JP3727882B2 - 固体支持体への核酸固定化用担体 - Google Patents

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Description

【０００１】
背景技術
１．技術分野
本発明は、ＤＮＡチップの作製に使用される核酸固定化用担体に関する。また、本発明は、該担体への核酸の固定化方法、及び当該担体での標的核酸の検出方法に関する。
【０００２】
２．関連技術
ゲノム解析技術の進展により、各種生物ゲノムの構造が解明されつつある。これと並行して、ゲノムの機能解析のための技術開発がすすめられている。このような状況で、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）は注目されている技術である。ＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体表面に多数の異なる遺伝子あるいはその断片（ＤＮＡ断片）を固定化したマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異および多型性の解析に有用である。
【０００３】
標的核酸の担体への固定化法は、ＤＮＡチップを作製するために必要な基本技術であり、ＤＮＡチップの作製には大きく分けて２通りの方法が使用されている。一つは、担体上に共有結合したリンカーの先端で核酸を化学合成する方法で、例えば、サイエンス（Science）、第２５１巻、７６７−７７３頁（１９９１）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第２０巻、１６７９−１６８４頁（１９９２）に記載されている。この方法でＤＮＡはオリゴヌクレオチドに限られており、また、反応を制御するための特殊な装置を必要とし、一般的ではない。
【０００４】
もう一つの方法は、予め合成されたＤＮＡやＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で調製されたＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）を担体に共有結合あるいは非共有結合させる方法で、例えば、サイエンス（Science）、第２７０巻、４６７−４７０頁（１９９５）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第２２巻、５４５６−５４６５頁（１９９４）に記載されている。
【０００５】
非共有結合による固定化方法においては、ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）等の塩溶液に溶解したＤＮＡ（またはＲＮＡ）をそのままあるいは変性処理した後、ポリリジンやポリエチレンイミン等の塩基性ポリカチオンでコートした、あるいはアミン含有シラン化合物（例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン）でシラン処理したスライドガラスにスポットし、ＵＶ照射により固定化する。この方法によれば、どのようなＤＮＡ（またはＲＮＡ）も固定化することができるはずである。
【０００６】
しかしながら、実際には、この方法では、オリゴヌクレオチドや短鎖ＤＮＡ（０．３Ｋｂ未満）は固定化されにくい。また、長鎖ＤＮＡ（０．３Ｋｂ超）を非共有結合する場合においても、洗浄やハイブリダイゼーションの工程でＤＮＡが担体から剥離する可能性があり、標的核酸の検出感度を低下させる要因となり得る。
【０００７】
さらには、非共有結合による固定化方法には、担体表面に残存する塩基性官能基（陽イオン）とプローブ核酸（陰イオン）との非特異的な結合により、バックグラウンドシグナルが高くなるという制約がある。残存するアミノ基をアセチル化（無水コハク酸などの無水物によるアミンのカルボン酸への転換）によりブロッキングする方法が知られているが、この転換は必ずしも完全ではない。
【０００８】
核酸としては短鎖核酸、長鎖核酸、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡを含む多くの種類があり、その各々の種類の核酸の固定化に適し、高感度で標的核酸の検出に使用することができる担体の開発が求められている。
【０００９】
発明の概要
本発明の主な目的は、（１）高効率で核酸を固定化できる新規な核酸固定化用担体の作製；（２）核酸を固定化した担体（すなわち、作製されたＤＮＡマイクロアレイ）；（３）固定化核酸の製造方法；および（４）核酸を固定化した担体を用いる核酸の検出方法である。
【００１０】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、核酸の結合のために表面にポリアニオンを有する核酸固定化用担体に関する。１つの好ましい態様においてポリアニオンはポリアクリル酸であるが、いずれものポリアニオンを使用することができる。
【００１１】
本発明の第２の発明は共有結合を介する核酸の担体への固定化を含む。好ましい方法はカルボン酸官能基の活性化エステルへの転換を含む。次いで、活性化エステルをアミン修飾核酸と反応させる。
【００１２】
本発明の第１、第２の発明の態様において、担体は非多孔性表面であり、ガラスが好適である。
【００１３】
本発明の第３の発明は核酸が固定化された担体であって、ポリアニオンの活性化エステル型を介して核酸が担体に共有結合している、核酸が固定化された担体に関する。本発明の第３の発明の態様において、ポリアニオンは好ましくはポリアクリル酸であり、好ましい活性化エステルは、カルボジイミドカップリングを介してポリアニオンおよびペンタフルオロフェノールから調製されるペンタフルオロフェノールエステルである。
【００１４】
本発明の第４の発明は核酸の担体への固定化方法であって、ポリアニオンの活性化エステル誘導体でコートした担体を、アミン修飾核酸と接触させる、核酸の担体への固定化方法に関する。本発明の第４の発明の態様において、ポリアニオンは好ましくはポリアクリル酸であり、担体は好ましくは非多孔性であり、非多孔性担体としてはガラスが好適である。
【００１５】
本発明の第４の発明の態様において、核酸は活性化エステル誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸であり、好ましくは核酸をアミノ基で修飾する。
【００１６】
本発明の第５の発明は、限定するものではないが、下記工程を包含することを特徴とする被検体（または試料）中の標的核酸の検出方法に関する：
ａ）核酸固定化用担体がポリアニオンの活性化エステル誘導体となる工程であって、ポリアニオンはスライドガラスの表面に事前に共有結合されている；
ｂ）上記活性化エステル誘導体と、当該エステル誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程；
ｃ）担体に固定化された核酸（標的核酸）と、相補的な核酸（プローブ核酸）とをハイブリダイズさせる工程；
ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
【００１７】
本発明の第６の発明は、限定するものではないが、下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法に関する：
ａ）担体の活性化エステル誘導体と、当該活性化エステル誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程；
ｂ）担体に固定化された核酸と、相補的な核酸とをハイブリダイズさせる工程；
ｃ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
【００１８】
詳細な説明
ポリアニオンとは２個以上の負電荷を含むポリマーである。
【００１９】
核酸なる用語は、オリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、アンチセンス、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの部分、またはウイルス（ウイルスＤＮＡ）、直鎖ＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡ由来遺伝物質の形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を包含する。
【００２０】
恒湿器は固定された湿度範囲に維持できるいずれかのチャンバーである。
【００２１】
本発明における核酸を固定化する担体は、ＤＮＡチップやバイオセンサーに使用出来るものであれば特に限定はないが、好ましくは、非多孔性でなめらかな表面を有する支持体からなり、スライドガラスまたはシリカビーズのような材料が好適に使用出来る。
【００２２】
１つの態様において、担体表面にポリアニオンと反応できる官能基（この場合アミノ基）を与えるように担体を３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理する。ガラス担体の表面に官能基を導入できるいずれかのシランを本発明において使用することができる。次いで、ポリアニオンを、カルボジイミドカップリング反応を介して担体のシラン処理した表面に共有結合させることができる。
【００２３】
ポリアニオンは、プローブ核酸との非特異的結合（静電的）を妨げる効果のある、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基等の酸性官能基を有し、担体表面に共有結合され、ポリアクリル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびポリリン酸が好適に用いられる。これらのポリアニオンを、カルボジイミド（またはその他の活性化エステル）化学反応を介して担体のシラン処理した表面に結合させる。
【００２４】
これらのポリアニオンコートした担体に標的核酸を固定化するためには、ポリアニオンの酸性官能基を活性化しておく（活性化エステルを形成させる）必要がある。例えば、カルボキシル基であればペンタフルオロフェノールを、リン酸基であればイミダゾールエステルを、活性化エステル誘導体として使用することができる。
【００２５】
担体に固定化する核酸としては、特に限定はなく、合成オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらの誘導体のいずれも使用することができる。これらの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は一本鎖、二本鎖のいずれの形態も使用することができる。該誘導体としては、担体表面への固定化を可能にする修飾を有していれば特に制限はないが、例えば、ＤＮＡの５’末端がアミノ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基で修飾された誘導体を例示することができる。また、修飾した５’末端に架橋剤や、スぺーサーとしてのリンカー、例えばアルキルアミン等を付加した誘導体も使用することが出来る。本発明においては、５’末端の修飾はオリゴヌクレオチドのような短鎖核酸の固定化に特に有効である。種々の官能基またはシグナル基（signaling group）を導入するように共有結合により修飾されたいずれの核酸を使用することもでき、ＭｉｒｕｓのＬａｂｅｌＩＴ試薬を使用して核酸を修飾してもよい。
【００２６】
前記修飾核酸を、０．０１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるように、固定化に好適な溶液、例えば、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．５）、あるいは５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、そのままあるいは変性処理した後、表面処理してエステル官能基を活性化した前記担体と接触させることにより、所望の核酸を担体に固定化することができる。すなわち、前記ＤＮＡ溶液をマイクロピペットやＤＮＡチップ作製装置（ＤＮＡアレイヤー）を用いて前記表面処理して活性化されたエステル官能基を有する担体に一定量ずつスポットする。恒湿器中に３０〜６０分保持した後、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、蒸留水の順で洗浄する。さらに、必要とあれば核酸を固定化した担体を室温で０．３Ｎ ＮａＯＨに５分間、あるいは沸騰水中に２分間浸漬して核酸を変性させ、蒸留水、無水エタノールの順で洗浄、乾燥させる。この処理によって、核酸と未反応の活性化エステル基は、カルボン酸部分に加水分解される（すなわち負に荷電する）。これらの酸性基は、プローブ核酸と担体との非特異的な静電結合を妨げるので、一般的には、ポリリジンスライドに必要な無水コハク酸ブロッキング操作が省略できる。これらの酸性基はまたバックグラウンドシグナルを低下させる。
【００２７】
このようにして担体に固定化された核酸量は、蛍光標識した核酸を用いて測定することができる。標識標的核酸の共有結合による固定化操作を行い、残存する蛍光シグナルを検出することができる。本発明の固定化方法は、固定化効率が高く、固定化された核酸はハイブリダイゼーションの条件下で剥離することはないので（核酸は担体に共有結合しているので）、遺伝子の発現レベル、変異、多型性等の高感度検出に利用することが出来る。
【００２８】
担体（例えばＤＮＡチップ）に共有結合した標的核酸の検出には、一般的なハイブリダイゼーション方法が用いられる。プローブ核酸を蛍光色素（またはその他のシグナル基）で標識し、アルカリ、または熱変性した後、ハイブリダイゼーション溶液に加え、その５〜２０μｌをアレイ表面に滴下し、その上に空気がはいらないようにカバーガラスをのせ、これを恒湿器に入れ、適当な温度で適当な時間保持した後カバーガラスをはずし、スライドガラスを十分洗浄し、水滴を除いて蛍光スキャナー（蛍光リーダー）で蛍光シグナルを検出する。
【００２９】
本発明のポリアニオンコートしたスライドガラスは核酸を効率良く固定化できる。共有結合したポリアニオンによって担体の表面に形成された三次元マトリックスにより、核酸の固定化量が多くなる。
【００３０】
本発明の核酸が固定化された担体によって、核酸のシグナル検出が高感度で低バックグランドとなる。標的核酸と未反応のポリアニオンの活性化エステル誘導体は加水分解によりポリアニオンになり、負荷電のプローブ核酸の担体への非特異的結合は阻止される。
【００３１】
本発明によれば、（１）標的核酸（オリゴヌクレオチドを含む）が高い効率で担体に固定化され、（２）固定化後のブロッキング操作が省略でき、（３）標的核酸と担体との非特異的な結合が最小限に抑えられ、（４）ポリアニオン処理による三次元効果でハイブリダイゼーションの効率が高まる等の結果として、高感度で標的核酸が検出ができる。
【００３２】
実施例
以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００３３】
実施例１
（１）標準ＤＮＡとして、それぞれ配列表の配列番号１及び２に示す２種類のファージＤＮＡ断片（それぞれ１．０Ｋｂおよび０．３Ｋｂで、後者は前者の一部）をＰＣＲにより調製した。
【００３４】
すなわち、ファージＤＮＡを鋳型として配列表の配列番号３に示すプライマーＳと配列表の配列番号４に示すプライマーＡ１０００の組み合わせと、プライマーＳと配列表の配列番号５に示すプライマーＡ３００の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行った。その後、各増幅断片をＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ ９６（キアゲン社製）を用い、添付説明書に従って精製した。カラムからのＤＮＡの溶出は蒸留水にて行い、凍結乾燥により濃縮した。
【００３５】
各ＤＮＡ断片を２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、ＧＭＳ４１７アレイヤー（Genetic MicroSystems社製）を用いて表面にアミノ基を有する市販のスライドガラス上にアレイを作製した。スライドガラスは、ＤＮＡチップ作製に広く用いられている、ポリ−Ｌ−リジンをコートしたＰＯＬＹ−ＰＲＥＰ−ＳＬＩＤＥＳ（シグマ社製、以下ＰＬＬコートスライドガラスと略す）およびアミノアルキルシラン系のＭＡＳコートスライドガラス（松浪硝子工業社製、以下ＭＡＳコートスライドガラスと略す）を用いた。スポットは、サイズ１５０μｍ、間隔３７５μｍに設定し、同一ＤＮＡを５スポットずつ整列させた。
【００３６】
ＤＮＡのスポット後、各スライドガラスを３７℃、湿度９０％の恒温恒湿器中に１時間保持した後、６０ｍＪ／ｃｍ２でＵＶクロスリンクした。このスライドガラスを０．２％ＳＤＳで１回、蒸留水で２回洗浄後、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去した後、風乾した。このように前処理したスライドガラスは、蒸留水で十分洗浄した後、沸騰水浴中で３分間煮沸後、氷冷エタノールにさらすことによりＤＮＡを変性し、低速遠心分離によりエタノールを除去後、風乾し、デシケーター中に保存した。
【００３７】
スライドガラスの一部を無水コハク酸処理し、担体表面の遊離アミノ基をスクシニル化によりブロッキングした。１．５ｇの無水コハク酸を８９．５ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解後、９ｍｌの１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混和し、ブロッキング溶液を調製した。スライドガラスをブロッキング溶液に室温で２０分間浸した。このように処理したスライドガラスは、蒸留水で十分洗浄した後、沸騰水浴中で３分間煮沸後、氷冷エタノールにさらすことによりＤＮＡを変性し、低速遠心分離によりエタノールを除去後、風乾し、デシケーター中に保存した。
【００３８】
（２）アミノアルキルシラン処理した市販スライドガラス（Ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅｓ、ＰＥバイオシステムズ社製、以下ＡＡＳスライドガラスと略す）を２．５％ グルタルアルデヒド溶液に１時間浸漬した後、蒸留水で３回洗浄し、風乾させ、アルデヒド基でコートしたスライドガラスを得た。
【００３９】
配列表の配列番号６に示した配列を有し、５’末端に鎖長６のアルキルアミノリンカー（ＰＥバイオシステムズ社製）を結合させた２４塩基長のオリゴヌクレオチド（以下、ＮＨ２−Ｆオリゴと称す）をＤＮＡ合成機を用いて合成し、１０ｍＭとなるように２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。実施例１−（１）と同様にして、この合成ＤＮＡをＧＭＳ４１７アレイヤーを用いてグルタルアルデヒド処理スライドガラスにスポットした。スポット後のスライドガラスは、０．２％ＳＤＳで２分間洗浄後、蒸留水で連続的に洗浄した。担体のアルデヒド基とＤＮＡのアミノ基との共有結合によるシッフ塩基を安定なアミンに還元するために、スライドガラスを０．２５％の水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬社製）を含んだＰＢＳ−１００％エタノール（体積比３：１）に５分間浸漬した後、乾燥させた。
【００４０】
（３）ポリアニオンの固体支持体への共有結合
顕微鏡用スライドガラスを、２Ｍ硝酸、２Ｍ水酸化ナトリウム、純水、およびアセトン中で、それぞれ１０分間ずつ超音波処理することにより洗浄した。４％となるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノールに溶解し、先に洗浄したスライドガラスをこの溶液中で２分間アミノシラン化した後、１００℃で１０分間保持することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。次に、５ｍｇ／ｍｌとなるようにポリアクリル酸をジメチルホルムアミドに溶解し、さらに、４．０ｇ／１００ｍｌとなるように１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（以下ＥＤＣと略す）を加えた。アミノシラン化した上記スライドガラスをこの溶液に一晩浸し、ジメチルホルムアミド、メタノール、純水、およびアセトンでリンスした。このポリアクリル酸コートスライドガラスを減圧下で乾燥させた。
【００４１】
（４）ポリアニオンコート固体支持体の活性化
以下のようにしてポリアクリル酸コートスライドガラスを活性化エステルコートスライドガラスとした。１．８ｇのペンタフルオロフェノール、２．０ｇのＥＤＣ、および１３ｍｇのジメチルアミノピリジンを５０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。実施例１−（３）で調製したポリアクリル酸コートスライドガラスを、この溶液に５時間浸した後、ジメチルホルムアミドおよび塩化メチレンでリンス後、減圧下で乾燥させ、デシケーター中で保存した。
【００４２】
実施例２
（１）実施例１−（１）と同様にして、２つのサイズのλファージＤＮＡ断片（１．０Ｋｂおよび０．３Ｋｂ）を調製した。この合成において、５’末端に鎖長６のアルキルアミノリンカー（ＰＥバイオシステムズ社製）を結合させた、アミン含有プライマーＳを用いることにより、末端にアミノ基を有するＤＮＡ断片を増幅した。精製後の各アミン含有ＤＮＡ断片を、終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、実施例１−（４）の方法により活性化した活性化エステルコートスライドガラス上に、３個ずつスポットした。なお、コントロールとして、ＰＬＬコートスライドガラスにも同じアレイを作製した。
【００４３】
ＤＮＡをスポットした活性化エステルコートスライドガラスは、３７℃、湿度９０％の恒温恒湿器（東京理化器械：アイラＫＣＬ１０００型）中に３０分間保持した後、室温の０．２％ＳＤＳ中で保持して余分な塩を洗浄し、次いで蒸留水で洗浄した。その後、０．３Ｎ ＮａＯＨに５分間浸漬してＤＮＡを変性させ、蒸留水で十分洗浄後、１，０００ｒｐｍ程度の遠心分離により乾燥させ、デシケータ中に保存した。
【００４４】
（２）ハイブリダイゼーション
それぞれのスライドガラスで作製した核酸アレイを、蛍光色素で標識した核酸プローブとハイブリダイズさせ、観察した。各ＤＮＡアレイを、５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、および６×ＳＳＣからなるプレハイブリダイゼーション緩衝液中で、４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションに供した。
【００４５】
上記実施例１−（１）で調製した１．０ＫｂλファージＤＮＡ断片を、Ｌａｂｅｌ ＩＴＲ Ｃｙ５ＴＭ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、添付説明書にしたがってＣｙ５ＴＭで標識した後、エタノール沈殿によって精製した。このＣｙ５ＴＭ標識核酸プローブを、終濃度が２０、２、あるいは０．２ｎｇ／ｍｌとなるようにプレハイブリダイゼーション緩衝液で希釈し、９５℃で２分間加熱し室温まで冷却した後、遠心分離により不溶物を除去した。ハイブリダイゼーション溶液約５μｌを核酸アレイ上に滴下し、泡が入らないようにカバーガラスで覆った後、恒湿器に入れ４２℃で２０時間保温した。室温の２×ＳＳＣ溶液中でカバーガラスを外し、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中で、６５℃で５分間、５５℃で３０分間を２回洗浄した。その後、室温の０．０５×ＳＳＣで１０分間洗浄し、１，０００ｒｐｍ程度の遠心分離により水分を除去後、風乾した。
【００４６】
ハイブリダイゼーション後の核酸アレイをＧＭＳ４１８アレイスキャナー（ＧＭＳ社製）を用いて、測定波長：６３５ｎｍ、励起波長：６６０ｎｍで読み取った。検出されたシグナルの強度を画像解析ソフトウエアＩｍａＧｅｎｅ（バイオディスカバリー社製）を用いて解析した。その結果を表１にまとめて示した。
【００４７】
【表１】
Figure 0003727882
【００４８】
表１で明らかなように、すべてのプローブ濃度において、いずれのサイズの固定化されたＤＮＡのシグナルも活性化エステルコートスライドガラスの方がＰＬＬコートスライドガラスと比較して強かった。すなわち、標的ＰＣＲ増幅核酸断片の検出において、活性化エステルコートスライドガラスを用いて作製したＤＮＡチップは、従来の（ＰＬＬ）コートスライドガラス上で作製したものより強いシグナルを与えることが示された。
【００４９】
実施例３
（１）オリゴヌクレオチドＤＮＡアレイを有するＤＮＡチップの作製
配列表の配列番号６に示した配列を有し、５’末端を鎖長６のアルキルアミノリンカー（ＰＥバイオシステムズ社製）で修飾した２４塩基長のオリゴヌクレオチド（以下、ＮＨ２−Ｆオリゴと称す）、および水酸基を含むように５’末端を修飾したオリゴヌクレオチド（以下、ＯＨ−Ｆオリゴと称す）の２つを、それぞれＤＮＡ合成機を用いて調製した。さらに、該オリゴヌクレオチドに相補的な配列番号７に示した配列を有し、５’末端にＣｙ３ＴＭを結合させた２４塩基長のオリゴヌクレオチド（以下、Ｃｙ３−Ｒオリゴと称す）、及びこれらのオリゴヌクレオチドと無関係な配列で配列番号１４で示される配列を有する５’末端にアルキルアミノリンカーを結合させた２４塩基長のオリゴヌクレオチド（以下、ＮＨ２−Ｎオリゴと称す）の２つを合成した。
【００５０】
ＯＨ−Ｆオリゴ、ＮＨ２−Ｆオリゴ、およびＮＨ２−Ｎオリゴを２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に、５、５０、および５００μＭの濃度となるようにそれぞれ溶解し、実施例１−（４）記載と同様な方法で活性化した活性化エステルコートスライドガラスに整列させた。なおこの時、各ＤＮＡ配列を７スポットずつ整列させた。スポット後、実施例２記載のようにスライドガラスを洗浄、乾燥し、オリゴヌクレオチドチップとした。なお、コントロールとして、実施例１−（２）に記載の方法で、同じオリゴヌクレオチドのアレイをグルタルアルデヒド処理スライドガラスに作製した。
【００５１】
（２）オリゴヌクレオチドチップのハイブリダイゼーション
それぞれのスライドガラスで作製したオリゴヌクレオチドチップを、先に調製したＣｙ３−Ｒオリゴをプローブとしてハイブリダイズさせ、その蛍光シグナルを観察した。すなわち、１ｍＭのＣｙ３−Ｒオリゴ、０．２％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、および６×ＳＳＣからなるハイブリダイゼーション溶液約５μｌをオリゴヌクレオチドアレイにそれぞれ添加し、泡が入らないようにカバーガラスで覆った後、恒湿器に入れ４２℃で２０時間保温した。室温の２×ＳＳＣ溶液中でカバーガラスを外し、室温の２×ＳＳＣ中で１０分間の洗浄を２回行い、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。ハイブリダイゼーション後のオリゴＤＮＡチップの全蛍光をＧＭＳ４１８アレイスキャナーを用いて、測定波長：６３５ｎｍ、励起波長：６６０ｎｍで測定し、検出されたシグナルの強度を画像解析ソフトウエアＩｍａＧｅｎｅを用いて解析した。その結果を表２にまとめて示した。
【００５２】
【表２】
Figure 0003727882
【００５３】
表２で明らかなように、活性化エステルコートスライドガラスでは、５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチドのスポットの方がアミノ基を持たないオリゴヌクレオチドのスポットより強いシグナルを示し、スライドガラス上の活性化エステル基とオリゴヌクレオチドのアミノ基が反応していることが確認された。いずれのオリゴヌクレオチドにおいても、活性化エステルコートスライドガラスに作製したスポットの方が、グルタルアルデヒド処理スライドガラスのものよりシグナル強度は強くなった。
【００５４】
実施例４
ポリアクリル酸の三次元効果
異なる長さの蛍光標識核酸をスポットした核酸アレイのハイブリダイゼーションシグナルを、固定化された単位核酸長当たりのシグナルとして算出した。ヒトトランスフェリンレセプター（以下ＴＦＲと略す）ｃＤＮＡ断片は以下の方法で調製した。常法によりヒトＫ５６２細胞株（大日本製薬社製）よりｍＲＮＡを抽出し、ＴＦＲのｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＴＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ０１０６０）に特異的な、配列表の配列番号８及び９に示すプライマーＳ７とＡＳ７を用いて、４，７３８ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これをｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン社製）に接続し、組換え体プラスミドｐＴ７ＴＦＲを得た。このｐＴ７ＴＦＲをテンプレートとして、片方のプライマーをローダミンＸ（ＰＥバイオシステムズ社製：以下ＲＯＸと略す）で５’末端標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、鎖長の異なる蛍光標識ＰＣＲ断片を調製した。すなわち、ＲＯＸ標識Ｓ７（配列番号８）とＡＳ４（配列番号１０）、ＡＳ３（配列番号１１）、ＡＳ２（配列番号１２）、あるいはＡＳ１（配列番号１３）のプライマー対でそれぞれＰＣＲを行い、１．０、０．５、０．２、および０．１ｋｂの断片を調製した。
【００５５】
精製後の各ＤＮＡ断片は２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した後、Ａｍｉｎｏ Ｌａｂｅｌ ＩＴＲ試薬を用いてアミノ化した。すなわち、精製ＤＮＡ溶液に、ジメチルスルホキシドに溶解したＡｍｉｎｏ Ｌａｂｅｌ ＩＴＲ試薬を重量比で５分の１量添加し、３７℃で１時間保温した。アミノ化した各ＤＮＡは、エタノール沈殿法により精製した。
【００５６】
Ａｍｉｎｏ Ｌａｂｅｌ ＩＴ試薬は国際公開公報ＷＯ９８／５２９６１記載の方法に従い、蛍光基をアミノ基に換え調製した。
【００５７】
アミノ化ＴＦＲ断片を、終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、実施例１−（４）のようにして活性化した活性化エステルコートスライドガラス上に、実施例１−（１）の方法により各配列７点ずつスポットした。スポット後、実施例３記載のように洗浄、乾燥した。なお、コントロールとして、実施例１−（１）に記載の方法で、同じアレイをＭＡＳコートスライドガラスを用いて作製し、固定化処理後、遊離アミノ基の無水コハク酸ブロッキングを行ったものと、ブロッキング処理を行わないものを作製した。
【００５８】
それぞれのスライドガラスで作製したＤＮＡチップを、ＲＯＸと異なる蛍光波長を有するＣｙ５で標識したＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、そのシグナルを観察した。すなわち、上記のように調製した１．０ＫｂのＴＦＲ断片を、Ｃｙ５ Ｌａｂｅｌ ＩＴＲ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、添付説明書にしたがってＣｙ５ＴＭで標識した。
【００５９】
２０ｎｇ／ｍｌＣｙ５標識ＤＮＡプローブ、０．２％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、および６×ＳＳＣからなるハイブリダイゼーション溶液約５μｌをチップ上のＤＮＡが固定されている領域にそれぞれ添加し、カバーガラスで覆った後、恒湿器に入れ６５℃で２０時間保温した。室温の２×ＳＳＣ溶液中でカバーガラスを外し、０．２％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中で、６５℃で５分間、５５℃で３０分間を２回洗浄した。その後、室温の０．０５×ＳＳＣで１０分間洗浄し、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。
【００６０】
ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップは、ＧＭＳ４１８アレイスキャナーを用いて、アレイＤＮＡの末端ＲＯＸ標識の蛍光シグナルおよびハイブリダイゼーションプローブのＣｙ５標識の蛍光シグナルをそれぞれ測定し、得られた画像を画像解析ソフトウエアＩｍａＧｅｎｅを用いて解析し、蛍光シグナルを数値化した。そして、各サイズのＤＮＡごとに、Ｃｙ５のシグナル強度をＲＯＸのシグナル強度で割った値を単位ＤＮＡ当たりのシグナル強度とした。その結果を表３に示した。なお、ＭＡＳコートスライドガラスで作製したＤＮＡチップのうち、遊離アミノ基のブロッキング処理しなかったＤＮＡチップは、バックグラウンドが高く、シグナルの定量ができなかった。
【００６１】
【表３】
Figure 0003727882
【００６２】
表３で明らかなように、いずれの長さのＤＮＡ断片においても活性化エステルコートスライドガラスに作製したスポットの方が、ＭＡＳコートスライドガラスに作製したものより単位ＤＮＡ当たりのシグナル強度は強くなった。この結果は、活性化エステルコートスライドガラスによってハイブリダイゼーションの効率がより良くになることを示す。共有結合したポリアニオンによって作り出される三次元格子により、結合した標的核酸の接近がより多くなり得る。
【００６３】
実施例５
実施例２−（１）と同様にして、ＤＮＡ断片の末端にアミノ基が付加した１．０Ｋｂおよび０．３Ｋｂの２種のλファージＤＮＡ断片を調製した。得られたＤＮＡの一部を、実施例４記載の方法で、Ａｍｉｎｏ Ｌａｂｅｌ ＩＴＲ試薬を用いてさらにアミノ化した。各ＤＮＡ断片を、終濃度０．５ ｍｇ／ｍｌとなるように２０ ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、活性化エステルコートスライドガラスおよびＭＡＳコートスライドガラス上に各ＤＮＡ断片あたりそれぞれ７箇所ずつスポットした。
【００６４】
それぞれのスライドガラスで作製した核酸アレイを、蛍光Ｃｙ３標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、そのシグナルを解析した。すなわち、上記のように調製した１．０Ｋｂのλファージ断片を、Ｌａｂｅｌ ＩＴＲ Ｃｙ３ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、添付説明書にしたがってＣｙ３で標識した。このＣｙ３標識ＤＮＡプローブを使用して実施例４記載の方法でハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。
【００６５】
ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの蛍光（すなわち、シグナル強度）を、ＧＭＳ４１８アレイスキャナーを用いて測定波長：５３２ｎｍ、励起波長：５７０ｎｍで測定し、得られた画像を画像解析ソフトウエアＩｍａＧｅｎｅを用いてシグナル強度を数値化した。ＭＡＳコートスライドガラス上のスポットのシグナルを１００とした相対蛍光強度を求めた。その結果を表４に示した。
【００６６】
【表４】
Figure 0003727882
【００６７】
表４で明らかなように、活性化エステルコートスライドガラスのシグナル強度は、いずれのＤＮＡ断片のスポットにおいてもＭＡＳコートスライドガラスより強く、特に、３００ｂｐの短鎖ＤＮＡ断片においてＭＡＳスライドガラスより顕著にシグナルが強くなった。
【００６８】
活性化エステルコートスライドガラスにスポットした場合では標的をさらにアミン修飾した方がアミン修飾しないものより強いシグナルが得られ、Ａｍｉｎｏ Ｌａｂｅｌ ＩＴＲを用いたアミノ化修飾は、活性化エステルコートスライドガラスへの標的の結合の増加に有効であることが示された。
【００６９】
上記の実施例は本発明の原理の例示である。さらに当業者にとって多数の変形および変更は容易であるので、本発明を上記の特定の構成、操作に限定するものではない。従って、全ての適切な変形および等価物は本発明の範囲内にある。

Claims (10)

  1. ポリアニオンを共有結合させた担体表面に前記ポリアニオンと結合した核酸が固定化された核酸検出用担体であって、前記核酸とは未反応のポリアニオンの酸性基が担体表面に存在することを特徴とする核酸検出用担体。
  2. ポリアニオンがポリアクリル酸からなる請求項１記載の担体。
  3. 固体支持体が非多孔性である請求項１記載の担体。
  4. 固体支持体がガラスからなる請求項３記載の担体。
  5. 下記工程を包含することを特徴とする核酸の担体への固定化方法：
    ａ）担体表面にポリアニオンを共有結合させる工程；
    ｂ）ポリアニオンの酸性基を活性化エステルに活性化する工程；
    ｃ）前記担体に核酸を接触させ、核酸を担体に固定化する工程；
    ｄ）未反応の活性化エステルを加水分解して酸性基にする工程。
  6. ポリアニオンがポリアクリル酸からなる請求項５記載の方法。
  7. 固体支持体が非多孔性である請求項５記載の方法。
  8. 固体支持体がガラスからなる請求項７記載の方法。
  9. 核酸が活性化エステルとの反応のためにアミノ基を含む請求項５記載の方法。
  10. 下記工程を包含することを特徴とする被検体中の試料核酸の検出方法：
    ａ）請求項１記載の核酸検出用担体上の固定化核酸に相補的な試料核酸をハイブリダイズさせる工程；
    ｂ）ハイブリダイズした試料核酸を検出する工程。
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