JP2003530861A - オリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法及びその方法によって製造されるオリゴヌクレオチドアレイ - Google Patents

オリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法及びその方法によって製造されるオリゴヌクレオチドアレイ

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Abstract

(57)【要約】 本発明はオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法及びその方法によって製造されるオリゴヌクレオチドアレイに関するものである。本発明のヌクレオチドの製造方法は次の疎水性の固定層を製造する段階と；末端に疎水基を結合させたオリゴヌクレオチド水溶液を固定層上の一定部位に滴下する段階と；上記疎水性の固定層を固形化させる段階とからなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明はオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法及びその方法によって
製造されるオリゴヌクレオチドアレイに関するものである。本発明はハイブリダ
イゼーションを基礎とする遺伝診断、分析及びDNAチップ分野に効果的に利用で
きる。
【０００２】 （背景技術） 支持体に固定されたオリゴヌクレオチドを利用するハイブリダイゼーションは
、各種の遺伝子を探索する方法で生命工学関連全分野で幅広く使用される技術で
あり、最近ではこれを基本原理として高密度集積オリゴヌクレオチドアレイ即ち
、DNAチップが既存の伝統的なゲル(gel−based)方法を代置して遺伝的突然変異
、遺伝形質発現、塩基配列決定等早くて経済的な遺伝研究の道具として急浮上し
、実用化されている。しかし、支持体にオリゴヌクレオチドを効率的に固定させ
る方法には困難な点がある。
【０００３】 現在までガラス、シリコン、ニトロセルロース膜またはポリスチレンのような
支持体に予め合成されたオリゴヌクレオチドを固定するか、または、直接支持体
上でオリゴヌクレオチドを合成する多様な方法等が知られている。
【０００４】 オリゴヌクレオチドを直接支持体上で合成する方法は25mer以下の短いオリゴ
ヌクレオチドを高密度でアレイすることができる。しかし、診断等多くの分野で
は、予め合成されたオリゴヌクレオチドやPCR等で合成された遺伝子断片を利用
しなければならないし、このために現在まではDNAと支持体表面を結合反応基で
それぞれ活性化させ相互間の共有結合を利用する方法と並びに受動吸着(passive
absorption)やアビジン−ビオチン親和性結合またはポリアクリルアミド、ポリ
ピロールまたはニトロセルロース溶液とオリゴヌクレオチドを混ぜた後、共重合
させる結合方法等が提示された。また、ガラス板にポリアクリルアミドゲルを形
成させた後ゲル表面を活性化させてオリゴヌクレオチドと共有結合を誘導する3
次元的機能化ポリアクリルアミドゲルパッド法も提示された。
【０００５】 もう少し具体的に、Dugganらはガラス板表面をポリリジンでコーテイングして
陽性電荷を呈する官能基を誘導し、DNA溶液を滴下した後、UVを照射してガラス
板表面の官能基とDNAを構成するチミジン残基(thymidineresidues)間の共有結合
でDNA断片をガラス支持体に結合した(Duggan，D．J．等(1999)Ｎat Genet.(Supp
l.) 21、10−14)、しかし、この方法で支持体に固定されたDNAは特定な方向がない
ため非特異的に支持体上に固定されるので, ハイブリダイゼーションに影響を及
ぼす。
【０００６】 このような非特異的結合を最少化するために、Chriseyらは一側方向にチオー
ルを加えて変形させたオリゴヌクレオチドとアミノシランを加えて変形させたシ
リカスライドまたはn-型Ｓiウエーハ支持体, そして多様な種類のアミン/スルフ
ヒドリル異型二機能クロスリンカ(heterobifunctional crosslinker)を利用して
DNAを固定及びハイブリダイゼーションを行なった。その結果、固定密度162−22
34fmol/ｍｍ２, ハイブリダイゼーション効率９.３−76.1%(15−178fmol/mm２)
を表すと報告したことがあるが(Linda A. Chriseyら(1996)Nucleic Acids Res.
24, 3031−3039)この方法は、多様な塩基で構成されたオリゴヌクレオチドの場
合、効率が低いので、オリゴヌクレオチド種類に従って、使用が制限されること
もある。
【０００７】 また、Rogerらは二硫化−変形されたオリゴヌクレオチドをメルカプトシラン
に変形された支持体にクロスリンカ無しにd(T)10スペーサーだけを使用して直接
固定する方法を報告した。(Yu−Hui Rogerら(1999)Anal．Biochem.、266、23−30
)。その結果、高い固定密度(3×105)oligo/μｍ２＝500fmol/mm２)とハイブリダ
イゼーション効率(16%)を見せている。また、支持体表面の疎水性特徴は滴下後
、乾燥状態に従って、形成されるドーナツ現象と多様な種類のオリゴヌクレオチ
ドを同時に高密度滴下時、発生し得る混合現象を抑制することができると報告し
た。
【０００８】 Joosらは、カルボキシル化オリゴヌクレオチドとアミノ基で変形させた支持体
間のアミノ/カルボキシ異型二機能クロスリンカ(EDC)を利用した固定方法を報告
した(Beda Joos ら(1997)Anal.Biochem.、247、 96−101)。彼らによれば、固定時
、EDC 反応phに従って、固定効率は異なって表れ、最高固定密度は160fmole/mm2 であった。 ハイブリダイゼーションの最適条件は、固定されるオリゴヌクレオチ
ド上にスペーサーとして約15個以上の塩基が必要なことが報告された。
【０００９】 スペーサーを必要とする、また他の例として、Guoらは支持体をアミノプロピ
ルトリメトキシルシランで処理し、これをp−フェニレンジイソチオシアネート
と反応させ、5’アミノ−変形オリゴヌクレオチドと共有結合をなすようにした(
Zhen Guo ら(1994)Nucleic Acids Res．22, 5456-5456)。彼らによれば、最高固
定密度は、330fmole/ mm2であり、スペーサーとしてd(T)15使用した。
【００１０】 このように、共有結合を利用する方法は、殆ど別途のクロスリンカを準備しな
ければならないし、固形媒質(本明細書の“支持体”と同じ概念であって、本明
細書で混用する)表面とオリゴヌクレオチドにそれぞれ相互結合できる反応基を
誘導する前処理をしなければならいないので、製造過程が複雑で、オリゴヌクレ
オチドアレイの製造費用が増加する。
【００１１】 非共有結合方法である受動吸着としては、支持体としてポリスチレンを使用す
る方法が提示された(Nikiforov T．T．ら(1995)Anal．Biochem．，227，201−20
9)。これは塩や、陽イオン性界面活性剤が含まれたDNA溶液をそのまま支持体と
反応、固定させる方法であって塩はオリゴヌクレオチド骨格のリン酸とポリスチ
レン表面の陰電荷間の反発力を減らし、陽イオン性界面活性剤の陽電荷はオリゴ
ヌクレオチドの陰電荷間の反発力を減らすことにより、ポリスチレンとオリゴヌ
クレオチド間の電気的反発力を最少化させ、疎水性相互作用による結合を誘導す
ることができるとした。この方法で固定されたオリゴヌクレオチドの固定効率は
、1.1pmol/wellであったし、 ハイブリダイゼーションは最高50%まで表れた。 こ
の方法は、 比較的簡単であり、経済的ではあるが、 常用し得る支持体が制限され
、高温において固定が不安定である。
【００１２】 また、ビオチン−アビジン親和性結合を利用する方法(Syvanen. Ａ．C.ら(199
8)Nucleic Acides Res. 16、 11327−11338)は固形媒質とオリゴヌクレオチドに
アビジンとビオチンをそれぞれ結合させる前処理段階を経なければならないので
、試料製造単価が非常に高くなる。
【００１３】 共重合は、5’−末端にアクリルアミド基を有するオリゴヌクレオチドをアクリ
ルアミドと混ぜ、該溶液をシランで処理されたガラススライド上に滴下した後、
共重合させることによりオリゴの塩基部位が外に露出されたポリマー層がガラス
表面に形成される(Farah N. Rehman, ら（1999)Nucleic Acids Res. 27, 649−6
55), この方法は固定率は83−84%(約200fmol/mm2)であって非常に高いが、これ
に比べてハイブリダイゼーションは上記固定条件下で約15%であって相対的に低
い。
【００１４】 （発明の開示） 従って、本発明は、上記従来技術の短所を克服し、高い結合効率性と安定性を有
し、ハイブリダイゼーションのためにオリゴヌクレオチドを特定方向に結合する
ように支持体に付着させる方法及びその方法によって製造されたオリゴヌクレオ
チドアレイを提供することである。
【００１５】 また、本発明は多数の多様なオリゴヌクレオチドに対し制約無しに使用するこ
とができるオリゴヌクレオチドを支持体に付着させる方法及びその方法によって
製造されたオリゴヌクレオチドアレイを提供することである。
【００１６】 さらに、本発明は簡単で経済的にオリゴヌクレオチドを支持体に付着させる方
法及びその方法によって製造されたオリゴヌクレオチドアレイを提供することで
ある。
【００１７】 （発明を実施するための最良の形態） 本発明は、オリゴヌクレオチドを支持体に固定させる改善された方法を提供す
る。また、本発明は、上記方法によって製造されるオリゴヌクレオチドアレイを
提供する。
【００１８】 上記本発明の目的を達成するための本発明は、支持体上に一定条件下で固形化
できる疎水性の固定層を塗布する段階と；3’−または5’−末端に疎水基を結合
させたオリゴヌクレオチドで水溶液を上記固定層上の一定部位に滴下する段階；
及び上記固定層を固形化させる段階とで構成される。
【００１９】 また、本発明は、支持体上に塗布された固形化された疎水性の固定層を一定条
件下で流動化させる段階と；3’−または5’−末端に疎水基を結合させたオリゴ
ヌクレオチド水溶液を上記固定層上の一定部位に滴下する段階と；上記固定層を
固形化させる段階とから構成される。
【００２０】 また、本発明の構成には上記3’−または5’−末端に疎水基を結合させたオリ
ゴヌクレオチドの代わりに5’−末端に疎水基を結合させたプライマーから増幅
されたPCR増幅産物を支持体に固定させる方法も含まれる。
【００２１】 本発明において、上記固定層は、好ましくは重合または重縮合によって形成さ
れるポリマーであることを特徴とする。
【００２２】 また、本発明において、上記オリゴヌクレオチドまたはPCR増幅産物またはそ
のプライマーに結合される疎水基は好ましくはジメトキシトリチル基、ピレンま
たはコレステロールであることを特徴とする。
【００２３】 のみならず、本発明は、上記方法等によって製造されるオリゴヌクレオチドア
レイ、即ち、支持体上に塗布された固定層に複数個のオリゴヌクレオチドの 5’
−末端または3’−末端に結合された疎水基が固定されたオリゴヌクレオチドア
レイから構成される。
【００２４】 本発明で支持体はガラス、シリコン、ニトロセルロース膜またはポリスチレン
のような重合体等、DNAチップに利用される支持体はいかなるものでも利用でき
る。
【００２５】 本発明において”オリゴヌクレオチド”は、アデニン、グアニン、シトシン、
チミン、ウラシル及びこれらの誘導体を含む多様な種類のヘキサンが2個以上数十
個まで結合されたことを意味し、のみならず、プライマーで増幅されたPCR増幅産
物も含む意味に使用される。
【００２６】 DNA合成は、塩基単量体または二量体以上のオリゴヌクレオチドの5’−OHの
保護基、例えばジメトキ シトリチル基（dimethoxytrityl ｇroup；DMT）を除去
させ5’−OHを活性化させる脱保護（deprotection）段階，脱保護された5’−
OHを新しい塩基単量体と亜リン酸トリエステル結合を形成させるカップリング段
階、亜リン酸トリエステル結合を安定的なリンに変化させる酸化段階、 反
応しないで残った5’−OHをジメトキシトリチル基（dimethoxytrityl group; DM
T）等を利用して不活性化（本明細書において“保護(protection)”と同一な概
念に使用される）させるキヤッピング段階；のような4段階の一連の過程の反復
を通じて行われる。従って、最終的に合成されたオリゴヌクレオチドの5’−OH
は保護基(protection group)で保護されており、一般的にオリゴヌクレオチドの
場合、5’末端の保護基を除去する”脱保護段階”を経て合成されるか、最終合
成後5’−保護基を除去し、使用するようになる。
【００２７】 本発明において固定層としては一定条件下で固形化できる多様な疎水性物質を
含む。好ましくは重合または重縮合によって形成されるポリマーを使用すること
ができるが、これらポリマーの単位体であるモノマーを適当な溶媒に溶かして流
動性のある状態に作った後、支持体上に塗布することにより固定層を形成する。
例えば、PVC樹脂または紫外線や光によって固形化されるポリマー等を使用する
ことができる。
【００２８】 本発明において固定層は支持体上に塗布された後、固形化される前に末端一側
に疎水基が結合されたオリゴヌクレオチド水溶液を固定層上に滴下した後、疎水
基が疎水性である固定層内に疎水性相互反応(hydrophobic interaction)するよ
うにした後、固定層を重合等で固形化させることができる。固定層を重合または
固形化させる方法は使用される固定層成分の特性に従って選ぶことができるし、
例えば乾燥させるか紫外線線照射等の方法で固形化させることができる。
【００２９】 または、支持体上に予め固定層を塗布し、固形化させておいてからオリゴヌク
レオチドを固定させる必要がある場合には支持体上に塗布された固形化された疎
水性の固定層を一定条件下で例えば、有機溶媒を一定量加える等の方法で流動化
させた後、末端の一側に疎水基を結合させたオリゴヌクレオチド水溶液を上記固
定層上の一定部位に滴下し、上記固定層をさらに固定化させることができる。
【００３０】 本発明において、オリゴヌクレオチドを溶解させる溶媒としては親水性であり
、オリゴヌクレオチドを溶解させる溶媒は何れでも使用することができる。例え
ば、水や適当な緩衝溶液を使用することができるし、特にオリゴヌクレオチド及
びオリゴヌクレオチドの3’−または5’−末端疎水基を安定化させ得る溶媒が好
ましい。
【００３１】 本発明において、オリゴヌクレオチドは3’−または5’−末端に疎水基 を有
する。本発明の一実施例ではオリゴヌクレオチド合成終了後、5’−末端に付着
された疎水性保護基を除去する必要なしにそのままオリゴヌクレオチドアレイ製
造に使用することができる。一例として、現在商業的に使用されるオリゴヌクレ
オチド製造用DNA単量体は5’−末端がDMTで保護されている例が多いが、オリゴ
ヌクレオチド製造後、最終段階で結合されたヌクレオチドの5’−末端に付着さ
れたDMTを除去する必要なしにそのままオリゴヌクレオチドアレイ製造に利用で
きる。この場合DMT除去工程即ち、脱保護工程及び他のリンカを結合させる工程
が省略されるので全体工程が従来方法に比べて遥かに簡単になり費用もまた顕著
に低減される。必要な場合オリゴヌクレオチド製造後、残存している5’−末端
の保護基を除去し、疎水性のまた他の保護基を末端の一側即ち、3’−または5’
−側に結合させた後，本発明の方法に使用できる。
【００３２】 また、オリゴヌクレオチド末端の一側に結合させる疎水基は必要に応じて3’-
または5’−末端に結合させることができる。例えば、支持体上にオリゴヌクレ
オチドを特定方向に結合しなければならない必要があるとき、3’−末端にだけ
または5’−末端にだけ疎水基を結合させることにより支持体に付着されるオリ
ゴヌクレオチドの方向性を決定することができる。
【００３３】 本発明の方法において、末端の一側に疎水基が結合されたオリゴヌクレオチド
を利用することによりこの疎水基が結合されたオリゴヌクレオチド水溶性液を固
定層上に提供すると親水性及び疎水性の同一性質間の親和性と他の性質間の反発
力に因りオリゴヌクレオチドに結合された疎水基部位は相対的に疎水性である固
定層に、オリゴヌクレオチドの親水性部位、即ち、DNAは固定層と反対方向に位
置する状態で維持される(図6 参照)。先ず、支持体10上に固定層20を塗布する。
この固定層が誘導状態にあるとき例えば、モノマーが重合されないとき、オリゴ
ヌクレオチド水溶液30を固定層上に滴下する。このときオリゴヌクレオチドの末
端の一側に結合された疎水基31は疎水性固定層上に疎水性結合をするようになり
、親水性のオリゴヌクレオチド側32は支持体と反対側に位置するようになる。固
定化段階を経て固定層が固定化されることによりオリゴヌクレオチドは支持体に
固定されるようになる。
【００３４】 この状態で固定層を乾燥(または固定化)させることによりオリゴヌクレオチド
がハイブリダイゼーションをすることができる最適の状態に方向性をもって支持
体上の固定層に固定されるようになる。従って、本発明の方法によって製造され
たオリゴヌクレオチドアレイは正確に5’−末端または3’−末端の疎水基部分が
支持体側に付着され、オリゴヌクレオチドは支持体の反対側に位置するようにな
るので、ハイブリダイゼーション立体妨害(steric hindrance)による影響がない
という点がまた異なる長所である。
【００３５】 （実施例１：オリゴヌクレオチドアレイの製造） PerSeptive Biosystemes社の ’8909 Expedite Nucleic Acid Synthesis Syat
em‘ 合成機を利用して次のような配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
【００３６】 つぎの配列等は任意の人工配列であり、本発明はオリゴヌクレオチド配列の特
性とは係わりなく全てのオリゴヌクレオチドに適用できる。
【００３７】 （1）一般オリゴヌクレオチド 疎水基を有するオリゴヌクレオチドの固定及びハイブリダイゼーションの対照
用に使用され合成及び精製は次のとおりである。
【００３８】 5’−末端がDMTで保護された状態(trityl−ON)にオリゴヌクレオチドを合成し
た後アンモニア溶液を処理して合成のとき使用された支持体から分離した後、CO
Pコラムを使用してDMT基を除去した状態で精製し、分光光度計で定量化し、真空
濃縮機で完全に乾かした後、1xTE、pH８緩衝溶液で100、200pmol/ul濃度で溶か
し、冷凍保管しながら使用した。
【００３９】 上記方法で合成及び精製されたオリゴヌクレオチドは如何なる種類の疎水基も
有しないし、疎水基を有するオリゴヌクレオチド(DMT−及びコレステロールオリ
ゴヌクレオチド)とそれぞれ同一な塩基配列を有する。
【００４０】 一般オリゴヌクレオチドの種類及び塩基配列は次のとおりである。
【００４１】 No. 1：５’−GCT TTG GGG CAT GGA CAT TGA CCC GTA TAA−3’(30mer) No. 2：５’−GCT TTG GGG CAT GGA TAT TGA CCC GTA TAA−3’(30mer) No. 3：５’−TTT TCC TGG GCC TGT GGC TGG−3’(21mer) No. 4：５’−TTT TTT ATG GGG ATA TGC TGG TGA Ｇ−3’(25mer) No. 5：５’−TTT TTT CCG CCT CAC AGT TGA TGG A−3’(25mer) （2）疎水基を有するオリゴヌクレオチド (イ) DMTオリゴヌクレオチド 一般オリゴヌクレオチドのように5’-末端がDMTで保護された状態(trityl−ON
)で合成されたオリゴヌクレオチドをアンモニア溶液で処理した後、１Ｍトリス(
pH 8)緩衝溶液を最終濃度100mＭになるように適正量を添加した後、真空濃縮機
で乾燥させ、0.1xTE, pH 8 緩衝溶液で溶かし、分光光度計で定量した後、１xTE
, pH 8 緩衝溶液で100、 200pmol/ulの多様な濃度で希釈後冷凍保管しながら使用
した。
【００４２】 DMTオリゴヌクレオチドの種類及び塩基配列は次のとおりである。
【００４３】 DMT 1：５’−DMT−GCT TTG GGG CAT GGA CAT TGA CCC GTA TAA−3’(30mer
) DMT 2：５’−DMT GCT TTG GGG CAT GGT TAT TGA CCC GTA TAA−3’(30mer) DMT オリゴヌクレオチドDMT 1, 2は一般オリゴヌクレオチドNo. 1, 2はそれ
ぞれ塩基構成は同じであり、５’末端に疎水性DMT基有無によって区別される。
【００４４】 （ロ）ピレン基オリゴヌクレオチド ピレン基−CEホスホルアミデート(Pyrene−CE phosphoramidite)(Cruachem)を
利用して5’末端側がピレン結合され変形されたピレンオリゴヌクレオチドをト
リチル−オフ(trityl−OFF)合成した。その後RP−HPLCで精製し、真空濃縮機で乾
燥し、1xTE、pH８緩衝溶液で500pmol/ulに製造して冷凍保管しながら使用した。こ
れは疎水性の性質が強いのでトリチル−オフ合成後RP−HPLC精製が可能である。
【００４５】 ピレンオリゴヌクレオチド塩基構成は次のとおりである。 Pyr．1：5’−ピレンCTT CTG ACT TCT TTC CTT CTA TTC−3’(24mer) (ハ) コレステロールオリゴヌクレオチド コレステロールホスホルアミデート(Cholesterol phosphoraｍidite)(Chemgen
es)を利用して5’末端にコレステロールが結合され変形されたコレステロールオ
リゴヌクレオチドをトリチル-オン(trityl−ON)合成後、RP−HPLC精製した。精
製されたコレステロールオリゴヌクレオチドは真空濃縮機で乾燥し、1xTE、pH８
緩衝溶液で500pmol/ulに製造して冷凍保管しながら使用した。
【００４６】 コレステロールオリゴヌクレオチドの種類及び塩基構成は次のとおりである。
【００４７】 Chol．1：5’−コレステロール−CTT CTG ACT TCT TTC CTT CTA TTC−3’(2
4mer) Chol．2：5’−コレステロール−TTT TCC TGG GCC TGT GGC TGG−3’（21me
r） Chol. 3:5’−コレステロール-TTT TTT ATG GGG ATA TGC TGG TGA G−3’(2
5mer) Chol. 4:5’−コレステロール-TTT TTT CCG CCT CAC AGT TGA TGG A−3’(2
5mer) コレステロールオリゴヌクレオチド Chol. 1. 2. 3. 4は、一般オリゴヌクレ
オチドNo．3. 4. 5と同一な塩基配列で構成される。
【００４８】 （3）蛍光オリゴヌクレオチド ハイブリダイゼーション確認に使用し、5’末端がフルオレセインに変形され
たオリゴヌクレオチドはフルオレセイン−CEホスホルアミデート(Fluorescein−
CE phosphoramidite)（Cruachem）を使用して合成後、PAGE精製し、3’末端がフ
ルオレセインに変形されたオリゴヌクレオチドはフルオレセインカラム(Fluores
cein column) （Cruachem）を使用してトリチル−オン(trityl−ON)合成後COP精
製した。
【００４９】 上記方法で合成及び精製されたそれぞれの蛍光オリゴヌクレオチドは分光光度
計で定量し、真空濃縮機で乾燥後、 DWで１nmol/ul濃度のストックで製造して冷
凍保管し、使用時、 ハイブリダイゼーション溶液に適正濃度で希釈した。
【００５０】 蛍光オリゴヌクレオチドの種類及び塩基構成そしてそれぞれの特性はつぎのと
おりである。
【００５１】 Flu．1：5’−TAC GGG TCA ATG TCC ATG CCC CAA−フルオレセイン−3’(2
４mer) DMT 1及びＮo．1と相補的塩基配列で構成 Flu．2：5’−TAC GGG TCA ATA ACC ATG CCC CAA−フルオレセイン−3’(2
４mer) DMT 2及びＮo．2と相補的塩基配列で構成 Flu．３：5’−フルオレセインGTG GTT TCA CCT ACG ACA CTA−3’(21mer) Flu．4：5’−フルオレセインGAA TAG AAG GAA AGA AGT CAG−3’(21mer) Pyr．1及び Chol. 1と相補的塩基配列で構成 Flu．5：5’−フルオレセインCCA GCC ACA GGC CCA GG−3’(1７mer) Chol. 2及びNo．3と相補的塩基配列で構成 Flu．6：5’−フルオレセインCTC ACC AGC ATA TCC CCA TAA−3’(21mer) Chol. 3及びNo．4と相補的塩基配列で構成 Flu．7：5’−フルオレセインTCC ATC AAC TGT GAG GCG GAA−3’(21mer) Chol. 4及びNo．5と相補的塩基配列で構成 （実施例２：オリゴヌクレオチドアレイの製造） 一般的に使用されるガラススライドを２Ｎ ＨＣ１で５分間処理し蒸留水で３
回洗浄した後、アセトンで１分間処理して水分を除去し、固定層である重合体が
堅固に結合できるように結合実例である(ジメチルジクロロシラン)で表面を処理
した後室温に保管しながら使用した。
【００５２】 紫外線固形化樹脂(紫外線照射によってのみ固形化される特性を有する−市販
されている)を結合実例である処理されたスライド表面に0.2〜0.3mm厚さで一様
に塗布して流動状態の固定層を形成させ、その上に実施例1の方法で準備した多様
な濃度のDMT、ピレンまたはコレステロールに変形されたオリゴヌクレオチドと変
形されない一般オリゴヌクレオチドを0.2〜1ulずつ滴下した。
【００５３】 その後、スライドは、オリゴヌクレオチドが滴下された表面が下に向かった状
態で維持しながら空気中に３〜５分間放置した後、312nm紫外線を約30秒〜1分間
照射して紫外線固形化樹脂を固形化させることにより、 オリゴヌクレオチドを固
定化させた。 場合によって上記UV固形化樹脂の完全な重合(固形化)のためにオリ
リゴヌクレオチドが滴下された位置に蒸留水0.5ul／スポットを加えて水溶液層
を形成させた後、 UVランプ(254nm)で1分間照射して２次固形化した。
【００５４】 上の方法で準備されたオリゴヌクレオチドアレイは空気中で２時間乾燥させた
後、結合されないオリゴヌクレオチドを除去するために１xTE. Ph８緩衝溶液で
３回洗浄するかまたは０.２％SDS溶液に２分、蒸留水に２分間２回浸して洗浄し
、空気乾燥させた後、ハイブリダイゼーションに使用した。
【００５５】 （実施例３：ハイブリダイゼーション） ハイブリダイゼーションは先ず、DMTオリゴヌクレオチドの場合、次のとおり
行った。 ５xSSC、 0.５% SDSハイブリダイゼーション溶液に相補的及び非相補的
蛍光オリゴヌクレオチドを適正量希釈してこれを上記のとおりオリゴヌクレオチ
ドが滴下された位置に0.5 ulずつ滴下し、溶液の蒸発を防ぐために2xSSC または
1xTE 緩衝溶液で湿度を維持したハイブリダイゼーションカセットにスライドを
入れて30℃で3時間処理した。スライド洗浄は2ｘSSC、0.1% SDS溶液で10分間2回
処理し、 1xTE、 pH8 緩衝溶液で5回洗浄した。Molecular Dynamics社(米)の‘Ｓt
orm(商標名)’を利用して蛍光を測定及び分析した。本実験ではピクセル(pixel)
当たり200umのスキャン分解能で分析し、0.5ulを滴下する場合、約3ｍｍ２の表
面積となり、これは75ピクセル/スポット(pixel/スポット)に該当する。各ピクセ
ルの蛍光サイズは16−ビット正確度(precision)で計数化され、 これをImageQuaN
T ｖ4.0分析プログラムで分析した。
【００５６】 また、ピレン及び/またはコレステロールに変形されたオリゴヌクレオチドに対
するハイブリダイゼーション実験は次のとおり行った。
【００５７】 先ず、5xSSC, 0.2% SDSハイブリダイゼーション溶液にそれぞれの蛍光オリゴ
ヌクレオチドを10pmol/ul量で希釈し、 この溶液10ul(100pmol)を上記実施例２の
方法でオリゴヌクレオチドを結合させたスライドに滴下した後、 カバーガラス（
18×18mm）を気泡がないように被せた。スライドをハイブリダイゼーションカセ
ットに入れ、湿度を維持しながら50℃で2時間処理してハイブリダイゼーション
を行った。 ハイブリダイゼーションが終わったスライドは洗浄溶液I（2xSSC．0
．2 %SDS）を利用して先ず、カバーガラスを除去した後、新しい洗浄溶液Ｉに浸
して37℃で30分間処理した。室温で洗浄溶液II(0.2xSSC、 0.2 % SDS)と洗浄溶液
III(0.2xSSC)、 蒸留水に順次3分間浸し、 段階別に洗浄した。 その後、空気中に
完全に乾燥させGSI １umonics 社の‘ScanArray 5000’で蛍光を測定及び比較分
析した。この時、解像度(Resolution)は10um, レーザー出力(Laser Power)は50〜
55%、PMTグレインは60〜65%であった。
【００５８】 ハイブリダイゼーション結果は図７乃至図９に示した。 （実施例４：オリゴヌクレオチドの固定確認） 疎水性であるDMT基による支持体上にオリゴヌクレオチドの固定したか否かを
確認するために2種類のDMTオリゴヌクレオチドDMT１とDMT２(図1のスポット1,2)
そして、DMTオリゴヌクレオチドと同一な塩基配列の一般オリゴヌクレオチドNo.
1と No.2(図1のスポット3,4)を固定層として重合体が塗布された支持体表面にそ
れぞれ30pmol/スポット(0.3ul)ずつ滴下した後、それぞれの相補的蛍光オリゴヌ
クレオチドFlu. 1とFlu．2 25pmolでハイブリダイゼーションさせた。その結果
を図1に示した。コントロールとしてCは、1xTE緩衝溶液0.3ulを滴下した後、ハ
イブリダイゼーションを行わない結果である。図１からDMTオリゴヌクレオチドは
DMTによって支持体によく固定されハイブリダイゼーションが可能であることが
分かる。
【００５９】 5’末端をピレンまたはコレステロールを結合させたオリゴヌクレオチドに対
しても上記方法で実験した。結果は図７乃至図９に示した。
【００６０】 図７はピレンオリゴヌクレオチドと一般のオリゴヌクレオチドを支持体に固定
した後、相補及び非相補的蛍光オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションさ
せた結果を示す写真である。
【００６１】 レーンAの１〜6にはPyr.１ピレンオリゴヌクレオチドを、 レーンBの1、2、4、5に
はNo. 4一般オリゴヌクレオチドを滴下した。 また、 レーンＢのスポット3と6に
はオリゴヌクレオチドなしに1xTE緩衝溶液0.2ulを滴下しコントロールとして使
用した。
【００６２】 また、P1にはPyr．1ピレンオリゴヌクレオチドとは非相補的であるが、No．4
一般オリゴヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドでハイブリダイゼー
ションし、P2にはPyr．1と相補的であるFlu. 4蛍光オリゴヌクオチドでハイブリ
ダイゼーションした。
【００６３】 一般オリゴヌクレオチド(レーンＢ)とピレンオリゴヌクレオチド(レーンＡ)の
比較及びＰ1とＰ2の比較を通じてピレンによってオリゴヌクレオチドが支持体上
に特異的ハイブリダイゼーションが可能な状態に固定されたことが分かる。
【００６４】 また、Ｐ2のレーンＡスポット4、 5、 6には同一量のピレンオリゴヌクレオチド
を固定し、相補的であるFlu．４蛍光オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーシ
ョンを行った結果でこれを通じて再現性を確認することが出来た。
【００６５】 図8は支持体に4つの種類のコレステロールオリゴヌクレオチドと一般オリゴヌ
クレオチドを固定した後、蛍光オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションさ
せた結果を示した写真である。
【００６６】 P1, P2、 P3のレーンAにはコレステロールオリゴヌクレオチドを滴下（Al：Cho
l. 1, A2: Chol．2，A3：Chol.3，A4：Chol.4）し、レーンＢには一般オリゴヌ
クレオチドを滴下（Ｂ2：Ｎｏ．3、Ｂ3：Ｎo．4，B4:No．5）した。レーンＢの
スポット1には1xTE緩衝溶液0．2ulを滴下し、コントロールとして使用した。
【００６７】 また、P1にはＦlu.4蛍光オリゴヌクレオチドで、Ｐ２にはＦIｕ．5で、P3 にはFlu.６でそれぞれハイブリダイゼーションした。
【００６８】 その結果、Chol．1コレステロールオリゴヌクレオチドはその配列に相補的なF
lu．4蛍光オリゴヌクレオチドと特異的に反応し、Chol．2、Chol．3コレステロ
ールオリゴヌクレオチドもそれぞれその配列に相補的なFlu．5，Flu．6 蛍光オ
リゴヌクレオチドと特異的に反応した。
【００６９】 このようにＰ1〜Ｐ3の各レーンＡとＢの比較を通じて固定された各オリゴヌク
レオチドの塩基構成及び長さに係わりなくコレステロールによってオリゴヌクレ
オチドが支持体上に特異的ハイブリダイゼーションが可能な状態で固定されてい
るのを知ることができる。
【００７０】 図９は三種類のコレステロールオリゴヌクレオチドと一般のオリゴヌクレオチ
ドを支持体に固定した後、相補的及び非相補的蛍光オリゴヌクレオチドでハイブ
リダイゼーションさせた結果を示す写真である。
【００７１】 Ｓ1−レーンＡにはChol．2コレステロール-オリゴヌクレオチドを固定さ
せ、 Ｓ1−レーンＢにはNo．3一般オリゴヌクレオチドを固定させ、 Ｓ2−レーンＡにはChol．3コレステロール-オリゴヌクレオチドを、 Ｓ2−レーンＢにはNo．4一般オリゴヌクレオチドを、 Ｓ3−レーンＡにはChol．4 コレステロール−オリゴヌクレオチドを、 Ｓ3−レーンＢにはNo．5一般オリゴヌクレオチドをそれぞれ固定させた。
【００７２】 Ｓ1、 S2、S3のスポットＢ3及びB６にはオリゴヌクレオチド無しに1xTE0.
2ulを滴下してコントロールとして使用した。
【００７３】 また、各スポットには次のとおり蛍光オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼー
ションした。
【００７４】 S1−P1：Flu．4蛍光オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション S1−P2：Flu．5蛍光オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション S1−P1：Flu．7蛍光オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション S2−P2：Flu．6蛍光オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション S3−P1：Flu．4蛍光オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション S3−P2：Flu．7蛍光オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション 一般オリゴヌクレオチド（レーンB）と比較するとき、コレステロールオリゴ
ヌクレオチド（レーンA）は支持体上に固定され特異的ハイブリダイゼーション
が可能(レーンAの1、2、3と4，5、6比較)し、各Sの比較を通じてコレステロール
-オリゴヌクレオチドの種類(塩基構成及び長さ)に係わりなく固定されることを
再確認することができた。また、 レーンAの4、5、６で再現性を確認することがで
きた。
【００７５】 （実施例５：相補的及び非相補的蛍光オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼー
ション比較） 支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションであ
るか否かを確認するためにDMTオリゴヌクレオチドを固定させた後、相補及び非
相補的蛍光オリゴヌクレオチド濃度を異にしてハイブリダイゼーションを行った
。
【００７６】 図2はDMT １オリゴヌクレオチドを50pmol/スポット(0.5ul)ずつ滴下した後、
レーンＡは相補である蛍光オリゴヌクレオチドFlu．1で10、50、100pmol(スポッ
ト 1，2，3)ずつハイブリダイゼーションし、レーンＢは非相補的蛍光オリゴヌ
クレオチドFlu.3で10、 50、 100pmol(スポット 4, 5，6)ずつハイブリダイゼーシ
ョンした。 Cはコントロールであってハイブリダイゼーションを行わない状態で
ある。結果は図2に示されたように相補的蛍光オリゴヌクレオチドを加えた場合、
ハイブリダイゼーションが起こり、また、相補的蛍光オリゴヌクレオチドの濃度が
高くなるほどハイブリダイゼーションが良く起こった。
【００７７】 （実施例6：再現性確認） DMT １オリゴヌクレオチドを0.5ul（50pmol）ずつ8個を滴下後、相補的蛍光オ
リゴヌクレオチドFlu. 1 50pmolでハイブリダイゼーションさせた。 7個（図３の
スポット 1-7）の結果を比較して再現性を確認した。Cはコントロールであって、
オリゴヌクレオチド滴下後ハイブリダイゼーションを行わなかったものである。
結果を図3に示した。
【００７８】 ピレンオリゴヌクレオチド及びコレステロールオリゴヌクレオチドに対しても
図７及び図９のように同一な濃度で3個のスポットに対して実験することにより
再現性実験を行い、その結果、再現性があることを確認することができた。
【００７９】 （実施例7：固定の安定性確認） DMTによって固定された状態の安定性を確認するために固定されたものが確認
されたスライドを1xTE緩衝溶液に浸しておいた状態で室温で18時間処理した後、
再び蛍光サイズを測定した。
【００８０】 再現性確認のために使用されたスライド(図3)を利用して前記方法を行い、蛍
光のサイズにおいて変化がなかった。即ち、安定的な結合であることが分かった
。
【００８１】 （実施例8：固定及びハイブリダイゼーション効率比較） DMT１オリゴヌクレオチドを100pmol(レーンＡ)、50ｐmol(レーンＢ)で各4個ず
つ滴下した後、相補的蛍光オリゴヌクレオチドFlu．1 100、50、25、０pmol(1、
2、3、４)でハイブリダイゼーションさせた後、結果を比較した。結果を図5に示
した。それぞれの蛍光値を図４の標準曲線と比較して固定及びハイブリダイゼー
ション密度を算出した結果は表１のとおりである。
【００８２】
【表１】 （産業上の利用可能性） 本発明の場合、固定されたオリゴヌクレオチドが430fmol/mm2 までハイブリダ
イゼーションが可能であることを知ることができた。
【００８３】 本発明によるオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法は、支持体及びオ
リゴヌクレオチドに別途のリンカを付着させる等の前処理が必要でない。
【００８４】 さらに、本発明によるオリゴヌクレオチドの固定方法は、高い結合効率で多様
な種類のオリゴヌクレオチドを同時に付着させることができる。
【００８５】 さらに、本発明によるオリゴヌクレオチドの固定方法は、ハイブリダイゼーシ
ョン効率が従来技術に比べて著しく高いので、診断等の分野で有用である。
【００８６】 のみならず、本発明によるオリゴヌクレオチドの固定方法および、その方法に
よって製造されたオリゴヌクレオチドアレイは特定方向即ち、支持体から5’→3
’、または支持体から３’→５’方向のようにオリゴヌクレオチドアレイの方向
性を特定できるので、従来の方法に比べて有用であり、ハイブリダイゼーション
効率も高い。
【００８７】 また、本発明によるオリゴヌクレオチドの固定方法および、その方法によって
製造されたオリゴヌクレオチドアレイは従来の支持体とオリゴヌクレオチド間の
非特異的な結合に比べて立体妨害が少ない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 支持体に固定されたDNAオリゴヌクレオチドと一般オリゴヌクレオチドのハイ
ブリダイゼーション結果を示す写真である。
【図２】 支持体に固定させたDNTオリゴヌクレオチドを相補的及び非相補的蛍光オリゴ
ヌクレオチドで濃度別にハイブリダイゼーションさせた結果を示した写真である
。
【図３】 支持体に同一な条件でDMTオリゴヌクレオチドを固定させた後、ハイブリダイ
ゼーションを行って再現性を確認した写真である。
【図４】 固定率及びハイブリダイゼーション効率を確認するための蛍光サイズの標準曲
線である。
【図５】 濃度別に支持体に固定されたDMTオリゴヌクレオチドを相補的蛍光オリゴヌク
レオチドで濃度別にハイブリダイゼーションさせた結果を示す写真である。
【図６】 本発明のオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法を概念的に示したもの
である。
【図７】 ピレン(pyrene)オリゴヌクレオチドと一般オリゴヌクレオチドを支持体に固定
した後、相補及び非相補的蛍光オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションさ
せた結果を示す写真である。
【図８】 支持体に4つの種類のコレステロールオリゴヌクレオチドと一般のオリゴヌク
レオチドを固定させた後、蛍光オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションさ
せた結果を示す写真である。
【図９】 ３つの種類のコレステロールオリゴヌクレオチドと一般オリゴヌクレオチドを
支持体に固定した後、相補及び非相補的蛍光オリゴヌクレオチドでハイブリダイ
ゼーションさせた結果を示す写真である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１１月１４日（２００１．１１．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA11 HA14 4B029 AA07 AA23 BB20

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 支持体上に一定条件下で固形化できる疎水性の固定層を塗布
    する段階と； 3’−または５’−末端に疎水基を結合させたオリゴヌクレオチド水溶液を上記
    固定層上の一定部位に滴下する段階；及び上記固定層を固形化させる段階とから
    構成されるオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法。
  2. 【請求項２】 支持体上に塗布された固形化された疎水性の固定層を一定条
    件下で流動化させる段階と；3’−または5’−末端に疎水基を結合させたオリゴ
    ヌクレオチド水溶液を上記固定層上の一定部位に滴下する段階と；上記固定層を
    固形化させる段階とから構成されるオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方
    法。
  3. 【請求項３】 上記疎水基を結合させたオリゴヌクレオチドは5’−末端に
    疎水基を結合させたプライマーから増幅されたPCR増幅産物であることを特徴と
    する請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法。
  4. 【請求項４】 上記固定層は、重合または重縮合によって形成されるポリマ
    ーであることを特徴とする請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドを支持
    体に固定させる方法。
  5. 【請求項５】 上記疎水基は、ジメトキシトリチル基、ピレン基及び、コレ
    ステロールから構成されたグループ中の１種以上であることを特徴とする請求項
    １または２に記載のオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法。
  6. 【請求項６】 上記固定層は、重合または重縮合によって形成されるポリマ
    ーであることを特徴とする請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを支持体に固定
    させる方法。
  7. 【請求項７】 上記疎水基は、ジメトキシトリチル基、ピレン基及び、コレ
    ステロールから構成されたグループ中の1種以上であることを特徴とする請求項
    ３に記載のオリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法。
  8. 【請求項８】 第１項ないし第７項中のいずれかの１方法によって製造され
    るオリゴヌクレオチドアレイ。
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