固後に遠心分離して、または遠心分離せずに得ることができる。遠心分離を使用する場合、次いで、これに限らないが、適切なスピード、例えば、１，５００〜３，０００倍ｇで行うことが一般的である。血漿または血清を、ＤＮＡを抽出するために新しいチューブに移す前に追加的な遠心分離工程に供することができる。
ＤＮＡは、全血の無細胞部分に加えて、女性からの全血試料を遠心分離し、血漿を除去した後に得ることができる、軟膜部分に富化された細胞画分から回収することもできる。
Ｃ．ＤＮＡの抽出
血液を含めた生体試料からＤＮＡを抽出するための多数の公知の方法がある。ＤＮＡの調製の一般的な方法（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年に記載されている）に従うことができる；さまざまな市販の試薬またはキット、例えばＱｉａｇｅｎのＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ＫｉｔまたはＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ
Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＧＦＸ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）も、妊娠中の女性に由来する血液試料からＤＮＡを得るために使用することができる。これらの方法の２つ以上の組み合わせも使用することができる。
一部の実施形態では、まず、試料を、１つ以上の方法によって胎児核酸について富化する、または相対的に富化することができる。例えば、胎児のＤＮＡおよび母体のＤＮＡの識別は、本発明の組成物およびプロセスを単独で、または他の識別因子と組み合わせて使用して実施することができる。これらの因子の例としては、これらに限定されないが、Ｘ染色体とＹ染色体との間の一塩基の差、Ｙ染色体特異的な配列、ゲノム内の他の所に位置する多型、胎児のＤＮＡと母体のＤＮＡとの間のサイズの差、および母体の組織と胎児の組織との間のメチル化パターンの差が挙げられる。
試料を核酸の特定の種について富化するための他の方法は、全てがこれによって参照により組み込まれる、２００７年５月３０日出願のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／６９９９１、２００７年６月１５日出願のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７１２３２、米国特許仮出願第６０／９６８，８７６号および同第６０／９６８，８７８号（出願者に譲渡されている）（２００５年１１月２８日出願のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０５／０１２７０７）に記載されている。特定の実施形態では、母体核酸を試料から選択的に除去する（部分的に、実質的に、ほぼ完全に、または完全に、のいずれかで）。
核酸のメチル化特異的な分離
本明細書において提供される方法により、示差的にメチル化されたＤＮＡのメチル化特異的な分離に基づいて胎児のＤＮＡを富化するための代替の手法が提供される。発生制御に関与する多くの遺伝子が、胚性幹細胞におけるエピジェネティクスによって調節されていることが最近見いだされた。したがって、多数の遺伝子は、胎児起源の核酸と母体起源の核酸との間の示差的なＤＮＡのメチル化を示すと予測することができる。これらの領域が同定されたら、メチル化されたＤＮＡを捕捉するための技法を使用して、胎児のＤＮＡを特異的に富化することができる。示差的にメチル化された領域を同定するために、新規の手法を使用してメチル化されたＤＮＡを捕捉した。この手法では、ＭＢＤ２のメチル結合ドメインが抗体のＦｃ断片と融合しているタンパク質（ＭＢＤ−ＦＣ）を使用する（Ｇｅｂｈａｒｄ Ｃ、Ｓｃｈｗａｒｚｆｉｓｃｈｅｒ Ｌ、Ｐｈａｍ ＴＨ、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ｅ、Ｋｌｕｇ Ｍ、Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ Ｒ、Ｒｅｈｌｉ Ｍ（２００６年）Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ａｂｅｒｒａｎｔ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ、６６巻：６１１８〜６１２８頁）。この融合タンパク質は、従来のメチル化特異的抗体と比較して、いくつかの有利な点を有する。ＭＢＤ−ＦＣは、メチル化されたＤＮＡに対して高い親和性を有し、二本鎖ＤＮＡに結合する。最も重要なことに、２つのタンパク質は、ＤＮＡへの結合の仕方が異なる。メチル化特異的抗体は、確率論的にＤＮＡに結合し、これは、二者択一の答えのみを得ることができることを意味する。ＭＢＤ−ＦＣのメチル結合ドメインは、他方ではＤＮＡ分子のメチル化状態にかかわらず、全てのＤＮＡ分子に結合する。このタンパク質−ＤＮＡ相互作用の強度は、ＤＮＡのメチル化のレベルによって定義される。ゲノムＤＮＡに結合させた後、塩濃度を増加させた溶出液を使用して、メチル化されていないＤＮＡおよびメチル化されたＤＮＡを分画し、より調節された分離を可能にすることができる（Ｇｅｂｈａｒｄ Ｃ、Ｓｃｈｗａｒｚｆｉｓｃｈｅｒ Ｌ、Ｐｈａｍ ＴＨ、Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ Ｒ、Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ Ａ、Ｒｅｈｌｉ Ｍ（２００６年）Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ（ＭＢ）−ＰＣＲ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３４巻：ｅ８２頁）。したがって、メチル−ＣｐＧ免疫沈降（ＭＣＩＰ）と称されるこの方法では、ゲノムＤＮＡが富化するだけでなく、メチル化のレベルに従って分画することもでき、これはメチル化されていないＤＮＡ画分も同様に調査するべきである場合に特に役立つ。
メチル化感受性制限酵素による消化
本発明は、母体試料に由来する胎児核酸の量を決定するための組成物およびプロセスも提供する。本発明により、母体核酸を選択的に、かつ完全に、または実質的に消化して試料を少なくとも１つの胎児核酸領域について富化する酵素を用いて前記母体試料に由来する核酸を選択的に消化することによって、母体試料中の胎児核酸領域を富化することが可能になる。消化効率は、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えることが好ましい。富化した後、胎児核酸の量を、多型配列または亜硫酸水素塩処理を必要としない定量的方法によって決定することができ、それによって、女の胎児に対して、かつ異なる民族性にわたって同等に良好に働き、低コピー数の胎児試料中に存在する核酸を保存する解決法が提供される。
例えば、そのＤＮＡ認識配列がメチル化されていない場合に、優先的に、または実質的にそのＤＮＡ認識配列で切断または消化するメチル感受性酵素がある。したがって、メチル化されていないＤＮＡ試料は、メチル化されたＤＮＡ試料よりも小さな断片に切り取られる。同様に、高メチル化されたＤＮＡ試料は切断されない。対照的に、そのＤＮＡ認識配列がメチル化されている場合にのみ、そのＤＮＡ認識配列で切断するメチル感受性酵素がある。
本発明の方法において使用するために適した、メチル化されていないＤＮＡを消化するメチル感受性酵素としては、これらに限定されないが、ＨｐａＩＩ、ＨｈａＩ、ＭａｅＩＩ、ＢｓｔＵＩおよびＡｃｉＩが挙げられる。使用することができる酵素は、メチル化されていないＣＣＧＧ配列のみを切り取るＨｐａＩＩである。使用することができる別の酵素は、メチル化されていないＧＣＧＣ配列のみを切り取るＨｈａＩである。どちらの酵素も、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）、Ｉｎｃから入手可能である。メチル化されていないＤＮＡのみを消化する２種以上のメチル感受性酵素の組み合わせも使用することができる。メチル化されたＤＮＡのみを消化する適切な酵素としては、これらに限定されないが、認識配列ＧＡＴＣで切り取るＤｐｎＩ、およびＡＡＡ＋タンパク質ファミリーに属し、修飾されたシトシンを含有するＤＮＡを切り取り、認識部位５’．．．ＰｕｍＣ（Ｎ４０−３０００）ＰｕｍＣ．．．３’で切り取るＭｃｒＢＣ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）が挙げられる。
特定の部位でＤＮＡを切り取るために選択された制限酵素についての切断の方法および手順は、当業者に周知である。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｒｏ−Ｍｅｇａ Ｂｉｏｃｈｅｍｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍなどを含めた多くの制限酵素の供給者が、特定の制限酵素によって切り取られるＤＮＡ配列の条件および種類の情報を提供している。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照されたい）は、制限酵素および他の酵素を使用するための方法についての一般的な説明を提供している。酵素は、多くの場合、母体のＤＮＡを約９５％〜１００％の効率で、好ましくは約９８％〜１００％の効率で切断すること可能にする条件下で使用する。
メチル化解析のための他の方法
さまざまなメチル化解析の手順が当技術分野で公知であり、本発明と併せて使用することができる。これらのアッセイにより、ＤＮＡ配列内の１つ以上のＣｐＧ島のメチル化状態を決定することが可能になる。さらに、これらの方法は、メチル化された核酸を数量化するために使用することができる。そのようなアッセイは、他の技法の中でも、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡをＤＮＡ配列決定すること、ＰＣＲ（配列特異的に増幅するための）、サザンブロット分析、およびメチル化感受性制限酵素の使用を伴う。
ゲノム配列決定は、ＤＮＡのメチル化のパターンおよび５−メチルシトシン分布を解析することに関して、亜硫酸水素塩処理を使用することによって簡易化されてきた技法である（Ｆｒｏｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：１８２７〜１８３１頁、１９９２年）。さらに、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物の制限酵素消化を使用することができる。例えば、Ｓａｄｒｉ ＆ Ｈｏｒｎｓｂｙ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４巻：５０５８〜５０５９頁、１９９６年）に記載されている方法、またはＣＯＢＲＡ（組み合わせ亜硫酸水素塩制限酵素分析）（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：２５３２〜２５３４頁、１９９７年）。
ＣＯＢＲＡ解析は、少量のゲノムＤＮＡ内の特定の遺伝子の遺伝子座におけるＤＮＡのメチル化のレベルを決定するために有用な定量的メチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：２５３２〜２５３４頁、１９９７年）。簡単に述べると、制限酵素消化を使用して、亜硫酸水素ナトリウムで処理したＤＮＡのＰＣＲ産物におけるメチル化依存性の配列の差を示す。まず、Ｆｒｏｍｍｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：１８２７〜１８３１頁、１９９２年）に記載されている手順に従って、標準の亜硫酸水素塩処理によってゲノムＤＮＡにメチル化依存性の配列の差を導入する。次いで、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡのＰＣＲ増幅を、対象とするＣｐＧ島に特異的なプライマーを使用して実施し、その後、制限エンドヌクレアーゼによって消化し、ゲル電気泳動し、特異的な、標識したハイブリダイゼーションプローブを使用して検出する。元のＤＮＡ試料中のメチル化のレベルは、広範なＤＮＡのメチル化のレベルにわたって直線的に定量化されるように、消化されたＰＣＲ産物と消化されなかったＰＣＲ産物の相対的な量で表される。さらに、この技法は、顕微解剖したパラフィン包埋組織試料から得たＤＮＡに確実に適用することができる。ＣＯＢＲＡ解析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＣＯＢＲＡに基づくキットに見ることができるような）としては、これらに限定されないが、特定の遺伝子（または、メチル化を変化させたＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）に対するＰＣＲプライマー；制限酵素および適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴ；対照ハイブリダイゼーションオリゴ；オリゴプローブ用のキナーゼ標識化キット；および放射性ヌクレオチドを挙げることができる。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収用の試薬またはキット（例えば、沈澱、限外濾過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化緩衝液；およびＤＮＡ回収用構成成分を含んでよい。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲ工程の後にさらなる操作を必要としない、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））技術を利用するハイスループットな定量的メチル化アッセイである（Ｅａｄｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５９巻：２３０２〜２３０６頁、１９９９年）。簡単に述べると、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスは、標準の手順（メチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩プロセス）に従って、亜硫酸水素ナトリウム反応においてメチル化依存性の配列の差の混合プールに変換されるゲノムＤＮＡの混合試料で開始する。次いで、蛍光に基づくＰＣＲを、「偏りのない」（公知のＣｐＧのメチル化部位とオーバーラップしないプライマーを用いる）ＰＣＲ反応、または「偏りのある」（公知のＣｐＧジヌクレオチドとオーバーラップするＰＣＲプライマーを用いる）反応のいずれかにおいて実施する。配列の識別は、増幅プロセスのレベルまたは蛍光検出プロセスのレベルのいずれかで、またはその両方で起こってよい。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは、ゲノムＤＮＡ試料におけるメチル化パターンの定量的試験として使用することができ、配列の識別はプローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量的バージョンでは、ＰＣＲ反応により、特定の推定メチル化部位とオーバーラップする蛍光プローブの存在下で偏りのない増幅がもたらされる。投入ＤＮＡの量についての偏りのない対照は、プライマーもプローブも、ＣｐＧジヌクレオチドのいずれの上にも重ならない反応によってもたらされる。あるいは、ゲノムのメチル化についての定性的試験は、公知のメチル化部位を「カバーしない」対照オリゴヌクレオチドを用いて（「ＭＳＰ」技法の蛍光に基づくバージョン）、または潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドを用いてのいずれかで、偏りのあるＰＣＲプールを探査することによって実現する。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔプロセスは、増幅プロセスにおいて「ＴａｑＭａｎ」プローブと一緒に使用することができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用する；例えば、偏りのあるプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、または偏りのないプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのいずれかを用いる２セットのＰＣＲ反応の１つに供す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光の「レポーター」分子および「クエンチャー」分子で２重標識されており、また、ＧＣ含有量が比較的高い領域に対して特異的になるように設計され、したがって、ＰＣＲサイクルにおいて、フォワードプライマーまたはリバースプライマーよりも約１０℃高い温度で融解する。これにより、ＰＣＲのアニーリング／伸長工程の間中ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを完全にハイブリダイズさせたままにすることが可能になる。新しい鎖がＰＣＲ中にＴａｑポリメラーゼによって酵素的に合成され、最終的にアニーリングされたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに到達する。そこでＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのエンドヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが消化されて退けられ、リアルタイム蛍光検出システムを使用して今やクエンチされていない信号を定量的に検出するための蛍光レポーター分子が放出される。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）分析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）に基づくキットに見ることができるような）としては、これらに限定されないが、特定の遺伝子（またはメチル化を変化させたＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）に対するＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；およびＴａｑポリメラーゼを挙げることができる。
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、特定のＣｐＧ部位におけるメチル化の差を、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理、その後の一塩基プライマー伸長に基づいて査定するための定量的方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：２５２９〜２５３１頁、１９９７年）。
簡単に述べると、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて、５−メチルシトシンは変化させずに、メチル化されていないシトシンをウラシル変換する。次いで、亜硫酸水素塩で変換したＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して所望の標的配列の増幅を実施し、生じた産物を単離し、対象のＣｐＧ部位（複数可）メチル化解析のための鋳型として使用する。
少量のＤＮＡ（例えば、顕微解剖した病理切片）を分析することができ、ＣｐＧ部位におけるメチル化状態を決定するために制限酵素を利用することが回避される。
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ解析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥに基づくキットに見ることができるような）としては、これらに限定されないが、特定の遺伝子（またはメチル化を変化させたＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）に対するＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；陽性対照プライマー；特定の遺伝子に対するＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；反応緩衝液（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応用）；および放射性ヌクレオチドを挙げることができる。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収用の試薬またはキット（例えば、沈澱、限外濾過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化緩衝液；およびＤＮＡ回収用構成成分を含んでよい。
ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）により、メチル化感受性制限酵素の使用に依存せずにＣｐＧ島内の実質的にあらゆるグループのＣｐＧ部位のメチル化状態を査定することが可能になる（Ｈｅｒｍａｎら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３巻：９８２１〜９８２６頁、１９９６年；米国特許第５，７８６，１４６号）。簡単に述べると、ＤＮＡを、全てのメチル化されていないシトシンをウラシルに変換するが、メチル化されたシトシンは変換しない亜硫酸水素ナトリウムによって修飾し、その後、メチル化されたＤＮＡ特異的なプライマーに特異的なプライマーと、対するメチル化されていないＤＮＡに特異的なプライマーを用いて増幅する。ＭＳＰは少数のＤＮＡのみを必要とし、所与のＣｐＧ島遺伝子座の０．１％のメチル化された対立遺伝子に対する感度が高く、また、パラフィン包埋した試料から抽出したＤＮＡに対して実施することができる。ＭＳＰ解析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭＳＰに基づくキットに見ることができるような）としては、これらに限定されないが、特定の遺伝子（またはメチル化を変化させたＤＮＡ配列またはＣｐＧ島）に対するメチル化されたＰＣＲプライマーおよびメチル化されていないＰＣＲプライマー、最適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、および特異的なプローブを挙げることができる。
ＭＣＡ法は、ゲノムＤＮＡ内の変化したメチル化パターンをスクリーニングするため、およびにこれらの変化に関連する特定の配列を単離するために使用することができる方法である（Ｔｏｙｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９巻：２３０７〜１２頁、１９９９年）。簡単に述べると、その認識部位におけるシトシンのメチル化に対する感受性が異なる制限酵素を使用して、原発腫瘍、細胞系、および正常組織に由来するゲノムＤＮＡを消化した後、任意プライムＰＣＲ増幅する。示差的なメチル化を示す断片をクローニングし、ＰＣＲ産物を高分解能のポリアクリルアミドゲルにおいて分離した後に配列決定する。次いで、クローニングされた断片をサザン分析用のプローブとして使用して、これらの領域の示差的なメチル化を確認する。ＭＣＡ解析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭＣＡに基づくキットに見ることができるような）としては、これらに限定されないが、任意プライムゲノムＤＮＡに対するＰＣＲプライマー；ＰＣＲ緩衝液およびヌクレオチド、制限酵素および適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴまたはプローブ；対照ハイブリダイゼーションオリゴまたはプローブを挙げることができる。
メチル化部位を解析するための別の方法は、その後の、質量分析を使用するプライマー伸長遺伝子型決定分析のための増幅された標的を産生する最適化されたＰＣＲ増幅反応を含めた、プライマー伸長アッセイである。アッセイは、多重に行うこともできる。この方法（特に一塩基多型の遺伝子型決定に関する）は、ＰＣＴ公開ＷＯ０５０１２５７８Ａ１および米国特許出願公開ＵＳ２００５００７９５２１Ａ１に詳細に記載されている。メチル化解析するために、このアッセイを採用して、亜硫酸水素塩によって導入されたメチル化依存的なＣからＴへの配列の変化を検出することができる。これらの方法は、プライマー伸長反応について、処理量をさらに増加させ、反応当たりの費用を低下させるために、単一ウェルにおける多重化された増幅反応および多重化されたプライマー伸長反応（例えば、多重化均一プライマー集団伸長（（ｈＭＥ）アッセイ）を実施するために特に有用である。
ＤＮＡのメチル化解析のための４つの追加的な方法として、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ＲＬＧＳ、Ｃｏｓｔｅｌｌｏら、２０００年）、メチル化感受性代表差分析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＭＳ−ＲＤＡ）、メチル化特異的ＡＰ−ＰＣＲ（ＭＳ−ＡＰ−ＰＣＲ）および部分的に融解した分子（ＭＢＤ／ＳＰＭ）のメチル−ＣｐＧ結合ドメインカラム／分離が挙げられる。
本発明と併せて使用することができる追加的なメチル化解析方法は、以下の論文に記載されている：Ｌａｉｒｄ、Ｐ．Ｗ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ、３巻、２５３〜２６６頁（２００３年）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｕｈｌｍａｎｎ、Ｋ．ら Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３巻：４０７２〜４０７９頁（２００２年）−ＰｙｒｏＭｅｔｈ；Ｃｏｌｅｌｌａら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００３年７月；３５巻（１号）：１４６〜５０頁；Ｄｕｐｏｎｔ ＪＭ、Ｔｏｓｔ Ｊ、Ｊａｍｍｅｓ Ｈ、およびＧｕｔ ＩＧ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００４年１０月；３３３巻（１号）：１１９〜２７頁；およびＴｏｏｋｅ ＮおよびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｍ． ＩＶＤＴ．、２００４年１１月；４１巻。
ポリヌクレオチド配列の増幅および決定
メチル化示差的に核酸を分離した後、核酸を、配列に基づく分析に供することができる。さらに、胎児起源の１つの特定のゲノム配列が母体の等価物と比較して高メチル化されている、または低メチル化されていることが決定されたら、この胎児のゲノム配列の量を決定することができる。その後に、この量を、標準の対照値と比較することができ、またこの量は、特定の妊娠に伴う障害の潜在性の指標としての機能を果たす。
Ａ．ヌクレオチド配列の増幅
多くの場合、本発明の核酸配列は、当技術分野で周知の（上に列挙され、以下により詳細に記載されている）いくつかの核酸増幅手順のいずれかを使用して増幅することが望ましい。詳細には、核酸の増幅は、増幅されている核酸配列と相補的な配列を含有する核酸アンプリコン（コピー）の酵素的合成である。核酸を増幅することは、試料中に存在する標的配列の量が非常に低い場合に特に有益である。対象の生物体またはウイルスに属する試料中の核酸の検出をより確実にするためにアッセイの開始時に必要な標的配列が少ないので、標的配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することによってアッセイの感度をはるかに改善することができる。
種々のポリヌクレオチド増幅方法がよく確立されており、研究に頻繁に使用されている。例えば、ポリヌクレオチド配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一般的な方法は、当技術分野で周知であり、したがって、本明細書では詳細には記載していない。ＰＣＲの方法、プロトコール、およびプライマーの設計における原理の概説については、例えば、Ｉｎｎｉｓ、ら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．、１９９０年を参照されたい。ＰＣＲの試薬およびプロトコールは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓなどの民間のベンダーからも入手可能である。
ＰＣＲは、熱安定性酵素を用いた自動化されたプロセスとして最も一般的に行われている。このプロセスでは、反応混合物の温度が、変性領域、プライマーアニーリング領域、および伸長反応領域を自動的に循環する。この目的に特に適した機械は市販されている。
一般には本発明の実施において、ポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅が使用されるが、当業者は、母体の血液試料に見られるゲノム配列の増幅は、例えば、そのそれぞれが十分な増幅をもたらすものである、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介性増幅、および自家持続配列複製または核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの任意の公知の方法によって実現することができることを理解されよう。つい最近開発された分岐ＤＮＡ技術も、特定のメチル化パターンを表す本発明の特定のゲノム配列の存在を定性的に実証するため、または母体の血液中のこの特定のゲノム配列の量を定量的に決定するために使用することができる。臨床的な試料中の核酸配列を直接定量化するための分岐ＤＮＡシグナル増幅の概説については、Ｎｏｌｔｅ、Ａｄｖ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．、３３巻：２０１〜２３５頁、１９９８年を参照されたい。
本発明の組成物およびプロセスは、デジタルＰＣＲを用いて実施する場合にも特に有用である。デジタルＰＣＲは、Ｋａｌｉｎｉｎａとその同僚らによって最初に開発され（Ｋａｌｉｎｉｎａら、「Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ｓｃａｌｅ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．、２５巻；１９９９〜２００４頁、（１９９７年））、さらにＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒによって開発された（Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、９６巻；９２３６〜４１頁、（１９９９年））。胎児の診断に使用するためにデジタルＰＣＲを適用することは、Ｃａｎｔｏｒらに最初に記載され（ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ０５０２３０９１Ａ２）、その後にＱｕａｋｅらに記載されており（米国特許出願公開ＵＳ２００７０２０２５２５）、その両方がこれによって参照により組み込まれる。デジタルＰＣＲでは、単一分子レベルでの核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）の増幅を活用し、低コピー数の核酸を数量化するための、高感度の方法を提供する。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは核酸をデジタル解析するためのシステムを提供している。
Ｂ．ポリヌクレオチド配列の決定
ポリヌクレオチド配列を決定するための技法もよく確立されており、関連性のある研究分野において広く実施されている。例えば、ポリヌクレオチドを配列決定するための基本的な原理および一般的な技法は、Ｗａｌｌａｃｅら、上記；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記などの分子生物学および組換え遺伝学におけるさまざまな研究報告および専門書に記載されている。研究所において、手動または自動のいずれかで常套的に実施されるＤＮＡの配列決定方法を、本発明を実施するために使用することができる。本発明の方法を実施するための、ポリヌクレオチド配列における変化を検出するために適した追加的な手段としては、これらに限定されないが、質量分析、プライマー伸長、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、および電気泳動が挙げられる。
プライマー伸長反応の使用も、本発明の方法において適用することができる。プライマー伸長反応は、例えば、ＳＮＰ部位に隣接する領域とハイブリダイズするプライマー伸長プライマーにデオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドを組み込むことによってＳＮＰ対立遺伝子を識別することによって作動する。プライマーを、ポリメラーゼを用いて伸長する。プライマー伸長されたＳＮＰは、質量分析によって、またはビオチンなどのタグを付けた部分によって物理的に検出することができる。ＳＮＰ部位は、特異的な標識でタグを付けた相補的なデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチド、または特定の質量を持つプライマー伸長産物を生成する相補的なデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかによってのみ伸長するので、ＳＮＰ対立遺伝子を識別し、数量化することができる。
逆転写し、増幅する核酸は、修飾された核酸であってよい。修飾された核酸は、ヌクレオチド類似体を含んでよく、特定の実施形態では、検出可能な標識および／または捕捉剤を含む。検出可能な標識の例としては、これらに限定することなく、フルオロフォア、放射性同位元素、比色剤、発光剤、化学発光剤、光散乱剤、酵素などが挙げられる。捕捉剤の例としては、これらに限定することなく、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体断片、抗体／抗体受容体、抗体／プロテインＡまたはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、化学反応性基／相補的な化学反応性基（例えば、スルフヒドリル／マレイミド、スルフヒドリル／ハロアセチル誘導体、アミン／イソトリオシアネート（ｉｓｏｔｒｉｏｃｙａｎａｔｅ）、アミン／スクシンイミジルエステル、およびアミン／スルホニルハロゲン化物）対などから選択される結合対に由来する作用剤が挙げられる。特定の実施形態では、捕捉剤を有する修飾された核酸は、固体支持体に固定化することができる。
質量分析は、本発明のポリヌクレオチド、例えばＰＣＲアンプリコン、プライマー伸長産物または標的核酸から切断される検出プローブを検出するための、特に有効な方法である。ポリヌクレオチド配列の存在は、検出されたシグナルの質量を、対象のポリヌクレオチドの予測される質量と比較することによって検証する。相対的なシグナル強度、例えば、特定のポリヌクレオチド配列のスペクトルにおける質量のピークによって相対的な特定の対立遺伝子の集団が示され、したがって対立遺伝子の比率を直接データから算出することができる。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）標準ｉＰＬＥＸ（商標）アッセイおよびＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使用する遺伝子型決定方法の概説については、どちらもこれによって参照により組み込まれる、Ｊｕｒｉｎｋｅ、Ｃ．、Ｏｅｔｈ、Ｐ．、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｏｍ、Ｄ．、「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．」、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６巻、１４７〜１６４頁（２００４年）；およびＯｅｔｈ、Ｐ．ら、「ｉＰＬＥＸ（商標）Ａｓｓａｙ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｐｌｅｘｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ．」、ＳＥＱＵＥＮＯＭ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ（２００５年）を参照されたい。増幅プロセス中に切断され、質量分析によって検出される切断可能な検出プローブを使用して標的核酸を検出し、数量化することの概説については、２００７年１２月４日に出願され、これによって参照により組み込まれる米国特許出願第１１／９５０、３９５号、を参照されたい。
配列決定技術は、処理量および費用に関して改良されている。４５４プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｍ．ら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ、４３７巻、３７６〜３８０頁）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（もしくはＳｏｌｅｘａプラットフォーム）またはＳＯＬｉＤ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＨｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ単一分子ＤＮＡ配列決定技術（Ｈａｒｒｉｓ Ｔ Ｄら、２００８年Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０巻、１０６〜１０９頁）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子のリアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術、およびナノポア配列決定（Ｓｏｎｉ ＧＶおよびＭｅｌｌｅｒ Ａ．２００７年Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、５３巻：１９９６〜２００１頁）において実現可能なものなどの配列決定技術により、高次多重化で平行して、検体から単離した多くの核酸分子を配列決定することが可能になる（Ｄｅａｒ Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ、２００３年；１巻：３９７〜４１６頁）。
これらのプラットフォームのそれぞれにより、クローン的に拡大した、または増幅されなかった核酸断片の単一分子を配列決定することが可能になる。特定のプラットフォームは、例えば、（ｉ）色素で修飾したプローブのライゲーションによる配列決定（環状ライゲーションおよび切断を含めた）、（ｉｉ）ピロシーケンス、および（ｉｉｉ）単一分子の配列決定を伴う。そこから生成したヌクレオチド配列種、増幅核酸種および検出可能な産物は、そのような配列解析プラットフォームによってヌクレオチド配列を解析するための「試験核酸」とみなすことができる。
ライゲーションによる配列決定は、塩基対合のミスマッチに対するＤＮＡリガーゼの感度に頼る核酸配列決定方法である。ＤＮＡリガーゼは、正確に塩基対合しているＤＮＡの末端をつなぎ合せる。ＤＮＡリガーゼの、正確に塩基対合したＤＮＡ末端のみをつなぎ合せる能力を、蛍光標識したオリゴヌクレオチドまたはプライマーの混合プールと組み合わせることにより、蛍光検出によって配列を決定することが可能になる。より長い配列の読
み取りは、切断することが可能な標識を同定した後に切断可能な連結を含有するプライマーを含めることによって得ることができる。リンカーにおける切断により、標識が除去され、ライゲーションされたプライマーの末端の５’リン酸が再生され、別のラウンドのライゲーションのためのプライマーが調製される。一部の実施形態では、プライマーを２種以上の蛍光標識（例えば、１種の蛍光標識、２種、３種、または４種の蛍光標識）で標識することができる。
ライゲーションによる配列決定に基づいて当業者が使用することができるシステムの例は、一般に以下の工程を伴う。エマルションマイクロリアクター内で、試験核酸（「鋳型」）、増幅反応の構成成分、ビーズおよびプライマーを含有するクローンビーズの集団を調製することができる。増幅した後、鋳型を変性させ、ビーズの富化を実施して伸長した鋳型を伴うビーズと望ましくないビーズ（例えば、伸長した鋳型を伴わないビーズ）を分離する。選択されたビーズ上の鋳型は、３’修飾を受けてスライドに共有結合させることが可能になり、修飾したビーズをガラススライドに沈着させることができる。沈着チャンバーにより、ビーズローディングプロセスの間にスライドを１つ、４つ、または８つのチャンバーにセグメント化することができる。配列解析のために、プライマーをアダプター配列にハイブリダイズさせる。４色の色素で標識したプローブのセットを配列決定プライマーへのライゲーションについて競合させる。プローブライゲーションの特異性を、ライゲーションの連続の間の４番目および５番目の塩基の全てを調べることによって実現する。使用するライブラリーの種類によって決定したラウンド数で５〜７ラウンドのライゲーション、検出および切断により、全ての５番目の位置における色を記録する。ライゲーションの各ラウンド後に、１つの塩基によって５’方向に相殺される新しい相補的プライマーがさらなるライゲーションの連続のために置かれる。プライマーのリセットおよびライゲーションのラウンド（１ラウンド当たり５〜７サイクルのライゲーション）を、単一のタグに対して２５〜３５塩基対の配列が生成するまで５回、逐次的に繰り返す。メイトペア（ｍａｔｅ−ｐａｉｒｅｄ）配列決定を用いて、第２のタグについてこのプロセスを繰り返す。そのようなシステムを使用して、本明細書に記載のプロセスによって生成した増幅産物を、例えば、異種性の核酸を、本明細書に記載のプロセスによって生成した第１の増幅産物にライゲーションし、第１の増幅産物を生成するために最初に使用したものと同じ固体支持体または異なる固体支持体を使用してエマルション増幅を実施してことによって指数関数的に増幅することができる。そのようなシステムを使用して、指数関数的な増幅プロセスを迂回し、ガラススライド上の本明細書に記載の固体支持体を直接選別することによって、本明細書に記載のプロセスによって生成した増幅産物を直接分析することもできる。
ピロシーケンスは、合成による配列決定に基づく核酸の配列決定方法であり、ヌクレオチドが取り込まれた際に放出されるピロリン酸を検出することに頼る。一般に、合成による配列決定は、探索されている配列の鎖と相補的なＤＮＡ鎖である１つのヌクレオチを１つずつ合成することを伴う。試験核酸は、固体支持体に固定化し、配列決定プライマーとハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸（ｐｈｏｓｐｈｓｕｌｆａｔｅ）およびルシフェリンと一緒にインキュベートすることができる。ヌクレオチド溶液を逐次的に加え、除去する。正しいヌクレオチドの取り込みにより、ＡＴＰスルフリラーゼと相互作用し、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰを産生するピロリン酸が放出され、配列を決定することを可能にする化学発光シグナルを産生するルシフェリン反応があおられる。
ピロシーケンスに基づいて当業者が使用することができるシステムの例は、一般に以下の工程を伴う：アダプター核酸を試験核酸とラーゲーションし、試験核酸をビーズにハイブリダイズさせる工程；エマルション中で試験核酸内のヌクレオチド配列を増幅する工程；ピコリットルの多ウェル固体支持体を使用してビーズを選別する工程；および増幅されたヌクレオチド配列をピロシーケンスの方法体系によって配列決定する工程（例えば、Ｎａｋａｎｏら、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ」 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０２巻：１１７〜１２４頁（２００３年））。そのようなシステムを使用して、本明細書に記載のプロセスによって生成した増幅産物を、例えば、異種性の核酸を本明細書に記載のプロセスによって生成した第１の増幅産物とラーゲーションすることによって指数関数的に増幅することができる。
特定の単一分子の配列決定の実施形態は、合成による配列決定の原理に基づき、上首尾のヌクレオチド取り込みの結果として光子を放出する機構として単一対蛍光共鳴エネルギー転移（単一対ＦＲＥＴ）を利用する。放出された光子は多くの場合、感度を強化した、または高感度の冷却電荷結合素子を内部全反射顕微鏡（ＴＩＲＭ）と併せて使用して検出する。光子は、導入された反応溶液が、配列決定プロセスの結果として合成される成長中の核酸の鎖に取り込むための正しいヌクレオチドを含有する場合にのみ放出される。ＦＲＥＴに基づく単一分子の配列決定では、エネルギーは２つの蛍光色素、時にはポリメチンシアニン色素Ｃｙ３およびＣｙ５の間を長距離の双極子相互作用によって移動する。供与体はその特定の励起波長において励起され、励起状態のエネルギーが受容体色素に非放射的に移動し、今度はその受容体色素が励起される。受容体色素は、光子が放射放出されることによって最終的に基底状態に戻る。エネルギー転移プロセスにおいて使用される２つの色素は、単一のＦＲＥＴ対における「単一対」を表す。Ｃｙ３は、多くの場合、供与体フルオロフォアとして使用され、多くの場合、第１の標識ヌクレオチドとして取り込まれる。Ｃｙ５は、多くの場合、受容体フルオロフォアとして使用され、第１のＣｙ３標識ヌクレオチドが取り込まれた後の連続的なヌクレオチド付加のためのヌクレオチド標識として使用される。フルオロフォアは、一般に、エネルギー転移が首尾よく起こるためにそれぞれ１０ナノメートル以内である。
単一分子の配列決定に基づいて使用することができるシステムの例は、一般に、プライマーを試験核酸にハイブリダイズさせて複合体を生成する工程；複合体を固相と結びつける工程；蛍光分子を用いてタグを付けたヌクレオチドによってプライマーを反復的に伸長する工程；および各反復後に蛍光共鳴エネルギー転移シグナルの画像を捕捉する工程を伴う（例えば、米国特許第７，１６９，３１４号；Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙら、ＰＮＡＳ、１００巻（７号）：３９６０〜３９６４頁（２００３年））。そのようなシステムを使用して、本明細書に記載のプロセスによって生成した増幅産物を直接配列決定することができる。一部の実施形態では、放出された線形増幅の産物を、固体支持体、例えばビーズまたはガラススライド上に存在する固定化された捕捉配列と相補的な配列を含有するプライマーとハイブリダイズさせることができる。合成による単一のＦＲＥＴ対に基づく配列決定のために、プライマーと放出された線形増幅の産物の複合体を、固定化された捕捉配列とハイブリダイズさせることにより、放出された線形増幅の産物を固体支持体に固定化する。プライマーは多くの場合蛍光であり、したがって、固定化された核酸を有するスライドの表面の最初の参照画像を生成することができる。最初の参照画像は、真のヌクレオチドの取り込みが起こる場所を決定するために有用である。「プライマーのみ」の参照画像で最初に同定されなかったアレイの場所で検出された蛍光シグナルを非特異的蛍光として棄却する。プライマーと放出された線形増幅の産物の複合体を固定化した後、多くの場合、結合した核酸を、ａ）１つの蛍光標識したヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ伸長する工程ｂ）適切な顕微鏡、例えばＴＩＲＭを使用して蛍光を検出する工程ｃ）蛍光ヌクレオチドを除去する工程、およびｄ）異なる蛍光標識したヌクレオチドを用いて工程ａに戻る工程の反復によって平行して配列決定する。
一部の実施形態では、ヌクレオチドの配列決定は、固相一塩基配列決定の方法およびプロセスによるものであってよい。固相一塩基配列決定方法は、試料核酸と固体支持体を、試料核酸の単一分子が固体支持体の単一分子とハイブリダイズする条件下で接触させる工程を含む。そのような条件は、「マイクロリアクター」中に固体支持体分子および試料核酸の単一分子を提供することを含んでよい。そのような条件は、試料核酸分子が固体支持体上の固相核酸にハイブリダイズすることができる混合物を提供することも含んでよい。本明細書に記載の実施形態において有用な一塩基配列決定方法は、２００８年１月１７日出願の米国特許仮出願第６１／０２１，８７１号に記載されている。
特定の実施形態では、ナノポアシーケンシング検出方法は、（ａ）配列決定する核酸（「核酸塩基」、例えば、連結されたプローブ分子）を、配列特異的な検出器と、検出器が核酸塩基の実質的に相補的なサブシーケンスと特異的にハイブリダイズする条件下で接触させる工程；（ｂ）検出器からのシグナルを検出する工程、および（ｃ）検出されたシグナルに従って核酸塩基の配列を決定する工程を含む。特定の実施形態では、核酸塩基が孔を通過するにつれて検出器がナノポア構造に干渉したら、核酸塩基とハイブリダイズした検出器を核酸塩基から離れ（例えば、逐次的に解離し）、塩基配列から離れた検出器が検出される。一部の実施形態では、核酸塩基から離れた検出器は検出可能なシグナルを放出し、核酸塩基とハイブリダイズした検出器は異なる検出可能なシグナルを放出する、または検出可能なシグナルを放出しない。特定の実施形態では、核酸内のヌクレオチド（例えば、連結されたプローブ分子）を特定のヌクレオチド（「代表的なヌクレオチド」）に対応する特定のヌクレオチド配列で置換し、それによって拡大した核酸を生じさせ（例えば、米国特許第６，７２３，５１３号）、検出器を、核酸塩基としての機能を果たす拡大した核酸内の代表的なヌクレオチドとハイブリダイズさせる。そのような実施形態では、代表的なヌクレオチドを、二元配置またはそれよりも高次の配置に配置することができる（例えば、ＳｏｎｉおよびＭｅｌｌｅｒ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５３巻（１１号）：１９９６〜２００１頁（２００７年））。一部の実施形態では、核酸を拡大させず、拡大した核酸を生じさせず、核酸塩基を直接供給し、（例えば、拡大していない核酸塩基としての機能を果たす連結されたプローブ分子）、検出器を直接核酸塩基と接触させる。例えば、第１の検出器を第１のサブシーケンスとハイブリダイズさせることができ、第２の検出器を第２のサブシーケンスとハイブリダイズさせることができ、ここで第１の検出器および第２の検出器はそれぞれ、互いに区別することができる検出可能な標識を有し、第１の検出器からのシグナルおよび第２の検出器からのシグナルは、検出器が核酸塩基から離れた際に互いに区別することができる。特定の実施形態では、検出器は、核酸塩基とハイブリダイズする領域（例えば、２つの領域）を含み、それは長さが約３〜１００ヌクレオチド（例えば、長さ約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ヌクレオチド）であってよい。検出器は、核酸塩基にハイブリダイズしないヌクレオチドの領域を１つ以上含んでもよい。一部の実施形態では、検出器は、分子ビーコンである。検出器は、多くの場合、本明細書に記載のものからそれぞれ独立に選択される１種以上の検出可能な標識を含む。各検出可能な標識は、各標識によって生成されるシグナルを検出することができる任意の都合のよい検出プロセスによって検出することができる（例えば、磁気プロセス、電気的プロセス、化学的プロセス、光学的プロセスなど）。例えば、ＣＤカメラを使用して、検出器に連結された１つ以上の区別可能な量子ドットからのシグナルを検出することができる。
特定の配列解析の実施形態では、読み取りを使用して、より大きなヌクレオチド配列を構築することができ、これは、異なる読み取りにおけるオーバーラップ配列を同定すること、および読み取り内の同定配列を使用することによって容易にすることができる。読み取りからより大きな配列を構築するための配列解析方法およびソフトウェアは当業者に公知である（例えば、Ｖｅｎｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９１巻：１３０４〜１３５１頁（２００１年））。特定の配列解析の実施形態では、特定の読み取り、部分的なヌクレオチド配列構築物、および完全なヌクレオチド配列構築物を、試料核酸内のヌクレオチド配列間で比較することができる（すなわち、内部比較）、または参照配列と比較することができる（すなわち、参照比較）。内部比較は、時には、多数の試料から、または配列の変形を含有する単一の試料供給源から試料核酸を調製する状況において実施する。参照比較は、時には、参照ヌクレオチド配列が公知であり、試料核酸が、参照ヌクレオチド配列と実質的に類似している、または同じである、または異なるヌクレオチド配列を含有するかどうかを決定することが目的である場合に実施する。配列解析は、当業者に公知の配列解析用の装置および構成成分によって容易になる。
本明細書において提供される方法により、複数の核酸（例えば、上記で生成したヌクレオチド配列種、増幅された核酸種および検出可能な産物）における核酸種のハイスループットな検出が可能になる。多重化は、２つ以上の核酸種を同時に検出することを指す。多重化された反応を質量分析と併せて実施するための一般的な方法が公知である（例えば、米国特許第６，０４３，０３１号、同第５，５４７，８３５号および国際ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／３７０４１を参照されたい）。多重化により、個々の標的核酸種について別々の質量分析を実施しなければならないことと比較して、単一の質量スペクトルだけで複数の核酸種（例えば、異なる配列の変形を有するいくつか）を同定することができるという有利点が提供される。本明細書において提供される方法により、一部の実施形態では、配列の変形を高いスピードと正確度で解析するためのハイスループットな、高度に自動化されたプロセスが与えられる。一部の実施形態では、本明細書の方法は、単一反応において高レベルで多重化することができる。
特定の実施形態では、多重化される核酸種の数としては、限定することなく、約１〜約５００（例えば、約１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１１、１１〜１３、１３〜１５、１５〜１７、１７〜１９、１９〜２１、２１〜２３、２３〜２５、２５〜２７、２７〜２９、２９〜３１、３１〜３３、３３〜３５、３５〜３７、３７〜３９、３９〜４１、４１〜４３、４３〜４５、４５〜４７、４７〜４９、４９〜５１、５１〜５３、５３〜５５、５５〜５７、５７〜５９、５９〜６１、６１〜６３、６３〜６５、６５〜６７、６７〜６９、６９〜７１、７１〜７３、７３〜７５、７５〜７７、７７〜７９、７９〜８１、８１〜８３、８３〜８５、８５〜８７、８７〜８９、８９〜９１、９１〜９３、９３〜９５、９５〜９７、９７〜１０１、１０１〜１０３、１０３〜１０５、１０５〜１０７、１０７〜１０９、１０９〜１１１、１１１〜１１３、１１３〜１１５、１１５〜１１７、１１７〜１１９、１２１〜１２３、１２３〜１２５、１２５〜１２７、１２７〜１２９、１２９〜１３１、１３１〜１３３、１３３〜１３５、１３５〜１３７、１３７〜１３９、１３９〜１４１、１４１〜１４３、１４３〜１４５、１４５〜１４７、１４７〜１４９、１４９〜１５１、１５１〜１５３、１５３〜１５５、１５５〜１５７、１５７〜１５９、１５９〜１６１、１６１〜１６３、１６３〜１６５、１６５〜１６７、１６７〜１６９、１６９〜１７１、１７１〜１７３、１７３〜１７５、１７５〜１７７、１７７〜１７９、１７９〜１８１、１８１〜１８３、１８３〜１８５、１８５〜１８７、１８７〜１８９、１８９〜１９１、１９１〜１９３、１９３〜１９５、１９５〜１９７、１９７〜１９９、１９９〜２０１、２０１〜２０３、２０３〜２０５、２０５〜２０７、２０７〜２０９、２０９〜２１１、２１１〜２１３、２１３〜２１５、２１５〜２１７、２１７〜２１９、２１９〜２２１、２２１〜２２３、２２３〜２２５、２２５〜２２７、２２７〜２２９、２２９〜２３１、２３１〜２３３、２３３〜２３５、２３５〜２３７、２３７〜２３９、２３９〜２４１、２４１〜２４３、２４３〜２４５、２４５〜２４７、２４７〜２４９、２４９〜２５１、２５１〜２５３、２５３〜２５５、２５５〜２５７、２５７〜２５９、２５９〜２６１、２６１〜２６３、２６３〜２６５、２６５〜２６７、２６７〜２６９、２６９〜２７１、２７１〜２７３、２７３〜２７５、２７５〜２７７、２７７〜２７９、２７９〜２８１、２８１〜２８３、２８３〜２８５、２８５〜２８７、２８７〜２８９、２８９〜２９１、２９１〜２９３、２９３〜２９５、２９５〜２９７、２９７〜２９９、２９９〜３０１、３０１〜３０３、３０３〜３０５、３０５〜３０７、３０７〜３０９、３０９〜３１１、３１１〜３１３、３１３〜３１５、３１５〜３１７、３１７〜３１９、３１９〜３２１、３２１〜３２３、３２３〜３２５、３２５〜３２７、３２７〜３２９、３２９〜３３１、３３１〜３３３、３３３〜３３５、３３５〜３３７、３３７〜３３９、３３９〜３４１、３４１〜３４３、３４３〜３４５、３４５〜３４７、３４７〜３４９、３４９〜３５１、３５１〜３５３、３５３〜３５５、３５５〜３５７、３５７〜３５９、３５９〜３６１、３６１〜３６３、３６３〜３６５、３６５〜３６７、３６７〜３６９、３６９〜３７１、３７１〜３７３、３７３〜３７５、３７５〜３７７、３７７〜３７９、３７９〜３８１、３８１〜３８３、３８３〜３８５、３８５〜３８７、３８７〜３８９、３８９〜３９１、３９１〜３９３、３９３〜３９５、３９５〜３９７、３９７〜４０１、４０１〜４０３、４０３〜４０５、４０５〜４０７、４０７〜４０９、４０９〜４１１、４１１〜４１３、４１３〜４１５、４１５〜４１７、４１７〜４１９、４１９〜４２１、４２１〜４２３、４２３〜４２５、４２５〜４２７、４２７〜４２９、４２９〜４３１、４３１〜４３３、４３３〜４３５、４３５〜４３７、４３７〜４３９、４３９〜４４１、４４１〜４４３、４４３〜４４５、４４５〜４４７、４４７〜４４９、４４９〜４５１、４５１〜４５３、４５３〜４５５、４５５〜４５７、４５７〜４５９、４５９〜４６１、４６１〜４６３、４６３〜４６５、４６５〜４６７、４６７〜４６９、４６９〜４７１、４７１〜４７３、４７３〜４７５、４７５〜４７７、４７７〜４７９、４７９〜４８１、４８１〜４８３、４８３〜４８５、４８５〜４８７、４８７〜４８９、４８９〜４９１、４９１〜４９３、４９３〜４９５、４９５〜４９７、４９７〜５０１）が挙げられる。
多重化されたアッセイを用いた質量スペクトルの分解を実現するための設計方法は、プライマーおよびオリゴヌクレオチドの設計方法および反応の設計方法を含んでよい。例えば、表ＸおよびＹに提供される多重スキームを参照されたい。多重化されたアッセイにおけるプライマーおよびオリゴヌクレオチドの設計について、プライマーの設計用の同じ一般的なガイドラインが、間違ったプライミングおよびプライマー二量体を回避することなどの単一単位からなる（ｕｎｉｐｌｅｘｅｄ）反応に適用され、わずかに多いプライマーが多重反応に関与する。質量分析を適用するために、１つのアッセイについての質量スペクトルにおける、被検体のピークを、休止ピークおよび任意の他の副産物のピークを含めた、アッセイが多重化される任意のアッセイの産物から十分に分解する。また、被検体のピークは、使用者が指定した質量範囲内、例えば、５，０００〜８，５００Ｄａの範囲内に最適に入る。一部の実施形態では、多重解析を、例えば、染色体異常の質量分光測定的検出に適合させることができる。特定の実施形態では、多重解析を、本明細書に記載のさまざまな一塩基またはナノポアに基づく配列決定方法に適合させることができる。多重解析を容易にするために、商用生産されたマイクロ反応チャンバーまたはデバイスまたはアレイまたはチップを使用することができ、それらは、市販されている。
胎児の異数性の検出
胎児の異数性を検出するために、いくつかの方法は、母系遺伝性対立遺伝子と父系遺伝性対立遺伝子の比を測定することに頼る。しかし、染色体の変化を数量化する能力は、無細胞核酸の母性の寄与によって損なわれ、測定する前に母体のＤＮＡに由来する試料を枯渇させることが必要になる。有望な手法では、胎児のＤＮＡおよび母体のＤＮＡの異なるサイズ分布を活用する、または胎児に独占的に発現されているＲＮＡを測定する（例えば、ＵＳ２００６０２５２０７１として公開され、これによって参照により組み込まれる米国特許出願第１１／３８４１２８号を参照されたい）。胎児のＤＮＡが母体の血漿中の全無細胞ＤＮＡの約５％のみを占めると仮定すると、トリソミー試料と健康な対照との間の比率の差が１．６％から約１．２％まで減少する。したがって、対立遺伝子の比率の変化の信頼できる検出には、無細胞ＤＮＡの胎児の画分を、例えば、本発明の組成物および方法を使用して富化することが必要である。
いくつかの方法は、母体の血漿から胎児の染色体異数性を検出するために、父系遺伝性対立遺伝子に対する母系遺伝性対立遺伝子の比率を測定することに頼る。二倍体のセットにより、１：１の比率がもたらされ、トリソミーを２：１の比率として検出することができる。この差の検出は、胎児のＤＮＡの存在量が少ないこと、血漿試料中の過剰な母体のＤＮＡおよび測定技法に変動性が存在することに起因して、統計学的なサンプリングによって損なわれる。後者には、デジタルＰＣＲまたは質量分析のような測定精度が高い方法を使用することによって取り組む。試料中の無細胞ＤＮＡの胎児の画分を富化することは、現在は母体のＤＮＡをサイズ排除によって枯渇させること、または、胎児で発現されるＲＮＡのような胎児に特異的な核酸に焦点を合わせることのいずれかによって実現される。胎児のＤＮＡの特徴の別の区別は、そのＤＮＡのメチル化のパターンである。したがって、本明細書では、胎児と母親との間の示差的なメチル化に基づいて胎児核酸を正確に数量化するための新規の組成物および方法が提供される。方法は、母体試料の胎児核酸部分を数量化し、それによって胎児の形質を出生前に検出することを可能にするために、感度のよい絶対的なコピー数の解析に頼る。本発明の方法により、ゲノム内におよそ３０００個の、母体のＤＮＡと胎児のＤＮＡとの間で示差的にメチル化されているＣｐＧリッチな領域が同定された。選択された領域は、測定した試料全てにわたって高度に保存された示差的なメチル化を示した。さらに、発生制御において重要な遺伝子について領域のセットが富化され、これらの領域の後成的な制御が生物学的に関連性のある、一致するプロセスであることが示されている（表３参照）。胎児のＤＮＡの富化は、現在は、我々のＭＢＤ−Ｆｃタンパク質を使用して全無細胞ＤＮＡを捕捉し、次いで高度にメチル化されたＤＮＡ画分を高い塩濃度で溶出することによって実現することができる。低塩溶出液画分を使用しても同等に、ＭＢＤ−ＦＣをメチル化されていない胎児のＤＮＡを富化することができる。
本発明は、第１３染色体、第１８染色体および第２１染色体上の、母体のメチル化のレベルが低く胎児のメチル化のレベルが高い６３個の確認されたゲノム領域を提供する。これらの領域を捕捉した後、ＳＮＰを使用して、上述の対立遺伝子の比率を決定することができる。高頻度のＳＮＰを使用する場合、親が逆のホモ接合体遺伝子型を有し、子がヘテロ接合体遺伝子型を有するＳＮＰを少なくとも１つ見つけることの高い信頼度を実現するために、およそ１０種のマーカーを測定しなければならない。
ある実施形態では、絶対的なコピー数を数量化することを利用する、染色体異常を検出するための方法が提供される。二倍体染色体セットは、全ての染色体にわたって示差的にメチル化された領域について同じ数のコピーを示すが、例えば、２１トリソミー試料は、第２１染色体上の示差的にメチル化された領域について１．５倍多いコピーを示すことになる。二倍体染色体セットに対するゲノムＤＮＡ量の正規化は、参照として不変の常染色体を使用することによって実現することができる（同様に本明細書において提供される−表１Ｂ参照）。他の手法に匹敵して、全体的なコピー数が少ないので、単一のマーカーでは、この差を検出するために十分である可能性が低い。一般には、妊娠期間が１０〜１２週の母体の血漿１ｍｌに、およそ１００〜２００コピーの胎児のＤＮＡがある。しかし、本発明の方法により、二倍体の染色体セットと異数性染色体セットの高度に信頼できる識別を可能にする検出可能なマーカーの冗長性が提供される。
データ処理および染色体異常の存在または非存在の同定
本明細書で使用される染色体異常を「検出する」という用語は、上記で生成した増幅された核酸種、ヌクレオチド配列種、または検出可能な産物のセット（集合的に「検出可能な産物」）を検出することから生じるデータを処理することによって染色体の不均衡を同定することを指す。本発明において取り組まれているように、任意の適切な検出デバイスおよび検出方法を使用して、検出可能な産物の１つ以上のセットを区別することができる。染色体異常の存在または非存在に関する転帰は、これらに限定することなく、確率（例えば、オッズ比、ｐ値）、尤度、百分率、閾値を超える値、または対象または試料についての染色体異常の存在に関連する危険因子を含めた任意の適切な形態で表すことができる。特定の実施形態では、転帰は、感度、特異性、標準偏差、変動係数（ＣＶ）および／または信頼水準の１つ以上、または前述のものの組み合わせで提供することができる。
検出可能な産物の１つ以上のセットに基づいた染色体異常の検出は、これらに限定されないが、感度、特異性、標準偏差、変動係数（ＣＶ）、閾値、信頼水準、スコア、確率および／またはその組み合わせを含めた１つ以上の算出された変数に基づいて同定することができる。一部の実施形態では、（ｉ）診断方法のために選択されたセットの数、および／または（ｉｉ）診断方法のために選択された各セットの特定のヌクレオチド配列種を、一部において、または完全に、そのように算出された変数の１つ以上に従って決定する。
特定の実施形態では、感度、特異性および／または信頼水準の１つ以上を百分率として表す。一部の実施形態では、各変数についてそれぞれ独立した百分率は、約９０％を超える（例えば、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、または９９％を超える（例えば、約９９．５％以上、約９９．９％以上、約９９．９５％以上、約９９．９９％以上））。変動係数（ＣＶ）は、一部の実施形態では百分率として表され、時には、百分率は約１０％以下（例えば、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％、または１％未満（例えば、約０．５％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下、約０．０１％以下））である。確率（例えば、アルゴリズムによって決定される偶然によらない特定の転帰）は、特定の実施形態ではｐ値として表され、時には、ｐ値は約０．０５以下（例えば、約０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１、または０．０１未満（例えば、約０．００１以下、約０．０００１以下、約０．００００１以下、約０．０００００１以下））である。
例えば、スコア化またはスコアは、特定の染色体異常が、対象／試料において実際に存在する、または存在しない確率を算出することを指してよい。スコアの値を使用して、例えば、実際の染色体異常に対応する可能性がある増幅された核の検出可能な産物の変動、差、または比率を決定することができる。例えば、検出可能な産物から陽性のスコアが算出されることにより、単一の試料の分析に特に関連性のある染色体異常が同定される。
特定の実施形態では、シミュレートされた（またはシミュレーション）データが、例えばアルゴリズムを訓練すること、またはアルゴリズムを試験することによってデータ処理することの助けになり得る。シミュレートされたデータは、例えば、血清、血漿などにおける胎児核酸および母体核酸の異なる濃度の仮定上のさまざまな試料に関与する。シミュレートされたデータは、実際の集団から予測され得ることに基づいてよい、または、シミュレートされたデータセットに基づいてアルゴリズムを試験するため、および／または正しい分類を割り当てるために偏っていてもよい。シミュレートされたデータは、本明細書では「仮想の」データとも称される。試料内の胎児の／母体の寄与を数の表またはアレイ（例えば、参照生体分子または増幅された核酸配列の切断産物の質量シグナルに対応するピークの一覧として）、質量スペクトルとして、ゲル上のバンドのパターンとして、または質量分布を測定する任意の技法の表示としてシミュレートすることができる。シミュレーションは、ほとんどの場合、コンピュータプログラムによって実施することができる。シミュレートされたデータセットを使用することにおける１つの可能性のある工程は、同定された結果の信頼度、すなわち選択された陽性／陰性が試料にどのくらいよく適合するか、および追加的な変形があるかどうかを評価することである。一般的な手法は、選択された試料よりもよいスコアを有する無作為の試料の確率を推定する確率の値（ｐ値）を算出することである。特定の状況では、ｐ値の算出はひどく高くなり得るので、少なくとも１つの試料が参照試料と適合する（分解された変形あり、またはなしで）と仮定される経験的なモデルを査定することができる。あるいは、ポアソン分布などの他の分布を、確率分布を説明するために使用することができる。
特定の実施形態では、アルゴリズムにより、信頼度の値を、算出された真陽性、真陰性、偽陽性および偽陰性に割り当てることができる。染色体異常の出現の尤度の割り当ても、特定の確率モデルに基づいてよい。
シミュレートされたデータは、多くの場合、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロセスで生成される。本明細書で使用される、「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」という用語はコンピュータを使用して実施される研究および実験を指す。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの方法としては、これらに限定されないが、分子モデリング研究、核型分析、遺伝的計算、生体分子ドッキング実験、および分子相互作用などの分子の構造および／またはプロセスの仮想表示が挙げられる。
本明細書で使用される「データ処理ルーチン」は、取得データの生物学的な有意性（すなわち、アッセイの最終結果）を決定する、ソフトウェアにおいて具体化することができるプロセスを指す。例えば、データ処理ルーチンにより、収集されたデータに基づいて各ヌクレオチド配列種の量を決定することができる。データ処理ルーチンにより、決定された結果に基づいて計器および／またはデータ収集ルーチンを調節することもできる。データ処理ルーチンおよびデータ収集ルーチンは、多くの場合、統合され、それにより計器によってデータの取得を操作するためのフィードバックがもたらされ、したがって、本明細書において提供されるアッセイに基づいた判定方法が提供される。
本明細書で使用されるソフトウェアは、コンピュータによって実行される場合、コンピュータ操作を実施するコンピュータ可読のプログラムの説明書を指す。一般には、これらに限定されないが、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、および磁気テープを含めた磁気媒体；およびＣＤ−ＲＯＭディスク、ＤＶＤディスク、光磁気ディスクを含めた光学的な媒体、およびプログラム説明書を記録することができる他の媒体を含めた、コンピュータ可読の媒体上に記録されたプログラムの説明書を含有するプログラム製品でソフトウェアが提供される。
異常または正常性を予測する異なる方法により異なる種類の結果がもたらされる。任意の所与の予測について、４つの可能性のある種類の転帰がある：真陽性、真陰性、偽陽性、または偽陰性。本明細書で使用される「真陽性」という用語は、染色体異常を有すると正確に診断された対象を指す。本明細書で使用される「偽陽性」という用語は、染色体異常を有すると間違って同定された対象を指す。本明細書で使用される「真陰性」という用語は、染色体異常を有さないと正確に同定された対象を指す。本明細書で使用される「偽陰性」という用語は、染色体異常を有さないと間違って同定された対象を指す。これらが発生する比率に基づいて、任意の所与の方法の性能の２つの尺度を算出することができる：（ｉ）感度値、陽性であると正確に同定される予測陽性の割合（例えば、正確に、または不正確にそのように同定される全ヌクレオチド配列セットに対する、レベル比較検出／決定によって染色体異常を示すと正確に同定されるヌクレオチド配列セットの割合）、それによって染色体異常を検出することにおける結果の正確度が反映される；および（ｉｉ）特異性値、陰性であると正確に同定される予測陰性の割合（正確に、または不正確にそのように同定される全ヌクレオチド配列セットに対する、レベル比較検出／決定によって染色体の正常性を示すと正確に同定されるヌクレオチド配列セットの割合）、それによって染色体異常を検出することにおける結果の正確度が反映される。
以下の実施例は、単に例証として提供され、限定としては提供されない。当業者は、本質的に同じ結果または同様の結果を得るために変更または改変することができる種々の決定的でないパラメータを容易に理解されよう。
以下の実施例１において、出願人らは、胎児胎盤組織と母体の血液との間で示差的にメチル化されているゲノム領域を同定するために、メチル化されたＤＮＡを捕捉する新しい融合タンパク質をＣｐＧ島アレイと組み合わせて使用した。ストリンジェントな統計学的手法を使用して、試料間で変動をほとんど示さない、したがって、根底にある生物学的な機構を示唆する領域のみを選択した。主に第１３染色体、第１８染色体および第２１染色体に位置する８５個の示差的にメチル化されたゲノム領域を検証した。この検証のために、これらの８５領域を網羅している２６１個のＰＣＲアンプリコンを調べる定量的質量分析に基づく手法を使用した。結果は、非常に良好に一致し（９５％の確証）、この手法の実現性がもたらされている。
次に、出願人らは、異数性を試験するための、対立遺伝子の比率ではなく絶対的なコピー数の測定に頼る革新的な手法を提供する。
（実施例１）
以下の実施例では、１０対の母体と胎盤のＤＮＡ試料を使用して、示差的にメチル化された領域を同定した。これらの結果を、質量分析に基づく定量的メチル化アッセイを使用して実証した。まず、母体の軟膜に由来するゲノムＤＮＡおよび対応する胎盤組織を最初に抽出した。次に、ＭＢＤ−ＦＣを使用して、各ＤＮＡ試料のメチル化された画分を捕捉した。図１〜３を参照されたい。２つの組織画分を、異なる蛍光色素で標識し、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）ＣｐＧ島マイクロアレイとハイブリダイズさせた。図４を参照されたい。これは、出生前診断のために利用することができる示差的にメチル化された領域を同定するために行った。したがって、２つの判断基準を使用して、潜在的な富化マーカーとしてのゲノム領域を選択した：観察されたメチル化の差は、試験した試料対全てに存在しなければならず、領域は２００ｂｐ超の長さでなければならなかった。
ＤＮＡの調製および断片化
母体の軟膜に由来するゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）および胎盤組織に由来するゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、それぞれＱｉａｇｅｎ（登録商標）（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商標）およびＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ
Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商標）を使用して調製した。ＭＣＩｐについては、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ １０００（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してｇＤＮＡを数量化した。ＴＥ緩衝液５００μｌ中２．５μｇのＤＮＡの３００〜５００ｂｐの平均断片サイズへの超音波処理（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０（商標）（Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用いて、以下の設定を使用して行った：振幅２０％、超音波処理時間１１０秒間、パルスオン／パルスオフ時間１．４／０．６秒間。ゲル電気泳動を使用して断片の範囲をモニターした。
メチル−ＣｐＧ免疫沈降
試料当たり５６μｇの精製ＭＢＤ−Ｆｃタンパク質および１５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ
Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を、１５ｍｌのＴＢＳ中、４℃で一晩回転させた。次いで、ＭＢＤ−Ｆｃビーズ（１５０μｌ／アッセイ）を２ｍｌのＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ遠心濾過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）中に移し、分散させ、緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ−４０）で３回、急速回転させて洗浄した。超音波処理したＤＮＡ（２μｇ）を、２ｍｌの緩衝液Ａ中洗浄したＭＢＤ−Ｆｃビーズに加え、４℃で３時間、回転させた。ビーズを遠心分離して結合していないＤＮＡ断片（３００ｍＭの画分）を回収し、その後に濃度を次第に増加させたＮａＣｌ（４００ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、および１０００ｍＭ）を含有する緩衝液６００μｌで２回洗浄した。各洗浄工程を通した流液を別々のチューブ内に採取し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して脱塩した。平行して、２００ｎｇの超音波処理した投入ＤＮＡを、対照としてＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して処理した。
マイクロアレイの取扱いおよび分析
マイクロアレイハイブリダイゼーション用の蛍光標識したＤＮＡを生成するために、各試料について、６００ｍＭおよび１ＭのＮａＣｌ画分（富化されたメチル化されたＤＮＡ）を混ぜ合わせ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５−ａｈａ−ｄＣＴＰ（母体）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ａｈａ−ｄＣＴＰ（胎盤）のいずれかで標識した。標識化反応は製造者のマニュアルに従って行った。釣り合わせた母体／胎盤対の違うように標識したゲノムＤＮＡ断片を混ぜ合わせて最終的な体積を８０μｌとし、５０μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、５２μｌのＡｇｉｌｅｎｔ１０×ブロッキング試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）、７８μｌの脱イオン化したホルムアミド、および２６０μｌのＡｇｉｌｅｎｔ２×ハイブリダイゼーション緩衝液を補充した。試料を３分間、９５℃まで加熱し、混合し、その後、３７℃で３０分間インキュベートした。次いでＡｇｉｌｅｎｔ ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ（商標）において、６７℃で４０時間、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＨｙｂ（商標）チャンバーおよびＡｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーションオーブンを使用してハイブリダイゼーションを行った。スライドを、洗浄液Ｉ（６×ＳＳＰＥ、０．００５％のＮ−ラウロイルザルコシン）中、室温で５分間洗浄し、洗浄液ＩＩ（０．０６×ＳＳＰＥ）中、３７℃でさらに５分間洗浄した。次に、スライドをアセトニトリルおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｏｚｏｎｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）に、それぞれ３０秒間浸した。画像を直ちにスキャンし、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）を使用して解析した。マイクロアレイ画像を、Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ９．５および標準のＣＧＨプロトコールを使用して処理した。
亜硫酸水素塩処理
ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウムによる変換を、ＥＺ−９６ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｕｎｔｙ、ＣＡ）を使用して実施した。１μｇのゲノムＤＮＡおよび代替の変換プロトコール（二温ＤＮＡ変性）を使用し、製造者のプロトコールに従った。
定量的なメチル化解析
ＳｅｑｕｅｎｏｍのＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）システムを使用して、定量的なメチル化解析を実施した。このシステムでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析をＲＮＡ塩基特異的な切断（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（商標））と組み合わせて利用する。次いで、メチル化の状態について検出可能なパターンを解析した。ＰＣＲプライマーを、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＥｐｉＤＥＳＩＧＮＥＲ（商標）（ｗｗｗ．ｅｐｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｃｏｍ）を使用して設計した。８５個の標的領域を網羅する合計２６１個のアンプリコンを検証のために使用した（増幅長の中央値＝３６７ｂｐ、ｍｉｎ＝１０８、ｍａｘ＝５００；アンプリコン当たりのＣｐＧの数の中央値＝２３、ｍｉｎ＝４、ｍａｘ＝６５）。各リバースプライマーについて、ｉｎ−ｖｉｖｏ転写に対する追加的なＴ７プロモータータグ、ならびにフォワードプライマー上に１０ｍｅｒのタグを加えて融解温度の差を調整した。ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（商標）生化学を、以前に記載された通り実施した（Ｅｈｒｉｃｈ Ｍら（２００５年）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｙ ｂａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、１０２巻：１５７８５〜１５７９０頁）。質量スペクトルを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）Ｃｏｍｐａｃｔ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を使用して取得し、メチル化の比率を、ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）ソフトウェアｖ１．０（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）によって生成した。
統計分析
全ての統計計算を、Ｒ統計ソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用して実施した。まず、アレイプローブをそれらの遺伝子位置に基づいてグループ分けした。その後、１０００ｂｐ未満離れたプローブを１つのグループにした。示差的にメチル化された領域を同定するために、対照試料を参照として使用した。対照試料では、血液に由来する対照ＤＮＡのメチル化された画分を、それ自体に対してハイブリダイズさせた。理想的には、この試料は約０の２色チャネルの対数比を示すはずである。しかし、ハイブリダイゼーション挙動は変動するので、プローブは平均対数比０．０２および標準偏差０．１８を示す。次に、我々の試料において観察された対数比を対照試料と比較した。二元配置の、対応のあるｔ検定を使用して、グループが同一であるという帰無仮説を検定した。４つ未満のプローブを含有したグループをこの分析から排除した。４つまたは５つのプローブを含むグループについて、全てのプローブを対応のあるｔ検定において使用した。６つ以上のプローブを有するグループについて、一度に５つのプローブからなるスライドウィンドウを使用し、それによって１つのプローブが増大するごとにウィンドウを移動させた。各試験試料を対照試料と比較し、ｐ値を記録した。１０個の試料のうち８個がｐ値＜０．０１を示した場合、または１０個の試料のうち６個の試料がｐ値＜０．００１を示した場合、ゲノム領域を、示差的にメチル化されているとして選択した。グループが、ｐ値＜０．０１である試料を８個未満、およびｐ値＜０．００１である試料６個未満示した場合、ゲノム領域を、示差的にメチル化されていないとして分類した。いずれのカテゴリーにも入らない試料をこの分析から排除した。示差的にメチル化されていると同定されたゲノム領域のサブセットについて、定量的なメチル化解析を使用して結果を確認した。
ＧＯ解析を、オンラインのＧＯｓｔａｔツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｏｓｔａｔ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕ／ｃｇｉｂｉｎ／−ｇｏＳｔａｔ．ｐｌ）を使用して実施した。Ｐ値を、フィッシャーの直接検定を使用して算出した。
マイクロアレイに基づくマーカーの発見の結果
示差的にメチル化された領域を同定するために、単球のメチル化されたＤＮＡ画分をそれ自体に対してハイブリダイズさせた標準試料を使用した。この標準物質により、ゲノム領域における蛍光の測定値の変動性に対する参照がもたらされた。次いで、示差的にメチル化された領域を、１０個の胎盤／母体試料のそれぞれの対数比をこの標準物質と比較することによって同定した。この試験の目的は、母体のＤＮＡおよび胎児のＤＮＡの信頼できる分離を可能にするマーカーを同定することであったので、標的の選択は、連続したゲノムＤＮＡのひと続きにわたって安定な、一貫したメチル化の差を示す遺伝子に限られた。これは、多数のプローブにより示差的なメチル化が示されたゲノム領域に対する解析に焦点を合わせた。選択は、同様に、個体間の差が強力なものを除いて、全ての試料が示差的なメチル化を示した標的領域に限られた。２つの試料が、マイクロアレイ解析において一般に低い対数比を示した。標的を選択するために対応のある検定を使用したので、これは結果に負の影響を与えなかった。これらの選択の判断基準に基づいて、母体のＤＮＡと胎児のＤＮＡとの間で示差的にメチル化された３０４３個のゲノム領域を同定した。２１７７８個の領域ではメチル化の差は示されなかった。示差的にメチル化された領域の分布における染色体間の偏りは観察されなかった。示差的にメチル化された領域は、２１５９個の既知遺伝子の隣、またはその範囲内に位置した。示差的にメチル化された領域の大部分は、プロモーター領域（１８％）およびコード領域の内側（６８％）に位置するが、ほんの数領域は、遺伝子の下流（７％）、またはプロモーターからコード領域（７％）への変わり目に位置する。示差的なメチル化を示さなかった領域は、プロモーター（１３％）および下流の（５％）場所について同様の分布を示したが、プロモーターからコード領域への変わり目に位置する領域の割合が高く（３９％）、コード領域の内側の割合が低かった（４３％）。
胚性幹細胞（ＥＳ）において、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）の標的となる遺伝子が発生を制御している遺伝子として富化されることが示されている（Ｌｅｅ ＴＩら（２００６年）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｂｙ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ、１２５巻：３０１〜３１３頁）。多くの癌の種類において、示差的にメチル化された遺伝子がＰＲＣ２の標的となる遺伝子として富化されることも示されている（Ｅｈｒｉｃｈ Ｍら（２００８年）Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、１０５巻：４８４４〜４８頁）。この試験で示差的にメチル化されていると同定された遺伝子のセットも、ＰＲＣ２の標的となる遺伝子として富化される（ｐ値＜０．００１、オッズ比＝３．６、９５％、オッズ比のＣＩ＝３．１〜４．２）。示差的にメチル化された遺伝子のセットのＧｏ解析により、このセットが、発生の間に重要な機能のために有意に富化されることが明らかされている。１０種の最も富化された機能のうち６種として、発生プロセスまたは形態形成プロセス［解剖学的構造の形態形成（ＧＯ：０００９６５３、ｐ値＝０）、発生プロセス（ＧＯ：００３２５０２、ｐ値＝０）、多細胞性生物体の発生（ＧＯ：０００７２７５、ｐ値＝０）、器官の発生（ＧＯ：００４８５１３、ｐ値＝０）、系の発生（ＧＯ：００４８７３１、ｐ値＝０）および解剖学的構造の発生（ＧＯ：００４８８５６、ｐ値＝０）］が挙げられる。
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）を使用した検証
マイクロアレイの所見を検証するために、第１３染色体、第１８染色体および第２１染色体からの６３個の領域ならびに他の常染色体からの追加的な２６個の領域を、異なる技術によって確認するために選択した。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）技術を使用して、母体試料および胎盤試料におけるＤＮＡメチル化を定量的に測定した。ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）法の説明については、Ｅｈｒｉｃｈ Ｍ、Ｎｅｌｓｏｎ ＭＲ、Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ Ｐ、Ｚａｂｅａｕ Ｍ、Ｌｉｌｏｇｌｏｕ Ｔ、Ｘｉｎａｒｉａｎｏｓ Ｇ、Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ、Ｆｉｅｌｄ ＪＫ、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｏｍ Ｄ（２００５年）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｙ ｂａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、１０２巻：１５７８５〜１５７９０頁）を参照されたい。標的領域内の個々のＣｐＧ部位について、母体のＤＮＡ試料全てにわたる平均のメチル化の値および胎盤試料全てにわたる平均のメチル化の値を算出した。次いで、平均の母体のメチル化と平均の胎盤のメチル化との間の差を、マイクロアレイの結果と比較した。２つの技術からの結果は良好に一致した（図７参照）。８５個の標的領域について、定量的な結果により、マイクロアレイの結果が確認される（９５％の確認率）。全て第１８染色体に位置する４つの標的領域については、結果は確認することができなかった。この矛盾の理由は今のところ不明である。
メチル化の差を同定することに焦点を合わせるマイクロアレイと対照的に、ＤＮＡのメチル化を定量的に測定することにより、絶対的なメチル化の値を解析することが可能になった。８５個の確認された示差的にメチル化された領域の検証セットでは、２６個の領域のサブセットが、母体のＤＮＡ試料においてより多くメチル化されており、５９個の領域が胎盤の試料においてより多くメチル化されている（表１Ａ参照）。興味深いことに、胎盤の試料において低メチル化されている遺伝子は、胎盤の試料において高メチル化されている遺伝子よりもより大きなメチル化の差を示す傾向がある（低メチル化された遺伝子メチル化についての中央値の差＝３９％、高メチル化された遺伝子についてのメチル化の中央値の差＝２０％）。
（実施例２）
実施例２は、母体試料中に存在する胎児核酸の量を検出するための非侵襲的な手法（本発明において「胎児数量化器法（Ｆｅｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ）」と称される）を説明し、それは胎児の形質（例えば、胎児の性別またはＲｈＤ適合性）を検出または確認するため、または２１トリソミーなどの染色体異常を診断するために使用することができる（どちらも本発明において「メチル化に基づく胎児の診断方法」と称される）。図１０は、胎児数量化器方法（Ｆｅｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ）の一実施形態を示し、図１１は、メチル化に基づく胎児の診断方法の一実施形態を示す。どちらのプロセスでも、母体試料から得た胎児のＤＮＡを使用する。試料は、示差的にメチル化されている母体核酸と胎児核酸を含む。例えば、試料は、母体の血漿または血清であってよい。胎児のＤＮＡは、母体の血漿中の総ＤＮＡのおよそ２〜３０％を構成する。試料中に存在する全核酸に対する胎児の寄与の実際の量は妊婦間で変動し、これらに限定されないが、妊娠期間、母親の健康および胎児の健康を含めたいくつもの因子に基づいて変化し得る。
本明細書に記載のように、母体の血漿中の胎児のＤＮＡを解析することによって生じる技術的難題は、胎児のＤＮＡを、共存しているバックラウンドの母体のＤＮＡと識別することができる必要性にある。本発明の方法は、母親に由来する試料中に存在する比較的小さな百分率の胎児のＤＮＡを富化するための手段として、胎児のＤＮＡと母体のＤＮＡとの間で観察されるそのような差、例えば、示差的なメチル化を活用する。この手法の非侵襲的性質により、従来の、小さいが限定されている胎児損失の危険性を伴う出生前診断方法、例えば羊水穿刺、長期にわたる絨毛サンプリングおよび臍帯穿刺などに対する主要な有利点が提供される。また、この方法は、任意の特定の細胞分裂相にある胎児の細胞に左右されないので、この方法により、染色体異常の存在、さらに、その性質を決定するための迅速な検出手段が提供される。さらに、この手法は性別に依存せず（すなわち、Ｙ染色体の存在を必要としない）、多型に依存しない（すなわち、対立遺伝子の比率は決定されない）。したがって、本発明の組成物および方法により、母体試料中に存在する胎児核酸の量を正確に決定するための改善された普遍的な非侵襲的手法が表される。
アッセイの設計および有利点
母体試料から非侵襲的に単離された胎児のＤＮＡを正確に検出および定量化することが必要とされている。本発明では、母体の血漿または血清中を循環している、無細胞胎児核酸（ｃｃｆＤＮＡ）の存在を活用する。商業的かつ臨床的に実用的であるために、本発明の方法は、有限で入手可能である胎児のＤＮＡのごく一部のみを消費するべきである。例えば、試料の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、またはそれよりも少ない。さらに、この手法は、好ましくは、１つ以上の（全てが好ましい）以下のアッセイが含まれる多重アッセイ形式で開発するべきである：
・試料中に存在するゲノム等価物の総量を検出するためのアッセイ、すなわち、母体のＤＮＡ種および胎児のＤＮＡ種の両方を認識するアッセイ；
・男児の妊娠から単離した胎児のＤＮＡ、すなわち、Ｙ染色体に特異的な配列を検出するためのアッセイ；
・胎児と母親との間で示差的にメチル化されていると同定された領域に特異的なアッセイ；または
・調査される全ての組織において低メチル化されていることが公知である、制限効率についての対照としての機能を果たすことができる領域に特異的なアッセイ。
アッセイの他の特徴は、以下の１つ以上を含んでよい：
・各アッセイについて、標的配列と比較した１つ以上のヌクレオチドの差などの競合剤の区別可能な特徴は別として、標的配列と同一である、または実質的に同一である、標的に特異的な競合オリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に加えると標的と同時増幅され、これらの２つのＰＣＲアンプリコン間で得られた比率は、母体試料中に存在する標的特異的なＤＮＡ配列（例えば、特定の遺伝子座に由来する胎児のＤＮＡ）の数を示すことになる。
・アンプリコンの長さは、好ましくは、増幅がより短い断片に向かって偏らないように、同様の長さであるべきである。しかし、増幅効率がほとんど等しい限りは、異なる長さを使用することができる。
・示差的にメチル化された標的は、表１Ａ〜１Ｃから、または母親と胎児との間で示差的にメチル化されていることが公知の任意の他の標的から選択することができる。これらの標的は、妊娠していない女性から単離したＤＮＡにおいて低メチル化されてよく、胎児の試料から得た試料において高メチル化されていてよい。これらのアッセイは、制限効率についての対照としての機能を果たす。
・異なるアッセイから得られた結果を使用して、以下の１つ以上を数量化することができる：
○試料中に存在する増幅可能なゲノムの総数（ゲノム等価物の総量）；
○増幅可能なゲノムの胎児の割合（胎児の濃度または百分率）；または
○胎児に由来するＤＮＡ配列間のコピー数の差（例えば、胎児の第２１染色体と第３染色体などの参照染色体との間の）。
試験に使用されるアッセイの例
以下は、例えば、図１０に提供されるような本発明の方法を実施するために使用する反応工程の概略である。この概略は、本発明の範囲を限定するものではなく、むしろＳｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使用した本発明の一実施形態を提供する。
１）血漿試料からのＤＮＡの単離。
２）メチル化感受性制限酵素（例えば、ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩ）を使用したＤＮＡ標的の消化。
各反応について、入手可能なＤＮＡを水と混合して最終的な体積を２５μｌにした。
１０ユニットのＨｈａＩ、１０ユニットのＨｐａＩＩおよび反応緩衝液からなる反応混合物１０μｌを加えた。試料を、制限酵素にとって最適な温度でインキュベートした。ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩにより、メチル化されていないＤＮＡが消化される（半分メチル化された、または完全にメチル化されたＤＮＡは消化されない）。消化した後、加熱工程を使用して酵素を変性させた。
３）総容積５０μｌで、ＰＣＲ試薬（緩衝液、ｄＮＴＰ、プライマーおよびポリメラーゼ）を加えることによってゲノム増幅ＰＣＲを実施した。例示的なＰＣＲおよび伸長プライマーが以下に提供される。さらに、合成の競合オリゴヌクレオチドを既知濃度で加えた。
４）反復実験（任意選択の）−ＰＣＲ後、試験のＰＣＲ工程後の期間に導入される変動を最小限にするために、反応物５０μｌを５μｌの平行する反応（反復実験）に分割した。ＰＣＲ後の工程としては、ＳＡＰ、プライマー伸長（ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（登録商標）技術）、樹脂加工、ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｐおよびＭａｓｓＡＲＲＡＹの施工が挙げられる。
５）増幅可能なゲノムの数量化−Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使用して、各アッセイについて増幅産物の量を決定した。ＰＣＲ後、一塩基伸長アッセイを使用して、増幅された領域を調べた（工程３において導入された競合オリゴヌクレオチドを含む）。対象の部位のすぐ隣にハイブリダイズさせるために設計された特異的な伸長プライマーを導入した。下に提供される伸長プライマーを参照されたい。これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ｉＰＬＥＸ（登録商標）ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（登録商標）プライマーと称する。伸長反応において、ｉＰＬＥＸプライマーを相補ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させた。デオキシヌクレオチド三リン酸およびジデオキシヌクレオチド三リン酸の異なる組み合わせを酵素および緩衝液と一緒に含有する特別な終結混合物により、ｉＰＬＥＸプライマーの制限伸長を導いた。プライマー伸長は相補的なジデオキシヌクレオチドが取り込まれるまで起こる。
伸長反応によって、それぞれが独特の分子量を有するさまざまな長さのプライマー産物を生成した。結果として、プライマー伸長産物を、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔでマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を使用して同時に分離し、検出することができる。この分離および検出の後、ＳＥＱＵＥＮＯＭが登録商標を持つソフトウェアによってデータを自動的に分析する。
６）胎児核酸の量および濃度の算出−試料中に存在するゲノム等価物の総量、男児の妊娠から単離した胎児核酸の量（および濃度）、ならびに胎児核酸の量（および濃度）を、示差的にメチル化された標的に基づいて算出するための方法が以下、および図１８および１９に提供されている。
上記のプロトコールを使用して、下記のアッセイの１つ以上を実施することができる。すぐ下に提供される配列に加えて、多数の標的を調べる多重スキームが下の表Ｘに提供されている。
１）試料中の増幅可能なゲノム等価物の総数を数量化するためのアッセイ。
標的を、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体、またはＹ染色体上に位置しないハウスキーピング遺伝子中で選択した。標的は、単一コピー遺伝子であるべきであり、メチル化感受性制限酵素の任意の認識部位を含有するべきでない。
下線が引かれている配列はＰＣＲプライマー部位であり、イタリック体は一塩基伸長プライマーのための部位であり、太字（Ｃ）はヒトＤＮＡ上で伸長されるヌクレオチドである。
ＡｐｏＥ第１９染色体：調べられた太字のヌクレオチドＣを有する４５４０９８３５〜４５４０９９２２ＤＮＡ標的配列。この節で提供される染色体の位置は全て、２００９年２月のＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｕｉｌｄからのものである。
ＡｐｏＥフォワードプライマー：
（５’末端にダッシュによって分離された１０ｂｐの質量タグを含有するプライマー）
ＡｐｏＥリバースプライマー：
（５’末端にダッシュによって分離された１０ｂｐの質量タグを含有するプライマー）
ＡｐｏＥ伸長プライマー：
プライマーは、ヒトＤＮＡ標的においてＣを伸長し、合成のＤＮＡ標的においてＴを伸長する
ＡｐｏＥ合成の競合オリゴヌクレオチド：
（５７位の太字ＴはヒトＤＮＡと異なる）
２）試料中のＹ染色体配列の総数を数量化するためのアッセイ。
ゲノム内の他の所に同様の配列またはパラログ配列を有さない、Ｙ染色体に特異的な標的を選択した。標的は、好ましくは単一コピー遺伝子であるべきであり、メチル化感受性制限酵素（複数可）の任意の認識部位を含有するべきではない。
下線が引かれている配列はＰＣＲプライマー部位であり、イタリック体のヌクレオチド（複数可）は単一塩基伸長プライマーのための部位であり、太字（Ｃ）はヒトＤＮＡ上で伸長されるヌクレオチドである。
ｃｈｒＹにおけるＳＲＹ：２６５５６２８−２６５５７１７（逆相補物）
ＳＲＹフォワードプライマー：
（５’末端にダッシュによって分離された３ｂｐの質量タグを含有するプライマー）
ＳＲＹリバースプライマー：
ＳＲＹ伸長プライマー：
プライマーはヒトＤＮＡ標的においてＣを伸長し、合成のＤＮＡ標的においてＴを伸長する。５’末端の小文字「ａ」は、非相補的なヌクレオチドであるＳＲＹ合成の競合オリゴヌクレオチド：
３）試料中に存在する胎児のメチル化されたＤＮＡ配列を数量化するためのアッセイ。母体のＤＮＡと胎児のＤＮＡとの間で示差的にメチル化されていることが公知の領域において標的を選択した。配列を、メチル化感受性酵素のいくつかの制限部位を含有するように選択した。この試験のために、ＨｈａＩ（ＧＣＧＣ）およびＨｐａＩＩ（ＣＣＧＧ）酵素を使用した。
下線が引かれている配列はＰＣＲプライマー部位であり、イタリック体は一塩基伸長プライマーのための部位であり、太字（Ｃ）はヒトＤＮＡ上で伸長されるヌクレオチドである、小文字は、メチル化感受性制限酵素の認識部位である。
ｃｈｒ１２におけるＴＢＸ３：１１５１２４９０５−１１５１２５００１
ＴＢＸ３フォワードプライマー：
（５’末端にダッシュによって分離された１０ｂｐの質量タグを含有するプライマー）
ＴＢＸ３リバースプライマー：
（５’末端にダッシュによって分離された１０ｂｐの質量タグを含有するプライマー）
ＴＢＸ３伸長プライマー：
プライマーはヒトＤＮＡ標的においてＣを伸長し、合成のＤＮＡ標的においてＴを伸長する。５’末端の小文字「ａ」は、非相補的なヌクレオチドである
ＴＢＸ３合成の競合オリゴヌクレオチド：
４）酵素の制限効率についての対照アッセイ。
調査される組織のいずれにおいてもメチル化されていないことが公知の領域において標的を選択した。配列を、使用する各制限酵素に対してただ１つの部位を含有するように選択した。
下線が引かれている配列はＰＣＲプライマー部位であり、イタリック体のヌクレオチド（複数可）は、一塩基伸長プライマーのための部位を表し、太字（Ｇ）はヒトＤＮＡにおいて伸長されるリバースヌクレオチドであり、小文字は、メチル化感受性制限酵素の認識部位である。
ＣＡＣＮＡ１Ｇ ｃｈｒ１７：４８６３７８９２−４８６３７９７７（逆相補物）
ＨｈａＩフォワードプライマー：
（５’末端にダッシュによって分離された１０ｂｐの質量タグを含有するプライマー）
ＨｈａＩリバースプライマー：
（５’末端にダッシュによって分離された１０ｂｐの質量タグを含有するプライマー）
ＨｈａＩ伸長プライマー：
ＨｈａＩ合成の競合オリゴヌクレオチド：
検証実験
本発明の感度および正確度を、モデル系および臨床的な試料の両方を使用して測定した。異なる試料において、全コピー数を数量化するための２つのアッセイ、メチル化を数量化するための３つのアッセイ、Ｙ染色体に特異的な１つのアッセイおよび１つの消化対照アッセイを含有する多重アッセイを実行した。表Ｘを参照されたい。追加的なアッセイを伴う別の多重スキームが表Ｙに提供されている。
表Ｘ： ＰＣＲプライマーおよび伸長プライマー
表Ｙ： ＰＣＲプライマーおよび伸長プライマー
表Ｙ：競合オリゴヌクレオチド配列
Ｔ＝総量のためのアッセイ
Ｍ＝メチル化を数量化するためのアッセイ
Ｙ＝Ｙ染色体特異的なアッセイ
Ｄ＝消化対照。
ゲノムＤＮＡを使用したモデル系
試料中の増幅可能なゲノムのコピーの総数を決定する際に、方法の感度および正確度を決定するために、妊娠していない女性の血液から単離した異なるＤＮＡ試料のサブセットを試験した。各試料を、およそ反応当たり２５００コピー、１２５０コピー、６２５コピーまたは３１３コピーを含有するように希釈した。増幅可能なゲノムのコピーの総数を、３つの全コピー数アッセイから得たＤＮＡ／競合剤の比率の平均を取ることによって得た。４つの異なる試料からの結果が図１２に示されている。
反応を最適化するために、モデル系を開発して血漿から単離したＤＮＡ試料をシミュレートした。これらの試料は、一定数の母体のメチル化されていないＤＮＡを含有し、これに異なる量の男児の胎盤のメチル化されたＤＮＡをスパイクした。試料に、母体のメチル化されていないＤＮＡに対しておよそ０％〜２５％にわたる量をスパイクした。結果が図１３Ａおよび図１３Ｂに示されている。胎盤のＤＮＡの割合を、メチル化アッセイ（図１３Ａ）、ＳＲＹマーカー（図１３Ｂ）および全コピー数アッセイから得た比率を使用して算出した。メチル化アッセイ（ＴＢＸ）用、Ｙ染色体アッセイ（ＳＲＹ）用および全コピー数（ＡＰＯＥ）用のプライマー配列が上で提供されている。モデル系により、実施したメチル化に基づく方法がＹ染色体法（ＳＲＹマーカー）と等しいことが実証され、したがって、性別に依存しない胎児の数量化器（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ）としてのメチル化に基づく方法が検証されている。
血漿試料
臨床的な試料における方法の感度および正確度を調査するために、男の胎児を有する妊娠中の女性から得た３３個の血漿試料を、表Ｘからの多重スキームを使用して調査した。全試料のうちの一部のみを使用するという重要な要件に応じるために、各反応について、抽出物４ｍｌから得たＤＮＡの４分の１を使用した。
全コピー数の数量化
全コピー数の数量化からの結果は図１４Ａおよび図１４Ｂに見ることができる。図１４Ａには、各試料についてのコピー数が示されている。２つの試料（２５番および２６番）は他の全ての試料よりも有意に高い全コピー数を有する。一般に、血漿１ｍｌ当たり平均でおよそ１３００個（７６６〜２０５５の範囲）の増幅可能なコピーを得た。図１４Ｂは、結果を要約している、所与の値の箱ひげ図示す。
メチル化マーカーから得られた結果とＹ染色体マーカーから得られた結果との間の相関
図１５Ａおよび図１５Ｂでは、各試料について胎児のコピーの数がプロットされている。全ての試料は男児の妊娠由来であった。得られたコピー数を、メチル化マーカーまたはＹ染色体特異的なマーカーのいずれかを使用して算出することができる。図１５Ｂにおいて見ることができるように、所与の値の箱ひげ図により、２つの異なる測定値間の最小の差が示された。
メチル化マーカーから得られた結果とＹ染色体マーカー（ＳＲＹ）から得られた結果との間の相関を示す結果が図１６に示されている。さらに、実施したメチル化に基づく方法はＹ染色体方法（ＳＲＹマーカー）と等しく、性別に依存せず、かつ多型に依存しない胎児の数量化器（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ）としてのメチル化に基づく方法がさらに検証されている。表Ｘに開示されている多重化されたアッセイを使用して胎児核酸を決定した。
最終的に、対照に対する競合剤の消化の比率を使用し、この値を平均全コピー数アッセイと比較することによって消化効率を決定した。図１７を参照されたい。試料２６以外の全ての反応で効率が９９％を上回ることが示されている。
データ解析
質量スペクトル分析を、Ｔｙｐｅｒ４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍのソフトウェア製品）を使用して行った。個々のＤＮＡ被検体および競合剤アッセイについてのピークの高さ（シグナル対ノイズ）を決定し、さらに解析するためにエクスポートした。
各アンプリコンに存在する分子の総数を、ＤＮＡ特異的なピークを競合剤特異的なピークで割って比率をもたらすことによって算出した。（図１８および図１９の「ＤＮＡ」ピークは、所与のアッセイについての被検体のピークであると考えられる）。反応に加えた競合剤分子の数が既知であるので、比率に、加えた競合剤分子の数を掛けることによってＤＮＡ分子の総数を決定することができる。
各試料中の胎児のＤＮＡの割合（または濃度）を、男児の妊娠についてＹ染色体特異的なマーカーを、全ての妊娠についてメチル化された画分の平均を使用して算出した。簡単に述べると、Ｙ染色体について、被検体（ＤＮＡ）のピークを競合剤のピークで割ることによって比率を得、この比率に、反応に加えた競合剤分子の数を掛けた。この値を、増幅可能なゲノム等価物決定（総量のためのアッセイ（複数可）を使用する）の総数から得た同様の比率で割った。図１８を参照されたい。試料中に存在する核酸の総量は、母体核酸と胎児核酸の合計であるので、胎児の寄与は、より大きな、バックラウンドの母体の寄与のごく一部であると考えることができる。したがって、これを図１８に示されている方程式に転換すると、試料中に存在する全核酸の胎児の割合（ｋ）は、方程式：ｋ＝２×Ｒ／（１−２Ｒ）と等しく、ここでＲはＹ染色体量と総量の比率である。Ｙ染色体は一倍体であり、総量のためのアッセイでは決定のために二倍体の標的を使用するので、この算出は、母体の割合の５０％よりも小さな胎児の割合に限られる。
図１９では、メチル化特異的なマーカーを使用することによって胎児の濃度を同様に算出することが示されている（メチル化を数量化するためのアッセイを参照されたい）。Ｙ染色体特異的なマーカーと対照的に、これらのマーカーは二倍体の標的由来であり、したがって、Ｙ染色体特異的なアッセイについて述べた限定を省略することができる。したがって、胎児の割合（ｋ）は、方程式：ｋ＝Ｒ（１−Ｒ）を使用して決定することができ、ここで、Ｒはメチル化アッセイと全アッセイの比率である。
シミュレーション
第２１染色体に由来する２０種のマーカーおよび１つ以上の他の常染色体に由来する２０種のマーカーを使用する測定システムを仮定する第１の単純な検出力計算を実施した。１００コピーの胎児のＤＮＡ、２５個のコピーの測定値の標準偏差および０．００１未満であるべき第１種の過誤の確率から開始して、本発明の方法により、全事例の９９．５％で、二倍体の染色体セットと三倍体の染色体セットを弁別することができることが見いだされた。そのような手法の実用的な実行は、例えば、絶対的なコピー数を測定するための競合的なＰＣＲ手法を使用するシステムである質量分析を使用して実現することができる。この方法では、単一反応において２０回のアッセイを実行することができ、繰り返した測定の標準偏差約３％〜５％を有することが示されている。この方法を、例えば、核酸を分離するためにメチル結合剤を使用して、または母体核酸を消化するためにメチル化感受性酵素を使用して、メチル化されている核酸とメチル化されていない核酸を区別するための公知の方法と組み合わせて使用した。図８は、過剰なメチル化されていないＤＮＡの存在下でメチル化されたＤＮＡを捕捉し、それによって分離するためのＭＢＤ−ＦＣタンパク質（メチル結合剤）の有効性を示す（図８参照）。
第２の統計学的な検定力分析を実施して、本明細書に記載のメチル化に基づく胎児の診断方法の実施形態の予測的な検定力を査定した。トリソミーの第２１染色体特異的なマーカー群を参照マーカー群（例えば、第２１染色体以外の常染色体）と区別することの尤度を実証するためにシミュレーションを設計した。多くのパラメータが、マーカーの２つの集団を確実に識別するための能力に影響を及ぼす。本シミュレーションのために、実験に基づいて最も起こる可能性が高いことが示された各パラメータについての値を選択した。以下のパラメータおよびそれぞれの値を使用した：
コピー数
母体のコピー数＝２０００
第２１染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体以外の染色体についての胎児のコピー数＝２００
正倍数性の胎児の場合の第２１染色体についての胎児のコピー数＝２００
異数性のＴ２１胎児の場合の第２１染色体についての胎児のコピー数＝３００
胎児のＤＮＡの百分率（メチル化に基づく富化前）＝１０％（上記参照）
メチル化の頻度
母体のＤＮＡについての標的領域におけるメチル化の百分率の平均＝１０％
胎児のＤＮＡについての標的領域におけるメチル化の百分率の平均＝８０％
メチル化されていない母体のＤＮＡおよび消化されなかった母体のＤＮＡの百分率の平均（すなわち、制限効率の機能（数ある中で）＝５％
第２１染色体をターゲティングするアッセイの数＝１０
第２１染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体以外の染色体をターゲティングするアッセイの数＝１０
図２０に結果が示されている。ｘ軸の変動係数（ＣＶ）と単純なｔ検定（ｙ軸）を使用した、アッセイ集団を識別する検出力との間の関連性が示されている。データにより、全事例の９９％において、ＣＶが５％以下という条件で、有意水準０．００１で２つの集団（正倍数性対異数性）を識別することができることが示されている。このシミュレーションに基づいて、方法は、出生前に胎児の異数性を検出するための、性別に依存せず、全ての民族性において研究される（すなわち、対立遺伝子の偏りがない）有力な非侵襲的な診断方法を表す。
（実施例３）
追加的な示差的にメチル化された標的
第２１染色体上に位置しない示差的にメチル化された標的
以前のマイクロアレイ解析に基づいて、追加的な示差的にメチル化された標的を、さらなる解析のために選択した。マイクロアレイ解析の説明については実施例１を参照されたい。マイクロアレイスクリーニングの間、胎盤組織とＰＢＭＣとの間で示差的にメチル化された領域（ＤＭＲ）を規定した。領域を、ＥｐｉＴＹＰＥＲ確認のために、胎盤においてＰＢＭＣと比較して高メチル化されていることに基づいて選択した。変化の方向性を選択した後、領域を、有意性に関して最も有意から始めて低下させて設計した領域を用いて、統計的有意性に基づいて選択した。これらの試験を、８対のＰＢＭＣと胎盤の試料において実施した。追加的な非第２１染色体標的が、表４Ｂの各標的からの代表的なゲノム配列と一緒に表１Ｂに提供されている。
第２１染色体上に位置する示差的にメチル化された標的
マイクロアレイスクリーニングにより、１つのＤＭＲのサブセットのみが第２１染色体上に位置することが明らかになった。しかし、マイクロアレイによる第２１染色体の適用範囲は不十分であった。したがって、第２１染色体上の３５６個のＣｐＧ島の全てを、ＵＣＳＣゲノムブラウザの標準設定を使用して検査するためにさらなる解析を完了した。下の表１Ｃに示されているように、これらの標的のいくつかは、表１Ａにおいてすでに検査した標識と重複した。より詳細には、各ＣｐＧの約１０００ｂｐ上流および約１０００ｂｐ下流を含めた第２１染色体上に位置するＣｐＧ部位を、ＳｅｑｕｅｎｏｍのＥｐｉＴＹＰＥＲ（登録商標）技術を使用して調査した。ＳｅｑｕｅｎｏｍのＥｐｉＴＹＰＥＲ（登録商標）技術の説明については実施例１「Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）を使用した検証」を参照されたい。これらの試験を、８対のＰＢＭＣと胎盤の試料において実施した。さらに、ＤＭＲは、規定されたＣｐＧ島の外側に位置してもよいので、以下の特性を持つ潜在的な候補領域を同定するために、公的に入手可能なマイクロアレイデータに対してデータマイニングを実施した：母体の血液と比較して胎盤において高メチル化されており、規定されたＣｐＧ島に位置せず、４つより多いＣｐＧジヌクレオチドを含有し、かつメチル化感受性制限酵素の認識配列を含有する。次いで、これらの判断基準に適合した領域を、８対のＰＢＭＣと胎盤の試料に対してＳｅｑｕｅｎｏｍのＥｐｉＴＹＰＥＲ（登録商標）技術を使用して検査した。追加的な第２１染色体標的が、表４Ｃの各標的からの代表的なゲノム配列と一緒に表１Ｃに提供されている。
表１Ｂおよび表１Ｃに、異なる標的の詳細を、それらの場所および分析の異なる相、すなわちマイクロアレイ解析、ＥｐｉＴＹＰＥＲ８解析およびＥｐｉＴＹＰＥＲ７３解析の間に分析されたかどうかを含めて、提供している。「ＹＥＳ」は、それが分析されたことを示し、「ＮＯ」はそれが分析されなかったことを示す。表１Ｂおよび表１Ｃの列の定義は以下に列挙されている。
・領域名：各領域は、規定された、または近くの領域内にある遺伝子（複数可）によって名付けられている。遺伝子名がない領域が列挙されているが、近傍にｒｅｆｓｅｑ遺伝子を有さない遺伝子座のみを含有する。
・遺伝子領域：遺伝子に極めて近接して、またはその範囲内に含有される領域について、遺伝子領域は、この領域の、近くの遺伝子との関連性をさらに説明している。
・Ｃｈｒｏｍ：ＵＣＳＣゲノムブラウザのｈｇ１８ビルドを使用してＤＭＲが位置づけられる染色体。
・開始：ＵＣＳＣゲノムブラウザのｈｇ１８ビルドで示されるＤＭＲの開始位置。
・終了：ＵＣＳＣゲノムブラウザのｈｇ１８ビルドで示されるＤＭＲの終了位置。
・マイクロアレイ解析：この領域が、マイクロアレイ解析によって、示差的にメチル化されていることが同様に／最初に決定されたかどうかについて記載している。１０対の胎盤とＰＢＭＣの試料のメチル化された画分を、ＭＢＤ−Ｆｃタンパク質を使用して単離した。次いで、２つの組織画分を、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５−ａｈａ−ｄＣＴＰ（ＰＢＭＣ）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ａｈａ−ｄＣＴＰ（胎盤の）でのいずれかで標識し、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）ＣｐＧ島マイクロアレイとハイブリダイズさせた。これらの試験で検査した多くの領域は、最初のマイクロアレイを含有しなかった。
・ＥｐｉＴＹＰＥＲ８試料：この領域が、ＥｐｉＴＹＰＥＲ技術を使用して、８対の胎盤と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料において示差的にメチル化されていると解析され、決定されたかどうかについて記載している。検査のために選択した領域は、多数の判断基準に基づいた。まず、マイクロアレイ解析からのデータに基づいて領域を選択した。次に、第２１染色体上に位置する全てのＣｐＧ島の包括的な検査に着手した。最後に、ＣｐＧ島に位置する領域よりも低いＣｐＧ頻度を有する第２１染色体上の選択された領域を検査した。
・ＥｐｉＴＹＰＥＲ７３試料：この領域が、その後、７３対の胎盤とＰＢＭＣの試料からなる同じ試料コホートにおいてＥｐｉＴＹＰＥＲ技術を使用して分析されたかどうかについて記載している。この第２の試料コホートにおいて分析するための選択された全ての領域を、ＥｐｉＴＹＰＥＲ８の列に記載の実験からの結果に基づいて選択した。より詳細には、この追加的なコホート内の領域は、ＥｐｉＴＹＰＥＲ８試料分析において決定されたものと同様のメチル化のプロファイルを示した。例えば、表１Ｂ〜１Ｃに列挙されている領域の全てが、規定の領域内の検査したＣｐＧジヌクレオチドのかなりの部分において異なるレベルＤＮＡのメチル化を示している。ＣｐＧ部位の示差的なＤＮＡのメチル化を、対応のあるＴ検定を使用して決定し、ｐ値（胎盤組織とＰＢＭＣを比較した場合）がｐ＜０．０５である場合に、その部位を示差的にメチル化されているとみなした。
・以前検証されたＥｐｉＴＹＰＥＲ：この領域またはこの領域の一部が、以前の実験の間にＥｐｉＴＹＰＥＲを使用して検証されたかどうかについて記載している。（実施例１および２を参照されたい）。
・母体に対する胎盤の相対的なメチル化：示差的なメチル化の方向について記載している。「高メチル化」と標識された領域は、ＰＢＭＣと比較して胎盤試料中の示した領域内で多くメチル化されおり、「低メチル化」は、ＰＢＭＣ試料中の示した領域内で多くメチル化されている。
表１Ａ
表１Ａの情報は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによってもたらされた２００６年３月のヒト参照配列（ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ３６．１）に基づく。
表１Ｂ： 非第２１染色体の示差的にメチル化された領域
表１Ｃ： 第２１染色体の示差的にメチル化された領域
表２
表３
表４Ａ
表４Ｂ
表４Ｃ
本発明において参照された特許、特許出願、刊行物および文書のそれぞれの全体がこれによって参照により組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物および文書を引用することは、前述のいずれもが先行技術に関係することを認めるものではなく、これらの刊行
物または文書の内容または日付に関してどんな容認も構成するものでもない。
当該技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに改変を行うことができる。当該技術は、１つ以上の特定の実施形態を参照してかなり詳細に記載されているが、当業者は、本出願に詳細に開示されている実施形態に変化を生じさせてよく、それでもこれらの改変および改良は当該技術の範囲および主旨であることを理解されよう。
本明細書において適切に例示的に記載されている技術は、本明細書に詳細に開示されていない要素（複数可）のいずれがなくとも実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において「含む」、「から本質的になる」および「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと交換することができる。使用されている用語および表現は、説明する用語として使用され、限定ではなく、そのような用語および表現を使用することによって、示され、記載されている特徴の等価物またはその部分は排除されず、特許請求された技術の範囲内で種々の改変が可能である。「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」という用語は、要素のうちの１つ、または要素のうちの２つ以上のいずれかについて記載されていることが文脈上明らかでない限り、それが修飾する要素のうちの１つ以上を指し得る（例えば、「ａ（１つの）試薬」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書で使用される「約」という用語は、根底にあるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラス１０％またはマイナス１０％）を指し、一連の値の最初に「約」という用語を使用することにより、値のそれぞれを修飾する（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含んでよい。さらに、値の列挙が本明細書に記載されている場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、その列挙は、それらの中間の値および小数値の全てを含む（例えば、５４％、８５．４％）。したがって、本技術は代表的な実施形態および任意選択の特徴によって詳細に開示されているが、当業者は本明細書に開示されている概念の改変および変形を用いることができ、かつそのような改変および変形は本技術の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
当該技術の特定の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載されている。

Claims (18)

  1. 対立遺伝子の比率を染色体異常の存在または非存在の指標とする方法であって、
    ａ）示差的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含む、妊婦に由来する試料に存在する核酸を、メチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用剤と接触させることにより、前記作用剤に結合した核酸を生じ、それによって、前記胎児核酸を富化する工程であって、前記メチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用剤が、メチル化されたヌクレオチドに特異的に結合するタンパク質を含む、工程；
    ｂ）配列番号９０〜１６３、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２１２、２１３、２１４、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２４１、２５７、２５８、２５９および２６１の遺伝子座から選択される多数の遺伝子座における少なくとも１つの標的染色体に関する、前記胎児核酸の対立遺伝子の比率分析を実施する工程であって、前記多数の遺伝子座は前記少なくとも１つの標的染色体に含まれる、工程；
    ｃ）少なくとも１つの参照染色体に関して、前記胎児核酸の対立遺伝子の比率分析を実施する工程；ならびに
    ｄ）ｂ）における前記少なくとも１つの標的染色体に関する前記胎児核酸の前記対立遺伝子の比率と、ｃ）における前記少なくとも１つの参照染色体に関する前記胎児核酸の前記対立遺伝子の比率とを比較する工程
    を含み、染色体異常が存在するかどうかが工程ｄ）における比較に基づいて決定される、方法。
  2. 前記多数の遺伝子座が、配列番号１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２１２、２１３、２１４、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２４１、２５７、２５８、２５９および２６１の遺伝子座から選択される１つ以上の遺伝子座を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記多数の遺伝子座が、配列番号１９３、２００、２０８、２０９、２１１、２１３、２１４、２３１、２３２、２３５および２４１の遺伝子座から選択される１つ以上の遺伝子座を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記多数の遺伝子座が、配列番号２０９の遺伝子座を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記多数の遺伝子座が、配列番号２１１の遺伝子座を含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記多数の遺伝子座が、配列番号２１３の遺伝子座を含む、請求項３に記載の方法。
  7. 前記多数の遺伝子座が、配列番号２１４の遺伝子座を含む、請求項３に記載の方法。
  8. 前記標的染色体および前記参照染色体の各々上の３〜１５個の遺伝子座における核酸の量が決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記標的染色体および前記参照染色体の各々上の１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２００、３００または５００および任意の中間数の遺伝子座における核酸の量が決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 増幅反応において前記遺伝子座またはその部分を増幅し、それにより増幅産物を生成する工程を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記標的染色体および前記参照染色体に関する核酸の量を決定する工程が、競合剤ベースの増幅方法の使用を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ｉ）全核酸の量を決定する工程；および
    ｉｉ）前記核酸中のＹ染色体核酸の存在または非存在を決定する工程
    をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記核酸中に存在するＹ染色体核酸の量が、男の胎児に関して決定される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記核酸の量が前記Ｙ染色体核酸の量と比較される、請求項１３に記載の方法。
  15. ２つ以上のアッセイが前記核酸の総量を決定するために使用され、１つ以上のアッセイが男の胎児に関する前記Ｙ染色体核酸の量を決定するために使用される、請求項１３に記載の方法。
  16. ｂ）およびｃ）における核酸の量を決定する工程が、質量分析の使用を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ｂ）およびｃ）における核酸の量を決定する工程が、配列決定方法の使用を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記配列決定方法が、合成による配列決定を含む、請求項１７に記載の方法。
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