JP2002535013A - 複製可能なプローブアレー - Google Patents

複製可能なプローブアレー

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ジェイ． スワンソン，メルビン
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Abstract

(57)【要約】 例えば、元のマスターアレーを製造および複製することによる、そして／または再生できる再使用可能な検定アレーを提供することによる、実質上同一の特異的結合リガンド（例えば核酸）プローブアレーを生成するための系。一つの態様において、この系は、ａ）パターン化され、そして所望によりランダムなアレーの形にアドレス配列を固定化させたマスターアレー表面、ｂ）アドレス配列に対し相補的な結合ドメイン、標的配列に対し相補的な結合ドメイン、およびコンジュゲートを検定アレー表面内部またはその上に形成（例えば結合または重合により）させる際の使用のための第三リガンド、を有する多リガンドコンジュゲート、これはアドレスおよびその相補的配列の解離により、またはその際に使用することができる、の製造および使用を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願に対するクロスリファレンス 本出願は、１９９９年１月２９日出願の米国特許出願第０９／２４０，４６６
号、「複製可能なプローブアレー」の継続出願であり、その全開示を引用により
本明細書の一部とする。
【０００２】 発明の属する技術分野 本発明は、特異的結合リガンド、例えば核酸およびその他のリガンドを既知の
空間的配置に固定化することに関するものである。別の態様において本発明は、
かかる核酸を組み込んだ固体支持体、例えば、オリゴヌクレオチドチップに関す
るものである。さらに別の態様において、本発明は、光反応性基、かかる基を用
いて誘導体化された分子および／または表面、並びにかかる基の活性化によって
かかる分子を支持体表面に結合させることに関するものである。
【０００３】 発明の背景 オリゴヌクレオチドプローブアレー、より一般的に「ＤＮＡチップ」および「
GENE CHIP」(Affymetrix,Inc.の登録商標)として知られているものの開発は、過
去数年間にわたり著しい進歩を遂げており、絶えず増大する注目および高い重要
性の中心となりつつある。例えば、Stipp,D.、Fortune、56頁、1997年3月31日を
参照されたい。また、Borman,S.、C&EN、42頁、1996年12月9日、およびTravis,J
.、Science News 151:144-145(1997)をも参照されたい。これらの２または３cm
の正方形のチップは、一万ないし十万個の固定化オリゴヌクレオチドを収めるこ
とができ、研究者が、協力して作用する数千の遺伝子の挙動を立証することを初
めて可能にした。ＤＮＡチップは、特異な遺伝子発現のパターンを観察し、薬物
治療の成功を評価し、患者の遺伝子構成に基づいた薬物療法を作り上げ、遺伝子
の配列決定を行い、そして遺伝子医学分野での研究の遂行に有用である。「ＤＮ
Ａが準備されているマイクロチップアレー」、R.Service、Science 282(5388):3
96-399、1998年10月16日；および「小規模な変革の醸成」、I.Amato、Science 2
82(5388):402-405、1998年10月16日、をも参照されたい。
【０００４】 典型的には、オリゴヌクレオチドプローブアレーは、特定のオリゴヌクレオチ
ド配列を、正確な位置で、情報の豊富なフォーマットで表示する。使用にあたり
、蛍光標識された核酸標的のハイブリダイゼーションパターンを用いて、その標
的についての一次構造情報を得る。このフォーマットは、病原体の同定、法医学
的適用、ｍＲＮＡ発現の監視、および新規の配列決定を包含する、広範囲の核酸
配列分析の問題に適用することができる。例えば、Lipshutz,R.J.等、BioTechni
ques 19(3):442-447(1995)を参照されたい。このようなアレーは時に、数万個、
または数十万個の個々のプローブを持っている必要がある。チップはまた、細胞
当たり１〜１００００コピーまでのうちいずれのレベルでも発現される可能性の
ある配列を検出するため、幅広い感度を提供する必要がある。
【０００５】 オリゴヌクレオチドプロープアレーの製造および／または使用のために、様々
なアプローチが開発されてきた。例えば、固相支持体に大規模の化学的多様性を
作り出すための合成的戦略を記載している、Weaver等（ＷＯ９２／１００９２）
を参照されたい。この系は、固相化学、光不安定性保護基および写真平版を使用
して、光指向性の、空間アドレス決定可能な平行化学合成を達成している。適切
な配列のマスクおよび化学的段階反応を使用して、各々がアレー表面上の前もっ
て定められた位置にある、所定のオリゴヌクレオチドの組を作り上げることがで
きる。
【０００６】 この技術を使用して、Affymetrix,Inc.(サンタクララ、ＣＡ)は、固体支持体
上の単分子二本鎖オリゴヌクレオチドのライブラリーを開発した。例えば、４〜
１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むアレーを記載している、米国
特許第５７７０７２２号を参照されたい。このアレーは、固体支持体、所望によ
るスペーサー、第一オリゴヌクレオチド、第一オリゴヌクレオチドに対し相補的
な第二オリゴヌクレオチド、および融通性のあるリンカーまたはプローブを含ん
でいる。記載されたこのライブラリーは、蛋白、ＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡと
結合するその他の分子といったようなレセプターをスクリーニングするのに有用
である。Affymetrixにより開発されたもう一つのアレーは米国特許第５８３７８
３２号に記載されている。この文献は、シリカチップ上にオリゴヌクレオチドプ
ローブの高密度アレーを作成する方法を記載している。このオリゴヌクレオチド
プローブは９〜２０ヌクレオチド長であって、固体支持体上で直接合成される。
このアレーは、リファレンス配列の一部分に対し相補的なオリゴヌクレオチドプ
ローブを含んでいる。
【０００７】 Synteni（パロアルト、ＣＡ）は、ポリリジンをガラススライドに適用し、そ
の後ｃＤＮＡをこの被覆スライド上にプリントすることによって、ｃＤＮＡのア
レーを製造している。次に、ＤＮＡをポリリジンと架橋させるため、このアレー
をＵＶ光に暴露する。次いで未反応のポリリジンを無水琥珀酸との反応によりブ
ロックする。「遺伝子発現マイクロアレー」（ＧＥＭ（商標））と呼ばれるこれ
らのアレーは、正常細胞から調製したｍＲＮＡを蛍光色素で標識し、次いで異常
細胞由来のｍＲＮＡを異なる色の蛍光色素で標識することによって使用する。こ
れら二つの標識したｍＲＮＡ分子をこのマイクロアレーに同時適用すると、これ
らは固定化されたｃＤＮＡ分子と競合的に結合する。この二色コード化技術を用
いて、二つの細胞試料間の遺伝子発現の相違を同定する（Heller,R.A.等、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、94:2150-2155(1997)）。
【０００８】 少なくとも一つのグループ、Cantor等(米国特許第５７９５７１４号)が、診断
補助手段の大規模製造に有用であるとされるプローブのアレーの複製方法を記載
している。この特許は、固体支持体上で一本鎖プローブのアレーを複製する方法
を包含しており、その方法は、 ａ）３’末端に長さＣの非可変配列を、そして５’末端に長さＲの可変配列を
それぞれ含む、核酸のアレーを合成し； ｂ）このアレーを第一の固体支持体に固定し； ｃ）非可変配列に対し相補的な配列をそれぞれ含む核酸の組を合成し； ｄ）この組の核酸をアレーとハイブリダイズし； ｅ）アレーの可変配列を鋳型に使用して、この組の核酸を酵素的に伸張させ； ｆ）伸張させた核酸の組を変性させ；そして、 ｇ）変性させた核酸の組を第二の固体支持体に固定して、一本鎖プローブの複
製されたアレーを作り出す、 工程を含む。
【０００９】 別の主題では、本発明の譲受人は、光化学、特に例えばポリマーおよびその他
の分子を支持体表面に結合させるための光反応性基の使用のための様々な適用を
過去に述べている。例えば、米国特許第４７２２９０６、４９７９９５９、５２
１７４９２、５５１２３２９、５５６３０５６、５６３７４６０、および５７１
４３６０号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０８７９７号（ウイル
ス不活性化被覆）、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０７６９５号（毛細管の内皮化）、およ
びＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３４４号（チェーントランスファー物質）を参照され
たい。
【００１０】 様々なこれまでの開発にも拘わらず、例えばオリゴヌクレオチドプローブアレ
ーを生成するために、様々な支持材料上への核酸の固定化を改善するための方法
および試薬に対する需要が依然として存在している。明らかに必要とされるもの
は、正確な感受性生成物を確保しつつ特異的結合リガンド（例えば核酸）アレー
を、費用効率が良く効率的な方法で、再生的に製造するための、新たな且つ改善
された方法および試薬である。
【００１１】 発明の要約 或る好ましい態様において本発明は、例えば元の「マスター」アレーを調製し
複製することにより、そして／または再生することのできる再使用可能な検定ア
レーを提供することにより、実質上同一の特異的結合リガンド（例えば核酸）プ
ローブアレーを製造するための系を提供する。このアプローチは、マスターアレ
ーを複製する利便性またはその後の使用のためにアレーを再生する融通性のない
、新しく各々のプローブアレーを別々且つ個々に製造する、伝統的なアプローチ
とは対照的である。本発明の方法は、その複製物を提供するために常套的アレー
との使用に適合させることができるが、好ましくは本明細書に記載の方法により
、かかる目的のため特別に設計されたマスターアレー（およびその他の構成成分
）と共に使用する。
【００１２】 このような好ましい態様において、本発明は、検定アレーを再生できるように
製造するための方法および系を提供するものであり、この系は、 ａ）例えば、直接的に、またはそれぞれの結合剤、例えば「マイクロビーズ」
またはその他の適当なリンカーを介して、複数の「アドレス」リガンドをそこに
固定化した、ここで、このリガンドは、パターン化された、且つ所望によりラン
ダムなアレーの形で固定化されている、支持体表面を含む、マスターアレー； ｂ）それぞれの多リガンドコンジュゲートが、（ｉ）マスターアレーの特定の
アドレスリガンドに相補的に結合するよう選択されたリガンドを含む、少なくと
も一分子の第一リガンド（例えばオリゴヌクレオチド）結合ドメイン、（ii）標
的核酸配列（例えば、遺伝子および／または遺伝子フラグメント）の特徴的リガ
ンドに相補的に結合するよう選択されたリガンドを含む、少なくとも一分子の第
二リガンド（例えば、オリゴヌクレオチド）結合ドメイン、および、（iii）結
合リガンドおよび重合性の基（例えば、アクリルまたはビニル基）より成る群か
ら選ばれる、少なくとも一分子の第三（そして好ましくは非オリゴヌクレオチド
）リガンド、を、（好ましくは独立に）結合させているコア（例えば、分子また
は固体）を含む、複数の多リガンドコンジュゲート；および、 ｃ）例えば、第三リガンドのための結合部位で被覆された（例えば、第三リガ
ンドに特異的な、固定化された対応する結合相手の分子）複製アレーのための支
持体表面を含む検定アレー支持体、 を含んでいる。
【００１３】 アドレスおよび標的リガンドが共に核酸、好ましくはオリゴヌクレオチドであ
る、本発明に係る好ましい対応する方法は、（１）上記のようなマスターアレー
を提供し、（２）それらのそれぞれのオリゴヌクレオチド結合ドメインが、マス
ターアレーの相補的アドレス配列とハイブリダイズできるようにすることにより
、多リガンドコンジュゲートをそこに結合させ、（３）結合した多リガンドコン
ジュゲートを検定アレー支持体に結合させるのに適切な条件下で、（例えば、第
三リガンドと、検定支持体表面上に存在する対応する結合部位を結合させること
により）この検定アレー支持体がマスターアレーに充分接近するようにし、そし
て、（４）検定アレー支持体が回収され使用されるのに適当な条件下で、ハイブ
リダイズした相補的オリゴヌクレオチドを解離させる、という工程を含んでいる
。得られる検定アレーは、マスターアレーにより確立されたパターンで存在する
複数の多リガンドコンジュゲートを結合させた（好ましくは依然として相補的標
的オリゴヌクレオチドを有する）検定アレー支持体を含む。
【００１４】 （第三結合リガンドに加えて、または第三結合リガンドの代わりに）当該コン
ジュゲートが重合性の基を含んでいる、別の好ましい態様では、得られる重合し
た層が支持され使用される（例えば、マスターアレーアドレスにより確立された
空間配置を維持しつつ、検定アレー支持体へと移動させる）のに充分なポリマー
補強物を形成させるために、当該多リガンドコンジュゲートを、それらの基をin
situで重合させることにより、マスターアレー表面の所望の位置に維持するこ
とができる。
【００１５】 いったん検定アレー支持体へと移されたならば、次に、第二のオリゴヌクレオ
チド結合ドメインを常套的に使用して、試料中における１以上の標的核酸の存在
（例えば絶対量または相対量）を決定できる。第二結合ドメインの順序および配
置は、予め決定しておき、本明細書に開示した複製方法の実施過程で維持する。
例えば、得られる検定アレーは、例えば任意の標的核酸がハイブリダイズされ検
出されるのに適当な条件下で該アレーを標的核酸の含有が疑われる試料と接触さ
せることにより、常套的なやり方で使用することができる。別の態様では、本発
明は、このような系を使用する方法；キットまたは１以上の構成成分の組み合わ
せを包含する、このような系の使用のための様々な構成成分；ならびに本発明方
法により形成される検定アレーを提供する。
【００１６】 詳細な説明 本発明は、特異的結合リガンドアレー、例えば、核酸アレーを再生可能に製造
するための方法および系を提供するものである。本明細書中使用する「核酸」と
は、高分子、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチ
ド核酸（ＰＮＡ）、または一般に、塩基対を形成する、もしくは相補的化学構造
とハイブリダイズする能力を有する、化学的バックボーンにより結合する、塩基
と呼ばれる任意の配列を包含する。核酸は任意の適当な形、例えば天然原料から
単離された、組換えにより製造された、または人工的に合成された形で提供する
ことができる。一方「オリゴヌクレオチド」という語は、「核酸」という語と互
換的に使用され、一般には、例えば、固体支持体核酸合成といったような現在当
分野で利用可能な合成技術を用いて製造されるような、短鎖（例えば、約１００
ヌクレオチド長未満、典型的には２０〜５０ヌクレオチド長）の核酸配列を指す
。本発明は核酸（およびハイブリダイゼーションを介して特異的に「結合する」
それらの能力）について特に記載されるが、本発明は他の特異的結合リガンド、
例えば免疫学的結合対またはその他のリガンド／抗リガンド結合対にも同様に適
用可能であるということが理解できるであろう。
【００１７】 一つの態様において、本発明は、そのパターンが任意の適当な手段によって管
理されそして／または決定されている、複数のアドレスオリゴヌクレオチドをそ
こに固定化した、マスターアレーを提供する。その後、当該多リガンドコンジュ
ゲートの第一（例えばオリゴヌクレオチド）結合ドメインを、マスターアレー支
持体上の相補的アドレスオリゴヌクレオチドに結合（例えばハイブリダイズ）さ
せるのに適当な条件下で、複数の多リガンドコンジュゲートを含む組成物を、マ
スターアレーとの結合に近い状態にさせる。特に好ましい態様では、第三のリガ
ンドが結合リガンド（例えばビオチン）の形で提供される。マスターアレーおよ
び多リガンドコンジュゲートを調製し、実質上上記のやり方によって第三結合リ
ガンドと組み合せ、次いでこれが、得られたコンジュゲート複合体を検定アレー
支持体へと移動させる役割を担う。結合したコンジュゲート分子を持っているマ
スターアレーは、検定アレー支持体との結合に近い状態にさせることができる。
一方、検定アレー支持体は、多リガンドコンジュゲートの第三結合リガンドとの
結合（例えば非共有結合的な）に適合させた結合部位（例えば結合相手分子）を
持っている。検定アレー支持体は、検定アレー支持体の結合相手分子が多リガン
ドコンジュゲート上の対応する結合リガンドと結合するのに適当な条件下で、結
合に近い状態とすることができ、したがって、マスターアレー−多リガンドコン
ジュゲート−検定アレー支持体という形の、一時的な「サンドイッチ」構造が形
成される。
【００１８】 選択し得る好ましい態様では、本発明に係る多リガンドコンジュゲートは、重
合性の基（例えば、アクリルまたはビニル基）をさらに含む。この態様では、マ
スターアレーのアドレスオリゴヌクレオチドが多リガンドコンジュゲートの各第
一結合ドメインとそれぞれハイブリダイズしたならば、当分野の技術内で試薬お
よび条件を用いて、重合性の基を反応させ、ポリマーフィルムを形成させる。こ
の重合性の基は、それらのそれぞれの位置を実質上保ちつつ、フィルム補強物に
共重合する。このフィルムはそのまま使用でき、または、空間的に規定された各
「アドレス」の位置を維持するのに充分安定である（例えば自立的）よう、所望
により安定化（例えば、ゲル化、別の層と共にラミネート化、またはその他の方
法で固化）することができる。同時にまたはその後に、このポリマー補強物は、
コンジュゲートの所望方向を維持するやり方で、検定アレー表面に移動させ、ま
たはその中に組み入れることができる。
【００１９】 いったん「サンドイッチ」構造が形成されたならば、検定アレーを、それに結
合した多リガンドコンジュゲートと共に除去するため、（マスターアレーの）ア
ドレスオリゴヌクレオチドおよび（コンジュゲートの）相補的オリゴヌクレオチ
ドの間の塩基対を解離させることができる。このコンジュゲートは、マスターア
レー表面へのそれらの当初の結合により確立されたものに充分該当するような空
間関係で結合し、それにより、標的核酸の位置の維持および決定が可能となる。
その後、マスターアレーは、繰り返し、且つ同様の方法で再使用でき、さらなる
、そして実質上同一の検定アレーを提供することができる。別の態様において、
本発明は、例えば共通のマスターアレーを複製し、または１以上の検定アレーを
連続的に複製することにより形成される、複数の同一の検定アレーを提供する。
【００２０】 さらに別の態様では、本発明は、マスターアレーを最初に調製または複製する
必要なしに、再使用可能な核酸アレーを直接製造する方法および系を提供する（
例えば、ここでこの検定アレー表面は、光ファイバーアレーの形で提供される）
。一つのこのような態様では、相補的核酸にハイブリダイズするよう適合させた
核酸が、検出可能なやり方でファイバーの各々に供される。このような態様での
使用に適当なファイバーアレーは、例えば(K.Michael等)、Analytical Chem. 70
(7):1242(1998)に記載されている。
【００２１】 本発明に係る検定アレーはまた、生体試料中の多岐にわたる核酸の検出に適合
させるのが好ましい。その使用過程においては、標的核酸を、ハイブリダイゼー
ションによって、それらの対応する、検定アレー上のオリゴヌクレオチド結合ド
メイン相補物と結合させるのに適当な条件の下で、１以上の標的核酸（例えば、
遺伝子または遺伝子フラグメント）の含有が疑われる被検溶液に、検定アレーを
暴露させることができる。検定アレー上に標的核酸が存在するかしないかは、選
択されたシグナル生成および検出系を用いて決定することができる。
【００２２】 本発明に係る系は、例えば、核酸プローブ密度、使用の容易性、再生産可能性
、および低減されたコストといったような性質のうち最適の組み合わせを包含す
る、現行方法に勝る幾つかの利点を提供する。本発明は、例えば、現在写真平版
に頼っている商業的アプローチよりも高い核酸プローブ密度を提供することがで
きる。このようなプローブ密度は、例えば写真平版光線系の波長よりも小さいマ
イクロビーズの使用によって達成する。さらに、本発明は、例えば、現在写真平
版合成によって取得できるものより長い（そしてそれ故に結合に関してより特異
的な）オリゴヌクレオチドを使用することにより、改善された検定特異性を提供
することができる。
【００２３】 その上、本発明に係る検定アレーは、常套的アレー読み取り機と共に使用して
、例えば固定化されたアレーの領域密度に応じた、様々な標的核酸能力を提供す
ることができる。この系はさらに、高密度アレースライドの製造コストを著しく
低減することができる。マスターアレーを製造するコストは、例えば所望により
マイクロビーズを使用する、アドレスオリゴヌクレオチド配列のパターン化され
た沈着および固定化を用いることによって、それ自身低減させることができる。
【００２４】 好ましい態様において、この系は、複数の異なるアドレスオリゴヌクレオチド
を含む専用のマスターアレーを使用する。このようなアレーの支持体表面は、安
定性、寸法、形、および表面の滑らかさといったような望ましい性質の最適な組
み合わせを提供する任意の適当な材料から製造することができる。アドレスオリ
ゴヌクレオチドは、この支持体表面に、直接、またはリンカーを介して（例えば
、該表面、オリゴヌクレオチド、またはその両者に相互反応性基を提供しそして
／または該表面、オリゴヌクレオチド、またはその両者を相互反応性基で誘導体
化することにより）結合させることができる。特に好ましい態様において、マス
ターアレー支持体表面を複数の結合マイクロビーズで被覆し、次いでこれらはオ
リゴヌクレオチドをそこに結合させる。よって、結合マイクロビーズと組み合わ
せて使用する場合、マスターアレー支持体表面には、好ましくは、結合マイクロ
ビーズの半径よりも形状的な凹凸が小さくなるような、充分な滑らかさが提供さ
れる（例えば、凹凸はマスターアレーの結合マイクロビーズの直径の５０％以下
である）。
【００２５】 この種のマスターアレー支持体表面は、好ましくは少なくとも第一表面を有す
る平面の非多孔性固体支持体の形で提供される。複数の異なるオリゴヌクレオチ
ドを、この固体支持体の第一表面に、１００の異なるオリゴヌクレオチド／cm2
を超える密度で、そして好ましくは１０００の異なるオリゴヌクレオチド／cm2
を超える密度で結合させることができる（ここで、この異なるオリゴヌクレオチ
ドの各々は、前もって規定された異なる領域で固体支持体表面に結合し、異なる
決定可能な配列を有し、そして少なくとも４ヌクレオチド長、好ましくは少なく
とも１０ヌクレオチド長、より好ましくは３０ヌクレオチド長である）。このオ
リゴヌクレオチドは、マスターアレー上に適当な多様性の「アドレス」を提供す
るに充分な長さで提供され、同時に該検定アレーにより検出される標的核酸配列
（例えば天然に存在する）に対する実質的な相補性を回避している。
【００２６】 好ましい態様において、マスターアレーは、固体支持体の第一表面に結合した
少なくとも１０００、より好ましくは少なくとも１００００の異なるアドレスオ
リゴヌクレオチドを含んでおり、その各々は、他の領域とは物理的に離れた、前
もって規定された領域に位置して（例えば点在して）いる。各々のオリゴヌクレ
オチドの多部位を選択すると、一つのアレー中のオリゴヌクレオチド部位の総数
はしばしば１００００を超える。
【００２７】 マスターアレーは、例えば生物学的または非生物学的、有機または無機材料を
包含する任意の適当な材料から製造することができる。例えば、マスターアレー
は任意の適当なプラスチックまたはポリマー、シリコン、ガラス、セラミック、
または金属から製造でき、固体、樹脂、ゲル、硬質フィルム、または可撓性膜の
形で提供することができる。適切なポリマーは、ポリスチレン、ポリ(アルキル)
メタクリレート、ポリ(ビニルベンゾフェノン)、およびポリカーボネートを包含
する。好ましい材料は、ガラスおよびシリコンを包含する。特に好ましい態様に
おいて、マスターアレーは、平面寸法が、約１／２cmおよび約７.５cmの間の長
さ、そして約１／２cmおよび７.５cm、好ましくは約１および２cmの幅で提供さ
れる。アレーはまた、他の支持体、例えば顕微鏡スライド（例えば約７.５cmｘ
２.５cmの寸法を有する）上に１個、または複数個を置くことができる。
【００２８】 マスターアレーの支持体表面はさらに、該表面上に光反応性二官能性または多
官能性試薬を均一に分布させ、その後これらの試薬を該表面に結合させることに
よって製造できる。或る態様では、例えば、充分な滑らかさを有するシリコンチ
ップを清浄化し、光反応性有機シロキサン試薬と反応させる。この試薬は、例え
ば市販の有機シロキサン試薬（例えばアミノプロピルジメチルメトキシシロキサ
ン）を、ベンゾイル安息香酸の酸クロリドといったような熱化学的に反応性の光
試薬と結合させることによって製造することができる。得られた光反応性シロキ
サン試薬を次いでマスターアレー支持体の酸化珪素表面と反応させ、光活性化し
得る基を備えた滑らかな表面を得る。得られたプライミングされた表面上の光反
応性基を活性化し、直接的に、またはリンカーにより間接的に、該表面を被覆す
るのに使用することができる。
【００２９】 別の態様では、潜在的反応性（例えば光反応性）基およびリガンド誘引性（例
えば、荷電した、カチオン性）基の両者を有する溶融または濃縮した試薬の溶液
を使用することができる。例えば、１以上の両タイプの基を有するポリスチレン
誘導体（例えば、ポリビニル安息香酸のチオコリン誘導体）をマスターアレー表
面に沈着させて、アドレスオリゴヌクレオチドの固定化のための反応性表面フィ
ルムを得ることができる。マスターアレーの表面を照射して滑らかな光反応性表
面を作り出すことができる。所望により、リガンド誘引性基（例えばカチオン／
チオコリン）を除去する。
【００３０】 本明細書中使用する「アドレスオリゴヌクレオチド」という語は、試験される
生物学的試料中に存在する標的核酸配列に対し非相補的であるよう選択された核
酸配列を指すのに用いられる。結果として、このアドレスオリゴヌクレオチドは
、特定の生物学的被検試料中に見出されるいかなる標的核酸とも塩基対を形成し
ない、またはその他の形でハイブリダイズしないと予想され、それにより、バッ
クグラウンドの、または偽陽性の読み取りの可能性が回避または最小化される。
好ましくは、これらのアドレスオリゴヌクレオチドは、１０および１００ヌクレ
オチド長の間であり、最も好ましくは２０および５０ヌクレオチド長の間である
。
【００３１】 マスターアレー表面へのアドレスオリゴヌクレオチドの沈着は、例えば直接結
合、またはリンカー（例えば結合マイクロビーズ）を介した間接的結合を包含す
る任意の適当な方法で達成することができる。例えば、アドレスオリゴヌクレオ
チドが、マイクロビーズ（これは後にマスターアレーに結合させることになる）
に結合するならば、沈着は重力に基づく方法により達成でき、ここでマイクロビ
ーズの比重が、アドレスオリゴヌクレオチドを有する個々のマイクロビーズをマ
スターアレー表面に接触させるようにする。この沈着が、マスターアレー表面に
、順序だった、それでいてランダムなパターンを形成する。次に、得られた表面
を、光反応性基を活性化するのに適当な条件の下で照射し、アドレスオリゴヌク
レオチドを有するマイクロビーズとマスターアレー支持体表面との間に結合を形
成させる。
【００３２】 特に好ましい態様では、光活性化可能化合物を用いてマスターアレー表面にオ
リゴヌクレオチドを固定化し、アドレスオリゴヌクレオチドとマスターアレー支
持体表面との間に結合を形成させる。これらの光活性化可能化合物は、例えばマ
スターアレー支持体表面またはアドレスオリゴヌクレオチド自身により、任意の
適当なやり方で提供し得る。一つの態様において、例えば、アドレスオリゴヌク
レオチドとの結合形成のための潜在的反応表面を得るために、マスターアレー支
持体表面を、光反応性（例えば光シロキサン）試薬で被覆する。その後、複数の
アドレスオリゴヌクレオチドを含有する溶液をこのマスターアレー支持体表面に
適用することができる。このマスターアレーを、長波長紫外光または可視光で照
射して、アドレスオリゴヌクレオチドをマスターアレー支持体表面に光化学的に
固定する。これに代わる態様においては、アドレスオリゴヌクレオチド自身が光
反応性である。
【００３３】 好ましくは、本発明に係るアドレスオリゴヌクレオチドは、これに直接または
間接的に共有結合した、１以上の懸垂する潜在的反応性（好ましくは光反応性）
基を含む。光反応性基は本明細書に定義されており、好ましい基は、それらがか
かる性質を保持する条件下で充分安定に保存される。例えば、米国特許第５００
２５８２号を参照されたく、その内容は引用により本明細書の一部とする。電磁
スペクトルの様々な部分に反応する潜在的反応性基を選択することができ、紫外
および可視部のスペクトルに反応する（本明細書中「光反応性」と称する）もの
が特に好ましい。
【００３４】 光反応性基は、適用された特異的外部刺激に応答して、例えば同一または異な
る分子により提供される隣接化学構造との間に生成される共有結合を伴う活性種
の生成を受ける。光反応性基は、保存条件の下ではそれらの共有結合が変化しな
いが、外的エネルギー源により活性化されると他の分子との共有結合を形成する
分子中にある、原子群である。
【００３５】 光反応性基は、電磁エネルギーを吸収する時、フリーラジカルのような活性種
、ならびに特にニトレン、カルベン、および励起状態のケトンを生成する。光反
応性基は、電磁スペクトルの様々な部分に反応するよう選択され、例えば紫外お
よび可視部分のスペクトルに反応する光反応性基が好ましく、本明細書では時に
「光化学的基」または「光基」と称することがある。
【００３６】 光反応性アリールケトン類、例えばアセトフェノン、ベンゾフェノン、アント
ラキノン、アントロン、およびアントロン様ヘテロ環（即ち、Ｎ、Ｏ、またはＳ
を１０位に有するもののようなアントロンのヘテロ環類似体）、またはこれらの
置換（例えば環上置換された）誘導体が好ましい。好ましいアリールケトン類の
例は、アクリドン、キサントン、およびチオキサントンを包含するアントロンの
ヘテロ環誘導体、ならびにそれらの環上置換誘導体を包含する。チオキサントン
、および励起エネルギーが約３６０nmより大であるその誘導体が特に好ましい。
【００３７】 このようなケトンの官能基は、それらが本明細書に記載の活性化／不活性化／
再活性化サイクルを容易に受けることができるため、好ましい。ベンゾフェノン
は、項間交差を受けて三重項状態となる励起一重項状態の初期形成を伴う光化学
的励起が可能であるため、特に好ましい光反応性基である。励起した三重項状態
は、水素原子の引き抜き（例えば支持体表面から）により炭素−水素結合中に挿
入され、したがってラジカルペアを作り出す。その後のラジカルペアの崩壊は、
新たな炭素−炭素結合の形成を導く。反応性結合（例えば炭素−水素）が結合の
ために利用できない場合、紫外光により誘発されるベンゾフェノン基の励起は可
逆的であり、この分子はエネルギー源の除去時に基底状態のエネルギーレベルに
戻る。ベンゾフェノンおよびアセトフェノンといった光活性化可能アリールケト
ン類は、水中で複数の再活性化を受け、よって増大した被覆効率を提供するため
、とりわけ重要性を有する。
【００３８】 アジド類は光反応性基の好ましいクラスを構成し、これらには、アリールアジ
ド類（Ｃ６Ｒ５Ｎ３）、例えばフェニルアジドおよび特に４−フルオロ−３−ニ
トロフェニルアジド、アシルアジド類（−ＣＯ−Ｎ３）、例えばベンゾイルアジ
ドおよびｐ−メチルベンゾイルアジド、蟻酸アジド類（−Ｏ−ＣＯ−Ｎ３）、例
えばアジド蟻酸エチル、アジド蟻酸フェニル、スルホニルアジド類（−ＳＯ２−
Ｎ３）、例えばベンゼンスルホニルアジド、ならびにホスホリルアジド類（ＲＯ
)2ＰＯＮ３、例えばジフェニルホスホリルアジドおよびジエチルホスホリルアジ
ドが包含される。ジアゾ化合物はもう一つの光反応性基のクラスを構成し、これ
らには、ジアゾアルカン類（−ＣＨＮ２）、例えばジアゾメタンおよびジフェニ
ルジアゾメタン、ジアゾケトン類（−ＣＯ−ＣＨＮ２）、例えばジアゾアセトフ
ェノンおよび１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン、ジアゾア
セテート類（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ２）、例えばジアゾ酢酸ｔ−ブチルおよびジア
ゾ酢酸フェニル、ならびにβ−ケト−α−ジアゾアセテート類（−ＣＯ−ＣＮ２ −ＣＯ−Ｏ−）、例えばα−ジアゾアセト酢酸ｔ−ブチルが包含される。その他
の光反応性基には、ジアジリン類（−ＣＨＮ２）、例えば３−トリフルオロメチ
ル−３−フェニルジアジリン、ならびにケテン類（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）、例えばケ
テンおよびジフェニルケテンが包含される。
【００３９】 光反応性基が活性化すると、この試薬分子は互いに、そして／または該光反応
性基の残基を介して共有結合により材料表面に共有結合する。光反応性基および
活性化時のそれらの残基の例は以下の通りである。
【００４０】 光反応性 基 残基の官能性 アリールアジド アミン R-NH-R’ アシルアジド アミド R-CO-NH-R’ 蟻酸アジド カルバメート R-O-CO-NH-R’ スルホニルアジド スルホンアミド R-SO2-NH-R’ ホスホリルアジド ホスホルアミド (RO)2PO-NH-R’ ジアゾアルカン 新しいＣ−Ｃ結合 ジアゾケトン 新しいＣ−Ｃ結合およびケトン ジアゾアセテート 新しいＣ−Ｃ結合およびエステル β−ケト−α−ジアゾ 新しいＣ−Ｃ結合およびβ−ケトエステル アセテート 脂肪族アゾ 新しいＣ−Ｃ結合 ジアジリン 新しいＣ−Ｃ結合 ケテン 新しいＣ−Ｃ結合 光活性化ケトン 新しいＣ−Ｃ結合およびアルコール
【００４１】 本発明に係る光活性化可能核酸は、炭素−水素結合を有するいかなる表面にも
適用でき、光反応性基はこれと反応して当該核酸を表面に固定化することができ
る。好適な支持体の例は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）
、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）、パリレンおよびガラスま
たはその他の無機表面の前処理に使用される複数の有機シランのうち任意のもの
を包含するが、これらに限定される訳ではない。光活性化可能核酸は整列させて
表面にプリントし、次いで均一な照射により光活性化し、それらを特異的パター
ンで該表面に固定化することができる。さらにこれらは該表面に連続して均一に
適用し、次いで一連のマスクを用いて照射することにより光活性化して、特定の
領域に特定の配列を固定化することもできる。したがって、異なったマスクを用
いる複数の照射により特定の光誘導体化核酸を多数回連続適用し、それぞれの光
カップリング工程の後に注意深く洗浄して未結合の光核酸を除去すると、固定化
した核酸のアレーを製造することができる。さらに光活性化可能核酸は、適用お
よび光固定化により、表面に均一に固定化することができる。
【００４２】 マスターアレー支持体表面へのアドレスオリゴヌクレオチドの固定化は、例え
ばアドレスオリゴヌクレオチドを担持したマイクロビーズを、光反応性表面の特
定のアドレスに位置させることによっても達成することができる。マイクロビー
ズは、例えば静電引力、電極または磁気プローブ、または光学的ピンセットのよ
うな技術によって位置させることができる。
【００４３】 より好ましくは、アドレスオリゴヌクレオチドを含む結合マイクロビーズは、
マスターアレー支持体表面に、一定の間隔をあけて固定化する。係る態様におい
て、マイクロビーズをばらばらに、但し規則正しい配置で該表面に沈着させるこ
とを促進するために、ビーズの直径よりわずかに大きな隙間を有する、作り上げ
られたスクリーンを、マスターアレー表面として使用、またはマスターアレー表
面上に位置させることができる。
【００４４】 アドレスオリゴヌクレオチドの固定化のためのその他の適当な方法は、オリゴ
ヌクレオチドの化学的修飾（例えばチオール修飾）、および高親和性結合剤によ
る非共有結合（例えばアビジン−ビオチン）を包含する。そして、オリゴヌクレ
オチド自身または適当な架橋試薬により供給される対応する反応性基を結合する
ため、マスターアレー支持体の表面を誘導体化（例えばアミン基により）するこ
とができる。別法として、結合相手（例えばストレプトアビジン）をマスターア
レー支持体表面に直接結合させて、アドレスオリゴヌクレオチドおよびマスター
アレーの支持体表面の間の相互作用を誘導することもできる。その他の方法には
、非修飾または修飾オリゴヌクレオチドの吸着、およびインクジェットによる支
持体表面へのオリゴヌクレオチドの固定化、または活性化されたマスターアレー
支持体表面上での可溶性プローブの熱化学的固定化による「ニードル」プリンテ
ィングが包含される。
【００４５】 本発明に係る典型的なマスターアレーは、それぞれ別々の位置またはアドレス
にある、表面に固定化された膨大な数のアドレスオリゴヌクレオチドを含んでい
る。この意義において使用する「アドレス」という語は、結合しているオリゴヌ
クレオチドが同定および識別できるに充分な程はっきりしている、支持体表面の
空間的に規定された位置を指す。この固定化された結晶状アレーの所産は、その
表面に複数の特異な「アドレス」を含むマスターアレーを提供する。
【００４６】 本発明の特に好ましい態様において、マスターアレー支持体表面は、そこに固
定化された重複するアドレスオリゴヌクレオチドを含んでおり、その結果、或る
アドレスが、マスターアレー上の空間的に規定される複数の位置に出現する。こ
の重複の結果、特異的アドレスオリゴヌクレオチドに対し相補的な配列を含む特
定の多リガンドコンジュゲートが、マスターアレー上の複数の位置のうちいずれ
の位置にも結合することができる。この、マスターアレー上の任意のアドレスの
重複は、試料中の対応する標的核酸の検出のための検定感度を上げる役割を果た
す。例えば、或る態様では、マスターアレーは、１および１００の間、好ましく
は２および１０の間の異なる位置に、支持体表面に固定化されたアドレス配列を
含むであろう。故にこのような好ましい態様では、重複するアドレスに関連する
標的核酸の検出は、マスターアレー上の幾つかの異なった位置でなされるであろ
う。
【００４７】 上に記載した或る態様では、アドレスオリゴヌクレオチドは固定化された形で
、例えば複数の同一「アドレス」オリゴヌクレオチド配列を有する個別的結合マ
イクロビーズの形で提供することができる。一つのこのような態様では、アドレ
スオリゴヌクレオチドを担持した結合マイクロビーズの組織的アレーを、光反応
性基を備えた滑らかなマスターアレー支持体表面上に沈着させることができる。
【００４８】 結合マイクロビーズは市販品を入手でき、入手可能な市販の方法および材料を
使用することにより、オリゴヌクレオチドを担持することができる。好ましくは
、結合マイクロビーズは、それらが重力によってマスターアレー表面に落ち着く
（ブラウン運動の影響を回避しつつ）のに充分な比重を有するよう選択する。結
合マイクロビーズへのアドレスオリゴヌクレオチドの結合は、好ましくはオリゴ
ヌクレオチドおよびビーズ間の共有結合の形成によって達成される。特に好まし
い態様においては、結合マイクロビーズの表面は、熱化学的反応性基を含む有機
シロキサン試薬と反応する（例えばエポキシ）。例えばグリシドキシプロピルト
リエトキシシロキサンはマイクロビーズと反応してエポキシ表面を提供すること
ができる。次に、アドレスオリゴヌクレオチドの５’末端を修飾して、スペーサ
ー上にアルキルアミン基を含む末端を生成させる。マイクロビーズ表面のエポキ
シシロキサンはアドレスオリゴヌクレオチドの末端に位置するアルキルアミンと
反応し、アドレスオリゴヌクレオチドおよびマイクロビーズ表面の間に結合を形
成する。
【００４９】 マイクロビーズのアレーは、所望により、分子上に光反応性基およびリガンド
誘引性基（例えば第四アミンのようなイオン性基）の両者を有するブロックコポ
リマーを含有する、水性懸濁液から沈殿し得る。前もってアドレスオリゴヌクレ
オチドを担持した単分散マイクロビーズ（例えば直径が約１／２ミクロンおよび
５ミクロンの間）を、このコポリマーの水溶液中で、懸濁液由来のマスターアレ
ー支持体表面に適用する。カチオン性反応性基は、ビーズ上のオリゴヌクレオチ
ド配列と結びつく役割を果たし、一方芳香族ブロック（例えばオリゴスチレン）
は、光反応性表面と結びつき結合する役割を果たす。特に好ましい態様では、こ
の結合マイクロビーズはわずかに過剰に提供される。
【００５０】 滑らかで平らな光反応性マスターアレー支持体表面を、マスターアレー支持体
表面上に少なくとも単層の結合マイクロビーズを供給するに充分な数で、アドレ
スオリゴヌクレオチド配列を固定化した結合マイクロビーズのスラリーに暴露す
る。このスラリーは、各々の所望アドレスオリゴヌクレオチド配列とほぼ同数の
ビーズと、オリゴヌクレオチドを含まない多数（例えば少なくとも３倍）のビー
ズを加えたもので構成される。オリゴヌクレオチドで被覆されたビーズの数は、
各々の標的核酸に特異的な部位を小過剰（例えば少なくとも３倍）で提供するに
充分である。
【００５１】 光基の早期活性化を回避するため、結合マイクロビーズを含有する溶液中、暗
所または減光の下でマスターアレーをインキュベートする。溶媒（好ましくは水
性）が光反応性表面上のスラリープールから蒸発するにつれて、均一な大きさの
ビーズが、例えば本明細書に記載のマイクロスクリーンを用いて、所望により、
間隔の離れた二次元「結晶性」配置内に納められる。
【００５２】 次にこの規則正しい配置を、例えば乾燥状態での照射により、所定の位置に「
固定」し、マスターアレー支持体表面上の光反応性基および結合マイクロビーズ
上の有機基（大抵はオリゴヌクレオチド）の間に炭素−炭素結合を形成させる。
重力により光反応性表面上に落ち着いたビーズのパターン化したアレーは、長波
長紫外光または可視光での照射により、該表面に光化学的に固定することができ
る。この照射は、光反応性有機シロキサン試薬を活性化し、次にアドレスオリゴ
ヌクレオチドとの結合を形成する。所望により、整列させた結合マイクロビーズ
がマスターアレー支持体表面にいったん光結合したならば、未結合のブロックコ
ポリマーはマスターアレーから洗い流して良い。この洗浄は、ビーズの外側にお
けるその後のオリゴヌクレオチド配列との干渉（例えば、ハイブリダイゼーショ
ン工程中の）を排除する。
【００５３】 次に、各々の固定化されたアドレスオリゴヌクレオチドの空間規定位置を、適
当な手段、例えば、蛍光標識した相補的配列をアレーに連続的に添加し、その後
各添加の間にすすぎおよびスキャンを行うことを含む、蛍光ハイブリダイゼーシ
ョンを用いて決定する。各アドレスオリゴヌクレオチド配列に対し相補的な蛍光
標識化オリゴヌクレオチドは、入手可能であるか、または互いに識別可能である
ことが一般的にわかっている幾つかの（例えば１０以上）異なる蛍光化合物のう
ちの一つを含むよう合成することができる。該表面上のアドレス配列に対し相補
的である、異なった既知の配列をそれぞれ有し、且つ対応する識別可能な発蛍光
団をそれぞれ有する、複数（たとえば１０）の異なるオリゴヌクレオチドを製造
することができる。標識化したプローブを該表面に同時に適用し、例えば５５℃
で３０分間ハイブリダイズする。次にこの表面をすすぎ、スキャンして、１０個
の配列のそれぞれの位置を同定する。次いで別の１０配列の組を該表面とハイブ
リダイズし、第二の１０配列の組を同定する。このプロセスを、全てのアドレス
が同定されるまで続け、その後、例えば沸騰水に２分間浸漬することにより、ハ
イブリダイズしたオリゴヌクレオチドからマスターアレーをはずし、複製検定ア
レーの製造に使用する。
【００５４】 本発明の好ましい系は、さらに、複数の活性（例えば結合または重合性）ドメ
インを含む多リガンドコンジュゲートを包含する。本発明に従い、一つ一つのリ
ガンドを、任意の適当な方法および／または順序で、例えば個別的にまたは一諸
に（例えば、直線配列中、且つ一つの位置で、または複数の位置で）、コア原子
または分子に結合させることができる。例えば、或る態様において、リガンドは
、例えば類似の反応条件下で、コアに同時に結合させる。所望により、マスター
アレーのアドレスオリゴヌクレオチドと多リガンドコンジュゲートにより供給さ
れる相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの後に、第三リ
ガンドとしての役割を有するリガンドをコアに結合させる。この態様では、第三
リガンドは別の試薬として存在するが、第三リガンドの結合は、第一および第二
結合ドメインと同一または類似の反応条件の下で起こり得る。さらに別の態様に
おいて、リガンドの各々は別々の反応の別々の条件下でトランスファーコアに結
合する。
【００５５】 これらリガンドが多リガンドコンジュゲートのコアに結合する順序は本発明に
とって決定的なものではなく、個々の活性（例えば結合）ドメインがそれらの特
異的相補体に結合するために利用できる限り、それらは任意の順序でコアにまた
は互いに結合することができる。特に好ましい態様において、個々の結合ドメイ
ンは、該表面上の複数の位置で、それぞれ個別的にコアに結合する。
【００５６】 所望により、多リガンドコンジュゲートのコアは、それ自身トランスファーマ
イクロビーズの形で提供される。多リガンドコンジュゲートの製造にとって有用
なマイクロビーズは、「結合マイクロビーズ」に関して上に記載したものと同じ
多様性を有していて良い。好ましいビーズは、望ましくは球形であり、大きさが
均一であり、水より大きな比重を有する。また、好ましいビーズは、有機試薬と
結合する、化学的組成または少なくとも表面を有する。例えば、約０.５ミクロ
ンおよび約５ミクロン（μ）の間の直径の均質なシリカ球体は、結合リガンドの
対応する基と該試薬を結合させるため、熱化学的反応性基（例えばエポキシ）を
含む有機シロキサン試薬と反応することができる。
【００５７】 一つのこのような態様では、例えばグリシドキシプロピルトリエトキシシロキ
サンを、公表されている反応条件下でガラスマイクロビーズと反応させ、エポキ
シガラス表面を得る。それぞれスペーサー上のアルキルアミン基で終了している
、本発明に係る３個の結合ドメインは、このビーズ表面のエポキシ基と容易に結
合することができる。
【００５８】 第一および第二オリゴヌクレオチド結合ドメインは、任意の適当な方法でトラ
ンスファーマイクロビーズに結合させることができ、例えば、アルキルアミンで
終止している結合ドメインを合成し、熱化学的に結合させることができる。第一
および第二オリゴヌクレオチド結合ドメインについて、オリゴヌクレオチドの長
さは、所望のハイブリダイゼーション強度および速度に関して最適化する（通常
２０〜５０ヌクレオチドの範囲）。第一結合ドメインは、マスターアレー支持体
表面上に固定化されたアドレスオリゴヌクレオチドに対し相補的なオリゴヌクレ
オチドを含み、一方第二結合ドメインは、被検試料中にあることがわかっている
またはそれが疑われる選択された標的核酸に対し相補的である。好ましくは、第
一結合ドメインの配列は、互いに、または、生体試料中に存在する可能性が有意
にある、既知のいかなる天然遺伝子配列および／または遺伝子フラグメントとも
相補的でない。結果として、第一結合ドメインオリゴヌクレオチド配列は、マス
ターアレー支持体表面に固定化されているそれら各々の相補的アドレスオリゴヌ
クレオチド配列のみとハイブリダイズするであろう。このことにより、第一結合
ドメイン（これは、多リガンドコンジュゲートを検定アレー支持体表面の空間規
定位置に位置させる原因となっている）と、被検試料中でスクリーニングされる
標的核酸配列との間の交差反応性（例えば交差ハイブリダイゼーション）が回避
される。
【００５９】 マスターアレーのアドレスオリゴヌクレオチドを含むランダム配列に対し相補
的な配列を調製することにより、第一結合ドメインのためのオリゴヌクレオチド
を選択する。この調製は、当分野で既知の任意の適当な方法、例えば固相ＤＮＡ
合成を用いて達成することができる。第一結合ドメインのためのオリゴヌクレオ
チドが合成されたならば、各オリゴヌクレオチドの末端を修飾して、スペーサー
上にアルキルアミン基を含むようにすることができる。
【００６０】 本発明に従い組み立てられるマイクロアレーにより検出される標的核酸（例え
ば遺伝子および／または遺伝子フラグメント）を最初に選択することにより、第
二結合ドメインのためのオリゴヌクレオチドを選択する。これらの遺伝子および
／または遺伝子フラグメントの配列は既知であるか、または当分野でよく知られ
る技術（例えば、サンガージデオキシ法、ＰＣＲ配列決定等）を用いて決定する
ことができる。第二結合ドメインが選択されたならば、各オリゴヌクレオチドの
末端を、スペーサー上にアルキルアミン基を含むよう、修飾することができる。
【００６１】 第三リガンド（例えば結合ドメインまたは重合性の基）は任意の適当なタイプ
であってよく、任意の適当な方法で、コアまたはトランスファーマイクロビーズ
に結合させることができる。好ましい態様において、例えば第三リガンドは、ビ
オチン−ポリ(アルキレンオキシド)アミン誘導体の形で提供される。かかる誘導
体は、例えばビオチンのＮ−オキシスクシンイミドエステルを、同じコアまたは
マイクロビーズ上に置かれるオリゴヌクレオチド誘導体とほぼ同じ分子長のポリ
(エチレンオキシド)ジアミンと反応させることによって製造することができる。
【００６２】 多リガンドコンジュゲートは、生体試料中に見出され、既知の、または決定可
能な配列を有する任意の所望標的核酸に対し相補的であり、よってこれとハイブ
リダイズするであろうオリゴヌクレオチドを含むよう、組み立てることができる
。或る態様において、本発明に係る多リガンドコンジュゲートの様々な第二結合
ドメインは、生体試料中に見出される様々な標的核酸に対し相補的な幅広いオリ
ゴヌクレオチドのアレーを含むことができる。
【００６３】 これに代わる態様では、多リガンドコンジュゲートの第二結合ドメインは、得
られる検定アレーが、天然に存在する遺伝子の特定のファミリーの標的核酸を配
置させるよう、組み立てられる。この特別の態様の一つの例は、嚢胞性線維症の
５０〜６０個の既知標的配列に対し相補的な第二結合ドメインを含む多リガンド
コンジュゲートの組である。よって、得られる検定アレーは、この疾患のみに結
びついていることがわかっている配列の存在を検出するよう、組み立てられる。
【００６４】 本発明に係る多リガンドコンジュゲートの第三リガンドは、所望により対応す
る結合相手と結合を形成するよう適合させた結合リガンドを含む。この第三リガ
ンドは、コアまたは多リガンドコンジュゲートのトランスファーマイクロビーズ
に直接結合し、またはスペーサーの使用により間接的に、該リガンドの立体障害
（例えば、リガンドがトランスファーマイクロビーズの近傍にあることによって
惹起される立体障害）を免れさせるようなやり方で結合することができる。換言
すれば、第三リガンドを結合させるためのスペーサーの使用は、リガンドがコア
またはトランスファーマイクロビーズの表面から充分遠くにあることを確実とし
、望ましい機能（例えば検定アレー表面上に含まれる対応する結合相手との重合
またはこれとの結合）を発揮するようにさせるのである。特に好ましい態様にお
いて、第三リガンドは、結合ドメインが立体障害を免れるに充分な長さの親水性
スペーサー、例えばポリエチレングリコールスペーサーを介して、コアまたはト
ランスファーマイクロビーズに結合する。
【００６５】 別の態様では、第三リガンドは、多リガンドコンジュゲートのマイクロビーズ
またはコアに結合しているのではなく、溶液で提供される。この態様においては
、マスターアレーアドレスオリゴヌクレオチドとこれに相補的な多リガンドコン
ジュゲートの第一結合ドメインとがハイブリダイズした後に、第三リガンドが組
み入れられる。故に、この態様では、多リガンドコンジュゲートの結合後に、そ
して検定アレーがマスターアレーとの結合に近い状態とされる前に、第三リガン
ドは、マスターアレー上に形成された複合体中に組み込まれる。好ましくは、第
三リガンドの付加は、第一および第二結合ドメインと異なる反応条件を必要とせ
ず、第三リガンドの付加は同一の条件下で起こり得る。
【００６６】 好ましい態様において、第三リガンドは光反応性化学を用いて多リガンドコン
ジュゲートに結合させる。この態様では、光反応性化合物との反応のための表面
を調製するため、マイクロビーズの表面を、例えば有機シロキサンで前処理する
。この態様において、第三リガンドは親水性スペーサーと結合し、次いでこれが
光反応性基に結合する。光反応性基は、スペーサー（結合リガンドに結合してい
る）およびトランスファーマイクロビーズの間に結合の形成をさせる。
【００６７】 本発明がマスターアレー表面に固定化した多孔性結合マイクロビーズの使用を
包含し、かかるマイクロビーズがアドレスオリゴヌクレオチドを結合させている
、別の態様では、多リガンドコンジュゲートのトランスファーマイクロビーズは
必要ない。この態様では、多孔性結合マイクロビーズはマスターアレーの表面に
固定化することができ、各々の多孔性マイクロビーズはその表面に複数のアドレ
スオリゴヌクレオチドを結合させている。この態様では、多リガンドコンジュゲ
ートは、アドレスオリゴヌクレオチドに対し相補的な第一結合ドメイン、生体試
料中に見出される標的核酸配列に対し相補的な第二結合ドメイン、および結合リ
ガンドを含む第三リガンドを含んでいる。多リガンドコンジュゲートはトランス
ファーマイクロビーズではなく化学的（例えば原子または分子）コアを含んでい
る。
【００６８】 複数の多リガンドコンジュゲートをマスターアレーに適用し、マスターアレー
のアドレス配列と、多リガンドコンジュゲート内部にある相補的オリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションをさせるのに適当な条件の下でインキュベート
する。当業者は、温度、塩濃度、および緩衝液組成の適当な条件を決定すること
ができるであろう。これらを適用するためのハイブリダイゼーション条件および
方法の検討のため、Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach、Hame
sおよびHiggins編、1985、を参照されたく、その内容は引用により本明細書の一
部とする。
【００６９】 多リガンドコンジュゲートの第三リガンドは、例えばこのコンジュゲートをマ
スターアレーの正しい位置に置きつつ安定なフィルムを形作るようにするため、
重合性の基の形で提供し得る。適当な重合性の基は、例えばアクリルおよびビニ
ル基を包含する。好ましい態様において、この重合性の基は、添加されるモノマ
ーおよびその他の試薬（例えば開始剤）の存在下で、付加重合を受けるよう適合
させ、安定なフィルムを形成する。重合は、水性フリーラジカル溶液重合、熱へ
の曝露、高エネルギー放射、超音波、紫外線照射、および水溶性または膨潤可能
ポリマーを生成するためのイオン重合触媒を包含する任意の適当な反応を介して
起こり得る。さらに、基の重合は、塩基により触媒される水素移動重合を介して
起こり得る。本明細書の記載が提供された場合、当業者は、かかる基を用いてリ
ガンドと他のモノマーとを共重合させ、対応するコンジュゲートを完全なポリマ
ー構造の形、例えばフィルム補強物とし、次いでこれを検定アレー支持体表面と
して、または検定アレー支持体表面へと移動させるために使用する方法が理解で
きるであろう。
【００７０】 本発明に係る検定アレー支持体は、任意の適当な材料から組み立てて、寸法の
安定性、形、および滑らかさといった性質の最適な組み合わせを得ることができ
る。検定アレーの組立に使用するための好適な材料は、マスターアレー自身のた
めに有用であると記載されたもの、好ましくはシリコンおよびガラスを包含する
。特に好ましい態様において、検定支持体は５０平方μｍの寸法で提供される。
好ましくは、検定アレー支持体は、直接的空間関係を提供するため、マスターア
レーに匹敵する寸法を有する。
【００７１】 別々の検定アレー支持体の表面は、方向性のあるコンジュゲート層の結合を容
易にするため、前処理することができる。好ましい態様において、検定アレーは
、清浄化し、磨き上げ、滑らかな酸化珪素表面を与えるよう処理されたシリコン
チップの形で供される。次にこの酸化珪素表面を有機シロキサン試薬（本明細書
に記載した）で処理して滑らかな光活性化可能な表面を得る。
【００７２】 一つの態様において、本発明に係る検定アレー支持体は、多リガンドコンジュ
ゲートの第三リガンドと結合を形成するよう適合させた結合相手分子で被覆する
ことができる。検定アレー支持体表面は、この表面を光反応性とするための光活
性化可能化合物（例えば光反応性シロキサン試薬）で該表面を被覆することによ
り製造することができる。その後、検定アレー支持体表面を、結合相手分子（例
えばアビジン）を含有する溶液に暴露し、結合相手と検定アレー表面との間に結
合を形成させるため、溶液を照射することができる。所望により、結合相手に暴
露する前および／または後に、検定アレーの表面を、例えば界面活性剤（例えば
ビオチントリブロックコポリマー）を用いて不動態化して、被検試料中に見出さ
れる分子が検定アレー支持体表面に非特異結合することを防ぐ。
【００７３】 特に好ましい態様では、結合相手は検定アレー支持体表面上の単層の形で提供
される。所望により、結合相手は、三次元層の形、例えば１ミクロンまでの厚さ
のアビジン−ヒドロゲル複合体の形で提供することができる。このような構造は
、例えば、光反応性検定アレー表面に、光反応性ヒドロゲル（例えば、ベンゾイ
ルベンズアミドプロピルメタクリルアミドとビニルピロリドンまたはアクリルア
ミドとのコポリマー）を加えたアビジンの溶液を担持させ、湿潤状態のうちに照
射することによって取得することができる。
【００７４】 別の特に好ましい態様では、光ポリマーの薄膜を、寸法に関して安定な検定ア
レー支持体表面に適用する。高い表面密度（例えば０.１pmol/mm2）の高親和性
リガンド基（例えばビオチン）を含有する不動態化している界面活性剤の自己集
合性単層フィルムをこの光反応性表面に適用する。次にこの単層界面活性剤フィ
ルムを該表面に光結合させ、未結合の界面活性剤があればそれを洗い流す。不動
態化した、リガンドをロードした表面を高親和性結合相手分子（例えばＸ−アビ
ジン）で飽和させ、過剰の結合相手を洗い流す。好適な高親和性結合相手分子は
、例えばｘ−アビジンフィルム、または高親和性抗体（例えば抗ジゴキシゲニン
）を包含する。
【００７５】 所望により、この系は、例えば相補的な、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオ
チド（例えば、マスターアレーのアドレスオリゴヌクレオチドおよび多リガンド
コンジュゲートが有している相補的オリゴヌクレオチド）の解離に使用するため
の手段（例えば試薬）を包含する、その他の構成成分をも含む。例えば、ハイブ
リダイズしたＤＮＡを解離させるための好適な手段は、系の温度、pH、または塩
濃度の変更を包含する。
【００７６】 所望により、この系はさらに、特異的アドレスに対する核酸標的のハイブリダ
イゼーションを検出するため、市販品が入手できるスキャナーを含む（例えば、
Molecular Dynamicsより入手できる共焦点蛍光顕微鏡）。
【００７７】 別の態様において、本発明は、核酸アレーを再生産的に製造するための方法を
提供し、当該方法は、 ａ）支持体表面を有するマスターアレーを提供し； ｂ）複数のアドレスオリゴヌクレオチドを、マスターアレー支持体表面上に、
パターン化され、所望によりランダムなアレーの形で固定化し（例えば、直接、
またはそれぞれのリンカーもしくは「結合」マイクロビーズを介して、例えば沈
着および固定させる）； ｃ）固定化されたアドレスオリゴヌクレオチドのパターンを決定および記録し
（例えば、アドレスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのための発
蛍光団に結合させたオリゴヌクレオチドを使用）； ｄ）各々の多リガンドコンジュゲートが、そこに、（ｉ）マスターアレーの或
る特定のアドレスオリゴヌクレオチド配列に対し相補的であるよう選択されたオ
リゴヌクレオチド配列を含む、少なくとも１分子の第一オリゴヌクレオチド結合
ドメイン、（ii）標的核酸配列（例えば、遺伝子および／または遺伝子フラグメ
ント）の特徴的オリゴヌクレオチド配列に対し相補的であるよう選択されたオリ
ゴヌクレオチド配列を含む、少なくとも１分子の第二オリゴヌクレオチド結合ド
メイン、および、（iii）結合リガンドおよび重合性の基（例えば、アクリルま
たはビニル基）より成る群から選ばれる、少なくとも１分子の第三（そして好ま
しくは非オリゴヌクレオチド）リガンド、を（好ましくは独立に）結合させてい
るコアを含む、複数の遊離（即ち、非固定化）多リガンドコンジュゲートを提供
し； ｅ）各アドレスオリゴヌクオレチドを多リガンドコンジュゲートの相補的第一
オリゴヌクレオチド結合ドメインとハイブリダイズさせるのに好適な条件の下で
、多リガンドコンジュゲートをマスターアレー支持体表面と接触させインキュベ
ートし（そして所望により、ハイブリダイズしていない多リガンドコンジュゲー
トを除去し）； ｆ）検定アレー支持体表面を提供し； ｇ）例えば、（重合性の基の形で提供される）第三リガンドを重合することに
より、または、（第三結合リガンドの形で提供される）第三リガンドを、検定支
持体表面により供される対応する結合部位と結合させることにより、コンジュゲ
ートをマスターアレー上のパターンに対応するパターンで検定支持体へと移動さ
せるのに適当な条件下で、ハイブリダイズした多リガンドコンジュゲートを検定
支持体表面と接触させ； ｈ）コンジュゲートを所望のパターンで検定支持体表面上に残存させるような
やり方で、第一結合ドメインをマスターアレー支持体から解離させる、 ことを含む。
【００７８】 使用にあたり、３以上のリガンドを有しているコア（例えばトランスファーマ
イクロビーズ）を同数混合し、水性緩衝液に懸濁する。この懸濁液は、試料中で
の検出が予想される標的核酸の特徴的オリゴヌクヌレオチド配列に対し相補的な
オリゴヌクレオチド配列を持っている各トランスファーマイクロビーズを過剰に
（マスターアレー上のマイクロビーズのハイブリダイゼーション能力以上に）含
有することができる。
【００７９】 マスターアレー表面に、選択された多リガンドコンジュゲート混合物の懸濁液
を注ぎ、固体状態のハイブリダイゼーションを平衡付近まで進行させることがで
きる。次に、ハイブリダイズしたマスターアレーから、過剰の多リガンドコンジ
ュゲートをすすぎにより回収し、結合したコンジュゲートは、共重合して安定な
補強物を形成するか、または検定アレー上の対応する結合相手に結合する。この
後マスターアレーは複製プロセス用に繰り返し利用できる。
【００８０】 このマスターアレーは、対応する検定アレーを製造するために繰り返し使用で
き、一方これは包装し、保管し、そして例えば湿潤または乾燥状態で輸送するこ
とができる。包装を取り去ると、検定アレーはスキャナーによる常套的ハイブリ
ダイゼーション検定プロトコルにすぐ使用することができる。その上、本発明は
、多目的に使用できるマスターアレーを提供するものであり、このマスターアレ
ーを使用および再使用して、同一のアレーを作り出し、またはアレーの機能を変
化させることができる（例えば、標的核酸の特徴的オリゴヌクレオチド配列に対
し相補的なオリゴヌクレオチド配列を変化させ、その結果使用者は、試料中に検
出すべき標的核酸を変えることができる）。
【００８１】 本明細書の記述を与えられた場合、当業者は、入手可能な市販のマイクロアレ
ー自体を本発明に係るマスターアレーとして使用し、１以上の回数複製して、対
応する検定アレーを形成する方法が理解できるであろう。この場合、市販アレー
の個々の核酸は、それらの元々の特異性に関わりなく、単にアドレス配列として
考え、本明細書に記載のやり方で使用して任意の望ましい特異性の検定アレーを
取得できる。
【００８２】 さらに別の態様において、そして特に第三リガンドが第三結合リガンドの形で
提供される態様において、本発明はサンドイッチアレーを提供し、これは、 ａ）複数のアドレスオリゴヌクレオチド配列を固定化（例えば、直接、または
それぞれのリンカーもしくは「結合」マイクロビーズを介して）した、支持体表
面を含むマスターアレー、ここでこのオリゴヌクレオチド配列は、パターン化さ
れ、且つ所望によりランダムなアレーの形に固定化されている； ｂ）各々の多リガンドコンジュゲートが、そこに、（ｉ）各分子が、マスター
アレーの或る特定のアドレスオリゴヌクレオチド配列に対し相補的なオリゴヌク
レオチド配列を含んでいる、第一オリゴヌクレオチド結合ドメインの分子、（ii
）各分子が、標的核酸（例えば、遺伝子および／または遺伝子フラグメント）の
特徴的オリゴヌクレオチド配列に対し相補的なオリゴヌクレオチド配列を含んで
いる、第二オリゴヌクレオチド結合ドメインの分子、および、（iii）結合リガ
ンドおよび重合性の基（例えば、アクリルまたはビニル基）より成る群から選ば
れる、少なくとも１分子の第三（そして好ましくは非オリゴヌクレオチド）結合
リガンド、を（好ましくは独立に）結合させているコアを含んでいる、複数の多
リガンドコンジュゲート、ここで、第一オリゴヌクレオチド結合ドメインは、マ
スターアレー上に固定化されている対応するアドレスオリゴヌクレオチドとハイ
ブリダイズしている；および、 ｃ）第三結合リガンドのための結合部位で被覆されている支持体表面を含んで
いる検定アレー支持体（例えば、第三結合リガンドに特異的な対応する結合相手
である、固定化された分子）、ここで、検定アレーの結合部位は、多リガンドコ
ンジュゲートの対応する結合リガンドに結合している、 を含んでいる。
【００８３】 所望により、さらにサンドイッチアレーは、マスターアレーの表面上に固定化
された結合マイクロビーズを含み、この結合マイクロビーズは複数のアドレスオ
リゴヌクレオチドをここに結合させている。
【００８４】 さらに別の態様において、本発明は、核酸アレーを再生産的に製造するための
１以上の構成成分を含む対応キットであって、該キット構成成分が、 ａ）複数の「アドレス」オリゴヌクレオチド配列を固定化（例えば、直接、また
はそれぞれのリンカーもしくは「結合マイクロビーズ」を介して）した、支持体
表面を含むマスターアレー、ここでこのオリゴヌクレオチド配列は、パターン化
され、且つ所望によりランダムなアレーの形に固定化されている； ｂ）各々の多リガンドコンジュゲートが、そこに、（ｉ）各分子が、マスター
アレーの或る特定のアドレスオリゴヌクレオチド配列に対し相補的なオリゴヌク
レオチド配列を含んでいる、第一オリゴヌクレオチド結合ドメインの分子、（ii
）各分子が、標的核酸配列（例えば、遺伝子および／または遺伝子フラグメント
）の特徴的オリゴヌクレオチド配列に対し相補的なオリゴヌクレオチド配列を含
んでいる、第二オリゴヌクレオチド結合ドメインの分子、および、（iii）結合
リガンドおよび重合性の基（例えば、アクリルまたはビニル基）より成る群から
選ばれる、少なくとも１分子の第三（そして好ましくは非オリゴヌクレオチド）
リガンド、を（好ましくは独立に）結合させているコアを含んでいる、複数の多
リガンドコンジュゲート； ｃ）例えば第三リガンドのための結合部位で被覆されている、複製アレーのた
めの支持体表面を含んでいる検定アレー支持体（例えば、第三結合リガンドに特
異的な対応する結合相手である、固定化された分子）；および、 ｄ）マスターアレー上のアドレスオリゴヌクレオチドの位置および検定アレー
上のハイブリダイズした標的核酸の存在を決定するための、アレー読み取り機、
より成る群から選ばれる、キットを提供する。
【００８５】 さらに別の態様において、本発明は、再使用可能な核酸アレーの形の複製可能
アレーを直接製造するための方法および系を提供する。この態様では、核酸が固
定化される表面は光ファイバーアレーにより提供され、検定アレー支持体表面は
このファイバー自体の遠位末端により提供される。所望により、そして好ましく
は、光ファイバーの遠位末端にマイクロウェルをエッチングする。
【００８６】 かかる態様において、常套的光ファイバー束を、試料中の様々な標的核酸を検
出するための特異的結合アレーバイオセンサー系として使用するために適合させ
ることができる。商業的供給源から、数千（例えば３０００〜１０００００）の
、六面体に束ねられ個別的に被覆された光ファイバーを含む、光画像ファイバー
束が供給されている。アレー中の各々のファイバーは、当該ファイバーの一端か
ら他端まで、自身の隔絶された光シグナルを運ぶ。一つ一つの特異的結合リガン
ドは各ファイバーの一端に結合することができ、他の末端は光シグナル分析機（
例えばＣＣＤカメラ）と機能的に接続している。
【００８７】 ファイバー束の検定末端（特異的結合リガンドを含んでいる）を、未知の標的
および光検定系に必要なその他の試薬（もしあれば）を含有する試料溶液に暴露
する。画像分析系を用いて、束の他端で光シグナルパターンを記録し分析する。
【００８８】 出願人は、標的配列に対し相補的なオリゴヌクレオチド結合ドメインは、任意
の適当な方法、例えば直接的に、または可逆的もしくは不可逆的に結合した結合
分子もしくはマイクロビーズによって、光検定アレー支持体表面に結合させるこ
とができることを見出した。次いで、オリゴヌクレオチド結合ドメインの最終的
な位置が決定され（例えば光学的手段および検定により）、好ましくは管理され
（例えば再使用可能なアドレスドメインの使用により）、そして所望により複製
（例えば可逆的リンカーの使用により）することができる。
【００８９】 一つの好ましい態様において、この系は、複数の多リガンドコンジュゲートを
含んでおり、各々の多リガンドコンジュゲートは、ａ）対応するアドレスリガン
ドとの結合に適合させた第一オリゴヌクレオチド結合ドメイン、および、ｂ）標
的核酸（例えば、遺伝子および／または遺伝子フラグメント）の特徴的オリゴヌ
クレオチド配列に対し相補的な第二オリゴヌクレオチド結合ドメイン、の分子を
含んでいる。アドレスリガンドはマスターアレーの遠位末端に、直接、またはリ
ンカーもしくはマイクロビーズの使用により、固定化される。次に、この多リガ
ンドコンジュゲートは、各々のアドレス決定されたファイバーに、既知の被検体
特異的リガンドを担持する。束の中にあるファイバー上の被検体特異的リガンド
の組は随意に変えることができる。
【００９０】 別の態様において、オリゴヌクレオチド結合ドメインの結合は、マイクロビー
ズを用いて達成する。この態様では、マイクロビーズを、オリゴヌクレオチド結
合ドメインに結合するよう調製する。次にマイクロビーズおよび結合ドメインを
検定アレー支持体表面に結合させる。マイクロビーズの結合は、例えばアビジン
−ビオチンといったような任意の適当な結合対を用いて達成することができる。
これに代わる態様では、光活性試薬を使用して、マイクロビーズを検定アレー支
持体表面に結合させることができる。
【００９１】 所望により、そして好ましくは、この系はさらに画像分析機を含んでいる。こ
の態様では、ファイバーの束は、その一端で光センサーに接続しており、この光
センサーが、シグナルを収集し、これら複数のセンサー（例えばファイバー）か
らの情報をプロセシングする。
【００９２】 このようなアプローチにおいて本発明は、再使用可能な核酸アレーを提供する
ものであり、ここでその使用者は、それぞれの特定の用途のために核酸アレーの
機能を変化させることができる。例えば、リンカーまたはマイクロビーズはイミ
ノビオチンで被覆でき、検定アレー支持体表面はビオチンで被覆することができ
る。このようにしてリンカーまたはマイクロビーズは検定アレー支持体表面に可
逆的に結合させることができる。リンカーまたはマイクロビーズは、低いpHがリ
ンカーまたはマイクロビーズを検定アレー支持体表面からの解離を惹起するよう
、pHを変化させることによって解離させることができる。
【００９３】 一つの態様においては、当分野で既知の技術を用いて、各々の光ファイバーの
遠位末端に、マイクロウェルをエッチングすることができる。例えば、湿潤化学
エッチング法を用いて一本一本のファイバーのコアを選択的にエッチングするこ
とができる。この技術は、ファイバーのコアおよびクラッディング材料の間のエ
ッチング速度の相違を利用している。エッチング時間を制御することにより、当
業者には、既知の形およびウェル容量の高密度規則的マイクロウェルアレーを得
る方法が理解できるであろう。ウェルの構造は、前もって作られた画像化ファイ
バーによって決定される。各々のマイクロウェルはそれ自身の光ファイバーの末
端に入っており、各ウェルは個別的センサーとしての役割を果たす。好ましくは
、エッチングされたマイクロウェルの直径は、これに関連して使用する個々の結
合マイクロビーズよりわずかに大きい。
【００９４】 或る態様において、例えば、標的核酸に対し相補的な１以上のオリゴヌクレオ
チド結合ドメインを結合させた複数のマイクロビーズを含有する溶液を、光ファ
イバー束の表面に添加する。溶液を光ファイバー束の表面から蒸発させるにつれ
て、個々の結合マイクロビーズが各マイクロウェル内部にランダムに落ち着く。
所望により、そして光反応性化合物をこの態様と結びつけて使用する場合には、
光ファイバーを照射して、結合マイクロビーズを各光ファイバーの表面に光結合
させる。次いで所望により、過剰のマイクロビーズをファイバー束の表面から洗
い落とす。
【００９５】 例えば、マイクロウェル内部の、ファイバーの遠位末端へのビーズまたはオリ
ゴヌクレオチド結合ドメインの固定化は、ウェル表面と結合を形成する光活性化
可能化合物を用いて達成することができる。或る態様において、光ファイバーの
ウェル表面は、光反応性シロキサン試薬で被覆され、その後、遊離（即ち、未結
合）のオリゴヌクレオチド結合ドメインを含有する溶液をウェル表面に適用する
。次にこの溶液を照射し、光反応性基を活性化し、オリゴヌクレオチド結合ドメ
インおよびウェル表面の間の結合の形成をもたらす。照射は、活性化光線をファ
イバーを通ってウェル中まで通過させることにより達成する。
【００９６】 上に論じたように、ファイバー束の個別のファイバーは、一端をエッチングし
て、マイクロビーズのための中空容器を提供することができる。光反応性有機シ
ロキサン試薬は、市販の有機シロキサン試薬、例えばアミノプロピルジメチルメ
トキシシロキサンを、熱化学的反応性光試薬、例えばベンゾイル安息香酸の酸ク
ロリドと結合させることにより製造できる。この光反応性シロキサン試薬は、画
像分析機束中のエッチングされた光ファイバーの中空酸化珪素表面と反応させる
。これに代わる態様では、各々のマイクロウェルをＸ−アビジンで被覆して、ビ
オチンと反応する表面を作り出す。この態様において、マイクロビーズはビオチ
ンまたはイミノビオチン誘導体で被覆される。
【００９７】 好ましくは、結合マイクロビーズは球形であり、一本一本の光ファイバーとほ
ぼ等しい（またはわずかに小さい）直径を有する。本発明に係る結合マイクロビ
ーズは、例えばガラス、ポリスチレン、ポリビニルベンゾフェノン、光ポリシロ
キサン被覆ガラスを包含する任意の適当な材料から製造される。好ましくは、こ
のマイクロビーズは、水よりも大きな比重を持ち、有機試薬と結合する化学組成
を有する。
【００９８】 オリゴヌクレオチド誘導体は、公表されている、そして商業的に利用できる方
法に従って合成することができ、本明細書にその詳細が記載されている。このオ
リゴヌクレオチド配列の長さは、所望のハイブリダイゼーション強度および速度
が得られるよう最適化する（通常２０〜５０ヌクレオチドの範囲）。オリゴヌク
レオチド配列は、選択された標的核酸に対し相補的である。
【００９９】 「アドレスオリゴヌクレオチド」誘導体は、光ファイバー末端のためのエポキ
シ活性化結合マイクロビーズと結合させることができる。好ましい態様において
、例えば、ほぼこのファイバーの直径を有する均質なシリカ球体を、本発明にお
けるオリゴヌクレオチド誘導体のアミン基との結合に有用な熱化学的反応基（例
えばエポキシ）を含む市販の有機シロキサン試薬と反応させる。グリシドキシプ
ロピルトリエトキシシロキサンを、公表されている反応条件下でガラスマイクロ
ビーズと反応させ、エポキシガラス表面を得る。本発明に係るアドレスオリゴヌ
クレオチド誘導体は、スペーサー上のアルキルアミン基で終結しており、これは
結合マイクロビーズ表面のエポキシ基と容易に結合する。
【０１００】 エッチングした光反応性光ファイバーの束を結合マイクロビーズのスラリーに
暴露する（ファイバー当たり少なくとも一つのタイプのアドレスオリゴヌクレオ
チドが提供されるのに充分な数で）が、各々のマイクロビーズはその表面にアド
レスオリゴヌクレオチド配列を固定化させている。好ましくは、１個のオリゴヌ
クレオチド結合ドメインが、各々の光ファイバーウェルに結合している。この態
様においてマスターアレーは再使用できる。このスラリーは、所望のアドレスオ
リゴヌクレオチド配列の各々とほぼ同数のビーズを含んでいる。オリゴヌクレオ
チド配列を供給するビーズの数は、各標的核酸特異的部位の重複（少なくとも３
回）を提供するのに充分である。暗所または減光の下で光反応性表面上のスラリ
ープールから溶媒（好ましくは水性）を蒸発させるにつれて、ファイバーの規則
的配置の末端にある中空のくぼみに一様の大きさのビーズが残る。次に、オリゴ
ヌクレオチド配列を供給する結合マイクロビーズを、乾燥状態で照射により「固
定」し、光ファイバー表面上の光反応性基およびアドレスオリゴヌクレオチドビ
ーズ上の有機基（大抵はオリゴヌクレオチド）の間に炭素−炭素結合を形成させ
る。過剰のマイクロビーズは系から洗い流す。
【０１０１】 得られた光ファイバー束は、このファイバーの一端の標的核酸配列に対し相補
的なオリゴヌクレオチドの安定且つ規則的配置を有し、そして次に、本明細書に
詳細を記載したように、蛍光標識した、アレーに対し相補的な配列を連続的に添
加し、各添加の間に洗浄およびアレー読み取りを行うことを含む、常套的蛍光ハ
イブリダイゼーション法によって、このオリゴヌクレオチド配列の位置を決定す
ることができる。
【０１０２】 一つの好ましい態様において、相補的配列を発蛍光団で標識する。配列の各々
に対し相補的であり、それぞれが互いに識別可能な幾つか（例えば１０個のうち
１個）の異なる蛍光化合物を含んでいる、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを合
成する。故に、各々のオリゴヌクレオチドは、既知の配列および既知の同定可能
な標識を有している。該表面上の１つのオリゴヌクレオチド配列に対し相補的な
、異なった既知の配列、および、同等の数の識別可能な発蛍光団の１個をそれぞ
れが有する、幾つかのオリゴヌクレオチドを、該表面に同時に適用し、５５℃で
３０分間ハイブリダイズする。
【０１０３】 次いでこの表面をすすぎ、分析して各々の配列の位置を同定する。次に、別の
組の配列を該表面とハイブリダイズし、スキャンして第二組の配列を同定する。
このプロセスを全ての位置が同定されるまで継続し、その後、沸騰水に２分間浸
漬することによりマスターアレーを取り除く。この時点で試料中の標的核酸の存
在を検出するための使用に供することができる。
【０１０４】 使用にあたり、マスターアレーを複数の標的核酸配列（例えば、遺伝子および
／または遺伝子フラグメント）を含む被検溶液に暴露する。被検溶液を蛍光標識
で標識し、結果の視覚化ができるようにする。被検溶液を、オリゴヌクレオチド
結合ドメインが試料内部に含まれる標的核酸とハイブリダイズできる条件下でイ
ンキュベートする。次いで未結合の溶液をマスターアレーから洗い流す。ハイブ
リダイズした核酸配列を、例えば上に述べたMolecular Dynamics社製の検定アレ
ー読み取り機を用いて視覚化する。
【０１０５】 検定アレーを０.０５％Tween20（PBS/Tween）を含有する燐酸緩衝化塩水で洗
浄し、次に、４Ｘ ＳＣＣ（０.６Ｍ ＮａＣｌ、０.０６Ｍクエン酸、ｐＨ７.０
）、０.１％（w/v）ラウロイルサルコシン、および０.０２％（w/v）ドデシル硫
酸ナトリウムより成るハイブリダイゼーション緩衝液を用いて５５℃で３０分間
ブロックする。アレー上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの一つに対
する配列相補性を有するＤＮＡを含む試料をファイバーの支持体表面に適用し、
密封されたハイブリダイゼーション室で１時間５５℃でインキュベートする。次
いで支持体表面を０.１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含有する２Ｘ Ｓ
ＳＣを用いて５５℃で５分間洗浄し、その後、標的ＤＮＡ上の別の配列に対し相
補的な蛍光標識した検出プローブ５０fmoleを支持体表面に適用し、５５℃で１
時間インキュベートする。次に支持体表面を、０.１％ＳＤＳを含有する２Ｘ Ｓ
ＳＣにより５５℃で５分間洗浄し、続いて０.１ｘＳＳＣで洗浄し、次いで乾燥
し、画像分析機、例えばアレー読み取り機（例えばMolecular Dynamicsより市販
品を入手可能）により蛍光パターンを記録する。
【０１０６】 当業者は、本発明が、特定のファイバー束に結びついた様々なオリゴヌクレオ
チド配列を提供できることを理解するであろう。一つの態様において、例えば、
このファイバーウェルを特異的結合剤で個々に被覆する。別の態様では、このフ
ァイバーウェルを一般的結合試薬（例えばイミノビオチン）で同時に被覆する。
この態様において、ファイバーウェルは、この一般的結合剤（例えばＸ−アビジ
ン）の相補物をそれぞれ含有する特異的結合試薬マイクロビーズの混合物から担
持させる。
【０１０７】 所望により、この系はさらに、アレー読み取り機、例えばMolecular Dynamics
より市販品が入手可能な検定アレー読み取り機を含んでいる。得られた検定アレ
ーは常法で使用することができ、例えば検定アレーは標準的アレー読み取り機に
より読み取ることができ、一方、マスターアレーは、上に開示した工程の一部ま
たは全てを反復することにより、より多くの検定アレーを製造するために再使用
することができる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年２月６日（２００１．２．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 HA12 HA20 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC07 FA03

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 特異的結合リガンドプローブアレーを複製するための系であ
    って、 ａ）複数のアドレスリガンドを、パターン化したアレーの形に固定化している
    支持体表面を含むマスターアレー； ｂ）各々の多リガンドコンジュゲートが、そこに、（ｉ）マスターアレーの或
    る特定のアドレスリガンドと特異的に結合するよう選択されたリガンドを含む、
    少なくとも１分子の第一リガンド結合ドメイン、（ii）標的リガンドと特異的に
    結合するよう選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第二リガンド結合
    ドメイン、および、（iii）結合リガンドおよび重合性の基より成る群から選ば
    れる、少なくとも１分子の第三リガンド、を結合させているコアを含んでいる、
    複数の多リガンドコンジュゲート；および、 ｃ）複製アレーのための支持体表面を含む検定アレー支持体、 を含む系。
  2. 【請求項２】 アドレスリガンド、ならびに第一および第二結合リガンドが
    、それぞれ、独立に核酸を含んでいる、請求項１に記載の系。
  3. 【請求項３】 核酸が、それぞれ、合成オリゴヌクレオチドを含んでいる、
    請求項２に記載の系。
  4. 【請求項４】 アドレスリガンドとマスターアレー支持体表面との結合を提
    供する結合剤をさらに含んでいる、請求項１に記載の系。
  5. 【請求項５】 結合剤がマイクロビーズを含む、請求項４に記載の系。
  6. 【請求項６】 第一リガンド結合ドメイン、第二リガンド結合ドメインおよ
    び第三リガンドが多リガンドコンジュゲートのコアに独立に結合している、請求
    項１に記載の系。
  7. 【請求項７】 結合リガンドがビオチン誘導体を含む、請求項１に記載の系
    。
  8. 【請求項８】 重合性の基がアクリルおよびビニル基より成る群から選ばれ
    る、請求項１に記載の系。
  9. 【請求項９】 検定アレー支持体が第三リガンドのための結合部位で被覆さ
    れている、請求項１に記載の系。
  10. 【請求項１０】 第三リガンドが結合リガンドを含み、結合部位が第三リガ
    ンドに特異的な結合相手の分子を含む、請求項９に記載の系。
  11. 【請求項１１】 特異的結合リガンドプローブアレーを複製するための方法
    であって、 ａ）複数のアドレスリガンドをそこに固定化させた支持体表面を含む、マスタ
    ーアレーを提供し； ｂ）各々の多リガンドコンジュゲートが、そこに、（ｉ）マスターアレーの或
    る特定のアドレスリガンドと特異的に結合するよう選択されたリガンドを含む、
    少なくとも１分子の第一リガンド結合ドメイン、（ii）標的リガンドと特異的に
    結合するよう選択されたリガンドを含む、少なくとも１分子の第二リガンド結合
    ドメイン、および、（iii）結合リガンドおよび重合性の基より成る群から選ば
    れる、少なくとも１分子の第三リガンド、を結合させているコアを含んでいる、
    複数の多リガンドコンジュゲートを提供し； ｃ）第一リガンド結合ドメインを相補的アドレスリガンドに特異的に結合させ
    ることにより、多リガンドコンジュゲートをマスターアレーに結合させ； ｄ）複製アレーのための支持体表面を含む検定アレー支持体を提供し、 ｅ）結合した多リガンドコンジュゲートが検定アレー支持体に結合するのに適
    切な条件の下で、検定アレー支持体をマスターアレーに充分接近させ；そして、 ｆ）検定アレー支持体を回収し使用するのに適切な条件の下で、結合した相補
    的アドレスリガンドおよび第一リガンド結合ドメインを解離させる、 ことを含む方法。
  12. 【請求項１２】 第三リガンドが重合性の基を含み、ここで、重合性の基は
    反応してポリマーフィルムを形成することができるものである、請求項１１に記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】 アドレスリガンドならびに第一および第二結合リガンドが
    、それぞれ、独立に核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 核酸が、それぞれ、合成オリゴヌクレオチドを含む、請求
    項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 さらに結合剤を含み、この結合剤がアドレスリガンドとマ
    スターアレー支持体表面との結合を提供する、請求項１１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 結合剤がマイクロビーズを含む、請求項１５に記載の方法
    。
  17. 【請求項１７】 第一リガンド結合ドメイン、第二リガンド結合ドメインお
    よび第三リガンドが独立に多リガンドコンジュゲートのコアに結合している、請
    求項１１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 結合リガンドがビオチン誘導体を含む、請求項１１に記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】 重合性の基がアクリルおよびビニル基より成る群から選ば
    れる、請求項１１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 検定アレー支持体が第三リガンドのための結合部位で被覆
    されている、請求項１１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 第三リガンドが結合リガンドを含み、結合部位が第三リガ
    ンドに特異的な結合相手の分子を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 再使用可能なアレーの形の複製可能なアレーを製造するた
    めの系であって、 ａ）各々の光ファイバーが該ファイバーの遠位末端に位置する支持体表面を有
    する、複数の光ファイバーを含むマスターアレー、および、 ｂ）各々のオリゴヌクレオチド結合ドメインが標的リガンドに特異的に結合す
    るよう選択されたオリゴヌクレオチド配列を含む、複数のオリゴヌクレオチド結
    合ドメイン、 を含む系。
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