JP4054499B2 - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はまた、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進んでおり、その解析手段として、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定し、検出する方法に利用される。形成されたハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する方法などが知られている。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００４】
ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化には至らなかった。
【０００５】
その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発され、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ ７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９５））。
【０００６】
しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作製技術が必要とされる。
【０００７】
ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チップ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マスキング技術」という。）が代表的である。
【０００８】
予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に応じて下記の方法がある。
（１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合には、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッタ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着して、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体表面に存在する。
【０００９】
ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しかし、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上に大きく寄与する。
【００１０】
（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌクレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られている。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在させる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡとの相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着しやすいため、検出を妨害するという問題がある。このため、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブロッキングという工程が必要であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によって結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の検出方法を提供することを、その課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は下記の本発明によって解決された。
【００１３】
（１）表面に反応性基を有する固相担体と、一方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、液相にて、双方の反応性基間で反応させることにより結合を形成させることからなるＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法であって、固相担体の反応性基を下記の反応性基のうちの一方とし、そしてＤＮＡ断片の反応性基を下記の反応性基の他方とすることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法：
下記一般式（Ｉ）：
【００１４】
【化２】
（Ｉ）
Ｚ＝Ｎ−Ｒ 3
【００１５】
［式中、Ｚは、Ｒ4ＮまたはＲ4Ｒ5Ｎ+Ａを表し；Ｒ4およびＲ5は、互いに独立に、水素原子、アルキル基またはアリール基を表し；Ａは、無機のアニオンまたは有機のアニオンを表し；Ｒ3は、水素原子、ＮＲ6Ｒ7、ＳＲ6、ＳＯ 2 Ｒ6またはＣＯＲ6を表し；Ｒ6およびＲ7は、互いに独立に、水素原子または置換基を表し；Ｚは、固相担体表面またはＤＮＡ断片と共有結合を形成する。］
で表される部分構造を有する反応性基、および
上記部分構造の窒素原子とカップリング反応しうる反応性基。
【００１６】
本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法なお、固相担体の反応性基が一般式（Ｉ）を有する反応性基であることが好ましい。
（２）上記の方法によって得られたＤＮＡチップ。
【００１７】
（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
（４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダーゼイションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
【００１８】
本発明は、被検体核酸断片試料との相互作用の小さい固相担体を用い、予め調整したＤＮＡ断片を固相担体上に点着した箇所でのみ、該ＤＮＡ断片と固相担体との間に迅速かつ効率よく共有結合が形成され、固定化が起こり、さらに、被検体核酸断片試料との相互作用の小さい固相担体を用いている結果として、特別なブロッキング工程が不要となることに基づいている。
【００１９】
本発明は、より具体的にはハロゲン化銀写真感光材料の分野で知られている一般式（Ｉ）で表されるいわゆる発色現像主薬酸化体とカプラーと称される化合物間のカップリング反応を用いることにより、ＤＮＡ断片を固相担体上に点着した箇所でのみ極めて効率よく共有結合が形成され、固定化される発見に基づいている。（以下、一般式（Ｉ）で表される化合物およびカプラーと称される化合物を総称してカップリング成分と呼ぶ。）上記カップリング反応が極めて効率よく強固な共有結合が形成可能となり、核酸断片の検出の感度が向上することはこれまで知られていなかった。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は以下のようにして具体化できる。
固相担体表面へのＤＮＡ断片固定は共有結合の形成をもって行われる。該共有結合の形成は固相担体表面とＤＮＡ断片の一方にカップリング成分である一般式（Ｉ）で表される部分構造を、他方にカプラーと称される部分構造をそれぞれ持たせることによって、ＤＮＡ断片を点着した部分でのみ共有結合を形成するような官能基を連結して達成される。従って、本発明においては一般式（Ｉ）で表される部分構造を固相担体表面に均一に存在させてカプラー部分構造を有するＤＮＡ断片を含む水性液体を点着する方法、あるいはを一般式（Ｉ）で表される部分構造をＤＮＡ断片を含む水性液体に存在させ、これをカプラー部分構造を均一に有する固相担体表面に点着する方法の２つの方法が採用される。このような方法を採用することによって、特別な処理を施すことなく点着部分のみが共有結合性を発現し、共有結合を形成することができ、非点着部分を被検体核酸断片との相互作用を小さくすることによって、検出のバックグラウンドを低下させることができ、結果として、煩雑なブロッキング工程を不要化することも可能となる。
【００２１】
本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法の好ましい態様は、以下の通りである。
（１）カップリング反応を用いて共有結合を形成するための官能基（カップリング成分のいずれか一方）を有する化合物を、固相担体表面に固定する。
（２）ＤＮＡ断片として、（１）で使用したカップリング成分のもう一方を末端に有し、その塩基配列が既知であるものを用いる。
（３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着する。
【００２２】
本発明のＤＮＡ断片固定固相担体（以下「ＤＮＡチップ」という。）では、固相担体表面に固定された成分に、共有結合を介してＤＮＡ断片が固定されている。ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定は、固相担体表面に、カップリング成分の一方を有する化合物を固相担体表面に固定する工程、そしてカップリング成分のもう一方を有するＤＮＡ断片を含む液体を点着し、点着部分においてはカップリング成分の一方を有する固相担体表面とカップリング成分のもう一方を有するＤＮＡ断片が接触するようにして、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行うことによってなされる。
【００２３】
本発明の代表的な固定方法を以下に説明する。代表的な固定方法としては前記の一般式（Ｉ）で表される部分構造を固相担体表面に導入し、ここに、カプラー部分構造を結合したＤＮＡ断片を含む液体を点着する。
【００２４】
点着部分においてはカップリング成分が接触することによって、カップリング反応が起こり、固相担体表面とＤＮＡ断片間に共有結合を形成される。このように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行うことによってＤＮＡチップを得ることができる。ここで、ＤＮＡ断片が有するカプラー部分構造と、ＤＮＡ断片のリン酸エステル基との間には、合成の都合上、クロスリンカーを存在させてもよい。
【００２５】
次に、本発明のＤＮＡ断片の固定方法の各工程について説明する。
本発明で用いる固相担体は、疎水性、あるいは親水性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金などの導電性材料などを挙げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００２６】
カップリング成分のカプラーに関しては、特開平１０−２０７０２８に記載のものを用いることができるほか、アニリンなどの電子供与性基を有する芳香族、アルキルおよびアリールスルフィン酸類も好ましく使用することができる。
【００２７】
また、一般式（Ｉ）で表される部分構造は、以下の一般式（ＩＩ）で表される水素分子が付加した還元体として、固相担体表面またはＤＮＡ断片に結合させることもできる。
【００２８】
【化３】
（ＩＩ）
ＨＺ−ＮＨ−Ｒ 3
【００２９】
この場合、カップリング反応させるためには、酸化剤を必要とするが、酸化剤としては無機あるいは有機の酸化剤を使用することができ、この例としては、二酸化マンガン、酢酸銀、酸化銀、次亜塩素酸ナトリウム、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、過酸化水素、赤血塩、キノン類などを好ましく用いることができる。
【００３０】
酸化剤は固相担体表面に一様に存在させてもよく、また、ＤＮＡ断片を含む水性液体中に添加してもよい。
【００３１】
カップリング成分の一方が固定された固相担体は、次のようにして作成することができる。
表面にアミノ基を有する固相担体（例えば、ガラス製担体表面を３−アミノプロピルトリメトシキシランを作用させて作製する）を用いる場合には、一方のカップリング成分にアミノ基との反応が可能な基を結合して、該アミノ基に反応させることによって得ることができる。このような連結基の例としては、カルボキシル基、ホルミル基、ハロスルホニル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基、酸無水物、ケテンなどが挙げられ、結合の際には、加熱や適当な塩基、縮合剤を用いて固定する方法を用いることができる。この中ではカルボキシル基を有するものが好ましく、適当な縮合剤（カルボジイミド化合物など）を用いてアミド結合を形成する方法が好ましい。
【００３２】
カップリング成分の一方が結合したＤＮＡ断片は、次のようにして作成することができる。
末端にアミノ基が導入されたＤＮＡ断片の作成法については、公知であり、商業的に容易に入手可能である。従って、カップリング成分を固相担体に固定する方法と同様の方法が採用できる。すなわち、カルボキシル基、ホルミル基、ハロスルホニル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基を有するカップリング成分や酸無水物、ケテンを部分構造として有するカップリング成分を、加熱や適当な塩基、縮合剤を用いてＤＮＡ断片のアミノ基と結合させることができる。この中ではカルボキシル基、ハロスルホニル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基を有するものが好ましく、カルボキシル基を有するものは適当な縮合剤（カルボジイミド化合物など）を用いてアミド結合を形成する方法が好ましい。
【００３３】
上記のカップリング成分を固相担体に固定する工程中では、酸、塩基や触媒の使用、水および有機溶媒の使用、加熱なども適宜行うことができる。
酸としては、無機酸および有機酸のいずれでも用いることができるが、塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが好ましく、トリフルオロ酢酸、酢酸が好ましい。
【００３４】
塩基としては、無機塩基および有機塩基の何れも用いることができるが、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムあるいは炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピリジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２−ピロリドンを用いることが特に好ましい。
加熱する場合には、その温度は４０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００３５】
表面処理された固相担体表面上には、さらに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させることも可能であり、このような処理を施した固相担体も好ましく用いることができる。
【００３６】
クロスリンカーは、単結合、アルキレン基あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であることが好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルアミノへキシレン基であることが特に好ましい。
【００３７】
ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。
【００３８】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好ましい。
【００３９】
点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００４０】
ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００４１】
ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００４２】
上記の工程によって作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションである。
【００４３】
標織方法としては、大別してＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、たとえば、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【００４４】
なお、上記の標識を利用する以外にも、導電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもできる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレータを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチップはこの検出方法に利用することもできる。
【００４５】
試料として用いる核酸断片としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００４６】
試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行なって調製することが好ましい。
【００４７】
ハイブリダイゼーション操作は、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００４８】
ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００４９】
【実施例】
［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成及びＤＮＡ断片の固定量の測定
（１）カップリング成分が導入されたスライド（Ｃ）の作成
２質量％の１，２−ビス（トリエトキシシリル）エタン（アルドリッチ社製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラン化合物被覆スライド（Ａ）を、ジケテンの４質量％アセトニトリル（５０ｍＬ）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下乾燥し、スライド（Ｃ）を作成した。
【００５０】
（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定
３'末端および５'未端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（３×１０-6Ｍ、１μＬ）に、下記式で表される化合物（Ａ）の６×１０-6Ｍ水溶液を１μＬ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の９×１０-6Ｍ水溶液を１μＬ加え、室温で３時間放置した。
【００５１】
【化４】
化合物（Ａ）
【００５２】
上記（１）で得たスライド（Ｃ）にこの水性液を点着した。直ちに、点着後のスライドを２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このスライドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ１）を得た。このスライド（Ｄ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、１５５５であった。
従って、本発明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラスに固定されたことが分かる。
【００５３】
［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出
（１）ＤＮＡチップの作成
５'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ２）を得た。
（２）試料ＤＮＡ断片の検出
５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌクレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、このものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、５８０であった。本発明の固定化方法によって作成されたＤＮＡチップを用いることによって、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固相担体表面にアミノ酸をシランカップリング剤を用いて導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができる高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製を可能にする。その一つの例として、本発明によって作製されたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を感度よく検出することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はまた、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進んでおり、その解析手段として、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定し、検出する方法に利用される。形成されたハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もしくは導電性基を持つインターカレータを利用する方法などが知られている。
【０００３】
ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００４】
ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化には至らなかった。
【０００５】
その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発され、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ ７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９５））。
【０００６】
しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作製技術が必要とされる。
【０００７】
ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チップ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マスキング技術」という。）が代表的である。
【０００８】
予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に応じて下記の方法がある。
（１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合には、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッタ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着して、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体表面に存在する。
【０００９】
ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しかし、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上に大きく寄与する。
【００１０】
（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌクレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られている。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在させる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡとの相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着しやすいため、検出を妨害するという問題がある。このため、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブロッキングという工程が必要であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によって結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の検出方法を提供することを、その課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は下記の本発明によって解決された。
【００１３】
（１）表面に反応性基を有する固相担体と、一方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、液相にて、双方の反応性基間で反応させることにより結合を形成させることからなるＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法であって、固相担体の反応性基を下記の反応性基のうちの一方とし、そしてＤＮＡ断片の反応性基を下記の反応性基の他方とすることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法：
下記一般式（Ｉ）：
【００１４】
【化２】
（Ｉ）
Ｚ＝Ｎ−Ｒ 3
【００１５】
［式中、Ｚは、Ｒ4ＮまたはＲ4Ｒ5Ｎ+Ａを表し；Ｒ4およびＲ5は、互いに独立に、水素原子、アルキル基またはアリール基を表し；Ａは、無機のアニオンまたは有機のアニオンを表し；Ｒ3は、水素原子、ＮＲ6Ｒ7、ＳＲ6、ＳＯ 2 Ｒ6またはＣＯＲ6を表し；Ｒ6およびＲ7は、互いに独立に、水素原子または置換基を表し；Ｚは、固相担体表面またはＤＮＡ断片と共有結合を形成する。］
で表される部分構造を有する反応性基、および
上記部分構造の窒素原子とカップリング反応しうる反応性基。
【００１６】
本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法なお、固相担体の反応性基が一般式（Ｉ）を有する反応性基であることが好ましい。
（２）上記の方法によって得られたＤＮＡチップ。
【００１７】
（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
（４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダーゼイションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
【００１８】
本発明は、被検体核酸断片試料との相互作用の小さい固相担体を用い、予め調整したＤＮＡ断片を固相担体上に点着した箇所でのみ、該ＤＮＡ断片と固相担体との間に迅速かつ効率よく共有結合が形成され、固定化が起こり、さらに、被検体核酸断片試料との相互作用の小さい固相担体を用いている結果として、特別なブロッキング工程が不要となることに基づいている。
【００１９】
本発明は、より具体的にはハロゲン化銀写真感光材料の分野で知られている一般式（Ｉ）で表されるいわゆる発色現像主薬酸化体とカプラーと称される化合物間のカップリング反応を用いることにより、ＤＮＡ断片を固相担体上に点着した箇所でのみ極めて効率よく共有結合が形成され、固定化される発見に基づいている。（以下、一般式（Ｉ）で表される化合物およびカプラーと称される化合物を総称してカップリング成分と呼ぶ。）上記カップリング反応が極めて効率よく強固な共有結合が形成可能となり、核酸断片の検出の感度が向上することはこれまで知られていなかった。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は以下のようにして具体化できる。
固相担体表面へのＤＮＡ断片固定は共有結合の形成をもって行われる。該共有結合の形成は固相担体表面とＤＮＡ断片の一方にカップリング成分である一般式（Ｉ）で表される部分構造を、他方にカプラーと称される部分構造をそれぞれ持たせることによって、ＤＮＡ断片を点着した部分でのみ共有結合を形成するような官能基を連結して達成される。従って、本発明においては一般式（Ｉ）で表される部分構造を固相担体表面に均一に存在させてカプラー部分構造を有するＤＮＡ断片を含む水性液体を点着する方法、あるいはを一般式（Ｉ）で表される部分構造をＤＮＡ断片を含む水性液体に存在させ、これをカプラー部分構造を均一に有する固相担体表面に点着する方法の２つの方法が採用される。このような方法を採用することによって、特別な処理を施すことなく点着部分のみが共有結合性を発現し、共有結合を形成することができ、非点着部分を被検体核酸断片との相互作用を小さくすることによって、検出のバックグラウンドを低下させることができ、結果として、煩雑なブロッキング工程を不要化することも可能となる。
【００２１】
本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法の好ましい態様は、以下の通りである。
（１）カップリング反応を用いて共有結合を形成するための官能基（カップリング成分のいずれか一方）を有する化合物を、固相担体表面に固定する。
（２）ＤＮＡ断片として、（１）で使用したカップリング成分のもう一方を末端に有し、その塩基配列が既知であるものを用いる。
（３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着する。
【００２２】
本発明のＤＮＡ断片固定固相担体（以下「ＤＮＡチップ」という。）では、固相担体表面に固定された成分に、共有結合を介してＤＮＡ断片が固定されている。ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定は、固相担体表面に、カップリング成分の一方を有する化合物を固相担体表面に固定する工程、そしてカップリング成分のもう一方を有するＤＮＡ断片を含む液体を点着し、点着部分においてはカップリング成分の一方を有する固相担体表面とカップリング成分のもう一方を有するＤＮＡ断片が接触するようにして、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行うことによってなされる。
【００２３】
本発明の代表的な固定方法を以下に説明する。代表的な固定方法としては前記の一般式（Ｉ）で表される部分構造を固相担体表面に導入し、ここに、カプラー部分構造を結合したＤＮＡ断片を含む液体を点着する。
【００２４】
点着部分においてはカップリング成分が接触することによって、カップリング反応が起こり、固相担体表面とＤＮＡ断片間に共有結合を形成される。このように、ＤＮＡ断片を固定する工程を順次行うことによってＤＮＡチップを得ることができる。ここで、ＤＮＡ断片が有するカプラー部分構造と、ＤＮＡ断片のリン酸エステル基との間には、合成の都合上、クロスリンカーを存在させてもよい。
【００２５】
次に、本発明のＤＮＡ断片の固定方法の各工程について説明する。
本発明で用いる固相担体は、疎水性、あるいは親水性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金などの導電性材料などを挙げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００２６】
カップリング成分のカプラーに関しては、特開平１０−２０７０２８に記載のものを用いることができるほか、アニリンなどの電子供与性基を有する芳香族、アルキルおよびアリールスルフィン酸類も好ましく使用することができる。
【００２７】
また、一般式（Ｉ）で表される部分構造は、以下の一般式（ＩＩ）で表される水素分子が付加した還元体として、固相担体表面またはＤＮＡ断片に結合させることもできる。
【００２８】
【化３】
（ＩＩ）
ＨＺ−ＮＨ−Ｒ 3
【００２９】
この場合、カップリング反応させるためには、酸化剤を必要とするが、酸化剤としては無機あるいは有機の酸化剤を使用することができ、この例としては、二酸化マンガン、酢酸銀、酸化銀、次亜塩素酸ナトリウム、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、過酸化水素、赤血塩、キノン類などを好ましく用いることができる。
【００３０】
酸化剤は固相担体表面に一様に存在させてもよく、また、ＤＮＡ断片を含む水性液体中に添加してもよい。
【００３１】
カップリング成分の一方が固定された固相担体は、次のようにして作成することができる。
表面にアミノ基を有する固相担体（例えば、ガラス製担体表面を３−アミノプロピルトリメトシキシランを作用させて作製する）を用いる場合には、一方のカップリング成分にアミノ基との反応が可能な基を結合して、該アミノ基に反応させることによって得ることができる。このような連結基の例としては、カルボキシル基、ホルミル基、ハロスルホニル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基、酸無水物、ケテンなどが挙げられ、結合の際には、加熱や適当な塩基、縮合剤を用いて固定する方法を用いることができる。この中ではカルボキシル基を有するものが好ましく、適当な縮合剤（カルボジイミド化合物など）を用いてアミド結合を形成する方法が好ましい。
【００３２】
カップリング成分の一方が結合したＤＮＡ断片は、次のようにして作成することができる。
末端にアミノ基が導入されたＤＮＡ断片の作成法については、公知であり、商業的に容易に入手可能である。従って、カップリング成分を固相担体に固定する方法と同様の方法が採用できる。すなわち、カルボキシル基、ホルミル基、ハロスルホニル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基を有するカップリング成分や酸無水物、ケテンを部分構造として有するカップリング成分を、加熱や適当な塩基、縮合剤を用いてＤＮＡ断片のアミノ基と結合させることができる。この中ではカルボキシル基、ハロスルホニル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基を有するものが好ましく、カルボキシル基を有するものは適当な縮合剤（カルボジイミド化合物など）を用いてアミド結合を形成する方法が好ましい。
【００３３】
上記のカップリング成分を固相担体に固定する工程中では、酸、塩基や触媒の使用、水および有機溶媒の使用、加熱なども適宜行うことができる。
酸としては、無機酸および有機酸のいずれでも用いることができるが、塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが好ましく、トリフルオロ酢酸、酢酸が好ましい。
【００３４】
塩基としては、無機塩基および有機塩基の何れも用いることができるが、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリウムあるいは炭酸ナトリウムを用いることがより好ましく、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあるいはピリジンを用いることがさらに好ましく、１−メチル−２−ピロリドンを用いることが特に好ましい。
加熱する場合には、その温度は４０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、５０乃至１２０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００３５】
表面処理された固相担体表面上には、さらに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させることも可能であり、このような処理を施した固相担体も好ましく用いることができる。
【００３６】
クロスリンカーは、単結合、アルキレン基あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であることが好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルアミノへキシレン基であることが特に好ましい。
【００３７】
ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。
【００３８】
ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好ましい。
【００３９】
点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００４０】
ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００４１】
ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００４２】
上記の工程によって作製されたＤＮＡチップの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡチップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションである。
【００４３】
標織方法としては、大別してＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、たとえば、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【００４４】
なお、上記の標識を利用する以外にも、導電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもできる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレータを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチップはこの検出方法に利用することもできる。
【００４５】
試料として用いる核酸断片としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００４６】
試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行なって調製することが好ましい。
【００４７】
ハイブリダイゼーション操作は、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００４８】
ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００４９】
【実施例】
［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成及びＤＮＡ断片の固定量の測定
（１）カップリング成分が導入されたスライド（Ｃ）の作成
２質量％の１，２−ビス（トリエトキシシリル）エタン（アルドリッチ社製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラン化合物被覆スライド（Ａ）を、ジケテンの４質量％アセトニトリル（５０ｍＬ）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下乾燥し、スライド（Ｃ）を作成した。
【００５０】
（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定
３'末端および５'未端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（３×１０-6Ｍ、１μＬ）に、下記式で表される化合物（Ａ）の６×１０-6Ｍ水溶液を１μＬ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の９×１０-6Ｍ水溶液を１μＬ加え、室温で３時間放置した。
【００５１】
【化４】
化合物（Ａ）
上記（１）で得たスライド（Ｃ）にこの水性液を点着した。直ちに、点着後のスライドを２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このスライドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ１）を得た。このスライド（Ｄ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、１５５５であった。
従って、本発明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラスに固定されたことが分かる。
【００５３】
［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出
（１）ＤＮＡチップの作成
５'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ２）を得た。
（２）試料ＤＮＡ断片の検出
５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌクレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、このものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、５８０であった。本発明の固定化方法によって作成されたＤＮＡチップを用いることによって、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固相担体表面にアミノ酸をシランカップリング剤を用いて導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができる高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製を可能にする。その一つの例として、本発明によって作製されたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を感度よく検出することができる。
Claims (5)
- 表面に反応性基を有する固相担体と、一方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、液相にて、双方の反応性基間で反応させることにより結合を形成させることからなるＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法であって、固相担体の反応性基を下記の反応性基のうちの一方とし、そしてＤＮＡ断片の反応性基を下記の反応性基の他方とすることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法：
下記一般式（Ｉ）：
で表される部分構造を有する反応性基、および
上記部分構造の窒素原子とカップリング反応しうる反応性基。 - 固相担体の反応性基が一般式（Ｉ）を有する反応性基であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。
- 請求項１もしくは２に記載の方法によって得られたＤＮＡチップ。
- 請求項３に記載のＤＮＡチップの表面に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
- 請求項３に記載のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法。
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