JP2001108683A - Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法 - Google Patents
Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 固相担体表面に、予め調製したＤＮＡ断片を
簡便かつ安価な方法によって共有結合させる固定方法、
ＤＮＡチップおよび核酸断片の検出方法を提供するこ
と。 【解決手段】 固相担体表面に一方の末端で固定された
鎖状分子に、アミド結合を介してＤＮＡ断片が固定され
ているＤＮＡ断片固定固相担体。
簡便かつ安価な方法によって共有結合させる固定方法、
ＤＮＡチップおよび核酸断片の検出方法を提供するこ
と。 【解決手段】 固相担体表面に一方の末端で固定された
鎖状分子に、アミド結合を介してＤＮＡ断片が固定され
ているＤＮＡ断片固定固相担体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでいる。ＤＮＡチップは、
スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ分子を整列
させたマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多
型性等の同時解析に非常に有用である。このＤＮＡチッ
プを用いるＤＮＡチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子
にも適用可能であり、創薬研究、疾病の診断や予防法の
開発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい
手段を提供するものとして期待されている。
析するための技術開発が進んでいる。ＤＮＡチップは、
スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ分子を整列
させたマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多
型性等の同時解析に非常に有用である。このＤＮＡチッ
プを用いるＤＮＡチップ技術は、ＤＮＡ以外の生体分子
にも適用可能であり、創薬研究、疾病の診断や予防法の
開発、エネルギーや環境問題対策等の研究開発に新しい
手段を提供するものとして期待されている。
【０００３】ＤＮＡチップ技術が具体化してきたのは、
ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダ
イゼーションによって決定する方法（ＳＢＨ：ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が
考案されたことに始まる（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１
９８９））。ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列
決定法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化に
は至らなかった。
ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダ
イゼーションによって決定する方法（ＳＢＨ：ｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が
考案されたことに始まる（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，ｐａｇｅ １１４（１
９８９））。ＳＢＨは、ゲル電気泳動を用いる塩基配列
決定法の限界を克服できる方法ではあったが、実用化に
は至らなかった。
【０００４】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。
【０００５】しかし、ＤＮＡチップ作製技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列させるためのＤＮＡチップの作製技
術が必要とされる。作製されたＤＮＡチップ上のＤＮＡ
断片は、一般的には、標識した試料核酸断片とのハイブ
リダイゼーションによって検出される。
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列させるためのＤＮＡチップの作製技
術が必要とされる。作製されたＤＮＡチップ上のＤＮＡ
断片は、一般的には、標識した試料核酸断片とのハイブ
リダイゼーションによって検出される。
【０００６】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め調製したＤＮＡ断片を固相担
体表面に固定する方法とが知られている。オン・チップ
法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用
と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術
および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリッ
クスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マスキ
ング技術」という。）が代表的である。
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め調製したＤＮＡ断片を固相担
体表面に固定する方法とが知られている。オン・チップ
法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用
と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術
および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリッ
クスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マスキ
ング技術」という。）が代表的である。
【０００７】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法は、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に
応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し、
ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させるのが
一般的である。また、固相担体表面の処理方法として、
アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシラン
カップリング剤を用いる方法も利用されている（Ｇｅ
ｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５（１９９
４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、
共有結合により固相担体表面に導入されるため、ポリ陽
イオンによる場合と比較して安定に固相担体表面に存在
する。
固定する方法は、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に
応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し、
ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させるのが
一般的である。また、固相担体表面の処理方法として、
アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシラン
カップリング剤を用いる方法も利用されている（Ｇｅ
ｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５（１９９
４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド基等は、
共有結合により固相担体表面に導入されるため、ポリ陽
イオンによる場合と比較して安定に固相担体表面に存在
する。
【０００８】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
−クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したス
ライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水
素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に
行う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡが固定されることは、ＤＮＡと標識した試料
核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上
に直接繋がる。
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
−クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したス
ライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水
素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に
行う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡが固定されることは、ＤＮＡと標識した試料
核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上
に直接繋がる。
【０００９】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５４
６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスライ
ドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネ
ート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応
させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基
導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られてい
る。上記の二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷電を
利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相担体
表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在させる
方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの
反応が遅く、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用
いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低
い（通常、加水分解が起こり易い）という問題点を有す
る。
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５４
６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスライ
ドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネ
ート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応
させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基
導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られてい
る。上記の二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷電を
利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相担体
表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在させる
方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの
反応が遅く、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用
いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低
い（通常、加水分解が起こり易い）という問題点を有す
る。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によって結
合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に結合
を維持可能な固定方法、ＤＮＡチップ、および核酸断片
の検出方法を提供することを、その課題とする。
面に、予め調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によって結
合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に結合
を維持可能な固定方法、ＤＮＡチップ、および核酸断片
の検出方法を提供することを、その課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、固相担体表面
に一方の末端で固定された鎖状分子に、アミド結合を介
してＤＮＡ断片が固定されていることを特徴とするＤＮ
Ａ断片固定固相担体にある。
に一方の末端で固定された鎖状分子に、アミド結合を介
してＤＮＡ断片が固定されていることを特徴とするＤＮ
Ａ断片固定固相担体にある。
【００１２】本発明は、また、固相担体表面に、自由末
端にカルボン酸基を有する鎖状分子を他方の側の末端に
て結合された連結基を形成する工程、そして、該連結基
のカルボン酸基と、一方の末端にアミノ基を有するＤＮ
Ａ断片の該アミノ基とを反応させることにより、アミド
結合を形成させる工程を順次行うことを特徴とするＤＮ
Ａ断片の固相担体表面への固定方法にもある。
端にカルボン酸基を有する鎖状分子を他方の側の末端に
て結合された連結基を形成する工程、そして、該連結基
のカルボン酸基と、一方の末端にアミノ基を有するＤＮ
Ａ断片の該アミノ基とを反応させることにより、アミド
結合を形成させる工程を順次行うことを特徴とするＤＮ
Ａ断片の固相担体表面への固定方法にもある。
【００１３】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表面への固
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）自由末端にカルボン酸基を有する鎖状分子を、固
相担体表面に、アミノ基を有するシランカップリング剤
を接触させることによって導入したアミノ基と、無水コ
ハク酸とを反応させて製造する。 （２）ＤＮＡ断片として、その塩基配列が既知であるも
のを用いる。
定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）自由末端にカルボン酸基を有する鎖状分子を、固
相担体表面に、アミノ基を有するシランカップリング剤
を接触させることによって導入したアミノ基と、無水コ
ハク酸とを反応させて製造する。 （２）ＤＮＡ断片として、その塩基配列が既知であるも
のを用いる。
【００１４】本発明は、さらに、本発明のＤＮＡ断片固
定固相担体に、蛍光物質で標識した核酸断片試料を溶解
あるいは分散してなる水性液を点着した後、インキュベ
ートして、該ＤＮＡ断片固定固相担体に固定されている
ＤＮＡ断片と核酸断片試料とで形成されたハイブリッド
ＤＮＡを検出することを特徴とする、該ＤＮＡ断片固定
固相担体に固定されているＤＮＡ断片に対して相補性を
有する核酸断片の検出方法にもある。
定固相担体に、蛍光物質で標識した核酸断片試料を溶解
あるいは分散してなる水性液を点着した後、インキュベ
ートして、該ＤＮＡ断片固定固相担体に固定されている
ＤＮＡ断片と核酸断片試料とで形成されたハイブリッド
ＤＮＡを検出することを特徴とする、該ＤＮＡ断片固定
固相担体に固定されているＤＮＡ断片に対して相補性を
有する核酸断片の検出方法にもある。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ断片固定固相担体
（以下「ＤＮＡチップ」という。）では、固相担体表面
に一方の末端で固定された鎖状分子に、アミド結合を介
してＤＮＡ断片が固定されている。ＤＮＡ断片の固相担
体表面への固定は、固相担体表面に、自由末端にカルボ
ン酸基を有する鎖状分子を他方の側の末端にて結合され
た連結基を形成する工程、そして、該連結基のカルボン
酸基と、一方の末端にアミノ基を有するＤＮＡ断片の該
アミノ基とを反応させることにより、アミド結合を形成
させる工程を順次行うことによって行う。
（以下「ＤＮＡチップ」という。）では、固相担体表面
に一方の末端で固定された鎖状分子に、アミド結合を介
してＤＮＡ断片が固定されている。ＤＮＡ断片の固相担
体表面への固定は、固相担体表面に、自由末端にカルボ
ン酸基を有する鎖状分子を他方の側の末端にて結合され
た連結基を形成する工程、そして、該連結基のカルボン
酸基と、一方の末端にアミノ基を有するＤＮＡ断片の該
アミノ基とを反応させることにより、アミド結合を形成
させる工程を順次行うことによって行う。
【００１６】本発明の代表的な固定方法を図１に模式的
に示す。鎖状分子（−Ｌ−ＣＯＯＨ）は、自由末端カル
ボン酸基と、固相担体（Ｍ）表面と自由末端カルボン酸
基とを結ぶ連結基（Ｌ）とからなる。鎖状分子を有する
固相担体（１）は、表面にアミノ基を有する固相担体
（４）の該アミノ基に、カルボン酸基導入試薬（Ｘ1）
を反応させることによって得ることができる。鎖状分子
を有する固相担体（１）の自由末端カルボン酸基を公知
の方法によって活性化し、次いで、カルボン酸基が活性
化された鎖状分子を有する固相担体と、一方の末端にア
ミノ基を有するＤＮＡ断片（２）とを反応させることに
よって、ＤＮＡチップ（３）を得ることができる。ここ
で、Ｙは、クロスリンカーを表す。Ｚは、固相担体表面
へのアミノ基導入の方法によって決定される。連結基
（Ｌ）は、Ｚおよびカルボン酸基導入試薬（Ｘ1）によ
って決定される。ｍは、０または１を表す。−リン酸エ
ステル基−ＮＮＮＮ・・・ＮＮは、ＤＮＡ断片を表す。
以下、図１の各工程について説明する。
に示す。鎖状分子（−Ｌ−ＣＯＯＨ）は、自由末端カル
ボン酸基と、固相担体（Ｍ）表面と自由末端カルボン酸
基とを結ぶ連結基（Ｌ）とからなる。鎖状分子を有する
固相担体（１）は、表面にアミノ基を有する固相担体
（４）の該アミノ基に、カルボン酸基導入試薬（Ｘ1）
を反応させることによって得ることができる。鎖状分子
を有する固相担体（１）の自由末端カルボン酸基を公知
の方法によって活性化し、次いで、カルボン酸基が活性
化された鎖状分子を有する固相担体と、一方の末端にア
ミノ基を有するＤＮＡ断片（２）とを反応させることに
よって、ＤＮＡチップ（３）を得ることができる。ここ
で、Ｙは、クロスリンカーを表す。Ｚは、固相担体表面
へのアミノ基導入の方法によって決定される。連結基
（Ｌ）は、Ｚおよびカルボン酸基導入試薬（Ｘ1）によ
って決定される。ｍは、０または１を表す。−リン酸エ
ステル基−ＮＮＮＮ・・・ＮＮは、ＤＮＡ断片を表す。
以下、図１の各工程について説明する。
【００１７】固相担体としては、疎水性、あるいは親水
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短
繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙げ
ることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至
１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５０
０ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。固相担体の材
質は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好まし
い。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による
解析の容易さによるものである。固相担体の厚さは、１
００乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短
繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙げ
ることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至
１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５０
０ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。固相担体の材
質は、ガラスもしくはシリコンであることが特に好まし
い。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による
解析の容易さによるものである。固相担体の厚さは、１
００乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００１８】固相担体は、ＤＮＡ断片を固定させるた
め、その表面がポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リシ
ン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等である
ことが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであることがさらに
好ましい）で被覆処理、あるいは固相担体表面への導入
置換基を有するシランカップリング剤によって接触処理
されていることが好ましく、固相担体表面への導入置換
基を有するシランカップリング剤によって接触処理され
ていることが特に好ましい。固相担体表面への導入置換
基としては、アミノ基であることが好ましい。ポリ陽イ
オンによる場合には、アミノ基が静電結合によって固相
担体表面に導入されるのに対して、シランカップリング
剤による場合には、共有結合によって導入されるため、
アミノ基が固相担体表面に安定に存在する。アミノ基の
他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水
酸基あるいはチオール基も好ましく導入することができ
る。シランカップリング剤の例としては、γ−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ
−アミノプロピルトリメトキシシランあるいはＮ−β
（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジメトキシ
シランを用いることが好ましく、γ−アミノプロピルト
リエトキシシランを用いることが特に好ましい。
め、その表面がポリ陽イオン（例えば、ポリ−Ｌ−リシ
ン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等である
ことが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであることがさらに
好ましい）で被覆処理、あるいは固相担体表面への導入
置換基を有するシランカップリング剤によって接触処理
されていることが好ましく、固相担体表面への導入置換
基を有するシランカップリング剤によって接触処理され
ていることが特に好ましい。固相担体表面への導入置換
基としては、アミノ基であることが好ましい。ポリ陽イ
オンによる場合には、アミノ基が静電結合によって固相
担体表面に導入されるのに対して、シランカップリング
剤による場合には、共有結合によって導入されるため、
アミノ基が固相担体表面に安定に存在する。アミノ基の
他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水
酸基あるいはチオール基も好ましく導入することができ
る。シランカップリング剤の例としては、γ−アミノプ
ロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ
−アミノプロピルトリメトキシシランあるいはＮ−β
（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジメトキシ
シランを用いることが好ましく、γ−アミノプロピルト
リエトキシシランを用いることが特に好ましい。
【００１９】ポリ陽イオンを用いる処理に、シランカッ
プリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。疎
水性、あるいは親水性の低い固相担体とＤＮＡ断片との
静電的相互作用を促進することができる。表面処理がさ
れた固相担体表面上に、さらに、電荷を有する親水性高
分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。
このような層を設けることによって表面処理がされた固
相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類
によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させる
ことも可能であり、このような処理を施した固相担体も
好ましく用いることができる。
プリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。疎
水性、あるいは親水性の低い固相担体とＤＮＡ断片との
静電的相互作用を促進することができる。表面処理がさ
れた固相担体表面上に、さらに、電荷を有する親水性高
分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。
このような層を設けることによって表面処理がされた固
相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類
によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させる
ことも可能であり、このような処理を施した固相担体も
好ましく用いることができる。
【００２０】Ｚは、該アミノ基の導入の方法によって決
定されるもので、ポリ陽イオンを用いて導入した場合に
は、単結合（但し、静電的な結合）、該シランカップリ
ング剤によって導入した場合には、シランカップリング
剤によって決定される。
定されるもので、ポリ陽イオンを用いて導入した場合に
は、単結合（但し、静電的な結合）、該シランカップリ
ング剤によって導入した場合には、シランカップリング
剤によって決定される。
【００２１】カルボン酸基は、公知の合成反応によって
導入することができるが、カルボン酸基導入試薬
（Ｘ1）を作用させることが好ましく、酸無水物を作用
させることが特に好ましい。カルボン酸基導入試薬（Ｘ
1）を作用させる際には、塩基を存在させてもよい。酸
無水物としては、マロン酸、シュウ酸、コハク酸、グル
タル酸、アジピン酸あるいはフタル酸の無水物であるこ
とが好ましく、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸あるいはフタル酸の無水物であることがさらに好
ましく、コハク酸の無水物であることが特に好ましい。
これらの酸無水物は、その水素原子が置換されていても
よい。置換基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキ
ル基、炭素原子数が３乃至６のシクロアルキル基、炭素
原子数が１乃至６のアルコキシル基、炭素原子数が１乃
至６のアルケニル基、炭素原子数が１乃至６のアルキニ
ル基、シアノ基、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）お
よび水酸基を挙げることができる。連結基（Ｌ）は、酸
無水物の種類によって決定され、酸無水物がマロン酸、
コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびフタル酸の無
水物であるとき、それぞれ、メチレン基、エチレン基、
プロピレン基、ブチレン基、１，２−フェニレン基をカ
ルボン酸基側に含む。塩基としては、無機塩基および有
機塩基の何れも用いることができるが、１−メチル−２
−ピロリドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリ
ウムあるいは炭酸ナトリウムを用いることがより好まし
く、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあ
るいはピリジンを用いることがさらに好ましく、１−メ
チル−２−ピロリドンを用いることが特に好ましい。
導入することができるが、カルボン酸基導入試薬
（Ｘ1）を作用させることが好ましく、酸無水物を作用
させることが特に好ましい。カルボン酸基導入試薬（Ｘ
1）を作用させる際には、塩基を存在させてもよい。酸
無水物としては、マロン酸、シュウ酸、コハク酸、グル
タル酸、アジピン酸あるいはフタル酸の無水物であるこ
とが好ましく、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸あるいはフタル酸の無水物であることがさらに好
ましく、コハク酸の無水物であることが特に好ましい。
これらの酸無水物は、その水素原子が置換されていても
よい。置換基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキ
ル基、炭素原子数が３乃至６のシクロアルキル基、炭素
原子数が１乃至６のアルコキシル基、炭素原子数が１乃
至６のアルケニル基、炭素原子数が１乃至６のアルキニ
ル基、シアノ基、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）お
よび水酸基を挙げることができる。連結基（Ｌ）は、酸
無水物の種類によって決定され、酸無水物がマロン酸、
コハク酸、グルタル酸、アジピン酸およびフタル酸の無
水物であるとき、それぞれ、メチレン基、エチレン基、
プロピレン基、ブチレン基、１，２−フェニレン基をカ
ルボン酸基側に含む。塩基としては、無機塩基および有
機塩基の何れも用いることができるが、１−メチル−２
−ピロリドン、トリエチルアミン、ピリジン、炭酸カリ
ウムあるいは炭酸ナトリウムを用いることがより好まし
く、１−メチル−２−ピロリドン、トリエチルアミンあ
るいはピリジンを用いることがさらに好ましく、１−メ
チル−２−ピロリドンを用いることが特に好ましい。
【００２２】カルボン酸基の活性化方法としては、公知
の方法を用いることができる。ヒドロキシスクシンイミ
ド、ヒドロキシフタルイミド等のヒドロキシイミド、塩
化チオニル、オキサリルクロリド等の塩化物で処理する
ことが好ましい。
の方法を用いることができる。ヒドロキシスクシンイミ
ド、ヒドロキシフタルイミド等のヒドロキシイミド、塩
化チオニル、オキサリルクロリド等の塩化物で処理する
ことが好ましい。
【００２３】クロスリンカー（Ｙ）は、単結合、アルキ
レン基あるいはＮ−アルキルアミノ−アルキレン基であ
ることが好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−
メチルアミノ−ヘキシレン基であることが特に好まし
い。
レン基あるいはＮ−アルキルアミノ−アルキレン基であ
ることが好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−
メチルアミノ−ヘキシレン基であることが特に好まし
い。
【００２４】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４n（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。
【００２５】ＤＮＡ断片には、固相担体表面の導入置換
基と結合を形成するための反応活性基を一方の末端に導
入する。反応活性基は、アミノ基である。
基と結合を形成するための反応活性基を一方の末端に導
入する。反応活性基は、アミノ基である。
【００２６】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。
【００２７】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は、１０3乃至１０6の
範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グ
リセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさ
らに好ましく、グリセリンを用いることが特に好まし
い。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、
０．１乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．
５乃至１容量％の範囲にあることが特に好ましい。ま
た、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相
担体を、９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度
範囲の環境に置くことも好ましい。
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は、１０3乃至１０6の
範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グ
リセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさ
らに好ましく、グリセリンを用いることが特に好まし
い。高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、
０．１乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．
５乃至１容量％の範囲にあることが特に好ましい。ま
た、同じ目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相
担体を、９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度
範囲の環境に置くことも好ましい。
【００２８】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。これらの後処理は、ポリ陽イオ
ンのみによって固相担体表面を処理した場合には特に有
効である。点着後は、インキュベーションを行うことも
好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗
浄して除去することが好ましい。
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。これらの後処理は、ポリ陽イオ
ンのみによって固相担体表面を処理した場合には特に有
効である。点着後は、インキュベーションを行うことも
好ましい。インキュベート後、未点着のＤＮＡ断片を洗
浄して除去することが好ましい。
【００２９】ＤＮＡ断片は、固相担体表面に対して、１
０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好まし
い。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０-15モルの範囲にあ
り、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にド
ットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円
形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量
的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドッ
ト間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にあることが好
ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあることが特に
好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０乃至３
００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、
１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１
乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
０2乃至１０5種類／ｃｍ2の範囲にあることが好まし
い。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０-15モルの範囲にあ
り、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点
着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表面にド
ットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円
形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量
的解析や一塩基変異を解析するために重要である。ドッ
ト間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にあることが好
ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあることが特に
好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０乃至３
００μｍの範囲にあることが好ましい。点着する量は、
１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１
乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００３０】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダーゼーションであ
る。
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダーゼーションであ
る。
【００３１】標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法（蛍
光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られている
が、本発明では蛍光法を用いる。蛍光物質としては、核
酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いるこ
とができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅTM
シリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、
Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（Ａ
ＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使
用することができる。
光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られている
が、本発明では蛍光法を用いる。蛍光物質としては、核
酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いるこ
とができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅTM
シリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、
Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−アセチルアミノフルオレン（Ａ
ＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使
用することができる。
【００３２】試料核酸断片としては、その配列や機能が
未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用
いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調
べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離
することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除
く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤
血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛
髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡなら
ば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出するこ
とが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮ
ＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシ
ン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）である
デオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませ
て標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとして
は、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好
ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮ
Ａ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下
であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断
片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分
子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍ
ＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識す
ることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子の変異や多
型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮ
ＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ること
が好ましい。
未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用
いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調
べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離
することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除
く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤
血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛
髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡなら
ば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出するこ
とが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮ
ＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシ
ン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）である
デオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませ
て標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとして
は、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好
ましい。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮ
Ａ量は、液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下
であることが好ましい。尚、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断
片がオリゴＤＮＡである場合には、試料核酸断片は低分
子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍ
ＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識す
ることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子の変異や多
型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮ
ＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行って得ること
が好ましい。
【００３３】ハイブリダイゼーションは、９６穴もしく
は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液
を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによ
って実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１０
０ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼー
ションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至
２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダ
イゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液
を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去する
ことが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液と
しては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
るが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液
を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによ
って実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１０
０ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼー
ションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至
２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダ
イゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液
を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去する
ことが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液と
しては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
るが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００３４】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダーゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダーゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。
【００３５】
【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作
成、およびＤＮＡ断片の固定量の測定本発明の固定方法
を、ＤＮＡ断片の反応経路によって表すこととし、その
反応経路を図２に示す。図中、１は、スライドガラスを
表す。 （１）カルボン酸基が導入されたスライド（Ｃ）の作成 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を、無水コハク酸（２．５
ｇ）の１−メチル−２−ピロリドン（５０ｍＬ）溶液に
１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで洗浄し、１
時間減圧下乾燥した。乾燥後の、末端にカルボン酸基が
導入されたスライド（Ｂ）を、ＷＳＣ（水溶性カルボジ
イミド）（９５５ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（５７５ｍｇ）のアセトニトリル（５０ｍＬ）溶
液に２時間浸し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧
下に乾燥し、カルボン酸基が導入されたスライド（Ｃ）
を得た。 （２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３’末端および５’末端がそれぞれアミノ基、蛍光標識
試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、アマ
シャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾され
たＤＮＡ断片（３’−ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧ
ＴＣＴＧＡＴＣ−５’）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
９．３）に分散してなる水性液（１×１０ -6Ｍ、１μ
Ｌ）を、上記（１）で得たスライド（Ｃ）に点着した。
直ちに、点着後のスライドを２５℃、湿度９０％にて１
時間放置した後、このスライドを０．１重量％ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳ
Ｃ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準
食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×
ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄
後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中
に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾
燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ１）を得
た。このスライド（Ｄ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャ
ニング装置で測定したところ、１６８０であった。本発
明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライド
ガラスに固定されたことが分かる。
成、およびＤＮＡ断片の固定量の測定本発明の固定方法
を、ＤＮＡ断片の反応経路によって表すこととし、その
反応経路を図２に示す。図中、１は、スライドガラスを
表す。 （１）カルボン酸基が導入されたスライド（Ｃ）の作成 ２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業
（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５
ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノ
ールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化
合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラ
ン化合物被覆スライド（Ａ）を、無水コハク酸（２．５
ｇ）の１−メチル−２−ピロリドン（５０ｍＬ）溶液に
１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで洗浄し、１
時間減圧下乾燥した。乾燥後の、末端にカルボン酸基が
導入されたスライド（Ｂ）を、ＷＳＣ（水溶性カルボジ
イミド）（９５５ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（５７５ｍｇ）のアセトニトリル（５０ｍＬ）溶
液に２時間浸し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧
下に乾燥し、カルボン酸基が導入されたスライド（Ｃ）
を得た。 （２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３’末端および５’末端がそれぞれアミノ基、蛍光標識
試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、アマ
シャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾され
たＤＮＡ断片（３’−ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧ
ＴＣＴＧＡＴＣ−５’）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
９．３）に分散してなる水性液（１×１０ -6Ｍ、１μ
Ｌ）を、上記（１）で得たスライド（Ｃ）に点着した。
直ちに、点着後のスライドを２５℃、湿度９０％にて１
時間放置した後、このスライドを０．１重量％ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳ
Ｃ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準
食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×
ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄
後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中
に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾
燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたスライド（Ｄ１）を得
た。このスライド（Ｄ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャ
ニング装置で測定したところ、１６８０であった。本発
明の固定化方法により、ＤＮＡ断片が効率よくスライド
ガラスに固定されたことが分かる。
【００３６】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 ３’末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５’末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（ＧＡＴＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣ
ＴＡＧ−５’）をハイブリダイゼーション用溶液（４×
ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μ
Ｌ）に分散させたものを、上記（１）で得たスライド
（Ｄ２）に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護
した後、モイスチャンバー内にて６０℃で２０時間イン
キュベートした。次いで、このものを０．１重量％ＳＤ
Ｓと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと
０．２×ＳＳＣとの混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水
溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心
し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を
蛍光スキャニング装置で測定したところ、６３２であっ
た。本発明の固定化方法によって作成されたＤＮＡチッ
プを用いることによって、ＤＮＡチップに固定されてい
るＤＮＡ断片と相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出で
きることが分かる。
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５’末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（ＧＡＴＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣ
ＴＡＧ−５’）をハイブリダイゼーション用溶液（４×
ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μ
Ｌ）に分散させたものを、上記（１）で得たスライド
（Ｄ２）に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護
した後、モイスチャンバー内にて６０℃で２０時間イン
キュベートした。次いで、このものを０．１重量％ＳＤ
Ｓと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと
０．２×ＳＳＣとの混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水
溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心
し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を
蛍光スキャニング装置で測定したところ、６３２であっ
た。本発明の固定化方法によって作成されたＤＮＡチッ
プを用いることによって、ＤＮＡチップに固定されてい
るＤＮＡ断片と相補性を有する試料ＤＮＡ断片を検出で
きることが分かる。
【００３７】
【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面にアミノ基をシランカップリング剤を用いて
導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合
も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製に繋がるも
のである。その一つの例として、本発明によって作製さ
れたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定
されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を
感度よく検出することができる。
断片を安定かつ迅速に固定することができる。特に、固
相担体表面にアミノ基をシランカップリング剤を用いて
導入した場合には、アミノ基の固相担体表面への結合
も、ＤＮＡ断片の結合も共に共有結合であるため、強固
にＤＮＡ断片を固定することができる。ＤＮＡ断片の安
定な固定は、遺伝子解析等に有効に利用することができ
る高い検出限界を有するＤＮＡチップの作製に繋がるも
のである。その一つの例として、本発明によって作製さ
れたＤＮＡチップを用いて、試料核酸断片とのハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、ＤＮＡチップに固定
されているＤＮＡ断片に相補性を有する試料核酸断片を
感度よく検出することができる。
【図１】本発明の代表的な固定方法を示す模式図であ
る。
る。
【図２】本発明のＤＮＡ断片の固定方法（シランカップ
リング剤を用いる固相担体表面へのアミノ基の導入する
工程を含む）を示す模式図である。
リング剤を用いる固相担体表面へのアミノ基の導入する
工程を含む）を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 瀬志本 修 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 HA12 4B063 QA01 QA17 QA18 QQ42 QR32 QR56 QR84 QS03 QS22 QS34 QS36 QX02
Claims (5)
- 【請求項１】 固相担体表面に一方の末端で固定された
鎖状分子に、アミド結合を介してＤＮＡ断片が固定され
ていることを特徴とするＤＮＡ断片固定固相担体。 - 【請求項２】 固相担体表面に、自由末端にカルボン酸
基を有する鎖状分子を他方の側の末端にて結合された連
結基を形成する工程、そして、該連結基のカルボン酸基
と、一方の末端にアミノ基を有するＤＮＡ断片の該アミ
ノ基とを反応させることにより、アミド結合を形成させ
る工程を順次行うことを特徴とするＤＮＡ断片の固相担
体表面への固定方法。 - 【請求項３】 自由末端にカルボン酸基を有する鎖状分
子を、固相担体表面に、アミノ基を有するシランカップ
リング剤を接触させることによって導入したアミノ基
と、無水コハク酸とを反応させて製造することを特徴と
する請求項２に記載のＤＮＡ断片の固相担体表面への固
定方法。 - 【請求項４】 ＤＮＡ断片として、その塩基配列が既知
であるものを用いることを特徴とする請求項２に記載の
ＤＮＡ断片の固定方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載のＤＮＡ断片固定固相担
体に、蛍光物質で標識した核酸断片試料を溶解あるいは
分散してなる水性液を点着した後、インキュベートし
て、該ＤＮＡ断片固定固相担体に固定されているＤＮＡ
断片と核酸断片試料とで形成されたハイブリッドＤＮＡ
を検出することを特徴とする、該ＤＮＡ断片固定固相担
体に固定されているＤＮＡ断片に対して相補性を有する
核酸断片の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29214199A JP2001108683A (ja) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29214199A JP2001108683A (ja) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001108683A true JP2001108683A (ja) | 2001-04-20 |
Family
ID=17778082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29214199A Withdrawn JP2001108683A (ja) | 1999-10-14 | 1999-10-14 | Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001108683A (ja) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2004534959A (ja) * | 2001-07-09 | 2004-11-18 | サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク | 固形支持体の機能化方法、機能化された固形支持体、およびその使用 |
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| US8298832B2 (en) | 2004-03-23 | 2012-10-30 | Toray Industries, Inc. | Method of agitating solution |
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| JP2018100873A (ja) * | 2016-12-20 | 2018-06-28 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 生体関連分子固定化用担体 |
-
1999
- 1999-10-14 JP JP29214199A patent/JP2001108683A/ja not_active Withdrawn
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