JP2001178474A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents
固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップInfo
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- JP2001178474A JP2001178474A JP37133199A JP37133199A JP2001178474A JP 2001178474 A JP2001178474 A JP 2001178474A JP 37133199 A JP37133199 A JP 37133199A JP 37133199 A JP37133199 A JP 37133199A JP 2001178474 A JP2001178474 A JP 2001178474A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程を特に要しないＤＮ
Ａチップを得ること。 【解決手段】 表面に反応性基を有する固相担体と、一
方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、液相に
て接触させることにより、双方の反応性基の間で不可逆
的な付加反応を起こさせて共有結合を形成させることを
特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法、こ
の方法により得られたＤＮＡチップ、そしてそのＤＮＡ
チップを用いるＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相
補性を有する核酸断片を検出する方法。
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程を特に要しないＤＮ
Ａチップを得ること。 【解決手段】 表面に反応性基を有する固相担体と、一
方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、液相に
て接触させることにより、双方の反応性基の間で不可逆
的な付加反応を起こさせて共有結合を形成させることを
特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法、こ
の方法により得られたＤＮＡチップ、そしてそのＤＮＡ
チップを用いるＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相
補性を有する核酸断片を検出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。
【０００２】
【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もし
くは導電性基を持つインターカレータを利用する方法な
どが知られている。
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もし
くは導電性基を持つインターカレータを利用する方法な
どが知られている。
【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。
【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。
【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。
【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。
【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。
【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。
【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。
【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。
明によって解決された。
【００１３】（１）表面に反応性基を有する固相担体
と、一方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、
液相にて接触させることにより、双方の反応性基の間で
不可逆的な付加反応を起こさせて共有結合を形成させる
ことを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方
法。この固定方法で、固相担体表面の反応性基がキノン
骨格を有する基であり、ＤＮＡ断片の反応性基がアミノ
基もしくはチオール基であることが望ましい。また、固
相担体表面の反応性基のキノン骨格が１，４−ベンゾフ
ェノン骨格もしくは１，４−ナフトキノン骨格であるこ
とを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ断片の固相担体
表面への固定方法。 （２）上記の方法によって得られたＤＮＡチップ。
と、一方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、
液相にて接触させることにより、双方の反応性基の間で
不可逆的な付加反応を起こさせて共有結合を形成させる
ことを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方
法。この固定方法で、固相担体表面の反応性基がキノン
骨格を有する基であり、ＤＮＡ断片の反応性基がアミノ
基もしくはチオール基であることが望ましい。また、固
相担体表面の反応性基のキノン骨格が１，４−ベンゾフ
ェノン骨格もしくは１，４−ナフトキノン骨格であるこ
とを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ断片の固相担体
表面への固定方法。 （２）上記の方法によって得られたＤＮＡチップ。
【００１４】（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしく
は導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料と
を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定され
ているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイ
ブリダーゼイションによってＤＮＡチップ上に固定する
工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料
とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたイ
ンターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは
導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしく
は導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料と
を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定され
ているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイ
ブリダーゼイションによってＤＮＡチップ上に固定する
工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料
とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたイ
ンターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは
導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。
【００１５】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）ＤＮＡ断片として、その塩基配列が既知であるも
のを用いる。
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）ＤＮＡ断片として、その塩基配列が既知であるも
のを用いる。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ断片固定固相担体
（以下「ＤＮＡチップ」という。）では、固相担体表面
に一方の末端で固定された鎖状分子に、不可逆的付加反
応により生成した共有結合を介してＤＮＡ断片が固定さ
れている。ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定は、例え
ば、固相担体表面に、自由末端にキノン骨格を有する鎖
状分子を他方の側の末端にて結合された連結基を形成す
る工程、そして、該連結基のキノン骨格と、一方の末端
にアミノ基またはチオール基を有するＤＮＡ断片とを反
応させることにより、不可逆的共有結合を形成させる工
程を順次行うことによって行う。
（以下「ＤＮＡチップ」という。）では、固相担体表面
に一方の末端で固定された鎖状分子に、不可逆的付加反
応により生成した共有結合を介してＤＮＡ断片が固定さ
れている。ＤＮＡ断片の固相担体表面への固定は、例え
ば、固相担体表面に、自由末端にキノン骨格を有する鎖
状分子を他方の側の末端にて結合された連結基を形成す
る工程、そして、該連結基のキノン骨格と、一方の末端
にアミノ基またはチオール基を有するＤＮＡ断片とを反
応させることにより、不可逆的共有結合を形成させる工
程を順次行うことによって行う。
【００１７】本発明で利用する不可逆的付加反応とは付
加反応の熱力学的平衡が生成系に著しく片寄っている反
応であり、原系（反応前の状態）から生成系へ進む正反
応の速度に比べて生成系から原系に戻る逆反応の速度が
著しく遅く、事実上逆反応が無視できる反応である。あ
るいは付加生成物が不可逆的な後続反応を引き起こす多
段階反応であってもよい。不可逆的共有結合とは前述の
反応により生成する安定な共有結合をいう。
加反応の熱力学的平衡が生成系に著しく片寄っている反
応であり、原系（反応前の状態）から生成系へ進む正反
応の速度に比べて生成系から原系に戻る逆反応の速度が
著しく遅く、事実上逆反応が無視できる反応である。あ
るいは付加生成物が不可逆的な後続反応を引き起こす多
段階反応であってもよい。不可逆的共有結合とは前述の
反応により生成する安定な共有結合をいう。
【００１８】本発明では不可逆的付加反応を限定しない
が、かかる反応としてキノン類とアミノ基またはチオー
ル基との反応が好ましい。特に好ましいのは、キノン類
として１，４−ベンゾキノン類または１，４−ナフトキ
ノン類を用いた場合である。１，４−ベンゾキノンまた
は１，４−ナフトキノンは置換基を有していても良く置
換基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭
素原子数が３乃至６のシクロアルキル基、炭素原子数が
１乃至６のアルコキシル基、炭素原子数が１乃至６のア
ルケニル基、炭素原子数が１乃至６のアルキニル基、シ
アノ基、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、水酸基、
炭素原子数が１乃至６のアシル基、炭素原子数が１乃至
６のアシルオキシ基、炭素原子数が１乃至６のエステル
基および炭素原子数が１乃至６のアシルアミノ基等を挙
げることができるが、置換基としては電子吸引性基が望
ましく、シアノ基、ハロゲン原子、アシルオキシ基が最
も好ましい。
が、かかる反応としてキノン類とアミノ基またはチオー
ル基との反応が好ましい。特に好ましいのは、キノン類
として１，４−ベンゾキノン類または１，４−ナフトキ
ノン類を用いた場合である。１，４−ベンゾキノンまた
は１，４−ナフトキノンは置換基を有していても良く置
換基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭
素原子数が３乃至６のシクロアルキル基、炭素原子数が
１乃至６のアルコキシル基、炭素原子数が１乃至６のア
ルケニル基、炭素原子数が１乃至６のアルキニル基、シ
アノ基、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、水酸基、
炭素原子数が１乃至６のアシル基、炭素原子数が１乃至
６のアシルオキシ基、炭素原子数が１乃至６のエステル
基および炭素原子数が１乃至６のアシルアミノ基等を挙
げることができるが、置換基としては電子吸引性基が望
ましく、シアノ基、ハロゲン原子、アシルオキシ基が最
も好ましい。
【００１９】本発明の代表的な固定方法を図１に模式的
に示す。鎖状分子（ＬＱ）は、自由末端キノン骨格
（Ｑ）と、固相担体（Ｍ）表面と自由末端キノン骨格と
を結ぶ連結基（Ｌ）とからなる。鎖状分子を有する固相
担体（１）の自由末端キノン骨格と一方の末端にアミノ
基またはチオール基を有するＤＮＡ断片（２）とを反応
させることによって、ＤＮＡチップ（３）を得ることが
できる。ここで、Ｙは、クロスリンカーを表す。Ａは、
アミノ基またはチオール基を表わす。Ｑ1は、固相担体
表面へのアミノ基等の導入の方法によって決定される。
連結上（Ｌ）は、Ｑ 1および後述するキノン誘導体の構
造によって決定される。ｍは、０または１を表す。リン
酸エステル基ＮＮＮＮ・・・ＮＮは、ＤＮＡ断片を表
す。以下、図１の各工程について説明する。
に示す。鎖状分子（ＬＱ）は、自由末端キノン骨格
（Ｑ）と、固相担体（Ｍ）表面と自由末端キノン骨格と
を結ぶ連結基（Ｌ）とからなる。鎖状分子を有する固相
担体（１）の自由末端キノン骨格と一方の末端にアミノ
基またはチオール基を有するＤＮＡ断片（２）とを反応
させることによって、ＤＮＡチップ（３）を得ることが
できる。ここで、Ｙは、クロスリンカーを表す。Ａは、
アミノ基またはチオール基を表わす。Ｑ1は、固相担体
表面へのアミノ基等の導入の方法によって決定される。
連結上（Ｌ）は、Ｑ 1および後述するキノン誘導体の構
造によって決定される。ｍは、０または１を表す。リン
酸エステル基ＮＮＮＮ・・・ＮＮは、ＤＮＡ断片を表
す。以下、図１の各工程について説明する。
【００２０】固相担体としては、疎水性、あるいは親水
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金
などの導電性材料などを拳げることができる。多孔質物
質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にある
ことが好ましく、２乃至５００n mの範囲にあることが
特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリ
コンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容
易さや電気化学的方法による解析の容易さによるもので
ある。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範
囲にあることが好ましい。
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金
などの導電性材料などを拳げることができる。多孔質物
質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にある
ことが好ましく、２乃至５００n mの範囲にあることが
特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリ
コンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容
易さや電気化学的方法による解析の容易さによるもので
ある。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範
囲にあることが好ましい。
【００２１】固相担体は、ＤＮＡ断片を固定させるた
め、その表面がポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リシ
ン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等である
ことが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであることがさらに
好ましい）で被覆処理、あるいは固相担体表面への導入
置換基を有するシランカップリング剤によって接触処理
されていることが好ましく、固相担体表面への導入置換
基を有するシランカシプリング剤によって接触処理され
ていることが特に好ましい。固相担体表面への導入置換
基としては、アミノ基であることが好ましい。ポリ陽イ
オンによる場合には、アミノ基が静電結合によって固相
担体表面に導入されるのに対して、シランカップリング
剤による場合には、共有結合によって導入されるため、
アミノ基が固相担体表面に安定に存在する。アミノ基の
他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水
酸基あるいはチオール基も好ましく導入することができ
る。シランカップリング剤の例としては、γ−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）
−γ−アミノプロピルトリメトキシシランあるいはＮ−
β−（アミノエチル）−β−アミノプロピルメチルジメ
トキシシランを用いることが好ましく、γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランを用いることが特に好ましい。
め、その表面がポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リシ
ン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等である
ことが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであることがさらに
好ましい）で被覆処理、あるいは固相担体表面への導入
置換基を有するシランカップリング剤によって接触処理
されていることが好ましく、固相担体表面への導入置換
基を有するシランカシプリング剤によって接触処理され
ていることが特に好ましい。固相担体表面への導入置換
基としては、アミノ基であることが好ましい。ポリ陽イ
オンによる場合には、アミノ基が静電結合によって固相
担体表面に導入されるのに対して、シランカップリング
剤による場合には、共有結合によって導入されるため、
アミノ基が固相担体表面に安定に存在する。アミノ基の
他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水
酸基あるいはチオール基も好ましく導入することができ
る。シランカップリング剤の例としては、γ−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）
−γ−アミノプロピルトリメトキシシランあるいはＮ−
β−（アミノエチル）−β−アミノプロピルメチルジメ
トキシシランを用いることが好ましく、γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランを用いることが特に好ましい。
【００２２】ポリ陽イオンを用いる処理に、シランカッ
プリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。疎
水性、あるいは親水性の低い固相担体とＤＮＡ断片との
静電的相互作用を促進することができる。表面処理がさ
れた固相担体表面上に、さらに、電荷を有する親水性高
分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。
このような溝を設けることによって表面処理がきれた固
相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類
によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させる
ことも可能であり、このような処理を施した固相担体も
好ましく用いることができる。
プリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。疎
水性、あるいは親水性の低い固相担体とＤＮＡ断片との
静電的相互作用を促進することができる。表面処理がさ
れた固相担体表面上に、さらに、電荷を有する親水性高
分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。
このような溝を設けることによって表面処理がきれた固
相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類
によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させる
ことも可能であり、このような処理を施した固相担体も
好ましく用いることができる。
【００２３】Ｑ1は、該アミノ基の導入の方法によって
決定されるもので、ポリ陽イオンを用いて導入した場合
には、単結合（但し、静電的な結合）、該シランカップ
リング剤によって導入した場合には、シランカップリン
グ剤によって決定される。
決定されるもので、ポリ陽イオンを用いて導入した場合
には、単結合（但し、静電的な結合）、該シランカップ
リング剤によって導入した場合には、シランカップリン
グ剤によって決定される。
【００２４】キノン骨格（Ｑ）は、公知の合成反応によ
って導入することができる。例えばIndian Journal of
Chemistry, 15B, 970 (1997)に記載の方法に準じて１，
４−ベンゾキノンまたは１，４−ナフトキノンとメルカ
プトアルカン酸との反応によりカルボン酸基を導入した
キノンを合成し、シランカップリング剤によって導入し
た固相表面上のアミノ基とカルボン酸基活性化試薬（Ｘ
1）を作用させればキノン類で修飾された固相表面を容
易に得ることができる。カルボン酸基活性化試薬として
は、公知のものを用いることができるがＤＣＣ、ＷＳＣ
等のカルボジイミド類、炭酸エステル類、塩化チオニ
ル、オキサリルクロリド等の塩化物が好ましく、カルボ
ジイミド類が特に好ましい。
って導入することができる。例えばIndian Journal of
Chemistry, 15B, 970 (1997)に記載の方法に準じて１，
４−ベンゾキノンまたは１，４−ナフトキノンとメルカ
プトアルカン酸との反応によりカルボン酸基を導入した
キノンを合成し、シランカップリング剤によって導入し
た固相表面上のアミノ基とカルボン酸基活性化試薬（Ｘ
1）を作用させればキノン類で修飾された固相表面を容
易に得ることができる。カルボン酸基活性化試薬として
は、公知のものを用いることができるがＤＣＣ、ＷＳＣ
等のカルボジイミド類、炭酸エステル類、塩化チオニ
ル、オキサリルクロリド等の塩化物が好ましく、カルボ
ジイミド類が特に好ましい。
【００２５】カルボン酸基活性化試薬（Ｘ1）を作用さ
せる際には、塩基を存在させてもよい。塩基としては、
無機塩基および有機塩基の何れも用いることができる
が、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミン、
ピリジン、炭酸カリウムあるいは炭酸ナトリウムを用い
ることがより好ましく、１−メチル−２−ピロリドン、
トリエチルアミンあるいはピリジンを用いることがさら
に好ましく、１−メチル−２−ピロリドンを用いること
が特に好ましい。
せる際には、塩基を存在させてもよい。塩基としては、
無機塩基および有機塩基の何れも用いることができる
が、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミン、
ピリジン、炭酸カリウムあるいは炭酸ナトリウムを用い
ることがより好ましく、１−メチル−２−ピロリドン、
トリエチルアミンあるいはピリジンを用いることがさら
に好ましく、１−メチル−２−ピロリドンを用いること
が特に好ましい。
【００２６】クロスリンカー（Ｙ）は、単結合、アルキ
レン基あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基である
ことが好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メ
チルアミノへキシレン基であることが特に好ましい。
レン基あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基である
ことが好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メ
チルアミノへキシレン基であることが特に好ましい。
【００２７】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。
【００２８】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。
【００２９】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１03乃至１０6の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
【００３０】また、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点
着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃
至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃
至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００３１】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。
【００３２】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。
して、１０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０15モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。
【００３３】反応性基が導入された固相担体の表面に、
反応性基を有するＤＮＡ断片を点着させると、双方の反
応性基の間で不可逆的な付加反応が進行し、該ＤＮＡ断
片が共有結合によって固相担体表面に固定されるが、固
相担体の表面には該ＤＮＡ断片が結合していない反応性
基も存在する。このような反応性基は、標識された核酸
断片試料との非特異的な反応を生じる可能性があるた
め、予め該反応性基をブロッキング処理（ブロッキング
処理を施さなくても、本発明の固定方法によって製造さ
れた、ＤＮＡ断片固定固相担体は、充分にＤＮＡチップ
として使用することができる。）しておくことも好まし
い。ブロッキング処理は、チオグリコール酸、３−メル
カプトプロピオン酸、タウリン、チオサリチル酸あるい
はこれらの塩を接触させることによって行うことが好ま
しい。
反応性基を有するＤＮＡ断片を点着させると、双方の反
応性基の間で不可逆的な付加反応が進行し、該ＤＮＡ断
片が共有結合によって固相担体表面に固定されるが、固
相担体の表面には該ＤＮＡ断片が結合していない反応性
基も存在する。このような反応性基は、標識された核酸
断片試料との非特異的な反応を生じる可能性があるた
め、予め該反応性基をブロッキング処理（ブロッキング
処理を施さなくても、本発明の固定方法によって製造さ
れた、ＤＮＡ断片固定固相担体は、充分にＤＮＡチップ
として使用することができる。）しておくことも好まし
い。ブロッキング処理は、チオグリコール酸、３−メル
カプトプロピオン酸、タウリン、チオサリチル酸あるい
はこれらの塩を接触させることによって行うことが好ま
しい。
【００３４】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。
【００３５】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。
【００３６】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブ
リッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレー
タを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方
法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチッ
プはこの検出方法に利用することもできる。
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。あるいは、蛍光発生基を持ち、形成されたハイブ
リッド構造体に取り込まれる性質を持つインターカレー
タを用いて、ハイブリッドの形成を蛍光法により検出方
法を利用する方法も知られており、本発明のＤＮＡチッ
プはこの検出方法に利用することもできる。
【００３７】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００３８】試料核酸断片は、遺伝子の変異や多型を調
べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを
含む反応系で標的領域のＰＣＲを行なって調製すること
が好ましい。
べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを
含む反応系で標的領域のＰＣＲを行なって調製すること
が好ましい。
【００３９】ハイブリダイゼーション操作は、９６穴も
しくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておい
た、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着するこ
とによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃
至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダ
イゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そ
して６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。
しくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておい
た、標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる
水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着するこ
とによつて実施することが好ましい。点着の量は、１乃
至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダ
イゼーション操作は、室温乃至７０℃の温度範囲で、そ
して６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片
を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好まし
い。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いる
ことができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好
ましい。
【００４０】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。
【００４１】
【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成
及びＤＮＡ断片の固定量の測定 本発明の固定方法を、ＤＮＡ断片の反応経路によって表
すこととし、その反応経路を図２に示す。図中、１は、
スライドガラスを表す。
及びＤＮＡ断片の固定量の測定 本発明の固定方法を、ＤＮＡ断片の反応経路によって表
すこととし、その反応経路を図２に示す。図中、１は、
スライドガラスを表す。
【００４２】（１）ベンゾキノン基が導入されたスライ
ド（Ｃ１）の作成 ２重量％アミノプロビルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を、IndianJournal of Che
mistry, 15B, 970 (1997)に記載の方法に準じて合成し
た２−（３−カルボキシプロピル）チオ−１，４−ベン
ゾキノン（ＢＱ）（２．５ｇ）と、ＷＳＣ（水溶性カル
ボジイミド）（９５５ｍｇ）のアセトニトリル（５０ｍ
Ｌ）溶液に２時間浸し、アセトニトリルで洗浄し、１時
間減圧下に乾燥し、ベンゾキノンが導入されたスライド
（Ｂ）を得た。
ド（Ｃ１）の作成 ２重量％アミノプロビルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を、IndianJournal of Che
mistry, 15B, 970 (1997)に記載の方法に準じて合成し
た２−（３−カルボキシプロピル）チオ−１，４−ベン
ゾキノン（ＢＱ）（２．５ｇ）と、ＷＳＣ（水溶性カル
ボジイミド）（９５５ｍｇ）のアセトニトリル（５０ｍ
Ｌ）溶液に２時間浸し、アセトニトリルで洗浄し、１時
間減圧下に乾燥し、ベンゾキノンが導入されたスライド
（Ｂ）を得た。
【００４３】（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３'末端および５'未端がそれぞれチオール基、蛍光標織
試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシ
ャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾された
ＤＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を０．１
Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（１
×１０-6Ｍ、１μＬ）を、上記（１）で得たスライド
（Ｂ）に点着した。直ちに、点着後のスライドを２５
℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このスライドを
０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×
ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶
液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との混合溶液で
２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次い
で、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍチオグリコール
水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留
水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定された
スライド（Ｃ１）を得た。このスライド（Ｃ１）表面の
蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、１
６８０であった。本発明の固定化方法により、ＤＮＡ断
片が効率よくスライドガラスに固定されたことが分か
る。
試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシ
ャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾された
ＤＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を０．１
Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（１
×１０-6Ｍ、１μＬ）を、上記（１）で得たスライド
（Ｂ）に点着した。直ちに、点着後のスライドを２５
℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このスライドを
０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×
ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶
液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との混合溶液で
２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次い
で、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍチオグリコール
水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、蒸留
水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定された
スライド（Ｃ１）を得た。このスライド（Ｃ１）表面の
蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、１
６８０であった。本発明の固定化方法により、ＤＮＡ断
片が効率よくスライドガラスに固定されたことが分か
る。
【００４４】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 ３'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。
【００４５】（２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｃ２）に点着し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、６３２であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｃ２）に点着し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、６３２であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。
【００４６】
【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面にアミノ酸をシランカップリング剤を用いて
導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合
も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製を可能にす
る。その一つの例として、本発明によって作製されたＤ
ＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリダイゼ
ーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定されて
いるＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を感度よ
く検出することができる。
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面にアミノ酸をシランカップリング剤を用いて
導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合
も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製を可能にす
る。その一つの例として、本発明によって作製されたＤ
ＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリダイゼ
ーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定されて
いるＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を感度よ
く検出することができる。
【図１】本発明の代表的な固定方法を示す模式図であ
る。
る。
【図２】本発明のＤＮＡ断片の固定方法（シランカップ
リング剤を用いる固相担体表面へのアミノ基の導入する
工程を含む）を示す模式図である。
リング剤を用いる固相担体表面へのアミノ基の導入する
工程を含む）を示す模式図である。
１ スライドガラス
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA09 HA14 HA19 4B029 AA07 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR32 QR55 QR66 QS03 QS34 QS39 QX02 QX07
Claims (6)
- 【請求項１】 表面に反応性基を有する固相担体と、一
方の末端部に反応性基を有するＤＮＡ断片とを、液相に
て接触させることにより、双方の反応性基の間で不可逆
的な付加反応を起こさせて共有結合を形成させることを
特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。 - 【請求項２】 固相担体表面の反応性基がキノン骨格を
有する基であり、ＤＮＡ断片の反応性基がアミノ基もし
くはチオール基であることを特徴とする請求項１に記載
のＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。 - 【請求項３】 固相担体表面の反応性基のキノン骨格が
１，４−ベンゾフェノン骨格もしくは１，４−ナフトキ
ノン骨格であることを特徴とする請求項２に記載のＤＮ
Ａ断片の固相担体表面への固定方法。 - 【請求項４】 請求項１乃至３の内のいずれかの項に記
載の方法によって得られたＤＮＡチップ。 - 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
有する核酸断片の検出方法。 - 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレ
ータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮ
Ａチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮ
Ａ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構
造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から
発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検
出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対
して相補性を有する核酸断片の検出方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37133199A JP2001178474A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
| US09/749,714 US20020103348A1 (en) | 1999-12-27 | 2000-12-27 | DNA chip and its preparation |
| US10/326,350 US20040096838A1 (en) | 1999-12-27 | 2002-12-20 | DNA chip and its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37133199A JP2001178474A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001178474A true JP2001178474A (ja) | 2001-07-03 |
Family
ID=18498525
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP37133199A Pending JP2001178474A (ja) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001178474A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006234712A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Ｄｎａの固定化方法 |
| JP2006230335A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 遺伝子の検出方法 |
-
1999
- 1999-12-27 JP JP37133199A patent/JP2001178474A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006234712A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Ｄｎａの固定化方法 |
| JP2006230335A (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-07 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 遺伝子の検出方法 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070828 |