DE102009012169B3

DE102009012169B3 - Vorrichtung und Verfahren zum Herstellen eines Replikats oder eines Derivats aus einem Array von Molekülen und Anwendungen derselben

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Publication number: DE102009012169B3
Application number: DE102009012169A
Authority: DE
Inventors: Roland Prof. Dr. Zengerle; Felix Von Dr. Stetten; Günter Dr. Roth; Jochen Hoffman
Original assignee: Hann-Schickard-Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Biocopy GmbH
Priority date: 2009-03-06
Filing date: 2009-03-06
Publication date: 2010-11-04
Anticipated expiration: 2029-03-07
Also published as: ES2637270T3; CA2756335C; WO2010100265A1; US20170369938A1; US9725758B2; EP2403961B1; CN106011238A; US20210340606A1; JP2012519475A; CA2756335A1; DK2403961T3; EP2403961A1; CN102449164A; US20120015844A1; CN102449164B

Abstract

Ein Verfahren zum Herstellen eines Replikats oder eines Derivats eines Arrays von Molekülen, wobei das Array eine räumliche Anordnung getrennter Proben von Molekülen aufweist, umfasst das Erzeugen zumindest eines räumlich begrenzten Wirkbereichs für jede Probe, der von den Wirkbereichen der anderen Proben getrennt ist, wobei eine mit einem Bindungsadapter oder Bindungseigenschaften versehene Oberfläche eines Trägers an die Wirkbereiche angrenzt. Die Moleküle werden mittels Amplifikationsmitteln in den Wirkbereichen zum Erzeugen von Replikaten oder Derivaten der Proben amplifiziert. Die Replikate oder Derivate der Proben werden an dem Träger mittels des Bindungsadapters oder der Bindungseigenschaften gebunden, so dass eine räumliche Anordnung der Replikate oder Derivate der Proben auf dem Träger der räumlichen Anordnung der Proben in dem Array entspricht. Der Träger mit den Kopien der Proben wird von dem Array entfernt.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vorrichtungen zum Herstellen eines Replikats oder eines Derivats aus einem Array von Molekülen, wie z. B. Biomolekülen oder chemisch erzeugten Molekülen, und insbesondere solche Verfahren und Vorrichtungen, die zum Herstellen eines Replikats oder Derivats eines Mikroarrays dieser Moleküle und/oder davon abgeleiteter Moleküle, wie beispielsweise eines DNA-Mikroarrays, RNA-Mikroarrays oder Protein-Mikroarrays, geeignet sind, sowie die Anwendung des Arrays zur Identifizierung von DNA-Sequenzen die mit Reaktionen zusammenhängen, in die primäre Sequenzen, Kopien davon oder Derivate davon involviert sind.
Unter einem Mikroarray ist eine Anordnung von vielen unterschiedlichen Biomolekülen an oder in einer Oberfläche in einzelnen Punkten zu verstehen. Die Punkte werden auch als Spots bezeichnet und haben üblicherweise einen Durchmesser zwischen 10 μm bis etwa 1000 μm. Innerhalb eines Spots liegen ein oder mehrere identische Populationen von Biomoleküle vor. Die verschiedenen Spots repräsentieren dagegen mit Ausnahme einiger beabsichtigter Redundanzen unterschiedliche Biomoleküle. Die Biomoleküle können auf der Oberfläche aufgebracht sein, in einer Schicht auf der Oberfläche vorliegen, in einer Kavität vorliegen, oder auf einem Partikel oder in einem Partikel immobilisiert vorliegen, wobei die Partikel als Array angeordnet sein können.
Konventionell gibt es unterschiedliche Techniken, um Mikroarrays herzustellen. Gemäß einer Technik werden die Biomoleküle vor Ort auf der Oberfläche synthetisiert, beispielsweise unter Verwendung einer Lichtsynthese, einer chemischen Synthese, einer Spotsynthese, eines Druckverfahrens und dergleichen. Eine derartige Lichtsynthese-Technik wird beispielsweise von der Firma Affymetrix verwendet, eine Spotsynthese wird von der Firma Agilent durchgeführt. Gemäß einer weiteren Technik werden die (Bio-)Moleküle zuerst synthetisiert und anschließend auf die Oberfläche als angeordnetes Array verbracht, wobei beispielsweise die Firmen Agilent, Gesim und Biofluidix eine solche Technik verwenden. Bei beiden Techniken ist ein hoher technischer Aufwand von Nöten. Dieser technische Aufwand steigt mit der Anzahl der unterschiedlichen Biomoleküle und mit dem abnehmenden Durchmesser der Auftragungspunkte mehr als linear an. Weiterhin steigen Zeitaufwand und Kosten, wenn ein solches Mikroarray beispielsweise doppelt so viele Substanzen enthalten soll oder die Größe der beschichteten Strukturen, d. h. Punkte oder Spots, verringert werden soll, deutlich an. Eine Stempeltechnik zur Erzeugung von Mikroarrays ist in [1] beschrieben.
Mittels der Synthese vor Ort auf einem Array ist es möglich Millionen verschiedener DNA-Sequenzen herzustellen. Allerdings ist für ein neues Layout oder eine andere Strukturgröße die komplette Umstellung des Herstellungsprozess notwendig. Dies erfordert dann eine neue Geräteeinstellung und im Falle der lichtgestützten Synthese sogar neue Photolithographiemasken oder eine Neuprogrammierung des digitalen Spiegelsystems, siehe [2], wo die Verwendung von digitalen Spiegeln zur Erzeugung eines Mikroarrays beschrieben ist. Dies wird aus Kostengründen möglichst umgangen.
Mittels der Synthese im Labor und der nachfolgenden Übertragung auf ein Mikroarray, beispielsweise mittels eines Nanoplotters, ist es schon aus Zeitgründen nicht möglich mehr als einige Zehntausend Substanzen zu transferieren. Für die Herstellung einer nennenswerten Anzahl von Mikroarrays mit einer Million verschiedener Biomoleküle würde man Wochen bis Monate benötigen.
Wünschenswert wäre also ein Verfahren, mit welchem man existierende Mikroarrays, also eine regelmäßige Anordnung bekannter Biomolekülen, die kompliziert und teuer in der Herstellung sind, einfach und kostengünstig kopieren kann.
Einige grundsätzliche Ideen hierzu wurden bereits angedacht, [3] und [4]. Aus [3] und [4] ist ein Verfahren zum Replizieren eines Oligonucleotid-Arrays bekannt, bei dem ein oder mehrere Biotin-funktionalisierte Oligonucleotide zu einem oder mehreren Oligonucleotiden auf einem ersten Substrat hybridisiert und amplifiziert werden. Die Biotinfunktionalisierten und amplifizierten Oligonucleotide werden dann mit Streptavidin an einem zweiten Substrat verankert. Die Biotin-funktionalisierten Oligonucleotide können durch mechanische Kraft von den Oligonucleotiden getrennt werden, um ein repliziertes Array zu erzeugen. Solche Kopierprozesse sind jedoch aufwändig und benötigen ein zusätzliches biochemisches Verankerungssystem.
In [5] ist ebenfalls das Kopieren eines DNA-Arrays mit Hilfe eines Streptavidin-Biotin-Systems beschrieben. In [6] ist beschrieben, wie man DNA zu RNA kopieren kann.
Bereits seit etwa 30 Jahren wird DNA im Labor amplifiziert.
Unter anderem hat die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) als Standardtechnik in fast allen Labors Einzug gehalten und ist die Grundlage der meisten genetischen Untersuchungen. Allerdings gibt es auch andere Techniken, die es erlauben DNA zu vervielfältigen, z. B. NASBA, Recombinase Polymerase Amplification, Rolling Circle Amplification und diverse andere isothermale Amplifikationstechniken.
Diese Techniken erlauben es nicht nur generell DNA zu vervielfachen, sondern auch gezielt einzelne DNA-Bereiche oder Untermengen der DNA zu vervielfältigen. Durch eine gezielte Wahl der Startpunkte (Primer) können auch gezielt einzelne Bereiche der DNA vervielfältigt werden. Die meisten Verfahren der DNA-Amplifikationen finden in Lösung statt und man spricht von einer Flüssigphasenreaktion. In den letzen Jahren kamen jedoch einige Verfahren auf, die eine zusätzliche Festphase für die DNA-Amplifikation verwenden und diese dabei auf dieser Festphase anreichern. Im Folgenden werden zwei der gängigsten Verfahren beschrieben, die Grundlagen der Bridge-Amplifikation der DNA sowie die Wasser-in-Öl-Emulsions-PCR.
Bridge-Amplifikation der DNA: Bei der Bridge-Amplifikation wird die (teils unbekannte) DNA zunächst an beiden Enden mit bekannten, sogenannten Adapter-Sequenzen verlängert. Diese Verlängerungen dienen als Bindungsstellen für komplementäre Sequenzen an der Oberfläche. Nur nach erfolgter Bindung an die Oberfläche findet später eine Amplifikation statt. Der kopierte und damit neu erzeugte DNA-Strang ist nun fest (kovalent) an die Oberfläche gebunden und verfügt an seinem nicht gebundenen Ende über eine weitere Bindungsstelle. Diese kann nun mit einem geeigneten Gegenstück auf der Oberfläche ebenfalls binden und eine weitere Amplifika tion starten, die ihrerseits einen neuen DNA-Strang erzeugt, der an einem Ende angebunden ist und am anderen freien Ende die ursprüngliche Bindungssequenz besitzt. So werden exponentiell immer mehr neue Stränge erzeugt, die an einem Ende fest gebunden sind und deren anderes Ende eine zwischenzeitliche Bindung an die Oberfläche erlaubt. Während der Amplifikation ist der Originalstrang am einen Ende fest (kovalent) und am anderen Ende lose (nicht-kovalent) gebunden und erzeugt so einen molekularen „Bogen”, der als Bridge bezeichnet wird. Diesbezüglich beschreibt [9] generell die Bridgeamplifikation und [10] beschreibt die Verwendung der Bridgeamplifikation zur Sequenzierung.
Bei einer Wasser-in-öl-Emulsions-PCR wird eine Art Bridge-Amplifikation verwendet. Hierbei werden die DNA-Stränge zunächst wie bei der Bridge-Amplifikation an beiden Seiten durch Adapter-Sequenzen verlängert. Danach wird die verlängerte DNA zusammen mit einem wässrigen PCR-Mix und Festphasen-Partikeln, die auch als Beads bezeichnet werden, gemischt und in Öl emulgiert, so dass eine Wasser-und-Partikel-in-öl-Emulsion entsteht. Für diese Wasser-in-Öl-Emulsion sind die Konzentrationen so gewählt, dass im Idealfall in jedem Wassertröpfchen jeweils genau ein DNA-Strang und genau ein Partikel eingeschlossen wird. Die Oberfläche des Partikels enthält entsprechend der Bridge-Amplifikation Sequenzen, die es erlauben, dass eine DNA-Kopie kovalent angebunden wird. So kann durch die Amplifikation der gesamte Partikel mit Kopien der ursprünglichen DNA bedeckt werden. Diese Technik wird hauptsächlich in Sequenzierern eingesetzt. Bei dieser Technik wird jeweils nur ein einziger definierter Strang auf der Festphase bzw. der Flüssigphase amplifiziert.
Bei der Protein-Amplifikation bzw. Protein-Synthese liegt ein DNA-Strang vor, der prinzipiell mit einem geeigneten biochemischen System zuerst in RNA und dann in ein Protein umgeschrieben werden kann. Ist die RNA stabil genug oder liegen genügend DNA-Template vor, so kann eine große Anzahl von Proteinen hergestellt werden. Diese Technik entspricht dem natürlichen Vorgang in einer Zelle, wie aus DNA über RNA Proteine geschaffen werden und ist das Fundament und zentrale Paradigma der Biochemie. Seit kurzem stehen vereinfachte biochemische Systeme zur Verfügung, die diesen Aufgabenkomplex meistern können und es so im Labor erlauben zumindest grundsätzlich aus einem DNA-Strang ein Protein herzustellen. Diesbezüglich beschreibt [7] eine Methode zum direkten Erzeugen eines Protein-Mikroarrays aus einem DNA-Mikroarray und [8] eine Methode zur Herstellung eines Proteinmikroarrays mit cDNA-Ankern. Alternativ können zur Protein-Amplifikation auch prokaryotische oder eucaryotische Zellen verwendet werden, in die die Protein-kodierende DNA eingeschleust wird.
Um eine DNA-Sequenz zu entschlüsseln werden sogenannte Sequenzierverfahren eingesetzt, wobei [11] eine Übersicht über neuere Sequenziermethoden gibt. Sequenzierverfahren, bei denen DNA an Partikel gebunden wird, sind ferner bei [12] beschrieben.
Die zur Sequenzierung verwendeten sehr komplexen Maschinen bedienen sich einer Vielzahl von Reaktionsschritten und Techniken, um gewonnene DNA zuerst einzufangen, zu vervielfältigen und dann Baustein für Baustein auszulesen. Mittels der gewählten Reaktionschemie und der Sequenziermethode ist es dann mit aufwändigen bioinformatischen Methoden möglich die DNA-Sequenz als Ganzes wieder rückzurechnen und somit das Genom der untersuchten Spezies zu erhalten.
Bei den früheren Sequenzierungstechniken wurde die Auftrennung der DNA in einem Gel vorgenommen. Dies war ein Ansatz, der nicht auf Festphasen basierte. Bei den Sequenzierern der neuesten Generation arbeitet man mit einer Wasser-in-Öl-Emulsions-PCR und generiert so Millionen von Partikeln, z. B. Kügelchen, die jeweils viele identische Kopien eines anderen DNA-Fragmentes tragen. Zum Auslesen der Sequenz werden die Partikel z. B. in einer sogenannten Pikowellplatte mit z. B. 130 Millionen verschiedenen Mikrokavitäten angeordnet und immobilisiert. Dies stellt im eigentlichen Sinne bereits ein Mikroarray dar. Diesbezüglich kann auf [13] verwiesen werden, wo die Verwendung der Bridgeamplifikation zur Sequenzierung beschrieben ist.
Auch wenn hier schon eine regelmäßige Anordnung von Biomolekülen erzeugt wurde, so kann es jedoch nicht wie ein herkömmliches Mikroarray mit bekannten Sequenzen verwendet werden, da die einzelnen Sequenzen der an die Partikel gebundenen Biomoleküle als solche noch nicht bekannt sind. Jedoch ist nach der Sequenzierung die Sequenz des an einen bestimmten Partikel gebundenen DNA-Fragments als solche bekannt.
Es werden bereits Anstrengungen unternommen, um die einzelnen Partikel wiederzugewinnen und nochmals als Array zu verwenden, beispielsweise von der Firma Scineon zusammen mit dem Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik in Berlin. Dieses Verfahren ist jedoch aufwändig und ermöglicht auch lediglich die Herstellung eines Exemplars eines derartigen Arrays.
Softlithografie bzw. Mikrocontact-Printing ist eine Stem peltechnik, die es erlaubt, Moleküle an eine Oberfläche aufzutragen und diese dann auf eine andere zu transferieren. Sie ermöglicht es auch kleine Kavitäten oder Mikrofluidik zu integrieren und so komplexe Schaltungen für Flüssigkeiten zu schaffen. Diese Schaltungen erlauben es, Oberflächen gezielt zu behandeln und so kleinste Strukturen zu beschichten oder zu verändern. Das dabei verwendete Material ist ein Silikon (PDMS). Mittels geeigneter Oberflächenmodifikation des PDMS lassen sich unterschiedliche Biomoleküle an die Oberfläche anlagern und so später transferieren. Es können sowohl DNA, RNA als auch Biomoleküle transferiert werden.
Diese Transfereigenschaften können unter anderem für einen Kopierschritt genutzt werden, wobei [14] erstmals beschreibt, wie mit Softlithographie Biomoleküle transferiert werden können.
DNA-Arrays bzw. DNA-Mikroarrays werden hauptsächlich für die so genannte Expressionsanalyse oder die SNP-Analyse verwendet.
Bei der Expressionsanalyse will man untersuchen, welche Gene wie stark aktiv sind. Als Marker hierfür gilt die mRNA. Hierzu werden Zellen oder Lebewesen stimuliert, z. B. durch Gabe eines Medikaments, durch Änderungen von Umweltfaktoren, durch Stress und dergleichen. Aus dem biologischen Material wird zunächst die mRNA gewonnen, in eine sogenannte komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben und mit einem Farbstoff versehen. Eine Referenzprobe wird mit einem anderen Farbstoff versehen. Meist verwendet man einen grünen und einen roten Farbstoff. Die Proben werden in gleichen Anteilen zusammengemischt und dann auf das Mikroarray gebracht.
Ist eine bestimmte DNA-Sequenz in beiden Ausgangsproben in der gleichen Konzentration enthalten, so binden an den betreffenden Spot des Mikroarray komplementäre Moleküle aus beiden Proben in derselben Konzentration. Das Auslesen dieses Spots führt also zu einer Mischfarbe. Im Falle von grün und rot ergibt sich gelb. Finden sich ungleiche Verhältnisse des selben Genabschnitts, so wird der entsprechende Punkt auf dem Mikroarray eine Mischfarbe aufweisen, die eine entsprechende Färbung zum vorherrschenden Genprodukt aufweist. Gene die komplett an- oder abgeschaltet sind, weisen nur den einen oder den anderen Farbton auf. Aufgrund des Farbmusters kann man auf die Menge an mRNA zurückschließen und hat einen Anhaltspunkt wie stark bestimmte Gene durch die untersuchten Einflüsse aktiviert oder deaktiviert wurden. [15] offenbart die Anwendung des Expressionsprofilings für genomweite Untersuchungen mittels hochparallelen Sequenzierungen.
Bei SNP-Analysen untersucht man, ob Genabschnitte einzelne Mutationen, d. h. bis auf ein Basenpaar identische Sequenzen besitzen (Einzel-Basenpaar-Austausch = Single-Nucleotide-Polymorphism). Die genaue Lage des ausgetauschten Basenpaares legt fest, ob der Austausch keinerlei, oder lediglich geringe Auswirkungen auf den Organismus hat, oder ob es sich um einen tödlichen Gendefekt handelt. Im Falle einiger schwerer Erbkrankheiten wie Corea Huntington, Parkinson oder Alzheimer sind solche schwerwiegende SNPs bekannt. Bei vielen anderen SNPs kann man auf erhöhte Risiken oder Anfälligkeiten für bestimmte Krankheiten wie z. B. Diabetes oder Rachitis schließen. Für die SNP-Analyse wird aus dem biologischen Material direkt die DNA gewonnen und mit einem Farbstoff markiert. Pro SNP befinden sich vier Punkte auf dem Mikroarray, die sich jeweils an derselben Position um ein Basenpaar unterscheiden. Aufgrund der Bindeposition kann angegeben werden, welche Base sich an der fraglichen Position bei der unbekannten Probe befindet, siehe [15].
Bei Proteinarrays gestaltet sich schon die Herstellung wesentlich schwieriger, da Proteine im Gegensatz zu DNA ein enorm weites Spektrum an Löslichkeiten, Reaktivitäten und Spezifitäten aufweisen. So ist es nicht trivial, verschiedene Proteine mit demselben chemischen Anker auf einer Oberfläche zu binden. Üblicherweise enthalten Proteinarrays einige Hundert bis Tausend verschiedene Proteine. Proteinarrays werden hauptsächlich für Bindungsstudien eingesetzt. Hierbei wird ein markiertes Molekül auf das Proteinarray gegeben. Punkte auf dem Mikroarray, die ein Färbung aufweisen, sind damit potentielle Bindungspartner für das untersuchte Molekül. Diese Technik wird unter anderem für das Epitopmapping verwendet, um gezielt Bindungsstellen zu finden.
Der Aufbau eines Mikroarrays als solches ist in [16] oder [17] beschrieben.
Die Anwendungen der Mikroarrays sind also weit reichend und vielfältig. Sie sind jedoch mangels der erforderlichen finanziellen Ressourcen bzw. den Kosten-Nutzen-Faktor deutlich eingeschränkt.
DNA-Sequenzen enthalten biochemische Informationen und können durch ein biochemisches Replikationssystem vervielfacht werden. Unterschiedliche Ansätze zum Kopieren von DNA-Sequenzen wurden bereits verfolgt, angefangen vom Aufkopieren der einzelnen Basenpaare auf eine Oberfläche bis hin zu dem in [4], [5] und [6] beschriebenen Ansatz, wo dargelegt ist, wie man grundsätzlich DNA von einer Oberfläche zur anderen kopieren kann.
Ebenso wurde kürzlich ein Artikel [7] veröffentlicht, wie man von einem DNA-Array eine Protein-Kopie herstellen kann.
Die obigen Ausführungen zeigen, dass der Stand der Technik zwei prinzipielle Techniken zur Erzeugung von Mikroarrays erlaubt, nämlich das direkte Erzeugen von Substanzen vor Ort auf der einen Seite und das Übertragen der Substanzen nach einer Synthese mittels eines mikroskopischen Dispensier- oder Druckverfahrens auf der anderen Seite. Jede dieser Techniken ist technisch komplex und mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden, wobei generell gilt, dass mit einer Verdoppelung der Anzahl der Substanzen auch die Zeit und der Kostenaufwand sich mindestens verdoppeln. Weiterhin ist vor der Synthese eine genaue Kenntnis der biochemischen Informationen, im Falle von DNA-Arrays der Sequenz, von essenzieller Bedeutung. Um im Falle von DNA an diese Informationen zu gelangen, werden, wie oben ausgeführt wurde, sogenannte Sequenzierer verwendet. Bisher ist keine direkte Produktionskette zwischen der Sequenzierung und der Herstellung von Mikroarrays bekannt oder etabliert. Dies bedeutet, dass ein unbekannter Organismus zunächst sequenziert werden muss, woraufhin die Sequenz aus den Daten des Sequenzierers berechnet und danach ein Array hergestellt wird. Mit diesem Array kann dann ein Expressionsmuster untersucht werden. Darüber hinaus ist es bekannt, Proteinarrays aus bekannten Sequenzen herzustellen. Diese Produktionskette ist sehr langwierig und kostenintensiv.
Könnte man mit einer einfachen Methode Proteinarrays unmittelbar als Derivat eines DNA-Arrays generieren, so bliebe die Kopplung zwischen Phänotyp und Genotyp erhalten und man könnte auf dem Derivat ortsaufgelöst Reaktionen (Antigen-Antikörper, Enzymatische Reaktionen) durchführen und diese mit der zugrundeliegenden DNA-Sequenz in Zusammenhang bringen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren und Vorrichtungen, die es ermöglichen, mit geringem Zeitaufwand und kostengünstig ein Replikat oder ein Derivat aus einem Array von Molekülen herzustellen, sowie ein entsprechendes Replikat bzw. Derivat sowie Verwendungen für ein solches Replikat bzw. Derivat zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1, ein Replikat gemäß Anspruch 23, eine Vorrichtung gemäß Anspruch 34 und Verwendungen gemäß den Ansprüchen 24, 28, 30 und 32 gelöst.
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen ein Verfahren zum Herstellen eines Replikats oder eines Derivats eines Arrays von Molekülen, wobei das Array eine räumliche Anordnung getrennter Proben von Molekülen aufweist, mit folgenden Schritten:
Erzeugen zumindest eines räumlich begrenzten Wirkbereichs für jede Probe, der von den Wirkbereichen der anderen Proben getrennt ist, wobei eine mit einem Bindungsadapter oder Bindungseigenschaften versehene Oberfläche eines Trägers an die Wirkbereiche angrenzt;
Amplifizieren der biochemischen Moleküle mittels Amplifikationsmitteln in den Wirkbereichen zum Erzeugen von Replikaten oder Derivaten der Proben;
Binden der Replikate oder Derivate der Proben an dem Träger mittels des Bindungsadapters oder der Bindungseigenschaften, so dass eine räumliche Anordnung der Replikate oder Derivate der Proben auf dem Träger der räumlichen Anordnung der Proben in dem Array entspricht; und
Entfernen des Trägers mit den Kopien der Proben von dem Array.
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen ein Replikat oder Derivat eines Arrays von Molekülen, das unter Verwendung eines entsprechenden Verfahrens hergestellt wurde.
Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen eine Vorrichtung zum Herstellen eines Replikats oder Derivats eines Arrays von Molekülen, wobei das Array eine räumliche Anordnung getrennter Proben von Molekülen aufweist, mit folgenden Merkmalen:
einer Einrichtung zum Erzeugen zumindest eines räumlich begrenzten Wirkbereichs für jede Probe, der von den Wirkbereichen der anderen Proben getrennt ist, wobei eine mit einem Bindungsadapter oder Bindungseigenschaften versehene Oberfläche eines Trägers an die Wirkbereiche angrenzt;
einer Einrichtung zum Amplifizieren der biochemischen Moleküle mittels Amplifikationsmitteln in den Wirkbereichen zum Erzeugen von Replikaten oder Derivaten der Proben und zum Binden der Replikate oder Derivate der Proben an dem Träger mittels des Bindungsadapters oder der Bindungseigenschaften, so dass eine räumliche Anordnung der Replikate oder Derivate der Proben auf dem Träger der räumlichen Anordnung der Proben in dem Array entspricht; und
einer Einrichtung zum Entfernen des Trägers mit den Kopien der Proben von dem Array.
Erfindungsgemäß wird jeder Probe eines Arrays von Molekülen, beispielsweise eines DNA-Mikroarrays, ein räumlich begrenzter Wirkbereich, der von den Wirkbereichen der anderen Proben getrennt ist, zur Verfügung gestellt, so dass die vorliegende Erfindung ermöglicht, schnell, einfach und kostengünstig ein Replikat oder ein Derivat eines entsprechenden Arrays unter Beibehaltung der Ortsinformationen, die durch die räumliche Anordnung gegeben sind, zu erzeugen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich insbesondere auf entsprechende Verfahren und Vorrichtungen, bei denen die Moleküle Biomoleküle oder synthetisch erstellte chemische Moleküle sind. Unter Replikat kann erfindungsgemäß eine 1:1-Kopie der originalen Moleküle verstanden werden, während unter Derivat eine Veränderung der originalen Moleküle verstanden werden kann, beispielsweise Abkömmlinge oder Subsets der originalen Moleküle. Unter Proben von Molekülen können erfindungsgemäß verschiedene Moleküle, die an den unterschiedlichen Stellen eines Arrays angeordnet sind, oder unterschiedliche Mischungen von Molekülen, die dort angeordnet sind, verstanden werden.
Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen es, Mikroarrays zu kopieren, ohne Kenntnis von der biochemischen Information zu haben, d. h. insbesondere auch nicht synthetische Mikroarrays zu kopieren. Dies ermöglicht es, bereits aus Sequenzierern eine Kopie der dortigen Anordnung von DNA herauszukopieren und so ein DNA-Array zu schaffen, ohne eine Kenntnis von den Sequenzen zu besitzen.
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung ermöglichen es somit, direkt vor, nach oder während einer Sequenzierung ein entsprechendes Mikroarray zu fertigen, sogar ohne Kenntnis der Sequenzen der einzelnen Proben. Somit kann der zeit- und kostenaufwändige Prozessschritt des synthetischen Generierens eines Arrays umgangen werden, und ein Array direkt aus der Sequenzierung hergestellt werden. Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen es somit, schnell ein gegebenes Mikroarray oder Beschichtungsmuster zu vervielfältigen, und zwar unabhängig vom Bekanntsein von biochemischen Sequenzen oder Informationen des Mikroarrays. Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung ermöglichen es ferner, von ein und demselben Original unterschiedliche Variationen zu fertigen, wie es für unterschiedliche Aufgabenstellungen notwendig sein kann, da für unterschiedliche biochemische Fragestellungen unterschiedliche Biomoleküle, beispielsweise DNA, RNA oder Proteine, verwenden werden. Vor, während oder nach einer Sequenzierung ein passendes DNA- oder gar Protein-Mikroarray herzustellen, war bisher nicht möglich.
Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen es, vor, während oder nach einer Sequenzierung direkt aus einem primären Material, beispielsweise einem primären Array von Partikeln, ein sekundäres Mikroarray mittels eines biochemischen Kopierprozesses herzustellen und dieses ggf. nochmals in Form eines weiteren Arrays biochemisch in DNA, RNA oder Proteine abzubilden. Weiterhin können während unterschiedlicher Kopierschritte Abwandlungen der Arrays in che mischer Form hergestellt werden, die beispielsweise bestimmte Marker oder Sequenzen enthalten, vergleichbar einer Farbkopie, bei der nur der Gelbanteil kopiert wird.
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf. die Herstellung einer Kopie eines Mikroarrays aus einer Anordnung von DNA-Sequenzen aus einer Sequenzierung (z. B. Partikelarray in einem Sequenzierer von ABI oder Roche 454), was bisher weder beschrieben noch durchgeführt wurde. Obwohl einzelne Teilschritte, wie beispielsweise das biochemische Kopieren von DNA zu DNA oder von DNA zu Protein in der Technik beschrieben sind, ist es jedoch nicht bekannt, einzelne Teilschritte zur Erzeugung eines Mikroarrays aus einer Sequenzierung zu kombinieren. Insbesondere ist auch eine Produktionslinie einer Sequenzierung, gefolgt von einer DNA-Array-Herstellung durch Erzeugung eines Replikats aus einem DNA-Array aus dem Sequenzierer, gefolgt von der Erzeugung eines RNA-Arrays oder Protein-Arrays aus dem DNA-Array bisher nicht bekannt.
Wie bereits ausgeführt wurde, ist es aus dem Stand der Technik nicht bekannt, aus einer laufenden Sequenzierung bereits ein DNA-Array zu erzeugen. Dieses dann direkt zu kopieren, dann durch gezielte Modifikationen in Subsets aus DNA- oder RNA-Mikroarrays bis hin zu Protein-Mikroarrays zu reformieren, wurde ebenfalls noch nicht beschrieben. Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen es erstmals, während einer Sequenzierung ein DNA-Array herzustellen und sofort in beliebige Array-Oberflächen zu wandeln, um somit alle gängigen Mikroarray-Untersuchungen zu ermöglichen. Hierdurch kann bei Ausführungsbeispielen der Erfindung die umständliche synthetische Herstellung von Mikroarrays komplett umgangen werden.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind jedoch nicht auf das Kopieren eines Mikroarrays aus einer Sequenzierung heraus begrenzt. Vielmehr ermöglichen Ausführungsbeispiele der Erfindung, einfach und kostengünstig ein planares Mikroarray, wie beispielsweise ein kommerziell erhältliches Mikroarray, direkt zu kopieren. Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen es, gezielt Aspekte von Arrays herauszukopieren und umzuschreiben, um so RNA-, DNA-Subsets-, cDNA- oder Protein-Arrays zu erzeugen.
Geeignete Kopiermethoden, beispielsweise geeignete Amplifikationsmittel (z. B. PCR, isothermale Amplifikation, NASBA) und jeweils dazu passende Bindungsadapter oder Bindungseigenschaften der Oberfläche (z. B. Primer, Streptavidin-Biotin, Antigen-Antikörper, Poly-Histidin-Nickel-Komplexe, elektrostatische/dynamische oder magnetische Eigenschaften), sind für Fachleute offensichtlich und bedürfen hierin keiner weiteren Erläuterung. Diesbezüglich kann auch auf die eingangs erwähnten Schriften verwiesen werden, deren diesbezügliche Lehre durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung wird somit aus genetischer Information, die als primäres Array bezeichnet werden kann, zumindest eine Kopie der genetischen Information, beispielsweise der DNA, erzeugt, die als sekundäres Array bezeichnet werden kann. Aus der Kopie kann wiederum eine weitere Array-Kopie, die als tertiäres Array bezeichnet werden kann, erzeugt werden. Das tertiäre und/oder das sekundäre Array können je nach Wahl des biochemischen Replikationssystems in Bezug auf das primäre bzw. sekundäre Array entweder eine identische Kopie, eine komplementäre Kopie, ein Subset oder ein RNA- oder Protein-Array sein.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung stammt das primäre Array aus einem DNA-Sequenzierer. Hierzu kommen prinzipiell alle kommerziellen Partikel-basierten Sequenzierer in Frage. Bei alternativen Ausführungsbeispielen können aber auch alle planaren DNA-Mikroarrays als primäre Arrays, die kopiert werden sollen, verwendet werden. Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich auf jeglichen „Kopierprozess” von einer wie auch immer gearteten Oberfläche zur anderen, sofern jeder Probe des Arrays ein räumlich begrenzter Wirkbereich, der von den anderen Wirkbereichen getrennt ist, zur Verfügung gestellt wird. Hierunter fallen alle ortsaufgelöst geordneten Substanzbibliotheken, die biochemische Informationen enthalten, was neben den planaren Mikroarrays beispielsweise auch nicht-planare Oberflächen oder Partikel-Arrays sind, wie sie in Sequenzierern oder bei chemischen Substanzbibliotheken erzeugt werden.
Als Amplifikationsmittel können bei Ausführungsbeispielen der Erfindung jegliche bekannte Amplifikationsmittel verwendet werden. Bisherige Amplifikationen zielten darauf ab, bestimmte DNA-Abschnitte oder Sequenzen zu vervielfachen. Bei derartigen bekannten Amplifikationen bleibt im üblichen Fall die Ortsinformation, wo welcher Strang erzeugt wurde, nicht erhalten, da diese in Lösung stattfinden. Im Gegensatz dazu bleibt bei Ausführungsbeispielen der Erfindung bei der Herstellung des Replikats die Ortsinformation von der Quelle, d. h. dem primären Array, zu der Kopie, d. h. dem sekundären Array, ganz oder in Teilen erhalten, indem jeder Probe ein räumlich begrenzter Amplifikationsmittelbereich, der von den Amplifikationsmittelbereichen der anderen Pro ben getrennt ist, zur Verfügung gestellt wird. Diese Ortsinformation wird häufig auch als Registrierung bezeichnet. Damit meint man z. B. die Position eines bestimmten DNA-Segments im Sinne dessen Anordnung (Zeile und Spalte bzw. x- und y-Position) innerhalb eines regelmäßigen Rasters. Durch diesen zumindest partiellen Erhalt der Ortsinformationen ermöglicht die vorliegende Erfindung die Herstellung von Replikaten hoher Güte. Je mehr Ortsinformationen erhalten bleiben, desto besser ist das Replikat. Eine schlechte Ortsauflösung erzeugt bei mehrfachem Kopieren eine immer schlechtere und damit irgendwann unbrauchbare Kopie.
Erfindungsgemäß können generell alle bekannten Amplifikationsmethoden angewendet werden, wobei bei Ausführungsbeispielen eine PCR oder eine Bridge-Amplifikation verwendet werden kann. Die Bridge-Amplifikation kann an einer Oberfläche verwendet werden. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung stellt somit der Kopierprozess eine Art Bridge-Amplifikation dar, die jedoch von einer Oberfläche zur anderen stattfindet, wobei die Ortsinformation bzw. die Registrierung der kopierten Spezies erhalten bleibt. Bei alternativen Ausführungsbeispielen kann auch ein zusätzliches Bindungssystem zum Binden der Kopien an den Träger verwendet werden, beispielsweise ein Streptavidin/Biotin-System, wie es in [4] beschrieben ist, was jedoch eine erhöhte Komplexität zur Folge hat.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können die Bindungsadapter ganzflächig auf den Träger, auf den das Array kopiert werden soll angeordnet sein.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung sind die Bindungsadapter Primer, die komplementär zu Sequenzen der zu kopierenden Moleküle sind.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird der Erhalt der Ortsinformationen durch eine räumliche Abtrennung oder Kompartimentierung der Amplifikationsmittelbereiche, die den jeweiligen Proben zugeordnet sind, erreicht. So kann verhindert werden, dass einzelne Moleküle aus dem „Mikrokompartment” entkommen, so dass die Ortsauflösung bzw. Registrierung erhalten bleibt. Wie bereits ausgeführt wurde, können bei Ausführungsbeispielen der Erfindung als Kopierprozess sämtliche Amplifikationstechniken in Frage kommen, wie z. B. PCR oder eine isothermale Amplifikation. Während des Kopierprozesses wird das Duplikat auf eine Zieloberfläche verbracht und verankert. Dabei bleibt neben der Tatsache, dass die genetische Information ganz oder teilweise erhalten bleibt, die Ortsinformation erhalten. Ausführungsbeispiele der Erfindung schaffen ein 1:1 Replikat, worunter generell ein „schlichtes” Abkopieren der Oberfläche zu verstehen ist. Hier wird eine möglichst identische Kopie des Originals erzeugt. Im Falle von Mikroarrays hat man nach dem Kopierprozess von einem DNA-Array ein weiteres DNA-Array erhalten.
Ausführungsbeispiele der Erfindung ermöglichen die Erstellung eines partiellen Replikats, also eines Derivats, eines Arrays. Unter einem partiellen Replikat oder einer partiellen Kopie ist eine gezielte Auswahl der kopierten Information zu verstehen. Beispielsweise kann während des Kopierprozesses eines DNA-Arrays durch Auswahl von Primern, die der Träger als Bindungsadapter aufweist, nur eine bestimmte Art der DNA vervielfältigt werden. Hierdurch gelangt man zu einem Subset, das die gewünschte Information erhält, wie z. B. alle DNA-Stränge, die eine bestimmte Sequenz oder einen bestimmten Promotor enthalten.
Ebenso wird unter einem Derivat eine „Umformung” der Kopie von einer DNA zu einer RNA oder cDNA, von einer RNA zu einer DNA, cDNA oder zum Protein bezeichnet. Hierbei werden die biochemischen Informationen von einer Molekülsorte in eine andere transferiert und die Ortsinformation bleibt weiterhin erhalten.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung werden die begrenzten Wirkbereiche in Form von räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereichen durch Festkörperstrukturen erzeugt, während bei alternativen Ausführungsbeispielen der Erfindung zur Erzeugung der der räumlich begrenzten Wirkbereiche Phasengrenzen zwischen Flüssigkeiten unterschiedlicher Viskosität beitragen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich ferner auf Anwendungen entsprechender Replikate und Derivate zu Analysezwecken, in Bezug auf Reaktion oder Wechselwirkung mit anderen Molekülen oder Partikeln, sowie in Bezug auf die Katalyse von Reaktionen
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindungen werden nachfolgend Bezug nehmend auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
1a bis 1d schematische Querschnittdarstellungen zur Veranschaulichung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens;
2 schematisch eine Draufsicht auf einen Ausschnitt eines Sequenzierer-Chips;
3 schematisch eine Querschnittdarstellung eines Sequenzierer-Chips mit DNA-Partikeln;
4a bis 4c schematisch Querschnittdarstellungen zur Veranschaulichung eines weiteren Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens;
5a bis 5d schematisch Querschnittdarstellungen zur Veranschaulichung eines weiteren Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens;
6a bis 6d schematisch Querschnittdarstellungen zur Veranschaulichung eines weiteren Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens; und
7 eine schematische Darstellung zur Veranschaulichung eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung.
Anhand der 1a bis 1d wird nachfolgend ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, bei dem das primäre Array in Form eines Sequenzierer-Chips 10 vorliegt. Der Sequenzierer-Chip 10 weist eine Mehrzahl von Mikrokavitäten 12 auf. Eine schematische Draufsicht auf einen Ausschnitt des Sequenzierer-Chips 10 mit den Mikrokavitäten 12 ist in 2 gezeigt. Die Mikrokavitäten können beispielsweise eine Abmessung von 44 μm aufweisen, wie in 2 gezeigt ist. Der Sequenzierer-Chip kann beispielsweise ein Sequenzierer-Chip (GS Titanium 2005 und GS FLX Titanium 2008) des 454-Sequenzers der Firma Roche sein.
In jede der Kavitäten 12 ist ein Partikel 14 verbracht, wobei jeder dieser Partikel 14 Millionen Kopien eines einzelnen DNA-Stranges 16 trägt. Eine schematische Querschnittdarstellung des Sequenzierer-Chips 10 mit den Kavitäten 12, in die die Partikel 14 mit den DNA-Strängen 16 eingebracht werden, ist in 3 gezeigt. Bisher werden die Sequenzierer-Chips nach der Sequenzierung in den Müll geworfen und fallen daher als „Abfallprodukt” bei der Sequenzierung an.
Bei dem in den 1 bis 3 dargestellten Ausführungsbeispiel wird dieser Chip als primäres Array für die Herstellung eines Replikats verwendet. Es soll die DNA aus den Kavitäten 12 herauskopiert werden. Die Kavitäten werden zu diesem Zweck zunächst mit einem Amplifikationsmittel befällt, beispielsweise einem PCR-Mix. Danach wird, wie in 1b gezeigt ist, ein Träger 20 aufgebracht, der die Kavitäten 12 verschließt und zu dem Amplifikationsmittel passende Bindungsadapter trägt, die in 1b schematisch als Punkte 22 gezeigt sind. Nach dem Verschließen der Kavitäten 12 durch den Deckel 20 ist somit für jede Probe, d. h. jedes Partikel 14 mit daran gebundenen DNA-Strängen 16, ein räumlich begrenzter Amplifikationsmittelbereich 24 erzeugt, der von den Amplifikationsmittelbereichen 24 der anderen Proben getrennt ist. Die Bindungsadapter 22 grenzen an diese Amplifikationsmittelbereiche 24 an. Beispielsweise sind die Bindungsadapter 22 zu dem PCR-Mix passende Primer. Diese Primer sind Bindungsstellen für die DNA-Polymerase. 1b zeigt bereits den Zustand nach dem Polymerase-Schritt, in dem biochemische Kopien der DNA vom Partikel gefertigt werden. Diese Kopien sind in 1b als gestrichelte Linien 18 dargestellt. Beispielsweise kann durch die Wahl der Primer ein als Amplifikationsmittel verwendeter Enzym-Mix bei diesem Schritt eine komplementäre DNA, d. h. eine Negativ-Kopie, erstellen.
Nachfolgend werden die erstellten Kopien 18 der DNA von den Partikeln 14 gelöst, was beispielsweise durch Erwärmen des Sequenzierer-Chips und somit der Kavitäten, in dem dieselben angeordnet sind, erfolgen kann. Anschließend lagern sich die gelösten Kopien 18 an die Bindungsadapter 22 an, was beispielsweise durch Abkühlen des Sequenzierer-Chips unterstützt werden kann. Das Ergebnis des Ablagerns der Kopien 18 an den Bindungsadapter 22 und somit den Träger 20 ist in 1c dargestellt. Bei diesem Schritt des Kopierens der Kopien an den Träger 20 bleibt die Ortsinformation bzw. die Registrierung erhalten, da für jede Probe ein räumlich begrenzter Amplifikationsmittelbereich 24 vorgesehen ist und die Amplifikationsmittelbereiche 24 voneinander getrennt sind.
Anschließend wird der Träger 20 mit den daran gebundenen DNA-Kopien 18 von dem Sequenzierer-Chip 10 entfernt und stellt ein Replikat des durch die in den Kavitäten 12 des Sequenzierer-Chips 10 angeordneten DNA-Partikels 14, 16 dar. Die Partikel 14 mit den DNA-Strängen 16 verbleiben in den Kavitäten 12, so dass dieser wieder als primäres Array für einen erneuten Kopiervorgang mit einem neuen Träger dienen kann. Somit kann eine quasi beliebige Anzahl von Kopien erstellt werden. Der Träger 20 mit den daran gebundenen DNA-Kopien 18 kann beispielsweise als Biochip in einer Transkriptom-Analyse eingesetzt werden.
Um nach dem Kopiervorgang das primäre Array (den Sequenzierer-Chip 10) wieder für einen weiteren Kopierzyklus vorzu bereiten, kann das Amplifikationsmittel in den Kavitäten, beispielsweise der PCR-Mix, ersetzt oder entfernt werden.
In den 4a bis 4c ist ein weiteres Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, bei dem ein herkömmliches planares Mikroarray als primäres Array dient. Das planare Mikroarray ist auf einem Arraysubstrat 30 angeordnet und enthält die gewünschten DNA-Proben. Die DNA-Proben besitzen eine zweidimensionale räumliche Anordnung. Für den Kopiervorgang der DNA-Proben wird eine Mikrostruktur 34 mit Kavitäten 36 bereitgestellt. Für jede DNA-Probe 32 ist zumindest eine Kavität 36 vorgesehen. Um eine höhere Auflösung zu erhalten, kann bei alternativen Ausführungsbeispielen für jede DNA-Probe 32 eine Mehrzahl von jeweils kleineren Kavitäten 36 vorgesehen sein. In den Kavitäten 36 sind Bindungsadapter 38 angeordnet.
Die Kavitäten bzw. Mikrokavitäten 36 werden mit einem Amplifikationsmittel befüllt, beispielsweise einem Polymerase-Mix. Die Mikrostruktur 34 wird dann auf das Mikroarray 30 verbracht, so dass die Kavitäten 36 durch das Arraysubstrat 30 verschlossen werden und die DNA-Proben in der jeweils zugeordneten Kavität 36 angeordnet sind. Dadurch wird wiederum für jede DNA-Probe ein räumlich begrenzter Amplifikationsmittelbereich 35 erzeugt, der von den Amplifikationsmittelbereichen 35 der anderen Proben getrennt ist. Die Bindungsadapter 38 können wieder durch zu einem Polymerase-Mix passenden Primer gebildet sein.
Nach dem Erzeugen der so abgeschlossenen Amplifikationsmittelbereiche 35 findet wiederum ein Polymerase-Schritt statt, bei dem die DNA-Proben 32 vervielfacht und in die Kavitäten 36 kopiert werden. Die kopierte DNA wird an den Bindungsadaptern 38 verankert, wie durch die DNA 42 schematisch in 4b gezeigt ist. Zu diesem Zweck kann wiederum die Temperatur der Kavitäten mit den darin befindlichen DNA-Proben entsprechend gesteuert werden. Schließlich wird das DNA-Substrat 30 mit den daran befindlichen DNA-Proben 32 von der Mikrostruktur 34 entfernt, so dass die Mikrostruktur 34 mit der kopierten DNA 42 ein Replikat des ursprünglichen Mikroarrays darstellt. Die so mit den DNA-Kopien 42 beladene Mikrostruktur 34 kann nun als Vorlage für weitere Kopierschritte verwendet werden, die beispielsweise analog zu dem Verfahren, wie es oben Bezug nehmend auf die 1a bis 1d beschrieben wurde, durchgeführt werden können. Die Mikrostruktur 34 kann dabei so ausgebildet sein, dass sie nach dem Kopiervorgang die gleichen Eigenschaften wie ein Sequenzierer-Chip, beispielsweise der Sequenzierer-Chip aus dem 454-Sequenzierer der Firma Roche, aufweist.
Ein Ausführungsbeispiel kann eine Kombination der Verfahren gemäß den oben beschriebenen Ausführungsbeispielen aufweisen. Zunächst kann ein Sequenzierer-Chip verwendet werden, um durch ein Kopierverfahren gemäß den obigen 1a bis 1d einen planaren Träger mit einem Mikroarray der gesamten DNA herzustellen. Danach wird dieser Träger gemäß dem Bezug nehmend auf das in den 4a bis 4c beschriebene Ausführungsbeispiel nochmals kopiert. Die so mit DNA belegten Mikrokavitäten (Mikrokavitäten 36 in den 4a bis 4c) können nun dazu verwendet werden, weitere Kopien der DNA herzustellen, beispielsweise nach dem verfahren gemäß den 1a bis 1d. Alternativ können die mit DNA belegten Mikrokavitäten verwendet werden, um veränderte Kopien in Form von komplementärer DNA, Subgruppen an DNA, verkürzte, verlängerte oder veränderte DNA, oder gar RNA bis hin zu Protei nen herzustellen. So können beliebige Arrays mit DNA, RNA oder Proteinen oder Peptiden hergestellt werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun Bezug nehmend auf die 5a bis 5d beschrieben. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird mittels einer Wasser-in-Öl-Emulsions-PCR DNA auf einzelne Partikel 50 vervielfältigt. Pro Partikel ist eine Sorte DNA verankert. Diese Partikel 50 werden auf einer Oberfläche eines Trägers 52 abgelegt. Genauer gesagt befinden sich die Partikel 50 in jeweiligen Flüssigkeitströpfchen 54, beispielsweise Wassertröpfchen. Die Wassertröpfchen sind durch einen Ölfilm 56 voneinander separiert. Die Wassertröpfchen tragen somit zur Definition räumlich begrenzter, voneinander getrennter Amplifikationsmittelbereiche 54' (5c) bei. Die Wassertröpfchen 54 können durch eine hydrophile Beschichtung an den jeweiligen Positionen an der Oberfläche des Trägers 52 fixiert werden, so dass dieselben in einer gegebenen räumlichen Anordnung auf dem Träger 52 angeordnet sind. Beispielsweise kann der Träger 52 ein regelmäßiges Muster aus hydrophilen Punkten aufweisen, das der Anordnung der Proben von biochemischen Molekülen entspricht. In die Wassertröpfchen 54 ist jeweils ein Amplifikationsmittel eingebracht. Somit ist für jede Probe in Form des Partikels 50 mit der daran gebundenen DNA ein räumlich begrenzter Amplifikationsmittelbereich vorgesehen, der von den Amplifikationsmittelbereichen der anderen Proben durch die Phasengrenzen zwischen den Flüssigkeiten, z. B. Wasser und Öl, getrennt ist. Ein Träger 60 mit Bindungsadaptern 62 wird, wie in 5b gezeigt ist, bereitgestellt. Der Träger 60 mit den Bindungsadaptern 62 wird auf den Ölfilm 56 aufgedrückt, so dass das Öl, das dünnflüssiger ist als Wasser, verdrängt wird und der Träger 60 mit der Oberfläche, die die Bin dungsadapter 62 aufweist, in Berührung mit den Wassertröpfchen 54 kommt. Diese können dabei leicht zusammengedrückt werden, wie in 5c dargestellt ist.
Anschließend wird die DNA, die an die Partikel in den Tröpfchen 54 gebunden ist, mittels des Amplifikationsmittels amplifiziert, um DNA-Kopien zu erzeugen. Diese DNA-Kopien 64 werden an die Bindungsadapter 62 gebunden und zusammen mit dem Träger 60 von dem Substrat 52 entfernt. Der Träger 60 mit den daran gebundenen kopierten DNA-Proben 64 stellt somit ein Replikat des ursprünglichen Arrays dar.
Bei alternativen Ausführungsbeispielen können statt auf dem Träger 60 auf dem Substrat 52 Bindungsadapter vorgesehen sein, so dass die DNA auf das Substrat 52 kopiert wird, während der Träger 60 lediglich als Gegenhalter dient. Auch dieses Ausführungsbeispiel ermöglicht somit die Erzeugung eines planaren Mikroarrays als Abbild eines Partikel-Arrays unter Verwendung einer Wasser-in-Öl-Emulsions-PCR. Somit ist eine schnelle Herstellung eines DNA-Arrays möglich. Weiterhin können auch RNA-, Protein- oder veränderte DNA-Kopien hergestellt werden.
Erfindungsgemäß wird für jede Probe des Arrays, das kopiert werden soll, d. h. für das ein Replikat oder Derivat erzeugt werden soll, ein räumlich begrenzter Wirkbereich erzeugt. Die räumliche Erzeugung des Wirkbereichs kann auf unterschiedliche Arten erfolgen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung ist für jede Probe eine räumlich geschlossene Kavität vorgesehen. Bei Ausführungsbeispielen kann eine räumliche Abgrenzung vorgesehen sein, die die Diffusion in bestimmte Richtungen erleichtert und in andere Richtungen erschwert, wie beispielsweise eine Anordnung von Säulen oder Gräben. Bei Ausführungsbeispielen können ein poröses Material, ein diffusionsbestimmendes Material oder molekulare Strukturen, die eine Diffusion in bestimmte Richtungen bevorzugen bzw. einschränken, verwendet werden, wie z. B. Hydrogele, Aerogele oder Polymeroberflächen. Bei Ausführungsbeispielen können geordnete oder ungeordnete Nano- oder molekulare Strukturen wie Polymerbranches, Dendrimere, Partikelarrays, Filtermembranen, Lipidmembranen (sphärisch oder planar) verwendet werden, um räumlich begrenzte Wirkbereiche zu implementieren.
Bei Ausführungsbeispielen können physikalische Felder, wie elektrische oder magnetische Felder, die ebenfalls eine bevorzugte Diffusionsrichtung erzeugen (Elektrophoresen, optische Pinzetten, Magnetophorese, Surface accoustic waves, ...) oder eine Diffusionsbarriere schaffen und so eine räumliche Trennung aufbauen, verwendet werden, um räumlich begrenzte Wirkbereiche zu erzeugen. Beispielsweise können eine magnetische Flüssigkeit und „härtende” Magnetfelder verwendet werden, oder ein Laserlichtgitter, dass die einzelnen Bereiche trennt.
Bei Ausführungsbeispielen kann zur Erzeugung von räumlich begrenzten Wirkbereichen eine Aktivierung und/oder Deaktivierung innerhalb oder außerhalb der Wirkbereiche erfolgen, z. B. mittels elektrischer Felder, Ladung, pH-Wert-Änderung, De/Aktivierung mittels Licht, Druck und dergleichen. Beispielsweise kann eine Lichtaktivierung der Polymerase oder Erzeugung von aktivierten Nukleotiden durch Licht in einem begrenzten Bereich erfolgen. In den dunklen Bereichen findet dann keine Reaktion statt.
Bei weiteren Ausführungsbeispielen können Oberflächenstrukturen verwendet werden, die unter bestimmten physikalischen Effekten einen räumlich begrenzten Wirkbereich schaffen. Beispielsweise können hier hydrophobe/hydrophile Bereiche (z. B. Öl und Wasser) oder Polymere genannt werden, die in bestimmten Bereichen quellen und verhärten können, durch elektrische Felder, und so ebenfalls räumlich begrenzte Wirkbereiche definieren können.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel, bei dem ein räumlich begrenzter Wirkbereich durch eine dreidimensionale Struktur definiert wird, wird nun Bezug nehmend auf die 6a bis 6d beschrieben. Wie in 6a gezeigt ist, sind Proben 100 von Molekülen, die Teil eines Arrays sind, auf Erhebungen 102 eines Array-Substrats 104 angeordnet. Zwischen den Erhebungen 102 sind Vertiefungen 103 in dem Array-Substrat 104 gebildet. Ein Träger 106 mit Bindungsadaptern 108 in Form eines Festphasenprimers wird in die Nähe des Array-Substrats 104 gebracht, wie in 6b gezeigt ist. Durch die räumliche Nähe des Array-Substrats 104 und des Trägers 106 entstehen im Bereich der Erhebungen 102 räumlich begrenzte Wirkbereiche zwischen den sich gegenüberliegenden Oberflächen der Erhebungen 102 und des Trägers 106. Dagegen ist der Abstand zwischen sich gegenüberliegenden Oberflächen der Vertiefungen 103 und des Trägers 106 so groß, dass hier kein Wirkbereich entsteht.
In den Wirkbereichen erlaubt der Kontakt zwischen dem Festphasenprimer und den Proben 100 ein Hybridisieren, so dass eine Amplifikation starten kann, wie in 6c gezeigt ist. Material für die Amplifikation kann aus den Vertiefungen nachgeliefert werden, wie in 6c durch Pfeile 112 angedeutet ist. Dadurch werden Replikate 114 der Proben 100, die an den Träger 106 gebunden sind, erzeugt, und somit ein Replikat des durch die Proben 100 gebildeten Arrays.
Ausgehend von dem in 6c gezeigten Zustand können nun das Array-Substrat 104 und der Träger 106 getrennt werden, wobei die Proben 100 an dem Array-Substrat 104 verbleiben und die Replikate 114 mit dem Träger 106 entfernt werden. Weitere Kopien können dann entweder von dem auf dem Array-Substrat 104 befindlichen Array oder von dem auf dem Träger 106 befindlichen Replikat gemacht werden.
Bei dem bezüglich der 6a bis 6d beschriebenen Ausführungsbeispiel finden eine Amplifikation und eine Übertragung auf den Träger im wesentlichen gleichzeitig statt. Finden Übertragung und Amplifikation getrennt voneinander statt, kann bei alternativen Ausführungsbeispielen ein Schritt großflächig und der andere räumlich definiert stattfinden.
Bei dem Bezug nehmend auf die 6a bis 6d beschriebenen Ausführungsbeispiel werden die räumlich begrenzten Wirkbereiche somit durch die beschriebenen Strukturen sowie die Anwesenheit eines Primers erzeugt. Die Reaktion entspricht hier einer Bridge-Amplifikation. Man bringt hierbei die Oberflächen in physikalischen Kontakt. Durch die räumliche Nähe entsteht an den Erhebungen, d. h. den Säulenspitzen ein „Wirkbereich” in dem die DNA auf die andere Oberfläche kopiert wird. Danach kann man sogar diese Spitzen entfernen, da es sich dann um eine klassische Bridgeamplifikation handelt, die sozusagen ihren eigenen Wirkungsbereich definiert. Aber der Start der Reaktion kommt nur durch die Anfangsbedingung des räumlichen Wirkbereichs zustande. Man könnte diese Reaktion als Kanten- oder Spitzenamplifikation bezeichnen. Die räumliche Kante oder Spitze startet die Reaktion. Der freie Raum neben der Kante versorgt die Reaktion mit allen benötigten Materialien.
Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel könnte abweichend von den 6a bis 6d das zu kopierende Array auf einem planaren Substrat angeordnet sein, während die Erhebungen auf dem Träger gebildet sind, auf den das Array kopiert wird. Wiederum alternativ können Erhebungen sowohl auf dem Array-Substrat als auch auf dem Träger gebildet sein.
Ein Ausführungsbeispiel, wie räumlich begrenzte Wirkbereiche durch Energiefelder, beispielsweise magnetische der elektrische Felder, erzeugt werden können, ist in 7 gezeigt. 7 zeigt schematisch lediglich ein Array-Substrat 120 und einen Träger 122. Molekülproben auf dem Array-Substrat 120, die kopiert werden sollen, sowie Bindungsadapter auf dem Träger 122 sind der Einfachheit halber nicht dargestellt. Im Bereich jeweiliger Proben von Molekülen sind Felderzeugungseinrichtungen 124 angeordnet, die ausgebildet sind, um Energiefelder 126 in einem zwischen Array-Substrat 120 und Träger 122 angeordneten Amplifikationsmittel zu erzeugen. Dadurch werden räumlich begrenzte Wirkbereiche 128 erzeugt, in denen das Amplifikationsmittel aktiviert ist, während dies in den übrigen Bereichen nicht der Fall ist.
Ausführungsbeispiele erfindungsgemäßer Verfahren wurden oben erläutert. Ausführungsbeispiele entsprechender Vorrichtungen bzw. Einrichtungen zum Implementieren der erfindungsgemäßen Verfahrensschritte ergeben sich aus der Be schreibung oder sind für Fachleute offensichtlich. So bedarf es keiner weiteren Erläuterung, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung geeignete Handhabungseinrichtungen aufweisen kann, um die physikalischen Entitäten, z. B. die verschiedenen Arrays, Träger oder Substrate, nach Bedarf zu positionieren. Ferner bedarf es keiner weiteren Erläuterung, dass geeignete Fluidikeinrichtungen vorgesehen sein können, um die jeweiligen Flüssigkeiten bzw. Mittel an den erforderlichen Positionen bereitzustellen. Ferner ist es für Fachleute offensichtlich, dass eine entsprechende Steuerung vorgesehen sein kann, um die Vorrichtung zu steuern, um die erfindungsgemäßen Verfahren auszuführen. Einrichtungen zum Erzeugen einer zur Durchführung der Verfahren erforderlichen Umgebung, beispielsweise Temperaturgeber, können ebenfalls vorgesehen sein.
Ausführungsbeispiele der Erfindung eignen sich insbesondere zum Erzeugen eines Replikats oder Derivats von Arrays, bei denen die Moleküle einzel- oder doppelsträngige Oligonucleotide, Polynucleotide, DNA oder synthetische DNA-analoge Moleküle (PNA) sind. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können als primäres Array eine räumlich planare Anordnung, wie z. B. ein Mikroarray, eine räumliche Anordnung von Partikeln, beispielsweise in einem Sequenzierer-Chip, eine räumliche Anordnung von Kavitäten, beispielsweise in einer Nanowellplatte oder eine räumliche Anordnung von unterschiedlichen Phasen, beispielsweise einzelner Flüssigkeitsdroplets, dienen. Weiterhin können Partikel-basierte Assays wie beispielsweise von den Firmen Illumina oder Applied Biosystems (SOLID) ebenfalls als solcherlei Arrays angesehen werden. Bei Ausführungsbeispielen können die biochemischen Moleküle, beispielsweise die Oligo- oder Polynucleotide, aus einer Sequenzierung zur Ableitung des Genoms, ei ner Sequenzierung zur Ableitung des Transkriptoms, einer Sequenzierung von RNA (wie z. B. mRNA, tRNA, siRNA oder RNA allgemein) oder einer Sequenzierung von Mutationen und Variationen kopiert werden. Die erzeugten Kopien können bei Ausführungsbeispielen der Erfindung DNA, veränderte DNA (verlängert, verkürzt, artifiziell, Inserts, Deletion, Mutation ...), DNA-Konstrukte (Expressionsvektoren, siRNA) artifizielle Moleküle (PNA, modifizierte Peptide), Expressionen, RNA oder Proteine sein, jeweils zur Fertigung eines Arrays.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können Oligo- oder Polynucleotide aus einer Sequenzierung zur Erzeugung eines Arrays oder einer strukturierten Oberfläche kopiert werden. Bei Ausführungsbeispielen können Oligo- oder Polynucleotide von einer Anordnung von Partikeln zur Herstellung eines Arrays oder zur Beschichtung einer Oberfläche kopiert werden. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung können Oligo- oder Polynucleotide von einer Oberfläche zur Herstellung einer Kopie, zur Herstellung einer komplementären Kopie oder zur physikochemischen Veränderung der Oberfläche kopiert werden.
Bei Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung können Oligo- oder Polynucleotide auf eine weitere Oberfläche kopiert werden, zum Zwecke der chemischen oder biochemischen Modifikation für eine Anwendung aufgrund der neuen Oberflächeneigenschaften oder für biochemische Prozessketten zur Herstellung von chemischen Stoffen. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann ein Partikel-Array, das beispielsweise mittels einer Wasser-in-Öl-Emulsions-PCR hergestellt sein kann, aber nicht sein muss und auch ohne sequenziert zu werden, zur Herstellung eines Arrays einer DNA- Bibliothek, zur Herstellung eines Arrays mit verschiedenen DNA-Mutanten, zum Weiterkopieren dieser Arrays zu RNA oder Proteinen oder zur Verwendung der Kopien in zellulären Experimenten kopiert werden.
Ausführungsbeispiele der Erfindung können in zahlreichen Anwendungsgebieten Verwendung finden. Beispiele solche Anwendungsgebiete sind die Sequenzierung, die Transkript-Analyse, die Messung von DNA, RNA oder Proteinaktivität, Expressionsuntersuchungen, Display-Techniken unter Verwendung von Phage-Displays, Ribosome-Displays oder Zell-Displays, und Metabolit-Studien. Ferner kann die Erfindung bei Wechselwirkungsstudien Anwendung finden, beispielsweise in Folgenden: DNA-DNA; DNA-RNA; DNA-Protein; RNA-Protein; RNA-Zelle; Protein-Protein; Kinase-Aktivität; Protease-Aktivität; Phosphatase-Aktivität; DNA-bindende Proteine; Epitopmapping; Pathogenbestimmung; und Bestimmung von Substanzen oder Inhibitoren.
Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung im Bereich der Impfstoffentwicklung Anwendung finden, wobei ein Beispiel im Folgenden dargelegt sei. Angenommen ein neuer Virus/Bakterium tritt auf. Vom ersten Lebewesen, das überlebt, wird eine Zellprobe und eine Blutprobe genommen. Die Zellprobe wird mit dem Virus infiziert und man isoliert die mRNA. Diese wird dann sequenziert und die erhaltene DNA wird herauskopiert. Nun wird das DNA-Array in ein Protein-Array umgeschrieben. Somit enthält dieses Array Proteine der Zelle und veränderte Proteine durch den Virenbefall. Nun wird die Blutprobe auf das Array gegeben und die Antikörper darin binden an die Proteine. Es binden nur Antikörper an die Virenproteine, da die Antikörper per se nicht an eigenes Protein binden. Mittels eines Färbeschrittes kann man dann die gebundenen Antikörper nachweisen. Somit kann man die DNA- und Protein-Sequenzen des Virus bestimmen. Damit hat man innerhalb kürzester Zeit ein Wissen über Epitope und Bindungsproteine der Antikörper. Somit können mit dieser Information umgehend sowohl passive als auch aktive Impfstoffe erzeugt werden. Hierdurch kann im Falle einer Epidemie die Zeit bis zur Herstellung eines Impfmittels drastisch verringert werden.
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung ermöglichen somit einen kompletten Arbeitsgang, bei dem das in einer Sequenzierung erzeugte Array aus DNA-Sequenzen (primäres Array) auf eine Oberfläche überführt werden soll und damit eine Kopie dieser DNA (sekundäres Array) erzeugt werden soll. Des Weiteren soll bei Ausführungsbeispielen das primäre oder sekundäre Array zusätzlich noch als eine weitere Kopie in Form von RNA oder Protein (tertiäres Array) abgeformt werden. Bei Ausführungsbeispielen kann jedes Array aus biochemischen Molekülen, wie z. B. DNA, als primäres Array angesehen werden. Weiterhin kann durch eine geeignete Wahl des Kopierverfahrens eine identische oder selektive Kopie des Originals erzeugt werden. Daher beziehen sich Ausführungsbeispiele der Erfindung darauf, noch vor, während oder nach einer Gensequenzierung das dabei verwendete Array zu kopieren und als Mikroarray abzubilden und optional dieses dann in weiteren Kopierschritten in ein Gen-, cDNA-, RNA- oder gar Proteinarray zu reformieren.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind vorteilhaft, dahingehend, dass noch während einer Sequenzierung eine molekulare Information ortsaufgelöst beliebig oft repliziert werden kann. Hierfür ist nur ein Original als Vorlage notwendig. Über die Natur des Originals und die darin enthaltenen Daten muss keine Information vorliegen. Der Kopierprozess ist somit unabhängig von der enthaltenen Information. Weiterhin erlauben es Ausführungsbeispiele der Erfindung, ohne den Einsatz von Vor-Ort-Synthesen oder Druck/Dispensiereinheiten Mikroarrays herzustellen oder biochemische Oberflächenstrukturierungen zu kopieren. Der Kopierprozess läuft auf molekularer Ebene und bedient sich etablierter biochemischer Systeme. Da die Ortsinformation erhalten bleibt, erlaubt der Kopierprozess eine hochparallele Prozessierung der biochemischen Informationen. Dies ermöglicht die Verbindung unterschiedlicher Mikroarray-Typen auf molekularer Ebene und umgeht die zeit- sowie kostenaufwändige Herstellung von Mikroarrays nach Kenntnis einer Sequenz.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung weisen Mikro- oder Nanostrukturen, die zur Definition räumlich begrenzter Amplifikationsmittelbereiche beitragen, eine ungeordnete Matrix auf, insbesondere auf der Basis einer Filtermembrane, eines Hydrogels oder eines Aerogels. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung basieren die Mikro- oder Nanostrukturen auf einem geordneten dreidimensionalen Substrat.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung sind die die räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereiche zumindest teilweise durch Phasengrenzen zwischen zwei Flüssigkeiten, einer Flüssigkeit und einem Gas oder einer physikalischen Grenze, insbesondere einer Lipidmembran, getrennt.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann das Binden der Replikate oder Derivate an den Träger auch gleichzeitig mit der Amplifikation erfolgen bzw. Bestandteil der Amplifikation sein, indem ein immobilisierter Bindungsadapter als Primer für die Amplifikation fungiert. Ferner können Deri wate über ein immobilisiertes Fängermolekül an den Träger gebunden werden, oder indem sie an das zu deren Erzeugung eingesetzte System gekoppelt bleiben und dieses System auf dem Träger immobilisiert ist. Dieses System kann beispielsweise aus Enzymen, Ribosomen oder Zellen bestehen.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung besteht die räumliche Begrenzung des Wirkbereichs darin, dass die Bindungsadapter als komplementäre Primer auf dem Träger in Form eines Primer-Arrays vorliegen, das eine regelmäßige oder unregelmäßige Verteilung von Punkten aufweisen kann, wobei die Punktgröße und Punktdichte auf dem Träger gleich oder kleiner als auf dem Array sind.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung ist das Amplifikationsmittel ausgelegt, um eine DNA-Amplifikation, insbesondere eine Polymerasekettenreaktion, eine isothermale Amplifikation oder eine NASBA-Reaktion, zu bewirken, und der Bindungsadapter einen dazu passenden Primer aufweist.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung werden von einem primären Array oder einem Replikat des primären Arrays primäre, sekundäre und/oder tertiäre Derivate generiert, indem DNA zu RNA transkribiert wird, die RNA in Protein translatiert wird, oder mit Hilfe eines erzeugten Proteins, einer erzeugten RNA oder einer erzeugten DNA oder deren Kopie aus einer Flüssigphase ein Binder angereichert wird oder wechselwirkt.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird ein Derivat auf der Festphase eines Zielarrays generiert und liegt dort immobilisiert vor. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung liegen am Ort der Proben noch weitere Moleküle oder DNA- Sequenzen oder Zellen vor, die Bestandteil der Probe sind oder immobilisiert sind und die zur Generierung von Derivaten erforderlich sind, insbesondere Expressionsvektorsequenzen wie Ori, Promotor, Ribosombindestellen, Startcodon, Endoproteasespaltstellen, Fusionssequenzen, Reportergene, Terminatoren, Antibiotikaresistenzgene, In-Vitro-Translationssysteme oder Zellen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich auf ein Replikat oder Derivat eines Arrays von Molekülen, das unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wurde und auf Verwendungen eines solchen Replikats oder Derivats. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird ein solches Replikat oder Derivat verwendet, um eine Reaktion zwischen einem Binder, insbesondere einem Protein, Antikörper oder Antigen, mit einem Originalmolekül, dessen Replikat oder dessen Derivat mit der DNA-Sequenz des Originalmoleküls in Zusammenhang zu bringen, insbesondere für eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird ein solches Replikat oder Derivat verwendet, um eine Reaktion, bei der das Originalmolekül, dessen Kopie oder dessen Derivat die Umsetzung eines Substrates katalysiert, mit der DNA-Sequenz des Originalmoleküls in Zusammenhang zu bringen, insbesondere für eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung. Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich auf eine DNA-Sequenz, die durch eine solche Verwendung identifiziert ist und auf Erzeugnisse oder Präparate, die auf der Basis einer solchen DNA-Sequenz hergestellt wurden, insbesondere Antikörper, Antigen, Impfstoff oder Antibiotikum.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird ein Replikat oder ein Derivat, das nach einem erfindungsgemäßen Verfah ren hergestellt wurde, verwendet, um Reaktionen zwischen einer Probe, eines Replikats oder eines Derivats davon mit einem wechselwirkenden Molekül oder Partikel zu detektieren, wobei die Detektion durch einen optischen, elektrochemischen oder magnetischen Sensor erfolgt und das wechselwirkende Molekül bzw. der wechselwirkende Partikel eine entsprechende Markierung trägt, oder die Detektion markierungsfrei über die Veränderung des evaneszenten Feldes, oder einer veränderten Resonanzfrequenz erfolgt, oder durch Einsatz einer optischen Pinzette, oder durch Kopplung der Reaktion mit einer Absorptionsveränderung, insbesondere Niederschlag oder Farbumschlag oder mit der Emission von Licht, insbesondere Chemilumineszenz. Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung wird ein gleiches Sequenziergerät zur Detektion der Reaktionen verwendet wird, das auch zur Detektion der Sequenzierung verwendet wird.
Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich auf eine Verwendung eines entsprechenden Replikats oder eines entsprechenden Derivats zur Durchführung von Reaktionen auf dem Replikat oder Derivat des Arrays, wobei über der Oberfläche des Replikats oder Derivats eine Kammer bzw. Fluidikstruktur mit Anschlüssen aufgebracht wird oder das Replikat oder Derivat in einen entsprechende Kammer eingebracht wird, wobei die Kammer bei einer bestimmten Temperatur inkubiert werden kann und in der Kammer befindliche Flüssigkeiten ausgetauscht werden können. Eine solche Verwendung kann in einer Vorrichtung stattfinden, die auch zum Sequenzieren des Arrays eingesetzt wird.
Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich auf die Verwendung eines entsprechenden Replikats oder Derivats zur gleichzeitigen Durchführung von Reaktionen und Detektionen auf dem Replikät oder Derivat. Ausführungsbeispiele der Erfindung beziehen sich auf ein Verfahren zur Sequenzierung eines Flüssig-Partikel-Arrays, wobei ein Replikat von auf Partikeln enthaltenen Proben erzeugt wird und das Replikat in einem Sequenziergerät sequenziert wird.
Bei Ausführungsbeispielen der Erfindung kann während des Amplifikations- oder des Bindungsvorganges das Voranschreiten der Reaktion mit Standardmethoden ausgelesen werden. Dies eröffnet Anwendungen im Bereich der Enzym-, Bindungs- und Reaktionskinetik. Beispielweise kann ein Enzym hergestellt werden, das CO2 bindet. Dieses könnte dann sofort durch die Änderung des pH-Wertes nachgewiesen werden. Ebenso könnten andere enzymatische oder katalytische Aktivitäten oder Bindungseigenschaften nachgewiesen werden. Darunter fallen dann sozusagen alle biochemischen Meßtechniken von der bloßen Anwesenheit eines Moleküls bis hin zu seiner Wirkungsweise. Ausführungsbeispiele der Erfindung umfassen somit ein Verfolgen von Änderungen von physikalischen oder chemischen Größen mit bekannten Detektionsmethoden innerhalb der einzelnen Wirkbereiche während der Anwendung, was eine bisher nicht vorhandene Einsicht in die Wirkmechanismen sowohl des Amplifikationsmittels, als auch des primären Arrays wie auch seiner Derivate ermöglicht.
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[17] MARGULIES, M. u. a.: Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature (2005) 437, 376–380

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Replikats oder eines Derivats eines Arrays von Molekülen (16; 32; 50), wobei das Array eine räumliche Anordnung getrennter Proben von Molekülen (16; 32; 50) aufweist, mit folgenden Schritten: Erzeugen zumindest eines räumlich begrenzten Wirkbereichs (24; 35; 54') für jede Probe, der von den Wirkbereichen (24; 35; 54) der anderen Proben getrennt ist, wobei eine mit einem Bindungsadapter (22; 38; 62) oder Bindungseigenschaften versehene Oberfläche eines Trägers (20; 34; 60) an die Wirkbereiche (24; 35; 54') angrenzt; Amplifizieren der Moleküle (16; 32; 50) mittels Amplifikationsmitteln in den Wirkbereichen (24; 35; 54') zum Erzeugen von Replikaten (18; 32; 64) oder Derivaten der Proben; Binden der Replikate oder Derivate (18; 32; 64) der Proben an den Träger (20; 34; 60) mittels des Bindungsadapters oder der Bindungseigenschaften (22; 38; 62), so dass eine räumliche Anordnung der Kopien oder Derivate der Proben auf dem Träger der räumlichen Anordnung der Proben in dem Array entspricht; und Entfernen des Trägers (20; 34; 60) mit den Replikaten oder Derivaten (18; 32; 64) der Proben von dem Array.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Erzeugen eines räumlich begrenzten Wirkbereichs das Erzeugen eines räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereichs (24; 35) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereiche (24; 35) zumindest teilweise durch Mikro- oder Nanostrukturen (12; 36) in einem Arraysubstrat (10) des Arrays oder in dem Träger (34) definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Mikro- oder Nanostrukturen eine ungeordnete Matrix aufweisen, insbesondere auf der Basis einer Filtermembrane, eines Hydrogels oder eines Aerogels.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die Mikro- oder Nanostrukturen auf einem geordneten dreidimensionalen Substrat basieren.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Erzeugen zumindest eines räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereichs (24) für jede Probe ein Bereitstellen der Proben in jeweils zugeordneten separaten Ausnehmungen (12) in dem Arraysubstrat (10), ein Einbringen des Amplifikationsmittels in die Ausnehmungen (12) und ein Verschließen der Ausnehmungen (12) durch den Träger (20) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Erzeugen zumindest eines räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereichs (35) ein Bereitstellen des Trägers (34) mit zumindest einer jeder Probe zugeordneten Ausnehmung (36), in der der Bindungsadapter (38) angeordnet ist, ein Einbringen des Amplifikationsmittels in die Aus nehmungen (36) und ein Verschließen der Ausnehmungen (36) mittels des Arraysubstrats (30), so dass die Proben dem Amplifikationsmittelbereich (35) ausgesetzt sind, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereiche (54') zumindest teilweise durch Phasengrenzen zwischen zwei Flüssigkeiten (54, 56), einer Flüssigkeit und einem Gas oder einer physikalischen Grenze, insbesondere einer Lipidmembran, getrennt sind.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Erzeugen zumindest eines räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereichs für jede Probe ein Bereitstellen der Proben in voneinander getrennten Flüssigkeitströpfchen (54), in den sich das Amplifikationsmittel befindet und die in der räumlichen Anordnung auf einem Arraysubstrat (52) des Arrays fixiert sind, wobei zwischen den Flüssigkeitströpfchen (54) eine dünnflüssigere Flüssigkeit (56) angeordnet ist, und ein Anordnen des Trägers (60) relativ zu dem Arraysubstrat (52) derart, dass die mit dem Bindungsadapter (62) versehene Oberfläche des Trägers (60) an die Flüssigkeitströpfchen (54) angrenzt, aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, bei dem das Erzeugen eines räumlich begrenzten Amplifikationsmittelbereichs für jede Probe ein Bereitstellen der Probe in einem Sequenzierer-Chip (10) oder einer Nanowellplatte aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Binden der Replikate oder Derivate an den Träger gleichzeitig mit der Amplifikation erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die räumliche Begrenzung des Wirkbereichs darin besteht, dass die Bindungsadapter als komplementäre Primer auf dem Träger in Form eines Primer-Arrays vorliegen, der eine regelmäßige oder unregelmäßige Verteilung von Punkten aufweisen kann, wobei die Punktgröße und Punktdichte auf dem Träger gleich oder kleiner als auf dem Array sind.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die räumliche Begrenzung des Wirkbereichs durch Anlegen eines Energiefelds bewirkt wird.
verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem die Proben in Form von an Partikeln (14; 50) gebundenen Molekülen bereitgestellt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem die Moleküle einzel- oder doppelsträngige Oligonucleotide, Polynucleotide, DNA oder synthetische DNA-analoge Moleküle (PNA) sind.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Array aus einer Sequenzierung zur Ableitung des Genoms, einer Sequenzierung zur Ableitung des Transkriptoms, einer Sequenzierung von RNA, mRNA, tRNA, siRNA oder einer Sequenzierung von Mutationen und Variationen stand.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem durch das Amplifizieren und Binden an dem Träger Kopi en erzeugt werden, die einer DNA, einer veränderten DNA, Expressionen einer DNA, einer RNA, Proteinen oder Peptiden entsprechen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem das Amplifikationsmittel eine DNA-Amplifikation, insbesondere eine Polymerasekettenreaktion, eine isothermale Amplifikation oder eine NASBA-Reaktion, bewirkt und der Bindungsadapter einen dazu passenden Primer aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem das Array aus Molekülen ein nicht-synthetisches Array aus Biomolekülen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bei dem am Ort der Proben noch weitere Moleküle oder DNA-Sequenzen oder Zellen vorliegen, die Bestandteil der Probe sind oder immobilisiert sind und die zur Generierung von Derivaten erforderlich sind, insbesondere Expressionsvektorsequenzen wie Ori, Promotor, Ribosom bindestellen, Startcodon, Endoproteasespaltstellen, Fusionssequenzen, Reportergene, Terminatoren, Antibiotikaresistenzgene, In-Vitro-Translationssysteme oder Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, bei dem von einem primären Array oder einem Replikat des primären Arrays primäre, sekundäre und/oder tertiäre Derivate generiert werden, indem DNA zu RNA transkribiert wird, die RNA in Protein translatiert wird, oder mit Hilfe eines erzeugten Proteins, einer erzeugten RNA oder einer erzeugten DNA oder deren Kopie aus ei ner Flüssigphase ein Binder angereichert wird oder wechselwirkt.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem ein Derivat auf der Festphase eines Zielarrays generiert wird und dort immobilisiert vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, das ferner ein Verfolgen von Änderungen von physikalischen oder chemischen Größen innerhalb der Wirkbereiche aufweist.
Replikat oder Derivat eines Arrays von Molekülen, das unter Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 23 hergestellt wurde.
Verwendung eines Replikats oder Derivats nach Anspruch 24, um eine Reaktion zwischen einem Binder, insbesondere einem Protein, Antikörper oder Antigen, mit einem Originalmolekül, dessen Replikat oder dessen Derivat mit der DNA-Sequenz des Originalmoleküls in Zusammenhang zu bringen, insbesondere für eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung.
Verwendung eines Replikats oder Derivats nach Anspruch 24, um eine Reaktion, bei der das Originalmolekül, dessen Kopie oder dessen Derivat die Umsetzung eines Substrates katalysiert, mit der DNA-Sequenz des Originalmoleküls in Zusammenhang zu bringen, insbesondere für eine Genotyp-Phänotyp-Kopplung
Verwendung eines Replikats oder Derivats nach Anspruch 24 zur Identifizierung einer DNA-Sequenz.
Verwendung eines Replikats oder Derivats nach Anspruch 24 zur Identifizierung einer DNA-Sequenz und zur Herstellung eines Erzeugnisses oder Präparats, insbesondere Antikörper, Antigen, Impfstoff oder Antibiotikum, auf der Basis der DNA-Sequenz.
Verwendung eines Replikats oder eines Derivats nach Anspruch 24 zur Detektion von Reaktionen zwischen einer Probe, einem Replikats oder einem Derivats davon mit einem wechselwirkenden Molekül oder Partikel, wobei die Detektion durch einen optischen, elektrochemischen oder magnetischen Sensor erfolgt und das wechselwirkende Molekül bzw. der wechselwirkende Partikel eine entsprechende Markierung trägt, oder die Detektion markierungsfrei über die Veränderung des evaneszenten Feldes, oder einer veränderten Resonanzfrequenz erfolgt, oder durch Einsatz einer optischen Pinzette, oder durch Kopplung der Reaktion mit einer Absorptionsveränderung, insbesondere Niederschlag oder Farbumschlag oder mit der Emission von Licht, insbesondere Chemilumineszenz.
Verwendung nach Anspruch 29, bei der ein gleiches Sequenziergerät zur Detektion der Reaktionen verwendet wird, das auch zur Detektion der Sequenzierung verwendet wird.
Verwendung eines Replikats oder eines Derivats nach Anspruch 24 zur Durchführung von Reaktionen auf dem Replikat oder Derivat des Arrays, wobei über der Oberfläche des Replikats oder Derivats eine Kammer bzw. Fluidikstruktur mit Anschlüssen aufgebracht wird oder das Replikat oder Derivat in einen entsprechende Kammer eingebracht wird, wobei die Kammer bei einer bestimmten Temperatur inkubiert werden kann und in der Kammer befindliche Flüssigkeiten ausgetauscht werden können.
Verwendung nach Anspruch 31 in einer Vorrichtung, die auch zum Sequenzieren des Arrays eingesetzt wird.
Verwendung eines Replikats oder eines Derivats nach Anspruch 24, zur gleichzeitigen Durchführung von Reaktionen und Detektionen auf dem Replikat oder Derivat.
Verfahren zur Sequenzierung eines Flüssig-Partikel-Arrays, wobei ein Replikat der auf den Partikeln enthaltenen Proben gemäß Anspruch 14 erzeugt wird und das Replikat in einem Sequenziergerät sequenziert wird.
Vorrichtung zum Herstellen eines Replikats oder Derivats eines Arrays von Molekülen (16; 32; 50), wobei das Array eine räumliche Anordnung getrennter Proben von Molekülen (16; 32; 50) aufweist, mit folgenden Merkmalen: einer Einrichtung zum Erzeugen zumindest eines räumlich begrenzten Wirkbereichs für jede Probe, der von den Wirkbereichen (24; 35; 54') der anderen Proben getrennt ist, wobei eine mit einem Bindungsadapter oder Bindungseigenschaften (22; 38; 62) versehene Oberfläche eines Trägers (20; 34; 60) an die Wirkbereiche (24; 35; 54') angrenzt; einer Einrichtung zum Amplifizieren der Moleküle mittels Amplifikationsmitteln in den Wirkbereichen (24; 35; 54') zum Erzeugen von Replikaten oder Derivaten (18; 32; 64) der Proben und zum Binden der Replikate oder Derivate der Proben an dem Träger (20; 34; 60) mittels des Bindungsadapters (22; 38; 62) oder der Bindungseigenschaften, so dass eine räumliche Anordnung der Kopien bzw. Derivate der Proben auf dem Träger der räumlichen Anordnung der Proben entspricht; und einer Einrichtung zum Entfernen des Trägers (20; 30; 60) mit den Kopien der Proben von dem Array.