KR20010001577A - 고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법 - Google Patents

고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법 Download PDF

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KR20010001577A
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박재찬
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Abstract

본 발명은 바이오칩(biochip)의 제조에 사용할 수 있는 다양한 염기서열의 다수의 올리고펩티드 핵산 탐침을 고체기질 위에서 고분자 광산발생제를 이용하여 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 고체기질을 표면처리한 다음, 산에 불안정한 보호기로 보호된 링커(linker)를 부착하고, 고분자 광산발생제로 코팅시킨 후, 노광시켜 산을 발생시킴으로써 산에 불안정한 보호기를 제거하고, 산에 불안정한 보호기로 보호된 펩티드 핵산의 단량체와 결합시키고, 반응 후 남아 있는 고분자 광산발생제를 제거하는 공정을 반복하여, 고체기질 위에서 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산 탐침을 제조하였다. 본 발명에 의하면, 종래의 DNA 칩의 제작에 사용된 포토레지스트(PR) 방식과 광산패턴배열(PPA) 방식의 문제점을 보완하여, 그 자체가 고분자로 구성된 고분자 광산발생제(polymeric photoacid generator)를 이용함으로써, 공정을 단순화하고 효율을 높일 수 있었으며, 본 발명에 의해 올리고 핵산 탐침을 대체할 수 있는 중이온성의 올리고펩티드 핵산 탐침을 제조할 수 있다.

Description

고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법{Process for Preparing Oligopeptidenucleotide Probe Using Polymeric Photoacid Generator}
본 발명은 고분자 광산발생제(polymeric photoacid generator)를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 바이오칩(biochip)의 제조에 사용할 수 있는 다양한 염기서열의 다수의 올리고펩티드 핵산 탐침을 고체기질 위에서 고분자 광산발생제를 이용하여 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
바이오칩은 유전자 분석, 질병 진단, 생물공정 및 환경 모니터링에 응용되는 바이오센서의 한 분류로서, 크게 유전물질인 DNA(deoxyribonucleic acid)의 염기서열을 규명하는 DNA 칩과 병원체, 항체, 항원 또는 효소 등의 단백질을 인식하는 단백질 칩으로 나눌 수 있다.
1953년 왓슨(Watson)과 크릭(Crick)에 의해 밝혀진 DNA의 구조는 분자생물학, 생화학 등과 같은 생명과학 분야에서 매우 중요한 위치를 차지하여 왔다. DNA는 인산기(phosphate)와 디옥시당(deoxyribose)을 기본 골격으로 하여, 디옥시당에 아데닌(adenine; A), 시토신(cytosine; C), 구아닌(guanine; G) 또는 티민(thymine; T) 등의 염기(nucleobase)가 연결된 생고분자(biopolymer)로서, A와 T 그리고 C와 G가 수소결합에 의해 특정적 그리고 상보적으로 상호간을 인식하여 결합된 매우 안정한 이중나선(double helix) 구조로 이루어져 있다. 이러한 DNA 염기 상호간의 특정적/상보적인 수소결합은 의약의 개발에 있어 매우 중요하므로, 현재 이를 기초로 한 안티센스치료제(antisense drug), 유전자 치료(gene therapy) 등의 신약 연구가 매우 활발하게 진행되고 있으며, 특히 암, 심장질환 등의 유전적 질병의 치료에 응용되고 있다.
최근, 인체가 가지고 있는 약 10만 개로 추정되는 모든 유전자 정보를 규명하고자 하는 노력과 함께, 유전병을 진단하고 치료 및 예방하는데 있어서 막대한 양의 유전자 정보를 신속히 제공할 수 있는 방법에 대한 요구가 크게 증가하고 있다. 현재 사용되고 있는 전기영동에 의한 DNA 염기서열을 분석하는 생거(Sanger)의 방법은 DNA를 복제하는 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)법의 개발 및 이의 자동화 등에 의해 꾸준히 발전하였음에도 불구하고, 과정이 번거럽고 많은 시간과 노력, 비용 및 고도의 숙련도를 필요로 하기 때문에, 이러한 단점을 극복할 수 있는 새로운 분석 시스템이 모색되었다. 이러한 필요에 의해 지난 수년간 DNA 칩의 제작과 이용기술과 관련된 많은 진보가 있었다.
일반적으로, DNA 칩이란 1평방 인치 미만의 작은 면적의 실리콘, 표면개질유리, 폴리프로필렌, 활성화 폴리아크릴아미드와 같은 고체표면에 염기서열이 알려진 작게는 수 개, 크게는 수백 개 염기크기의 올리고핵산(oligonucleotide) 탐침(probe)을 수백 내지 수십만 개의 정해진 위치에 부착시켜 미세집적(micro-array)시킨 것을 통칭한다. 이러한 DNA 칩에 분석하고자 하는 목표 DNA 단편을 결합시키면, DNA 칩에 부착되어 있는 탐침들과 목표 DNA 단편상의 염기서열의 상보적 정도에 따라 각기 다른 혼성화 결합(hybridization) 상태를 이루게 되는데, 이를 광학적인 방법 또는 방사능 화학적 방법 등을 통해 관찰 해석함으로써 목표 DNA의 염기 서열을 측정할 수 있다. 이러한 DNA 칩을 이용한 방법은 DNA 분석시스템의 소형화를 이루어 극미량의 시료만으로도 진단이 가능하며, 목표 DNA 상의 여러군데의 염기서열을 동시에 규명할 수 있게 함으로써, 간편하고도 저렴할 뿐만 아니라 신속하게 유전 정보를 제공할 수 있다.
올리고핵산 탐침을 이용하여 유전자의 염기서열을 진단하는 방법은 종래의 생거(Sanger) 방법에 비하여 신속하고도 용이하게 목적 유전자의 염기서열을 밝혀낼 수 있다는 점에서 매우 획기적인 방법이다. 생거의 방법은 합성된 형광물질 또는 방사능물질을 부착한 유전자 단편을 폴리아크릴아미드 젤 등을 사용하여 전기영동에 의해 분리해야 하므로, 일반적으로 분리하는데 장시간이 소요될 뿐만 아니라, 분리도 쉽지 않은 기술적인 문제점을 갖고 있다. 반면, 올리고핵산 탐침을 이용한 혼성화 결합에 의한 염기서열 분석방법(sequencing by hybridization; SBH)은 형광물질 또는 방사성 물질을 부착한 목표 유전자 단편을 올리고핵산 탐침에 처리한 후, 간단히 용매로 세척하여 상보적 염기서열의 유전자 단편만이 올리고핵산 탐침과 수소 결합시키는 원리를 이용한 방법이다.
따라서, 유기용매에 용해되지 않는 고체의 표면에 화학물질을 결합시켜 고체상에서 유기반응시키는 방법은 반응후의 정제공정이 간편하고 효율적인 이유로 메리필드(Merryfield)가 발명한 이래(참조: Fed. Proc., 24, 412 (1962)), 생물학적으로 관심이 큰 효소의 근간인 아미노산의 올리고펩티드 및 유전자물질인 올리고핵산 등의 합성에 매우 유용하게 사용되어 왔다. 이러한 개념에 조합화학 방법을 더하여 짧은 시간에 효율적으로 대량의 유기물질을 합성하는 새로운 물질의 제조방법은, 신약의 개발 뿐만 아니라 촉매의 대량검색 등에 매우 유용하게 사용되고 있다. 또한, 상술한 고체상의 조합합성 개념에 반도체 공정에 이용되는 포토리소그래피(photolithography, 이하 '리소'라 함) 기술을 조합하여, 유전자의 진단 등에 이용할 수 있는 다양한 올리고핵산 탐침의 공정방법이 개발되었다. 이 방법은 표면 처리된 유리기판의 특정 부분이 광화학적인 방법에 의해 선택적으로 활성화되며, 이 부분만이 다음에 가해질 뉴클레오티드와 화학적 결합을 하게 된다. 이때, 목적하는 부분만을 활성화하기 위해 차폐물질인 포토리소그래픽 마스크(photolithographic mask)상에 미리 정해진 형태에 따라 뚫린 구멍을 통해 빛을 쪼여 준다. 따라서, 칩 상의 특정 부위와 염기 조성은 매 단계에서 사용되는 차폐물질 상의 구멍 패턴과 이어서 공급되는 뉴클레오티드의 종류에 따라 달라지게 되는 바, 이러한 특성을 이용하면 아무런 제한없이 원하는 염기서열을 원하는 곳에 배치할 수 있다. 이 기술은 반도체 공정에 사용되는 극미세 가공 기술이기 때문에 손톱 크기의 칩 상에 수백만개 이상의 탐침을 부착시킬 수 있다.
예를 들면, 포돌(Fodor) 등은 자외선광에 불안정한 작용기로 보호된 핵산 및 아미노산을 고체표면상에 연결시키고, 포토리소그래픽 마스크를 이용하여 특정 부분을 노광시켜 보호기를 제거한 후, 광학적으로 불안정한 작용기로 보호된 핵산 또는 아미노산을 반응시켜 특정 부분의 핵산 또는 아미노산의 길이를 늘여가는 새로운 합성방법(direct photolysis)을 발표하였다(참조: 미국특허 제 5,445,934호 및 제 5,744,305호). 전기 방법은 특정위치에 특정 염기서열 및 길이를 가지는 올리고핵산 탐침을 선택적으로 합성할 수 있으므로, 다양한 염기서열의 올리고핵산 탐침을 원하는 길이로 원하는 위치에 합성할 수 있는 매우 유용한 방법이다. 또한, 전기 방법은 반도체의 공정에 사용되는 극미세가공 차폐물질을 사용함으로써, 올리고핵산 탐침의 고집적(high density) 합성에 매우 유용하다. 포돌 등은 종래의 생거 방법보다 훨씬 간편하고 빠르게 유전자의 염기서열을 규명하는 방법으로 올리고핵산 탐침을 이용하는 방법을 제시하였다. 그러나, 이러한 포돌의 방법이 고집적 올리고핵산 탐침의 제작방법으로 매우 유용하나, 빛을 쪼여 빛에 불안정한 보호기를 없애는 방법은 보호기가 광원의 세기에 따라 비례적으로 떨어져 나가기 때문에, 칩의 고집적화를 위한 극미세가공에 한계가 있다.
한편, 반도체 제조공정에서 미세패턴을 형성하기 위하여 사용되는 포토레지스트(photoresist; 이하, 'PR'이라 함)를 이용한 리소공정은 DNA 칩의 집적율을 높이기 위한 필수적인 기술이라는 데 주목을 받아 왔다. 이때, 반도체 칩의 크기나 용량은 리소공정에서의 해상도(spatial resolution)에 의해 좌우되기 때문에, 리소공정이 전체 반도체와 마이크로일렉트로닉스의 발전을 좌우해 왔다고 볼 수 있다. 리소공정은 고분자 포토레지스트(PR)의 용해도가 노광부위와 비노광부위에 따라 크게 차이가 나는 것을 이용하는데, 노광부위의 용해도가 감소하는 시스템을 네가티브(negative)라 하고, 반대인 경우를 포지티브(positive)라 하며, 반도체 칩의 제조에는 주로 포지티브를 사용한다. 이러한 리소공정을 이용하면, 제한된 면적의 칩상에 보다 많은 수의 올리고핵산 탐침을 배열할 수 있다.
지금까지 리소공정을 적용한 예로서는, 일반적인 PR을 이용한 방법(참조: 미국특허 제 5,658,734) 및 광산패턴배열방법(photoacid patterned array; 이하, 'PPA'라 함, 참조: 미국특허 제 5,843,655)을 들 수 있다.
이중, PR을 이용한 리소공정(이하, 편의상 'PR공정'이라 함)은 이미 반도체 산업을 위해 널리 개발 또는 상업화 되어 있는 재료를 사용할 수 있다는 장점이 있다. 이 방법에 의하면, 조사에 의해 패턴이 형성되고, 노광된 부분을 세척하면 그 표면에서 고상핵산반응(standard solid-phase nucleic acid synthetic reaction)이 일어나, 뉴클레오티드가 결합하게 된다. 이때, PR의 대표적인 예로는, 계면과의 접착력이 우수한 디아조퀴논/크레졸-노볼락(diazoquinone/cresol-novolac)을 들 수 있는데, i-line(365nm)에서 우수한 패턴특성을 보여, 반도체의 16메가 DRAM 공정에 사용되고 있다. 그러나, 이러한 PR은 알칼리 수용액 ([OH-]＞0.1M)의 조건에서 현상을 하는데, 이 조건에서는 염기의 아미노기를 보호하는 아미드의 결합이 깨지게 되므로, 이러한 부작용을 막기 위해 PR 바로 밑에 프로텍팅 코팅을 하여 현상 중의 문제점을 보완하는 방법이 제안되었다(참조: J. Vac. Sci. Tech., 1989, B7(6), 1734).
PR공정은 크게 세부분으로 나누어 지는데, 첫째는 PR의 코팅, 노광 및 현상으로 주로 PR의 패턴에 관한 공정이고; 두번째는 노광되어 패인 부분에서의 산용액에 의한 보호기 및 PR의 제거에 관한 공정이며; 및, 세번째는 순서에 의한 핵산의 결합과 후처리에 관한 공정이다. 그러므로, PR을 이용하는 리소공정은 높은 해상도를 얻는데는 손색이 없지만, 전기와 같은 공정의 복잡성이 지적되어 왔다.
따라서, 이러한 복잡한 공정수를 줄이고 효율을 높이기 위한 방안으로 광산패턴배열(PPA) 방식이 개발되었다. PPA 방식은 고분자 메트릭스에 광산발생제(photoacid generator; 이하, 'PAG'라 함)를 혼합하여 구성되므로, 노광된 부분에서만 산이 발생되고, 뒤이은 열처리로 보호기를 제거시킬 수 있으므로, 이 방식을 이용하면 PR공정에 각각 행해지는 PR과 보호기 제거의 공정을 하나의 공정으로 묶을 수 있다. 그러나, 이러한 PPA방식에도 몇가지 문제점이 보고되어 있다. 예를 들어, 일반 PR공정에서는 산용액에 의하여 보호기를 제거하므로, 산이 직접 보호기 부분에 접촉을 하도록 과량의 산용액을 사용하여 산의 농도나 양에는 크게 좌우되지 않는 반면, PPA방식은 발생산이 고분자 매트릭스에서 거동을 하므로 산의 양을 맞추기 위해 PAG를 많이 넣어 주어야 하는데, 일정농도 이상이 되면 PAG 도메인이 생기게 되어 광을 산란시켜 미세패턴에 방해가 되며, 패턴의 안정성과 재현성을 위해 넣어주는 과량의 PAG로 인해 효율이 떨어지게 된다. 또한, 발생하는 산이 열에 의해 고분자에서 확산되어 보호기 부분의 표면(실제로는 가열부에서 가까운 부분)에서 반응을 해야 하는데, 유리판을 핫플레이트에 올려 가열을 하면, 발생하는 산이 윗표면 부분 즉, 보호기 부분의 반대편으로 이동을 하여 효율이 떨어지게 된다. 더욱이, 커플링을 하기 위해 고분자와 PAG 혼합 필름을 제거하려면, 아세톤이나 메틸에틸케톤(MEK)과 같은 유기용제를 사용해야 하는데, 이러한 유기용제는 재처리 및 회수에 많은 비용이 소모된다.
한편, 종래의 DNA 칩이 안고 있는 또 다른 문제점으로는, 올리고핵산 탐침과 목표 유전자를 결합시키는 과정에서의 결합력 및 결합속도 그리고 유전자의 특정염기의 단일변형시에 결합력 및 해리력 등이 저하된다는 점이 지적되어 왔다. 예를 들면, 닐슨(Nielsen) 등은 올리고핵산의 상호결합시 올리고 핵산의 음이온적 성질 때문에 반발력이 생겨 결합력 및 결합속도가 떨어지는 문제점에 착안하여, 올리고핵산을 대체할 수 있는 중이온성의 물리적 성질을 가지며 종래의 메리필드(Merryfield)가 개발한 펩티드 합성방법을 일부 변형한 고체상의 합성방법에 의해 제조될 수 있는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)을 개발하였다. 이러한 물질은 핵산과의 결합시 핵산 상호간의 결합 보다 결합력 및 결합속도 등이 현저히 증가할 뿐만 아니라, 핵산의 특정 염기서열이 펩티드 핵산의 염기서열과 상보적이 아닐 때에는 결합력이 저하되어, 특정 유전자의 단일 염기변형의 인식에 유리한 장점이 있음이 보고되었다(참조: Nature, 1993, 8, 53). 이러한 장점으로 현재 펩티드 핵산을 안티센스 치료제(antisense drug)에 적용하는 방법이 개발 중에 있다. 그러나, 상술한 장점들이 있음에도 불구하고, 포토리소그래픽 마스크를 이용한 단위면적당 고집적의 올리고펩티드 핵산 탐침의 합성방법이 발표된 예는 아직 없다.
따라서, 종래의 DNA 칩의 제작에 사용된 PR방식과 PPA방식의 단점을 보완하여, 고체기질 위에서 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산 및 올리고 핵산을 높은 효율로 합성할 수 있는 새로운 방법의 개발에 대한 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 고체기질 위에서 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산을 높은 효율로 합성할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 종래의 고분자에 광산발생제를 첨가하는 PPA방식에 비해, 그 자체가 고분자로 구성된 고분자 광산발생제(polymeric photoacid generator)를 이용함으로써 공정효율이 향상되고, 이러한 방법으로 올리고 핵산의 음이온적 반발을 해소할 수 있는 중이온성의 올리고펩티드 핵산을 합성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 고분자 광산발생제를 이용하여 고체기질 위에서 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산을 합성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 고분자 광산발생제를 이용하여 합성된 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산 탐침을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 고체기질을 표면처리한 다음, 산에 불안정한 보호기로 보호된 링커(linker)를 부착하고, 고분자 광산발생제(polymeric photoacid generator; 이하, '고분자 PAG'라 함)로 코팅시킨 후, 노광시켜 산을 발생시킴으로써 산에 불안정한 보호기를 제거하고, 산에 불안정한 보호기로 보호된 펩티드 핵산의 단량체와 결합시키고, 반응 후 남아 있는 고분자 광산발생제를 제거하는 공정을 반복하여, 고체기질 위에서 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산 탐침을 제조하였다.
본 발명에서의 고분자 PAG는 분자량이 500 내지 1,000,000인 고분자로서, 주쇄 또는 측쇄에 술포늄염 또는 요오도늄염을 갖거나, 측쇄에 유기 광산발생기를 가짐으로써, 빛에 의해 산을 발생시키는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에서 사용된 펩티드 핵산 단량체는 N-(2-아미노에틸)글리신을 바탕으로 하여 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 티민 등의 염기가 아미드 결합으로 연결된 물질인데, 주쇄의 아미노 작용기가 다른 펩티드 핵산의 카르복실 작용기와 아미드 결합을 함으로써, 올리고펩티드 핵산이 합성된다. 올리고펩티드 핵산은 두 개 또는 그 이상의 펩티드 핵산을 의미한다. 현재, 주쇄의 아미노기가 산에 불안정한 터셔리부틸옥시카보닐(t-BOC)과 염기에 불안정한 플루오로메틸옥시카보닐(Fmoc)로 보호된 펩티드 핵산 단량체가 상업적으로 입수 가능한데, 전기 단량체들 중에 아데닌, 시토신, 및 구아닌의 염기의 엑소사이클릭(exocyclic) 아미노기는 강산에 안정한 디페닐메틸옥시카보닐(diphenylmethyloxycarbonyl) 또는 벤질옥시카보닐 (benzyloxycarbonyl) 등으로 보호되어 있다. 본 발명에서는 주쇄의 아미노기가 트리플루오로아세트산에 불안정한 터셔리부틸옥시카보닐(t-BOC)로 보호되고, 이 조건에서 일반적으로 안정한 벤질옥시카보닐기로서 염기의 엑소사이클릭 아미노기가 보호된 상업적으로 구입할 수 있는 물질을 사용했다.
일반적으로 알려진 올리고펩티드 핵산의 합성은 올리고 핵산의 합성방법(참조: Acc. Chem. Res. 1991, 24, 278)과 유사하게 수행할 수 있는데, 닐슨 등에 의한 합성방법은, 먼저, 아미노기가 노출된 고체 유지체에 산 또는 염기에 불안정한 작용기로 주쇄의 아미노기가 보호된 특정 염기(A,C,G 또는 T)의 펩티드 핵산의 카르복실기와 반응시켜 아미드 결합으로 연결시킨 후, 다음으로 산 또는 염기로 처리하여 아미노 보호기를 제거하여 노출된 아미노기를 또 다른 산 또는 염기에 불안정한 작용기로 주쇄의 아미노기가 보호된 특정 염기(A,C,G 또는 T)의 펩티드 핵산의 카르복실기와 반응시켜 펩티드 결합으로 연결시키는 공정을 반복함으로써, 원하는 염기서열 및 염기수의 올리고 펩티드를 합성한 후, 최종적으로 강한 산으로 처리하여 엑소사이클릭 아미노기 보호기와 고체 유지체를 화학적 반응에 의하여 분리하여 정제하는 고체상 합성방법이다. 이러한 공정은 각각의 유기반응시에 과량(5당량)의 펩티드 핵산 단량체를 사용하여 완전하게 반응시킨 후, 남아있는 단량체 및 반응물을 간단히 여과하고 유기용매로 씻어 내어 용매에 용해되지 않는 고체 지지체에 연결된 펩티드 핵산만을 쉽게 정제하는 공정상의 커다란 장점이 있다. 따라서, 본 발명에서는 다양한 바이오칩의 제작을 목표로, 고분자 PAG 방식을 도입하여 전기와 같은 고체상의 합성방법을 이용함으로써, 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산 탐침을 제조하는 방법을 제공하였다.
본 발명의 첫번째 공정으로 고체 지지체에 링커(linker)와 올리고펩티드 핵산을 부착시키기 위한 표면 처리가 요구되는 데, 본 발명에 사용된 기질은 현미경용 유리기판으로 이의 표면처리로는 다양한 방법이 알려져 있으나 여기서는 아미노기가 있는 아미노알킬옥시실란(aminoalkyloxysilane)으로 반응시켜 고정화하여 아미노기를 노출시키는 방법을 취하였다. 위와 같이 표면처리된 유리기판의 아미노기를 적당한 탄소수의 링커와 아미드 결합으로 연결시키는 데, 이때 링커물질은 아미노기가 산에 불안정한 작용기로 보호되어 있는 아미노알킬 칼복실산을 사용한다. 링커의 길이는 다양한 방법등이 알려져 있으나, 본 발명에 사용된 물질은 탄소수 6을 가진 오메가-아미노카프로익산이다.
이하, 본 발명의 고분자 PAG를 이용하여 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산의 제조방법을 공정별로 나누어 구체적으로 설명하고자 한다. 이때, 사용되는 고분자 PAG는 제조예 1에 의해 제조하였다.
제조예 1: 고분자 광산발생제(고분자 PAG)의 합성
1몰의 4,4'-티오디페놀을 상온에서 500ml의 아세톤에 용해시킨 후, 0.05몰의 초산을 가하고 온도를 0℃로 낮춘 다음, 과산화수소 1몰을 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 아세톤을 감압제거한 후, 석출된 고체를 에탄올과 물에서 재결정하여 4,4'-디페놀설폭시드를 수득하였다. 이어, 1몰의 오산화인(P2O5)을 50℃에서 1L의 메탄술포닉에시드에 용해시킨 후, 온도를 상온으로 낮추고, 2,6-디메틸아미졸 1몰을 첨가하여 온도를 0℃로 낮춘 후, 1몰의 전기에서 수득한 4,4'-디페놀설폭시드를 넣고 밤새 반응시켰다. 반응이 끝나면, 얼음에 2회 부어 윗물을 없애고, 과량의 소금(NaCl)과 물(H2O)을 가하여 교반시킨 다음, 에탄올을 가하고 재결정하여 아니솔디페놀설파이드염를 수득하였다. 그런 다음, 0.01몰의 아니솔다이페놀설파이드염을 40mL의 메틸피롤리디논에 용해시킨 후, 트리에틸아민을 0.025몰 및 테레프탈로일클로라이드를 0.01몰을 넣고 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 필터로 염을 제거하고 아세톤으로 침전시켜 진공 건조하여 고분자 PAG를 수득하였다.
제 1공정: 고체기질에 링커(linker)의 부착
고체기질을 표면처리한 후, 산에 불안정한 보호기로 보호된 링커(linker)를 부착한다: 먼저, 고체기질인 유기용매에 용해되지 않는 실리콘, 표면개질유리, 폴리프로필렌, 또는 활성화 아크릴아미드 성분의 기판, 바람직하게는 표면개질 유리, 가장 바람직하게는 현미경용 유리기판에 아민기를 고정시키는 표면처리를 하기 위하여, 0.05 내지 0.15%(v/v), 바람직하게는 0.1%(v/v) 아미노알킬옥시실란(바람직하게는, 아미노프로필트리에톡시실란)의 알콜(바람직하게는, 에탄올)용액에 담구어 상온에서 3 내지 7분간, 바람직하게는 5분간교반한 다음, 알콜(바람직하게는, 에탄올)에 수차례 담구어 세척한 다음, 진공 오븐에서 100 내지 140℃, 바람직하게는 110 내지 130℃, 가장 바람직하게는 120℃에서, 10 내지 30분간, 바람직하게는 15 내지 25분간, 가장 바람직하게는 20분간 처리하고, 아르곤 가스 환경에서 10 내지 14시간, 바람직하게는 12시간 동안 방치한 후, 디메틸포름알데히드(DMF)에 담구었다 꺼내어, 디클로로메탄으로 충분히 세척한다.
다음으로, 고체기질에 아민기가 산에 불안정한 보호기로 보호된 링커를 부착시키기 위하여, 전기 표면처리된 고체기질에 25 내지 35mM, 바람직하게는 30mM의 아미노알킬카르복실산(바람직하게는, 6-N-t-부톡시카보닐아미노카프로인산)이 용해된 DMF 용액, 및 전기 DMF 용액에 대해 4 내지 8g/ml, 바람직하게는 6g/ml 디시클로카보디이미드(dicyclocarbodiimide; DCC)를 첨가하여 70 내지 90℃, 바람직하게는 80℃에서 1 내지 5시간, 바람직하게는 2 내지 4시간, 가장 바람직하게는 3 시간 교반하여 반응시킨다.
이때, 미반응의 아민기는 1:2 내지 1:4(v/v), 바람직하게는 1:3(v/v)의 무수초산/피리딘 혼합용액에서 0.5 내지 2시간, 바람직하게는 1시간 동안 교반하여 아세틸기로 캡핑(capping)한다.
제 2공정: 고분자 광산발생제(고분자 PAG)로 코팅
전기 고체기질을 고분자 광산발생제(polymeric photoacid generator)로 코팅시킨다: 전기 공정에서 수득된 고체기질에 전기 제조예 1에서 수득한 고분자 PAG를 유기용매, 바람직하게는 N-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone; NMP)에 10 내지 50%(w/v)으로 용해시킨 후, 1,000 내지 5,000rpm, 바람직하게는 3,000rpm으로 스핀코팅한다.
제 3공정: 산에 불안정한 보호기의 제거
전기 코팅된 고체기질을 노광시켜 산을 발생시킴으로써 산에 불안정한 보호기를 제거한다: 전기 공정에서 고분자 PAG로 코팅된 고체기질을 50 내지 70℃, 바람직하게는 60℃ 에서 0.5 내지 2분간, 바람직하게는 1분간 소프트베이킹을 한 후, 다시 단파장 백색광에서 포토마스크를 이용하여 0.5 내지 2분간, 바람직하게는 1분간 노광시키고, 80 내지 100℃, 바람직하게는 90℃에서 0.5 내지 2분간, 바람직하게는 1분간 포스트베이킹을 한 후, 산을 발생시켜 노광된 위치의 보호기를 선택적으로 제거한다.
제 4공정: 펩티드핵산 단량체와 반응
전기 보호기를 제거한 고체기질을 산에 불안정한 보호기로 보호된 펩티드 핵산의 단량체와 결합시킨다: 전기 공정에 의해 보호기가 제거되어 선택적으로 노출된 아민기를 산에 불안정한 보호기로 보호된 펩티드 핵산의 단량체와 반응시키는데, 펩티드 핵산의 단량체를 10 내지 20μM, 바람직하게는 15μM로 용해시킨 디메틸포름알메히드(DMF) 용액 및 디시클로카보디이미드(DCC)를 단량체에 대해 1:2 내지 1:5(중량비)로 첨가하여 70 내지 90 ℃, 바람직하게는 80 ℃에서 1 내지 3 시간 바람직하게는 2 시간 동안 교반하여 결합시킨다. 이때, 각 단량체는 주쇄의 아민기가 알킬옥시카보닐기, 염기부분의 아민기가 벤질옥시카보닐기로 보호되어 있으며, 미반응의 아민기는 1:2 내지 1:4(v/v), 바람직하게는 1:3(v/v)의 무수초산/피리딘 혼합용액에서 0.5 내지 2시간, 바람직하게는 1시간 동안 교반하여 아세틸기로 캡핑한다.
제 5공정: 남아있는 고분자 광산발생제의 제거
전기 반응 후 남아 있는 고분자 광산발생제(고분자 PAG)를 제거한다: 전기 공정 후, 남아있는 고분자 PAG는 희박 트리알킬암모늄하이드록사이드, NaOH 또는 KOH 수용액, 또는 유기용제로 세척하여 제거한다.
이어, 전기 제 2공정 내지 제 5공정을 반복하여, 고체기질 위에 원하는 길이의 올리고펩티드 핵산 탐침을 제조한다.
고체기질 위의 자유(free) 반응기는, 펩티드 핵산의 아민기의 경우, 0.5 내지 2mM, 바람직하게는 1mM 플로레슨 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)와 DMF를 용매로 상온에서 0.5 내지 2시간, 바람직하게는 1시간 동안 반응시켜, 형광 표지하여 에탄올, 물 및 에탄올의 순서로 세척한 다음 건조시켜서 암실에 보관하고, 형광분석기(confocal fluorescent laser)로 형상을 촬영한다.
본 발명에서 고분자 PAG를 사용하여 다양한 염기서열을 가지는 올리고 펩티드 핵산을 합성하는 방법의 특징은 다음과 같다:
첫째, 고분자 PAG 공정은 PPA 공정에서 처럼 고분자 매트릭스에 단분자 PAG를 혼합하는 것이 아니라, PAG 자체가 고분자로 되어 있어 적당한 용제에 용해시켜 바로 스핀코팅을 할 수 있는 장점이 있다;
둘째, PPA 공정에서 발생된 산은 고분자 매트릭스와는 별도로 작용하여, 실제 계면에 닿아 탈보호(deprotecting) 반응에 참여하는 산은 적어지게 되는데, 고분자 PAG 공정에서는 PAG 자체가 탈보호 위치와 접촉을 하고 있어서 발생산의 반응 참여율이 높다;
셋째, PAG가 고분자 주쇄에 직접 연결되어 있어, PAG가 공정상에 발생하는 열이나 기타 화학물질에 안정하며, 코팅상에 도메인이 생길 염려가 없이 고르게 분포되어 양질의 패턴을 얻을 수 있으며, 최소한의 두께로 코팅이 되어 있어 노광된 빛이 바닥에 쉽게 도달해 발생산을 극대화시키고, 발생산의 확산도 도와줄 수 있다;
넷째, 패턴 공정이 끝난 후 고분자 PAG를 세척할 때에도 알칼리 희박 수용액을 사용할 수 있으므로 경제적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게서 자명할 것이다.
실시예 1: 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조
실시예 1-1: 유리기판에 링커(linker)의 부착
현미경용 유리기판을 클린싱 용액(95% 에탄올 수용액 1L, 물 12 mL, 수산화나트륨 120g)에 12 시간 담근 후, 물로 수차례에 걸쳐 세척하여, 공기 중에 말린 후에 95% 에탄올 수용액으로 씻은 다음, 아민기를 고정시키는 표면처리를 하기 위하여, 0.1%(v/v) 아미노프로필트리에톡시실란의 에탄올 용액에 담구어, 상온에서 5분간 교반한 다음, 에탄올에 3차례 담구어 세척하고, 진공오븐에서 120℃로 20분간 처리하고, 아르곤 가스 환경에서 12시간 동안 방치하고, 디메틸포름알데히드(DMF)에 담구었다 꺼낸 후, 디클로로메탄으로 충분히 세척하였다.
다음으로, 전기 표면처리된 유리기판에 아민기가 산에 불안정한 보호기로 보호된 링커를 부착시키기 위하여, 0.5ml의 30mM 6-N-t-부톡시카보닐아미노카프로익산의 DMF 용액 및 3g의 디시클로카보디이미드(DCC)를 첨가하여 80℃에서 1 시간 동안 교반하여 반응시키고, 미반응의 아민기는 1:3(v/v)의 무수초산/피리딘 혼합용액에서 1시간 동안 교반하여 아세틸기로 캡핑(capping)하였다.
실시예 1-2: 펩티드 핵산 단량체와의 결합
제조예 1에서 수득한 고분자 PAG를 N-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone; NMP)에 30%(w/v)으로 용해시킨 후, 전기 실시예 1-1의 산에 불안정한 보호기로 보호된 링커가 부착된 유리기판에 3,000rpm으로 스핀코팅하였다. 코팅된 유리기판을 60℃에서 1분간 소프트베이킹을 한 다음, 다시 단파장 백색광에서 포토마스크를 이용하여 1분 동안 노광시키고, 90℃에서 1분간 포스트베이킹을 하고, 산을 발생시켜 노광된 위치의 보호기를 선택적으로 제거한 후, N-(2-t-부틸옥시카보닐-아미노에틸)-N-티민-1-일아세틸)글리신, N-(N4-(벤질옥시카보닐)시토신-1-일)아세틸-N-(2-t-부틸옥시카보닐-아미노에틸)글리 신, N-(N6-(벤질옥시카보닐)아데닌-9-일)아세틸-N-(2-t-부틸옥시카보닐-아미노에틸)글리신, 및 N-(N4-(벤질옥시카보닐)구아닌-1-일)아세틸-N-(2-t-부틸옥시카보닐-아미노에틸)글리신 등의 상업적으로 시판(Perseptive Biosystems, U.S.A.)되는 펩티드 핵산 단량체 3g를 용해시킨 디메틸포름알메히드(DMF) 0.5ml 및 디시클로카보디이미드(DCC) 10mg을 첨가하여 80 ℃에서 2 시간 동안 교반하여 결합시켰다. 그런 다음, 미반응의 아민기는 1:3(v/v)의 무수초산/피리딘 혼합용액에서 1시간 동안 교반하여 아세틸기로 캡핑하였다. 전기 반응 후 남아 있는 고분자PAG는 1% 트리알킬암모늄하이드록사이드로 세척하여 제거하였다.
다음으로, 전기와 같이 고분자 PAG의 코팅, 포토마스크를 이용하여 노광하고, 보호기를 제거한 후 아민기가 보호된 펩티이드 핵산 단량체와 반응시키고 캡핑하는 공정을 반복하여 펩티드 핵산의 길이를 원하는 수 만큼 증가시켰다.
유리기판의 프리 아민기는 1 mM 플로레슨 이소티오시아네이트(Aldrich, U.S.A.)와 DMF를 용매로 상온에서 1시간 동안 반응시켜 형광 표지한 후, 에탄올, 물 및 에탄올의 순서로 세척한 후 건조시켜서 암실에 보관하였다. 위의 기판을 형광분석기로 형상을 촬영하여, 10 미크론의 미세 형상을 얻을 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 바이오 칩의 제작을 목표로 하여 고체기질 위에서 다양한 염기서열을 가지는 올리고펩티드 핵산 탐침을 합성하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 종래의 DNA 칩의 제작에 사용된 포토레지스트(PR) 방식과 광산패턴배열(PPA) 방식의 문제점을 보완하여, 그 자체가 고분자로 구성된 고분자 광산발생제(polymeric photoacid generator)를 이용함으로써, 공정을 단순화하고 효율을 높일 수 있었으며, 본 발명에 의해 올리고 핵산 탐침을 대체할 수 있는 중이온성의 올리고펩티드 핵산 탐침을 제조할 수 있다.

Claims (12)

  1. (ⅰ) 고체기질을 표면처리한 후, 산에 불안정한 보호기로 보호된 링커(linker)를 부착하는 공정;
    (ⅱ) 전기 고체기질을 고분자 광산발생제(polymeric photoacid generator)로 코팅시키는 공정;
    (ⅲ) 전기 코팅된 고체기질을 노광시켜 산을 발생시킴으로써 산에 불안정한 보호기를 제거하는 공정;
    (ⅳ) 전기 보호기를 제거한 고체기질을 산에 불안정한 보호기로 보호된 펩티드 핵산의 각 단량체와 결합시키는 공정; 및,
    (ⅴ) 전기 반응 후 남아 있는 고분자 광산발생제를 제거하는 공정을 포함하고, 전기 (ⅱ) 내지 (ⅴ) 공정을 반복함으로써 원하는 탐침의 길이로 합성시키는 것을 특징으로 하는 고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    고체기질은 유기용매에 용해되지 않는 실리콘, 표면개질유리, 폴리프로필렌, 또는 활성화 아크릴아미드 성분의 기판인 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    고체기질의 표면처리는 고체기질을 0.05 내지 0.15%(v/v)의 아미노알킬옥시실란의 알콜용액에 담구어 상온에서 3 내지 7분간 교반시킨 다음, 알콜로 세척하여 100 내지 140℃에서 10 내지 30분간 건조시키고, 아르곤 가스 환경에 10 내지 14시간 동안 방치한 다음, 디메틸포름알데히드 및 디클로로메탄으로 세척하여 고체기질에 아민기를 고정시키는 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    산에 불안정한 보호기로 보호된 링커는 아미노알킬카르복실산인 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    링커의 부착은 표면처리된 고체기질을 4 내지 8g/ml의 디시클로카보디이미드가 첨가된 25 내지 35mM 아미노알킬카르복실산의 디메틸포름알데히드 용액과 70 내지 90℃에서 1 내지 5시간 교반반응시킴으로써, 고체기질상의 아민기에 부착시키며, 링커가 부착되지 않은 미반응의 아민기는 1:2 내지 1:4(v/v)의 무수초산/피리딘 혼합용액에서 0.5 내지 2시간 동안 교반하여 아세틸기로 캡핑(capping)하는 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    고분자 광산발생제는 분자량이 500 내지 1,000,000인 고분자로서, 주쇄 또는 측쇄에 술포늄염 또는 요오도늄염을 갖거나, 측쇄에 유기 광산발생기를 가짐으로써, 빛에 의해 산을 발생시키는 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    고분자 광산발생제의 코팅은 링커가 부착된 고체기질 또는 단량체가 결합된 고체기질을 고분자 광산발생제가 유기용매에 10 내지 50%(w/v)으로 용해된 용액으로 1,000 내지 5,000rpm에서 스핀코팅하는 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    산에 불안정한 보호기의 제거는 고분자 광산발생제로 코팅된 고체기질을 50 내지 70℃ 에서 0.5 내지 2분간 소프트베이킹을 한 다음, 단파장 백색광에서 포토마스크를 이용하여 0.5 내지 2분간 노광시키고, 80 내지 100℃에서 0.5 내지 2분간 포스트베이킹하여 제거하는 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    단량체는 주쇄의 아민기가 알킬옥시카보닐기, 염기부분의 아민기가 벤질옥시카보닐기로 보호되어 되어 있는 화합물인 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    단량체와의 결합은 산에 불안정한 보호기가 제거된 고체기질을 펩티드 핵산의 각 단량체 10 내지 20μM 및 디시클로카보디이미드가 단량체에 대해 1:2 내지 1:5(중량비)로 첨가된 디메틸포름알메히드 용액과 70 내지 90 ℃에서 1 내지 3 시간 동안 교반반응시켜 산에 불안정한 보호기가 제거된 아민기에 결합시키고, 단량체가 결합되지 않은 미반응의 아민기는 1:2 내지 1:4(v/v)무수초산/피리딘 혼합용액에서 0.5 내지 2시간 동안 교반하여 아세틸기로 캡핑하는 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    남아있는 고분자 광산발생제의 제거는 단량체가 결합된 고체기질을 희박 트리알킬암모늄하이드록사이드, NaOH 또는 KOH 수용액, 또는 유기용제로 세척하여 수행하는 것을 특징으로 하는
    고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법.
  12. 제 1항의 방법에 의해 제조된 고체기질 위의 올리고펩티드 핵산 탐침.
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