KR100498288B1 - 핵산 마이크로어레이 및 이의 제조방법 - Google Patents

핵산 마이크로어레이 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노 입자를 이용하여 제조된 핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray) 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 원판 핵산 마이크로어레이에 고정된 핵산과 상보적으로 결합 할 수 있는 핵산 조각이 고정된 나노입자를 혼성화시켜 나노입자를 원판 마이크로어레이 상에 위치시키고, 나노입자의 위치정보를 유지시킨 상태에서 하이드로 겔을 이용하여 새 기판으로 이동시켜서 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작하는 방법 및 이와 같이 제작된 핵산 마이크로어레이에 관한 것이다.

Description

핵산 마이크로어레이 및 이의 제조방법{NUCLEIC ACID MICROARRAY AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 나노 입자를 이용하여 원판 핵산 마이크로어레이로부터 복제된 핵산 마이크로어레이 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, 수용액 내에서 이온 결합, 수소결합, 반데르발스(van der Waals) 결합 등의 비공유 결합의 세기는 공유 결합에 비하여 1/30 내지 1/300 정도 약하여 안정한 결합을 이루기 힘들지만, 거대 분자의 경우에는, 결합 자리의 수가 많아져서 상온에서도 안정한 결합을 유지할 수 있다. 이러한 비공유 결합은 특정 분자가 다른 분자를 매우 선택적으로 인지할 수 있도록 도와준다. 이와 같이, 다른 분자를 선택적으로 인지하는 특정 분자를 넓은 의미에서 수용체(receptor)라고 정의할 수 있는데, 그 예로서, 세포 표면에서 세포막 안으로 신호를 전달하는 막 단백질(membrane protein), DNA 또는 RNA의 특정 서열을 인지하는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides) 또는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 면역작용에 관여하는 항체, 및 대사물질을 가수분해하는 효소 등을 들 수 있다. 이와 같은 수용체와 선택적으로 결합하는 물질을 리간드(ligand)라고 한다.
1975년 DNA의 분자 인지 능력을 이용하여 특정한 염기 서열을 가진 DNA를 찾아내는 방법인 서던 블라팅(Southern blotting)이 에드윈 서던(Edwin Southern)에 의하여 개발되었다. 이 방법에 따르면, 전기 영동에 의하여 크기에 따라 분리된 DNA 조각을 니트로셀룰로오스 또는 나일론 멤브레인과 같은 고체 기판 상에 이동시켜 DNA 조각들을 크기에 따라 상대적으로 위치시킨다. 그리고 나서, 고체 상에 고정된 DNA 조각에 방사선 동위원소로 표지된 관찰하고자 하는 염기서열을 갖는 DNA 또는 RNA 프로브(probe)를 넣은 후, 혼성화(hybridization)를 통하여 상기 프로브가 상보적으로 결합을 할 수 있는 DNA 조각에 결합하게 하여, 찾고자 하는 염기서열을 가진 DNA, 즉 전기영동으로 분리된 DNA 조각의 크기(위치)를 알 수 있게 된다.
이 방법을 응용하여 RNA를 분석하는 노던 블라팅(Northern blotting), 단백질을 분석하는 웨스턴 블라팅(Western blotting)이 개발되었는데, 그 원리는 크게 다르지 않다. 이러한 수용체와 리간드의 결합을 이용한 많은 분석방법들은 생물학 연구나 의료진단, 신약탐색, 법의학 등 많은 분야에 사용되고 있는데, 이들은 대부분 제한된 수의 수용체와 리간드에 대한 것이다. 핵산의 예를 들면, 4 가지 염기를 가지고 10 개 염기의 순차적 서열로 구성된 DNA를 만들 경우, 가능한 분자의 종류가 1,000,000개 이상이 될 정도로 매우 다양한 구조를 갖고 있다. 그러므로, DNA과 DNA 또는 RNA의 결합반응에 대한 실험은 매우 반복적인 실험과정이 필요하고 이에 따라 많은 노동력과 시간 그리고 막대한 자원을 필요로 했다. 이러한 문제점은 해결하기 위하여, 염기서열을 아는 핵산을 기판위 기지(旣知)의 위치에 이차원으로 배열시키는 핵산 마이크로어레이 기술이 개발되었다.
핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray)는 좁은 기판 표면 위에 매우 다양한 염기서열을 갖는 핵산 조각을 고밀도로 배열시킨 것으로, 고정된 핵산과 미지의 핵산 시료와의 혼성화를 통하여 미지시료 내의 핵산에 대한 정보를 알아내는데 사용된다. 여기서 혼성화란 핵산 염기를 구성하는 아데닌(adenine)-티민(thymine) 또는 우라실(uracil), 구아닌(guanine)-시토신(cytosine)간의 수소결합에 의해 상보적인 염기서열을 갖는 유전자 부위(subsequence)가 서로 결합하여 이중나선 핵산(double-stranded nucleic acid)을 형성하는 것을 의미한다. 따라서, 미지의 핵산 시료 가운데 기판에 고정된 핵산 프로브와 상보적 염기서열을 갖는 핵산 단편은 프로브와 결합하여 기판 표면에 남아있게 되고, 핵산 프로브, 핵산 시료 또는 혼성화 후의 이중나선 핵산을 적당한 방법으로 표지(label)하여, 미지의 시료내의 핵산 염기서열에 대한 정보를 알 수 있다.
일반적으로 핵산 마이크로어레이는 수 백 개 내지 수 십만 개의 매우 다양한 염기서열을 가지는 핵산을 작은 공간에 배열시켜 고정된 기지(旣知)의 핵산과 미지(未知)의 핵산 시료와의 혼성화(hybridization)를 통하여 미지시료 내의 핵산에 대한 정보를 알아내는데 사용된다. 핵산 마이크로어레이는 기존의 서던 블라트(Southern blot), 노던 블라트(Norther blot), 돌연변이 검색 등을 대체하여 동시에 최소한 수 백개 이상의 염기서열 부위를 빠른 시간 안에 검색할 수 있는 장점을 가지고 있다.
핵산 마이크로어레이 제조방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 하나는 기판 상에서 직접 올리고핵산(oligo nucleic acid)을 합성하여 프로브를 만드는 합성법이고, 또 다른 하나는 이미 합성된 cDNA(complementary DNA), PNA(peptide nucleic acids), LNA(locked nucleic acids) 등과 같은 올리고핵산(oligo nucleic acid)을 기판 상에 올리는 방법이다.
올리고핵산을 기판에 올리는 방법에는 몇 가지가 있다. 한 가지 방법은, 반도체 공정에서 많이 사용되는 광식각(photolithography) 기술을 이용한 것으로, 폴리펩타이드를 실리콘 기판상에서 인-시투(in-situ) 합성하는 방법(미국 특허 5,143,854)이 있고, 미국의 Affymetrix사는 이와 유사한 방법으로 올리고핵산을 인-시투로 합성한 핵산 마이크로어레이를 제조, 판매하고 있다. 이 방법은 미리 기판 상에 각각의 염기가 합성될 수 있는 작용기를 도입하고, 작용기 말단은 빛에 민감한(photolabile) 화학물질에 의하여 보호(protect)된 상태로 만든다. 포토마스크(photomask)를 이용하여 특정 부위에만 빛을 쬐어주게 되면, 빛에 민감한 화학물질들이 제거되고, 염기와 반응할 수 있는 작용기만이 노출된다. 이 때, 반응에 참여하는 각각의 염기들도 그 말단이 빛에 민감한 화학물질로 보호되어 있기 때문에, 빛이 조사되어 작용기가 활성화된 부위에만 염기가 한 개씩 결합하게 된다. 그리고 난 후, 반응하지 않은 염기들을 제거하고, 다른 패턴의 포토마스크를 이용하여 기판 위에 특정 염기를 선택적으로 결합시키는 작업을 반복하게 되면, 결과적으로 기판 상의 특정한 위치에 원하는 염기서열의 올리고핵산을 합성할 수 있게 된다. 이 때, 기판 위의 일정한 면적의 각 스팟(spot) 상에 15 ~ 25 mer의 염기서열을 갖는 올리고핵산을 합성할 수 있다.
이와 같은 Affymetrix 칩의 단점으로 꼽히는 고가의 포토마스크를 사용하지 않는 광식각을 이용한 올리고핵산 합성을 방법이 개발되었다. 미국의 위스콘신 대학에서 개발한 방법으로 디지털 마이크로미러 어레이(Digital Micromirror Array)로 포토마스크의 역할을 대신하여 76,000개의 올리고뉴클레오타이드를 직접 칩의 표면 위에서 합성하는데 성공하였다(Nature Biotechnology 17 : 974 ~ 978, 1999).
또 다른 방법으로, 잉크젯 프린터의 경우와 같이, 압전 인쇄(piezoelectric printing) 방식에 의하여, 4가지 염기 중 하나를 전기적으로 방출시켜서 기판 표면 위에 올리고핵산을 합성하는 방법이 있다(US patent 5,474,796). 이 방법은 40 ~ 50 mer의 올리고핵산도 합성할 수 있지만, 배열(aligning) 공정이 용이하지 않으며, 패턴의 최소 크기가 약 100 ㎛ 정도이므로 집적화에 한계가 있다.
또한, 고전적인 방법으로, 이미 합성된 핵산을 기계적 마이크로스파팅(microspotting) 또는 마이크로피펫팅(micropipetting) 방식으로 기판 위에 올리는 방법이 있는데(Science 270:467-470, 1995), 이는 고밀도의 핵산 마이크로어레이를 제조할 수 없다는 단점과 대량생산에 있어서 제약이 있다는 단점이 있어서, 주로 연구용 목적의 핵산 마이크로어레이 제작에 응용되고 있다.
지금까지 개발된 핵산 마이크로어레이의 경우, 제조방식은 달라도 서로 다른 핵산 분자들이 일정한 크기를 갖는 사각형의 기판 위에 바둑판식으로 배열된 것이 특징이다. 혼성화 반응결과를 알기 위해서는 일반적으로 특정 표지 하거나 형광 이미지 스캐너를 사용하여 핵산 마이크로어레이 기판 면을 스캔하는 별도의 단계를 필요로 한다(미국 특허 제5,091,652호).
본 발명은 나노입자와 하이드로 겔을 이용하여 원판 핵산 마이크로어레이로부터 복제된 핵산 마이크로어레이 및 이의 제조방법을 제공하여, 제조 공정이 보다 간단하고, 생체분자와의 반응이 용이하며, 반복 제작이 가능한 핵산 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 나노 입자를 이용하여 제조된 핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray) 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 원판 핵산 마이크로어레이에 고정된 핵산과 상보적으로 결합 할 수 있는 핵산 조각이 고정된 나노입자를 혼성화시켜 나노입자를 원판 마이크로어레이 상에 위치시키고, 하이드로 겔을 이용하여 나노입자의 위치정보를 유지시킨 상태에서 새 기판으로 이동시켜서 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작하는 방법 및 이와 같이 제작된 핵산 마이크로어레이에 관한 것이다.
이 때, 핵산 분자들이 고정된 나노입자는 특이적 분자 인지를 통하여 원판 핵산 마이크로어레이에 선택적으로 위치하게 되고, 이러한 공간적 배열에 대한 정보를 유지시킨 채 새로운 기판으로 옮기기 위하여 고분자 겔을 만들 수 있는 모노머(monomer) 용액을 넣어 고분자 겔이 합성되도록 하여, 나노입자를 공간적 배열에 대한 정보를 유지한 채로 겔 내에 고정시킨다. 고분자 겔을 새로운 기판과 고정된 상태로 떼어내면 나노입자가 겔 표면 근처에 고정된 패턴을 얻을 수 있다. 이와 같이 만들어진 복제 핵산 마이크로어레이의 구조를 도1에 나타내었다.
이와 같은 방법을 사용하는 경우, 원판 핵산 마이크로어레이에 고정된 핵산은 그대로 남아있으므로 복제 핵산 마이크로어레이를 떼어낸 뒤에도 핵산 마이크로어레이를 재사용 하는 것이 가능하여, 상기 과정을 반복하여 하나의 핵산 마이크로어레이로부터 다수의 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작할 수 있다는 장점이 있다.
우선, 본 발명에 따른 핵산 마이크로어레이는 고체 기판(6) 및 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산(3)이 결합된 나노입자(4)를 원판 핵산 마이크로어레이 상의 공간적 배열상태와 거울상의 대칭 배열을 유지하면서 포함하는 하이드로 겔(5)을 포함하여 구성되어 있다. 상기 핵산 마이크로어레이는 기판 평면 위에서의 위치에 따라 상이한 염기서열 또는 상이한 유전정보를 갖는 핵산이 나노입자에 결합되어 배열되어 있다.
본 발명의 핵산 마이크로어레이의 제조방법은 다음의 단계를 포함한다:
1) 제작하고자 하는 핵산 마이크로어레이와 상보적인 염기서열을 갖는 핵산이 배열된 원판 핵산 마이크로어레이를 제작하는 단계(도 2a 참조);
2) 상기 원판 핵산 마이크로어레이를 핵산 마이크로어레이를 구성할 핵산이 결합된 나노입자를 포함하는 용액에 담가, 서로 상보적 염기서열을 갖는 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 나노입자 상의 핵산을 혼성화시키는 단계(도 2b 참조);
3) 상기 나노입자가 결합된 원판 핵산 마이크로어레이를 세척하여 비선택적으로 결합된 나노입자를 제거하는 단계(도 2c 참조);
4) 상기 나노입자가 결합된 원판 핵산 마이크로어레이 상에 기판(substrate)을 대고, 그 사이를 하이드로 겔로 채워, 원판 핵산 마이크로어레이 상의 상보적 염기서열을 갖는 핵산의 공간적 배열상태와 거울상의 대칭 상태를 유지한 채로 하이드로 겔 내에 나노입자를 고정시키는 단계(도 2d 참조);
5) 나노입자가 고정된 하이드로 겔이 고정된 기판을 떼어 내어 복제된 핵산 마이크로어레이를 얻는 단계(도 2e 참조).
이 때, 상기 단계 5) 이후의 원판 핵산 마이크로어레이에 단계 2) 내지 단계 5)의 과정을 반복함으로써, 하나의 원판 핵산 마이크로어레이를 사용하여 다수의 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 핵산 마이크로어레이 및 그의 제조방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 핵산 마이크로어레이 제작원리는 핵산(nucleic acid) 분자의 상보적 염기서열의 분자인식을 기본으로 한다. 아데닌(adenine)-티민(thymine) 또는 우라실(uracil), 구아닌(guanine)-시토신(cytosine)간의 수소결합에 의한 상보적 결합은 높은 선택성을 가지는데, 이는 핵산 마이크로어레이 기술의 기본원리이기도 하다. 본 발명은 이러한 핵산 분자간의 높은 선택성을 부여하는 상보적 결합을 이용하여, 원판 핵산 마이크로어레이로부터 핵산이 결합된 나노입자를 이용하여 복제 핵산 마이크로어레이를 만드는 방법 및 이와 같이 제작된 핵산 마이크로어레이에 관한 것이다.
본 발명에서 핵산 마이크로어레이는 평면상의 위치에 따라 특정 염기서열을 가진 핵산이 고정된 핵산 마이크로어레이를 의미하며 핵산은 기판 표면과 공유결합으로 고정되었다. 본 발명에 있어서, 핵산은 각종 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids), 및 LNA(Locked Nucleic Acids) 등과 같이 염기서열 형태로 정보를 가지며 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산과 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 모두 포함한다. 또한, 상기 기판으로 유리를 사용할 수 있고, 상기 나노 입자로서 금 또는 백금을 사용할 수 있지만, 본 발명에 있어서 기판과 나노 입자의 재질이 상기와 같이 제한되지 아니하여도 무방하다.
도 1은 본 발명에서 제안한 핵산 마이크로어레이의 구조를 보여준다. 본 발명의 복제된 핵산 마이크로어레이는 일반적인 핵산 마이크로어레이와 같이 기판 위의 위치에 따라 특정한 염기서열을 가지는 핵산이 고정된 스팟(spot)의 배열(array)로 구성되어 있다. 기판(substrate) 위에 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)과 같은 하이드로 겔(hydrogel)이 있고 각 스팟에는 겔 표면에 근접한 위치에는 핵산이 결합된 나노입자가 포함되어 있다.
상기 나노입자는 폴리아크릴아마이드 겔의 구멍(pore)보다 지름이 커서 겔 내에서 빠져 나오지 않게 된다. 폴리아크릴아마이드 겔의 구멍의 크기는 겔의 농도나 가교도에 따라 다르지만, 일반적으로 수 nm의 평균 지름을 갖는다. 그러므로, 나노입자의 지름이 수 nm 이상이면 겔 내에서 빠져 나오지 않게 된다. 본 발명에 있어서, 상기 나노입자의 지름은 수 nm 내지 100 nm인 것이 바람직하다.
이들 나노입자에는 동일한 염기서열 또는 같은 종류의 유전자로부터 기인한 핵산이 고정되어 있는데 나노입자 표면에 핵산을 고정시키는 방법에는 여러 가지가 있다. 우선, 나노입자 표면에 스트렙트아비딘(streptavidin)이 고정되어 있고 핵산의 끝에 비오틴(biotin)이 결합되어 스트렙트아비딘-비오틴의 강한 결합을 통하여 고정시킬 수 있다. 또한, 금(gold) 등과 같이 티올(thiol)기와 결합할 수 있는 금속으로 만든 나노입자 또는 표면이 이들 금속으로 된 나노입자의 경우에는 핵산에 티올기를 부착시켜서, 상기 금속과 티올기와의 공유결합을 통해 핵산을 나노입자에 고정시킬 수 있다. 그 밖에, 실리카(silica) 입자의 경우 실란(silane)을 이용한 방법 등으로 표면에 핵산을 고정시킬 수 있다. 이러한 나노입자 표면에 핵산을 고정시키는 방법들은 표면합성 분야의 전문가들에게는 일반적으로 잘 알려져 있는 것들이다.
이러한 구조의 핵산 마이크로어레이는 친수성의 하이드로 겔(hydrogel)을 포함하여, 핵산 등과 같은 친수성 생체분자들이 쉽게 접근할 수 있기 때문에, 이들과의 반응속도를 빠르게 할 수 있다. 하이드로 겔은 에틸렌(ethylene)기를 가진 모노머 유니트가 중합 반응하여 만들어지며, 상기 중합체를 만드는 모노머는 에틸렌기를 가진 폴리머화가 가능한 화합물로서, 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드(methacrylamide), 아크릴산(acrylic acid), 메타크릴산 (methacrylic acid) 및 이들과 구조적으로 연관된 아마이드(amide)나 에스테르(ester) 등을 포함한다. 상기 하이드로 겔로서 폴리아크릴아마이드 겔을 사용할 수 있다.
본 발명에서와 같이 나노입자를 사용하여 핵산을 고정시키면, 일반 평면에 핵산을 고정하는 것 보다 핵산을 고정시킬 수 있는 표면적이 넓어지므로, 하나의 스팟에 더 많은 핵산을 고정시킬 수 있다는 장점이 있다.
도 2a 내지 2e는 본 발명의 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작하는 과정을 보여준다. 여기서, 도 2a는 제작하고자 하는 복제 핵산 마이크로어레이와 상보적 결합을 하는 염기서열의 핵산이 배열되어 있는 원판 핵산 마이크로어레이의 제작단 계; 2b는 상기 원판 핵산 마이크로어레이를 핵산 마이크로어레이를 구성할 핵산이 결합된 나노입자를 포함하는 용액에 담가, 서로 상보적 염기서열을 갖는 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 나노입자 상의 핵산을 혼성화시키는 단계; 2c는 상기 나노입자가 결합된 원판 핵산 마이크로어레이를 세척하여 결합하지 않거나 비선택적으로 결합된 나노입자를 제거하는 단계; 2d는 상기 나노입자가 결합된 원판 핵산 마이크로어레이 상에 기판(substrate)을 대고, 그 사이에 하이드로 겔을 채워, 원판 핵산 마이크로어레이 상의 공간적 배열상태를 유지한 채로 하이드로 겔 내에 나노입자를 고정시키는 단계; 2e는 나노입자가 고정된 하이드로 겔이 고정된 기판을 떼어 내어 복제된 핵산 마이크로어레이를 얻는 단계를 나타내는 것이다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 원판과 기판 사이에 하이드로 겔을 만드는 단계에 원판과 기판 사이에 아크릴아마이드(acrylamide) 용액을 넣고 중합반응을 시켜 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔을 만들 수 있다. 이 때, 폴리아크릴아마이드 겔의 구조적 강도를 위해 가교(crosslink)를 시켜줄 수 있는 비스아크릴아마이드(bisacrylamide)와 같은 가교제를 아크릴아마이드 용액에 중합반응을 시킨다. 상기 중합반응은 퍼설페이트(persulfate)+테트라에틸메틸렌디아민(tetraetylmethylenediamine; TEMED), 퍼설페이트+가열, 과산화수소+Fe2+, 리보플라빈(riboflavin)+가시광선 조사, 퍼설페이트+바이설파이트(bisulfite), 퍼설페이트+티오설페이트(thiosulfate) 또는 감마광 조사 등의 방법으로 개시할 수 있다(참고문헌: Polymer Applications for Biotechnology Chapter 6, in David S. Soane, ed., Prentice-Hall Inc. New Jersey, 1992).
이 때, 하이드로 겔과 결합이 잘 되도록 하기 위하여 기판의 표면을 에틸렌(ethylene)기로 개질시켜 사용한다. 본 발명의 구체예에 있어서, 아크릴기로 기판의 표면을 개질하여 폴리아크릴마이드 겔이 기판과 잘 결합하도록 할 수 있다.
원판 핵산 마이크로어레이로부터 복제된 핵산 마이크로어레이를 떼어낼 때, 기계적 힘을 사용하여 떼어낼 수 있지만, 핵산-핵산 결합력에 의해 핵산이 손상되거나 마이크로어레이에서 떨어지는 것을 막기 위하여 떼어내는 과정에서 온도를 올려 원판 상의 핵산과 나노입자에 고정된 핵산 사이에 결합을 약화시켜서 떼어 낼 수 있다.
본 발명의 복제된 핵산 마이크로어레이는 원판 핵산 마이크로어레이의 염기서열 정보와 상보적인 염기서열 정보를 가지며 거울상으로 대칭되는 배열을 가지게 된다. 예를 들어 A 에서 I의 다른 염기서열을 가진 핵산이 있고 이에 상보적인 염기서열을 가진 핵산을 A' 에서 I'이라고 하면 원본 핵산 마이크로어레이와 복제된 핵산 마이크로어레이는 아래와 같은 관계를 갖는다.
A B C C' B' A'
D E F -> F' E' D'
G H I I' H' G'
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
혼성화되어 마이크로어레이 표면에 결합된 핵산을 새로운 기판으로 옮기는 것이 가능한지 실험하였다, 우선, 크롬 마스크(Cr mask)를 사용하여 광식각(photolithography) 기술인 리프트-오프(lift-off) 공정으로 유리판 위에 금(gold) 패턴을 만들었다. 금 패턴 이외의 유리 표면은 원판과 복제 핵산 마이크로어레이가 잘 떨어질 수 있도록 Sigmacote??(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 소수성 코팅을 했다. 5' 말단에 티올(thiol)가 결합된 올리고뉴클레오타이드(QC3, Thiol Mod C6, 5'-TGAAGACATAGTTCCTCACAG-3')를 티올기와 금과의 공유결합을 이용한 자기조립(self assembly) 방법으로 원판 표면에 고정시켰다. 이 실험에서는 QUIGEN Operon사에 주문 합성한 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 자기조립으로 표면에 고정시킬 때에는 올리고뉴크레오타이드를 TE 버퍼(Tris-EDTA, pH 7.0)에 녹인 용액을 기판 위에 떨어뜨리고 수용액이 증발하지 않도록 95% 이상의 습도를 유지시키면서 1 시간 이상 상온에서 반응시켰다.
실험에 사용한 나노입자는 Miltenyi Biotec(Gladbach, Germany)사의 스트렙트아비딘(streptavidin)이 결합된(conjugated) 초-상자성(super-paramagnetic) 나노입자인 mMACS (평균지름 50 nm 이하)를 사용하였다. 3' 말단에 바이오틴(biotin)이 결합되고 5' 말단에 Cy5 형광분자가 결합된 올리고뉴클레오타이드 (RQC3, 5'-ACTCGCAAGCACCCTATCAGGC-3')를 스트렙트아비딘-바이오틴 반응으로 나노입자에 결합시켰다. 나노입자에 올리고뉴클레오타이드를 결합시키는 방법은 Miltenyi Biotec사의 제너럴 프로토콜(General Protocol)을 그대로 사용하였다(www.miltenyibiotec.com).
올리고뉴클레오타이드(RQC3)가 결합된 나노입자를 5X SSC, 0.1% Tween 20 버퍼에 녹인 용액을 올리고뉴클레오타이드(QC3)가 결합된 금 패턴의 유리판 위에서 1시간 정도 혼성화시켰다. 혼성화되지 않거나 비선택적으로 결합된 올리고뉴클레오타이드가 결합된 나노입자를 제거하기 위하여 5X SSC, 0.1% Tween 20 버퍼에서 10분간 3회, 1X SSC, 0.1% Tween 20 버퍼에서 10분간 3회 세척하고 증류수로 세척하였다.
금 표면에 선택적으로 결합된 나노입자를 고정시키기 위한 하이드로 겔의 제조를 위하여 폴리아크릴아마이드(acrylamide)를 이용하였다. 아크릴아마이드용액 (20%T, 5%C, Acrylamide : N,N'-Methylene-bis-acrylamide=19:1)에 최종농도 0.1% TEMED(N,N'-Tetramethylethylenediamine) 및 0.1% APS(암모늄 퍼설페이트)를 넣은 용액을 핵산이 결합된 금 패턴의 유리판과 복제 핵산 마이크로어레이를 만들기 위한 슬라이드글라스 사이에 넣은 후 1 분간 상온에서 방치하여 중합에 의해 폴리아크릴아마이드 겔이 합성되도록 하였다. 아크릴아마이드 용액의 조성비는 복제 핵산 마이크로어레이의 용도나 원하는 기계적 강도에 따라 다르게 사용할 수 있다. 슬라이드 글라스는 폴리아클릴아마이드 겔이 잘 고정될 수 있도록 아크릴아마이드와 반응할 수 있는 바인드 실란(Bind Silane, 3% g-methacryloxypropyl tri-methoxysilane 메탄올 용액)으로 처리하였다.
핵산 혼성화에 의한 결합을 약화시키기 위해 95℃ 이상의 증류수 내에서 1분간 방치한 뒤 유리판과 슬라이드 글라스를 분리하였다. 복제 핵산 마이크로어레이인 슬라이드 글라스에 올리고뉴클레오타이드가 결합된 나노입자가 옮겨졌는지를 확인하기 위하여 형광스캐너 (ScanArray LITE, Packard Bioscience Inc, Meriden, CT, USA)를 사용하여 스캔하였다.
도 3은 Cy5가 표지된 올리고뉴클레오타이드가 결합된 나노입자를 갖는 복제 핵산 마이크로어레이의 스캔 결과 얻은 이미지로, 밝은 부분이 형광이 강하게 나온 이미지이다. 원판에서 올리고뉴클레오타이드가 결합한 패턴은 5 X 5의 정사각형으로 이루어져 있고 패턴 밑에 거울상으로 나타난 수치로 순서대로 폭과 패턴간격을 나타낸다. 도 3a와 3b는 각각 복제 핵산 마이크로어레이의 다른 부분을 형광스캐너로 스캔한 이미지이다. 금 패턴은 10 mm 정도의 패턴에 대해서도 복제가 가능하다.
본 실시예에서는 핵산 패턴의 복제 가능한 크기를 보기 위해 유리판 위에 금패턴에 올리고뉴클레오타이드를 고정시킨 것을 원판 핵산 마이크로어레이의 예로 보여주었지만 실제 사용가능한 원판 핵산 마이크로어레이는 광식각, 잉크젯, 스팟팅, 마이크로피펫팅 등의 방식으로 평면에 핵산 패턴을 만든 모든 핵산 마이크로어레이에 대하여 적용 가능하다.
본 발명에 따른 핵산 마이크로어레이 제조방법은 핵산 간의 혼성화를 이용하여 한 번에 핵산 마이크로어레이를 제작할 수 있으므로 공정이 단순하고 고가의 장비를 필요로 하지 않는다. 또한, 본 발명의 핵산 마이크로어레이는 하이드로 겔을 포함하므로, 생체분자의 접근이 용이하여 반응속도를 빠르게 할 수 있고, 나노입자 표면에 핵산을 고정시키므로 일반 평면에 고정시키는 경우보다 많은 양의 핵산을 결합시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 복제된 핵산 마이크로어레이의 구조를 개략적으로 보여주는 것이다.
도 2a 내지 2e는 원판 핵산 마이크로어레이로부터 복제된 본 발명의 핵산 마이크로어레이의 제조 과정을 모식적으로 보여주는 것이다.
도 3a 및 3b는 Cy5가 결합된 올리고핵산이 고정된 나노입자와 혼성화시켜서 복제한 핵산 마이크로어레이의 Cy5에 대한 형광 이미지이다.
*** 도면 주요부의 설명 ***
(1) 원판 핵산 마이크로어레이 (2) 스팟(spot)
(3) 핵산 (4) 나노입자
(5) 하이드로 겔 (6) 기판(substrate)
(7) 원판 핵산 마이크로어레이 표면에 고정된 핵산 분자와 상보적 결합을 할 수 있는 핵산 조각이 고정된 나노입자를 포함하는 용액
(8) 나노입자가 혼성화된 원판 핵산 마이크로어레이
(9) 복제된 핵산 마이크로어레이
<110> LG ELECTRONICS INC. <120> NUCLEIC ACID MICROARRAY AND MANUFACTURING METHOD THEREOF <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide QC3 <400> 1 tgaagacata gttcctcaca g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide RQC3 <400> 2 actcgcaagc accctatcag gc 22

Claims (20)

  1. 기판 상에, 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 상보적 염기 서열을 갖는 핵산을 포함하는 핵산 마이크로어레이로서,
    상기 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 상보적 염기 서열을 갖는 핵산은 나노 입자와 결합되어 있으며, 상기 나노 입자에 의하여 하이드로겔 내에 고정되어 기판에 결합되어 있는 것이고,
    원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 상보적 염기 서열을 갖는 핵산이 상기 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산 분자의 공간적 배열과 거울상의 대칭 배열 상태를 유지하면서 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 마이크로어레이.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산이 각종 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids), 또는 LNA(Locked Nucleic Acids)와 같이 염기서열 형태로 정보를 가지며 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산과 선택적으로 결합할 수 있는 분자인 핵산 마이크로어레이.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 하이드로 겔이 에틸렌(ethylene)기를 가진 모노머 유니트가 중합 반응하여 만들어진 친수성 고분자인 핵산 마이크로어레이.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 하이드로 겔의 모노머가 에틸렌기를 가진 폴리머화가 가능한 화합물로서, 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드(methacrylamide), 아크릴산(acrylic acid), 메타크릴산 (methacrylic acid), 또는 이들과 구조적으로 연관된 아마이드(amide)나 에스테르(ester)인 핵산 마이크로어레이.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 하이드로 겔이 폴리아크릴아마이드 겔인 핵산 마이크로어레이.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 나노입자의 지름이 수 nm 내지 100 nm인 핵산 마이크로어레이.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 기판이 에틸렌기로 표면 개질된 것인 핵산 마이크로어레이.
  8. 1) 제작하고자 하는 핵산 마이크로어레이와 상보적인 염기서열을 갖는 핵산이 배열된 원판 핵산 마이크로어레이를 제작하는 단계;
    2) 상기 원판 핵산 마이크로어레이를 핵산 마이크로어레이를 구성할 핵산이 결합된 나노입자를 포함하는 용액에 담가, 서로 상보적 염기서열을 갖는 원판 핵산 마이크로어레이 상의 핵산과 나노입자 상의 핵산을 혼성화시키는 단계;
    3) 상기 나노입자가 결합된 원판 핵산 마이크로어레이를 세척하여 비선택적으로 결합된 나노입자를 제거하는 단계;
    4) 상기 나노입자가 결합된 원판 핵산 마이크로어레이 상에 기판을 대고, 그 사이를 하이드로 겔로 채워, 원판 핵산 마이크로어레이 상의 상보적 염기서열을 갖는 핵산의 공간적 배열과 거울상의 대칭 배열 상태를 유지한 채로 하이드로 겔 내에 나노입자를 고정시키는 단계; 및
    5) 나노입자가 고정된 하이드로 겔이 고정된 기판을 떼어 내어 복제된 핵산 마이크로어레이를 얻는 단계를 포함하여 이루어지는 핵산 마이크로어레이 제작방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 5) 이후의 원판 핵산 마이크로어레이에 단계 2) 내지 단계 5)의 과정을 반복하는 단계를 추가적으로 포함함으로써, 하나의 원판 핵산 마이크로어레이를 사용하여 다수의 복제된 핵산 마이크로어레이를 제작할 수 있는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 핵산으로서 각종 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acids), 또는 LNA(Locked Nucleic Acids)와 같이 염기서열 형태로 정보를 가지며 상보적인 염기서열을 포함하는 핵산과 선택적으로 결합할 수 있는 모든 분자를 사용하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 나노입자로서 지름이 수 nm 내지 100 nm인 것을 사용하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 2)를 나노입자에 스트렙트아비딘(streptavidin)을 고정시키고, 핵산의 끝에 비오틴(biotin)을 결합시켜서, 스트렙트아비딘-비오틴의 강한 결합을 통하여 나노입자에 핵산을 고정시켜서 수행하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 2)를 금(gold) 등과 같이 티올(thiol)기와 결합할 수 있는 금속으로 만든 나노입자 또는 표면이 이들 금속으로 된 나노입자와 티올기가 부착된 핵산을 사용하여, 상기 금속과 핵산의 티올기와의 공유결합을 통하여 나노입자에 핵산을 고정시켜서 수행하는 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 4)를 에틸렌(ethylene)기를 갖는 중합 가능한 모노머를 포함하는 용액을 원판과 기판 사이에 주입하고, 이들을 중합 반응시켜, 원판과 기판 사이에 친수성 하이드로 겔을 형성시켜서 수행하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 단계 4)를 원판과 기판 사이에 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드(methacrylamide), 아크릴산(acrylic acid), 메타크릴산 (methacrylic acid), 또는 이들과 구조적으로 연관된 아마이드(amide)나 에스테르(ester)를 포함하는 용액을 주입하여 친수성 하이드로 겔을 형성시켜서 수행하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 단계 4)를 원판과 기판 사이에 아크릴아마이드(acrylamide) 용액을 넣고 중합반응을 시켜 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔을 형성시켜서 수행하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 형성된 폴리아크릴아마이드 겔의 구조적 강도를 강화시키기 위하여, 이들을 가교시켜 줄 수 있는 비스아크릴아마이드(bisacrylamide)와 같은 가교제를 아크릴아마이드 용액 첨가하고, 이들을 중합반응 시켜서 수행하는 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 중합 반응을 모노머 용액에 퍼설페이트(persulfate) 및 테트라에틸메틸렌디아민(tetraetylmethylenediamine; TEMED)를 첨가하거나, 퍼설페이트를 첨가하고 가열하거나, 과산화수소 및 Fe2+를 첨가하거나, 리보플라빈(riboflavin)을 첨가하고 가시광선을 조사하거나, 퍼설페이트 및 바이설파이트(bisulfite)를 첨가하거나, 퍼설페이트 및 티오설페이트(thiosulfate)를 첨가하거나, 감마광 조사하여 수행하는 방법.
  19. 제 8 항에 있어서, 하이드로 겔과 결합이 잘 되도록 하기 위하여 기판의 표면을 에틸렌(ethylene)기로 개질시켜 사용하는 방법.
  20. 제 8 항에 있어서, 상기 단계 5)의 원판과 기판의 분리 시 핵산-핵산 결합력에 의하여 핵산이 손상되거나 핵산 마이크로어레이에서 떨어지는 것을 방지하기 위하여, 온도를 올려 원판 상의 핵산과 나노입자에 고정된 핵산 사이에 결합을 약화시킨 후 상기 단계 5)를 수행하는 방법.
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