JP2004097173A

JP2004097173A - 静電層を有する固体支持体及びその用途

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Publication number: JP2004097173A
Application number: JP2002275797A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Okamura; 岡村　浩; Michifumi Nika; 丹花　通文; Hirobumi Yamano; 山野　博文; Mitsuyoshi Oba; 大場　光芳; Shuichi Kamei; 亀井　修一; Teruhisa Ichihara; 市原　輝久
Original assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2002-09-20
Publication date: 2004-04-02
Also published as: KR20050021504A; AU2003246264A1; EP1548102A4; EP1548102A1; KR100684098B1; CN1668742A; JP2008292482A; US8551765B2; US20060204959A1; CN100558890C; US8563239B2; EP1548102B1; JP4764901B2; WO2004007710A1; US20090098301A1; US20090111113A1

Abstract

【課題】ＤＮＡを容易に固定化できて、核酸分子の固定化量が高く、核酸分子の結合強度が高い固体支持体及びその応用を提供する。
【解決手段】基板上に、核酸分子を静電的に引き寄せるための静電層、及び核酸分子と共有結合しうる官能基を有する固体支持体を提供すると共に、それを利用したＰＣＲ法による核酸分子の増幅法。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ等を固定化するための支持体及び固定化核酸分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、既存の配列から核酸配列を合成する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、目的とするＤＮＡを１組のプライマーで挟み、ＤＮＡポリメラーゼを作用させることを繰り返し、プライマーで挟んだ領域を無限に増幅させることができる方法である。
【０００４】
ＰＣＲによれば、目的とする配列のみをかなり正確に多数増幅させることができ、しかも短時間で効率よく増幅することができるので、現在、生化学、医療分野等の各種研究、試験、検査等に広く用いられている。
【０００５】
従来より、ＰＣＲの原理は温度制御にあるとされ、その反応は加熱及び冷却の繰り返しにより進められている（サーマルサイクル）。すなわち、増幅対象である二本鎖ＤＮＡ分子を相補的一本鎖に高温変性させた後、冷却して該ＤＮＡの一部に相補するように選択されたプライマーを鎖にアニールさせ、再び加熱してＤＮＡポリメラーゼによりプライマーの後ろにＤＮＡを伸長させるという風に、変性、アニール、伸長のプロセスを１サイクルとして複数サイクル繰り返すことにより二本鎖ＤＮＡを多数増幅することができる。
【０００６】
具体的には、１）二本鎖ＤＮＡの水素結合をほどくために試料の温度を９５℃に上昇させる、２）次いでＤＮＡを複製するためのプライマーと再結合させるために試料の温度を４５℃に下降させる、３）更に耐熱性ポリメラーゼによりプライマーを伸長させてＤＮＡを複製させるために試料の温度を７４℃に上昇させる、といった１）〜３）のサーマルサイクルを幾度も繰り返す必要があった。このようなＤＮＡの増幅反応では、試料を合成樹脂の容器などに入れ、この容器をアルミニウムブロックに収容し前記サーマルサイクルを行っていた。
【０００７】
しかし、前記サーマルサイクルは多大な時間がかかり、目的とする量のＤＮＡを得るには数時間を要していた。また、加熱、冷却による温度制御により反応を進めると、一瞬にして温度を変化させるには限界があり、各段階への切り替えがスムーズにいかず、増幅される核酸の配列の正確性に影響が出たり、目的とする以外のＤＮＡも複製される場合も考えられた。また、迅速な温度変化をさせるためには、特別の装置や技術が必要となるため、設備投資等の経済的な問題や技術的な問題があった。
【０００８】
このような問題に鑑み、ＤＮＡを容易に固定化できて、ＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを複製するために適する支持体として、基板の表面に、表面処理層、及び核酸分子と共有結合しうる官能基を有する化学修飾層を順次設けてなる固体支持体が開発されている（例えば、特許文献３〜５参照）。
【０００９】
しかしながら、前記固体支持体のＤＮＡの固定化量及びＤＮＡの結合強度は、必ずしも充分とはいえず、ＤＮＡの固定化量がより高くＤＮＡ結合強度がより高い固体支持体の出現が望まれている。
【００１０】
この出願の発明に関する先行技術文献情報として次のものがある。
【特許文献１】
特開平７−７５５４４号公報
【特許文献２】
特開平７−３０３４６９号公報
【特許文献３】
ＷＯ００／２２１０８
【特許文献４】
ＷＯ０２／１２８９１
【特許文献５】
特開２００２−８２１１６号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、核酸分子の固定化量がより高く、核酸分子の結合強度がより高い固体支持体を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、基板上に、核酸分子と共有結合しうる官能基を有する固体支持体に、更に核酸分子を静電的に引き寄せるための静電層を設けることにより、核酸分子の固定化量及び核酸分子の結合強度が著しく向上することを見出し本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）基板上に、核酸分子を静電的に引き寄せるための静電層、及び核酸分子と共有結合しうる官能基を有する固体支持体。
（２）基板の表面がダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種で表面処理されている前記（１）に記載の固体支持体。
（３）静電層が、基板と共有結合していないアミノ基含有化合物を含む前記（１）又は（２）に記載の固体支持体。
（４）静電層が、基板と共有結合しているアミノ基含有化合物で構成され、該アミノ基含有化合物が、基板と結合していない側の末端にアミノ基を有する前記（１）又は（２）に記載の固体支持体。
（５）基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入して得られる前記（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体。
【００１４】
（６）基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入して得られる前記（１）〜（４）のいずれかに記載の固体支持体。
（７）非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物がポリアリルアミンである前記（６）に記載の固体支持体。
（８）核酸分子がＤＮＡである前記（１）〜（７）のいずれかに記載の固体支持体。
（９）前記（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体に核酸分子が固定化されてなる固定化核酸分子。
（１０）基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入することを特徴とする固体支持体の製造方法。
【００１５】
（１１）基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入することを特徴とする固体支持体の製造方法。
（１２）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせて、該核酸分子に相補的な核酸分子を伸長する方法。
（１３）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせ、標識した核酸の存在下で該核酸分子に相補的な核酸分子を伸長させ、該相補的な核酸分子に取り込まれた標識核酸に由来するシグナルを読みとることを含む、核酸分子の検出方法。
（１４）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせ、これをＰＣＲ反応に付すことにより、該核酸分子を増幅する方法。
（１５）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーにＤＮＡをハイブリダイズさせて、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと反応させることにより、該ＤＮＡを増幅する方法。
（１６）プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせた後に、該核酸分子を増幅する工程をさらに含む、（１３）に記載の方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる基板の材料としては、例えば、シリコン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ　Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ　Ｓｔｙｒｅｎｅ　樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。
【００１７】
基板の材料として前記のものを用いる場合には、表面処理層を施さなくてもよいが、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定化するために、表面処理を施すことがより好ましい。
【００１８】
表面処理には、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ　Ｌｉｋｅ　Ｃａｒｂｏｎ）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。
【００１９】
表面処理された基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
【００２０】
表面処理層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
基板の表面処理層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｖａｐｏｒ　Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｖａｐｏｒ　Ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＰＣ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００２１】
本発明に用いる基板としては、前記のように表面処理層を形成した構造だけでなく、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）；前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂をバインダーとして混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられ、また、前記の材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））であってもよい。
【００２２】
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００２３】
また、基板の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００２４】
基板としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（ＪＩＳ　Ｂ　０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のＤＮＡプローブ等を高密度で固定化できる点で好都合である。
【００２５】
本発明の固体支持体には、核酸分子を静電的に引き寄せるために静電層が設けられている。
静電層としては、核酸分子を静電的に引き寄せ、核酸分子の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００２６】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ_２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００２７】
静電層は、基板又は表面処理層と共有結合させずに形成してもよく、基板又は表面処理層と共有結合させて形成してもよい。
【００２８】
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。
【００２９】
また、静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板又は表面処理層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００３０】
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板又は表面処理層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
【００３１】
また、静電層が施された基板に核酸分子と共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。
【００３２】
静電層が施された基板に、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。
【００３３】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸分子の固定化量がより向上する。
【００３４】
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
前記のようにして、静電層を施した基板表面には、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入するため、化学修飾を施す。
前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。
【００３５】
官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ^１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ^２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^２は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ^３−ＣＯ−Ｒ^４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ^４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００３６】
前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる。
【００３７】
官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ^６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ^６は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。
【００３８】
官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ^７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ^７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸又はフェノール酸が挙げられる。
【００３９】
官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。
前記の化合物は、そのカルボキシル基が静電層のアミノ基と縮合してアミド結合を形成する。
【００４０】
前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。
【００４１】
本発明の固体支持体には、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれの核酸分子も固定化することができる。ＤＮＡ、ＲＮＡの塩基数は、通常１〜２００、好ましくは５〜１５０である。また、ＤＮＡは一本鎖、二本鎖のいずれも固定化することができる。
【００４２】
本発明の固体支持体は、核酸分子、例えば、ＤＮＡの伸長反応に用いることができる。この場合、まず、固体支持体上にプライマーを固定化して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせる。その後、ＤＮＡ伸長反応によりプライマーにハイブリダイズしたＤＮＡと相補的なＤＮＡを伸長させる。
【００４３】
プライマーとしては、長さ及び配列が明らかな一本鎖又は二本鎖の核酸分子を使用する。長さは特に限定されないが、好ましくは５〜２００塩基、さらに好ましくは１０〜１００塩基である。プライマーの固定化方法としては、特に限定されないが、例えば、核酸分子をバッファーに溶解してプライマー溶液を作成し、これに本発明の固定化支持体を浸漬することによって、固体支持体表面にプライマーを固定化することができる。浸漬は、通常、０〜９８℃、好ましくは４℃〜５０℃で、通常、１分〜２４時間、好ましくは１０分〜１時間行うことによってプライマーを固定化できる。この場合、一定時間浸漬した後、固体支持体を洗浄することによって、固定化されていないプライマーを除去することができる。また、スポッターといわれる装置を使用することによって、多種類のプライマー溶液を固体支持体の表面に固定化できる。スポッターを用いる場合には、例えば、スポッターでプライマー溶液を固体支持体上にスポットした後、加熱したオーブン中で一定時間ベーキングを行い、その後洗浄によって固定していないプライマーを除去する。スポッター装置を用いることにより他種類のプライマーを固体支持体上の異なる位置に固定化できるため一度に多数の試験を実施することができ、膨大な試験を要する核酸検出の分野において有利である。
【００４４】
従来の固体支持体では、伸長反応における熱処理によってプライマーが剥離することがあるが、本発明の固体支持体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、プライマーを固体支持体に固定化した状態で伸長反応を進行させることができる。
【００４５】
この伸長反応の時に、標識した核酸を取り込ませ、伸長反応後、標識に由来するシグナルを読みとることによって、プライマーに特定のＤＮＡがハイブリダイズして伸長反応が進行したか否かを検出することができる。従って、試験した試料中に、固定化支持体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが含まれているかどうかを判定することができ、研究及び医療における有用な検出手段となりうる。
【００４６】
標識としては、核酸分子に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Ｃｙ３及びＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなど）、放射能標識（α−^３２Ｐ、γ−^３２Ｐ、^３５Ｓなど）などが挙げられる。蛍光標識核酸を用いた場合は、伸長反応の後の固体支持体を蛍光撮影することにより、検出することができる。
【００４７】
本発明の固体支持体は、ＤＮＡの増幅反応に用いることができる。ＰＣＲ反応により増幅させる場合には、例えば、まず、固体支持体上にフォワードプライマーを固定化して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせ、その後酵素反応で相補鎖ＤＮＡを伸長する。更に▲１▼アニーリング、▲２▼ハイブリダイゼーション、▲３▼伸長反応という工程を連続で行うことによって、いわゆるＰＣＲ反応が進行する。
【００４８】
従来の固体支持体では、ＰＣＲ反応における熱処理によってプライマーが剥離したり、サーマルサイクルの制御がうまくいかないといった問題があったが、本発明の固体支持体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、さらに、反応を容器の中ではなく固体支持体上にＤＮＡを固定化した状態で行うため、ＰＣＲ反応における温度制御が正確で、増幅される核酸の配列の正確性に影響が出たり、目的外のＤＮＡが複製される可能性も低く、効率的にＤＮＡを増幅することができる。
【００４９】
本発明の固体支持体を上記のＰＣＲによるＤＮＡの増幅に使用する場合は、固体支持体の熱伝導率が０．１Ｗ／ｃｍ・Ｋ以上であることが好ましい。さらに好ましくは熱伝導率が０．５Ｗ／ｃｍ・Ｋ以上、最も好ましくは熱伝導率が１Ｗ／ｃｍ・Ｋ以上である。固体支持体の熱伝導率が高いと、ＰＣＲ反応を行う場合等において、加熱、冷却の追随性が優れているからである。
【００５０】
具体的には、固体支持体を製造するための基板として、熱伝導率の点からはダイヤモンド又は各種基板に表面処理層としてダイヤモンドを被覆した物等を使用するのが好ましい。
【００５１】
さらに、上記の標識核酸を用いた検出とＰＣＲによる増幅とを組み合わせることにより、固体支持体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが試料中に少量しか含まれていない場合であっても、上記のようにＤＮＡが複製され、結果的に多量のＤＮＡが固体支持体上のプライマーにハイブリダイズし、その相補鎖が伸長されるため、検出感度を増大させることが可能になる。
【００５２】
あるいは、伸長反応に使用する酵素として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを選択し、リバースプライマーを加えることによって、サーマルサイクルを経ることなく定温で、ＤＮＡを固体支持体上で増幅することができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に二本鎖領域があった場合その鎖を解離しながら、相補鎖合成を継続できるＤＮＡ合成酵素である。
【００５３】
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、Ｐｈｉ２９　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス）等が挙げられる。
【００５４】
本発明の別の態様においては、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを対象とすることにより、間接的ながらＲＮＡも対象となりうる。
【００５５】
この場合には、ｍＲＮＡから逆転写反応を利用してｃＤＮＡを得るが、ｃＤＮＡを得ると同時に固体支持体に固定化させることができる。まず、固体支持体の化学修飾部分に逆転写プライマーを結合させる。プライマーとしては、一般にオリゴｄＴプライマー、特定塩基配列に相補的なプライマー、ランダム６塩基プライマーが用いられるが、中でもＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）^＋配列に対応させてＴ（チミン塩基）が１０〜２０個程度連なった配列からなるオリゴｄＴプライマーを用いることが望ましい。
【００５６】
オリゴｄＴプライマーを用いる場合には、鋳型となるＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）部分をアニーリングさせる。これに逆転写酵素を作用させ、鋳型ＲＮＡに対し相補的なｄＮＴＰをプライマーの３’末端に順々に重合させることで、５’から３’の方向にｃＤＮＡを合成する。この逆転写反応のプライマーの結合、アニーリング、逆転写酵素による相補鎖重合は、定法に従い温度制御（サーマルサイクル）行うことによって実施できる。
【００５７】
このように逆転写反応を行うと同時に固体支持体への固定も可能であることから、本発明の方法によればいわゆるＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−ＰＣＲ）を効率よく行うことができ、ｍＲＮＡの定量用としても有用である。
【００５８】
更に、本発明の支持体を用い、末端水酸基又は末端カルボキシル基に、水素結合でオリゴ核酸の末端塩基を固定化し、更に、このオリゴ核酸と相補的塩基配列を有するＤＮＡを固定して、ＤＮＡライブラリーチップとして用いることもできる。また、ＤＮＡの代わりに、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント等を固定化して、ライブラリーとすることもできる。
【００５９】
本発明の固体支持体を用いて上記のような検出を行うことにより、疾患の診断を行うこともできる。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）基板に表面処理層を施すときにアミノ基含有化合物をチャンバーに導入（１）
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスに、イオン化蒸着法によって、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後に、メタンガスをキャリアーガスとして５ｃｍ^３／分の割合で１５℃に保温したエチレンジアミン中を通してチャンバーに導入した。作動圧を２Ｐａとして加速電圧０．５ｋｖでメタンとエチレンジアミンを原料としてＣ、Ｎ及びＨからなる層を１０ｎｍの厚みに形成した。
【００６１】
その後、メタンとエチレンジアミンを原料としてＣ、Ｎ及びＨからなる表面処理層のアミノ基に多価カルボン酸として無水ブタンテトラカルボン酸を縮合した後に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【００６２】
その後、０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌを、マイクロアレイ作成装置を用いて基板上にスポットした。その後、８０℃のオーブンで３時間加熱後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した後に、スポットしたＤＮＡの蛍光強度を測定した。
【００６３】
その結果、蛍光強度は３６０５０であった。更に、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにより洗浄した後に蛍光強度を測定すると、３５５４０と殆ど低下しなかった。
【００６４】
比較として、２重量％の３−アミノプロピルトリエトキシシランエタノール溶液にスライドガラスを１０分間浸漬した後、取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥した。次に、このアミノ基が導入された基板に無水コハク酸を縮合した後に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。このようにして得た基板に、同様にしてλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡを固定した後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄したところ、蛍光強度は２３５００であった。更に、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにより洗浄した後に蛍光強度を測定すると、蛍光強度は２３０００とあまり低下しなかった。
【００６５】
即ち、静電層が殆どない共有結合タイプの基板によっては、ＤＮＡを共有結合により強固に固定できるが、蛍光シグナル強度が上がらなかった。
【００６６】
また、静電層を有しない基板（スライドガラスに５％ポリアクリル酸水溶液を塗布乾燥後、６０分間紫外線照射して不溶化した。その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。）に同様にしてλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡを固定した後２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄したところ、ポリアクリル酸塗膜の剥離が生じたが、残存した部位での蛍光強度は２６２２０であった。更に、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにより洗浄すると、ポリアクリル酸塗膜は完全に剥離した。
【００６７】
（実施例２）基板に表面処理層を施すときにアミノ基含有化合物をチャンバーに導入（２）
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスに、イオン化蒸着法によって、メタンガスをキャリアーガスとして５ｃｍ^３／分の割合で１５℃に保温したエチレンジアミン中を通してチャンバーに導入した。作動圧を２Ｐａとして加速電圧０．５ｋｖでメタンとエチレンジアミンを原料としてＣ、Ｎ及びＨからなる層を２０ｎｍの厚みに形成した。
【００６８】
その後、メタンとエチレンジアミンからなる表面処理層のアミノ基に多価カルボン酸としてポリアクリル酸を０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドの存在下で縮合した後に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【００６９】
その後、０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌを、マイクロアレイ作成装置を用いて基板上にスポットした。その後、８０℃のオーブンで３時間加熱した後に２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した後に、スポットしたＤＮＡの蛍光強度を測定した。
【００７０】
その結果、蛍光強度は３４０５０であった。更に、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにより洗浄した後に蛍光強度を測定すると、３３５００と殆ど低下しなかった。
【００７１】
比較として、市販されている静電型基板（松浪硝子工業（株）製；スライドガラスにアミノシラン（シランカップリング剤）を塗布した基板）に同様にしてλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡを固定した後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄したところ、蛍光強度は３５４６０であった。更に、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにより洗浄した後に蛍光強度を測定すると、蛍光強度は２６２１０にまで低下した。
【００７２】
また、静電層を有しない基板（スライドガラスに５％ポリアクリル酸水溶液を塗布乾燥後、６０分間紫外線照射して不溶化した。その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。）に同様にしてλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡを固定した後２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄したところ、ポリアクリル酸塗膜の剥離が生じたが、残存した部位での蛍光強度は２６２２０であった。更に、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにより洗浄すると、ポリアクリル酸塗膜は完全に剥離した。
【００７３】
（実施例３）後処理で静電層を形成
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスに、イオン化蒸着法によって、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。
その後、塩素ガス中で３０分間紫外線照射して塩素化した。その後、ポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に基板を浸漬して、静電層を形成した。
【００７４】
その後、静電層のアミノ基に多価カルボン酸としてポリアクリル酸を０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドの存在下で縮合した後に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【００７５】
その後、０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌを、マイクロアレイ作成装置を用いて基板上にスポットした。その後、８０℃のオーブンで３時間加熱した後に２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄した後に、スポットしたＤＮＡの蛍光強度を測定した。
【００７６】
その結果、蛍光強度は３５０００であった。更に、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにより洗浄した後に蛍光強度を測定すると、蛍光強度は３４５００と殆ど低下しなかった。
【００７７】
比較として、ＤＬＣを１０ｎｍの厚みに形成したスライドガラスに、５％ポリアクリル酸水溶液を塗布乾燥後、６０分間紫外線照射して不溶化した。その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。同様にしてλＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡを固定した後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄したところ、ポリアクリル酸塗膜が完全に剥離した。
【００７８】
（実施例４）浸漬法によるプライマーの固定化
イオン化蒸着法によって、３ｍｍ角に切断したＳｉ基板上に、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１００ｎｍの厚みに形成した。その後、メタンガスと水素ガスの代わりに、アンモニアガス雰囲気とし、プラズマ法により１０分間アミノ化した。
【００７９】
その後、表面処理層に導入したアミノ基に多価カルボン酸（ポリアクリル酸）を縮合した後に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）に０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【００８０】
その後、滅菌水を用いて０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基）に固体支持体を室温で１時間浸漬することによって固定化反応を行った。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【００８１】
フォワードプライマーを固定化した固体支持体を、固定化したプライマーに相補的なλＤＮＡ　５００ｂｐの溶液（０．０２５μｇ／μｌ、バッファー：５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ／２０％ホルムアミド）に浸漬し、９８℃で５分間保持したのちに４２℃で１２時間保持した。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【００８２】
ハイブリダイゼーション後の固体支持体を、反応液（１×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ／０．０２５ｍＭ　Ｃｙ３−ｄＣＴＰ／１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ／０．２５Ｕ　ＥｘＴａｑ）に浸漬して、４２℃で６時間保持した。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
洗浄後の固体支持体を、蛍光画像スキャナーで観察したところ、伸長反応による蛍光シグナルが検出された。
【００８３】
（実施例５）スポット法によるプライマーの固定化（１）
イオン化蒸着法によって、３ｍｍ角に切断したＳｉ基板上に、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１００ｎｍの厚みに形成した。その後、メタンガスと水素ガスの代わりに、アンモニアガス雰囲気とし、プラズマ法により１０分間アミノ化した。
【００８４】
その後、表面処理層に導入したアミノ基に多価カルボン酸（ポリアクリル酸）を縮合した後に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）に０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【００８５】
その後、２０％ＤＭＳＯ溶液を用いて０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基、１０種類）を、スポッター装置を用いて、固体支持体にスポットした。その後、８０℃に加熱したオーブンに１時間入れた後、洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄して、滅菌水でリンスした。
【００８６】
プライマーを固定化した固体支持体を、固定化したプライマーに相補的な一本鎖λＤＮＡ　５００ｂｐの溶液（０．０２５μｇ／μｌ、バッファー：５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ／２０％ホルムアミド）に浸漬し、９８℃で５分間保持したのちに４２℃で１２時間保持した。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【００８７】
ハイブリダイゼーション後の固体支持体を、反応液（１×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ／０．０２５ｍＭ　Ｃｙ３−ｄＣＴＰ／１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ／０．２５Ｕ　ＥｘＴａｑ）に浸漬して、４２℃で６時間保持した。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
洗浄後の固体支持体を、蛍光画像スキャナーで観察したところ、伸長反応による蛍光シグナルが検出された。
【００８８】
（実施例６）スポット法によるプライマーの固定化（２）
イオン化蒸着法によって、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスに、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後、メタンガスと水素ガスの代わりに、アンモニアガス雰囲気とし、プラズマ法により１０分間アミノ化した。
【００８９】
その後、表面処理層に導入したアミノ基に多価カルボン酸（ポリアクリル酸）を縮合した後に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）に０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【００９０】
その後、２０％ＤＭＳＯ溶液を用いて０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基、１０種類）を、スポッター装置を用いて、固体支持体にスポットした。その後、８０℃に加熱したオーブンに１時間入れた後、洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄して、滅菌水でリンスした。
【００９１】
固定化したプライマーに相補的なλＤＮＡ　５００ｂｐの溶液（０．０２５μｇ／μｌ、バッファー：５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ／２０％ホルムアミド）を固体支持体上に１５μｌのせ、更にカバーガラスを載せた。４２℃で５時間保持してハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣでカバーガラスを洗い流し、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【００９２】
ハイブリダイゼーション後の固体支持体上に、反応液（１×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ／０．０２５ｍＭ　Ｃｙ３−ｄＣＴＰ／１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ／０．２５Ｕ　ＥｘＴａｑ）を１５μｌのせ、更にカバーガラスを載せた。４２℃で５時間保持して伸長反応を行った後、０．１×ＳＳＣでカバーガラスを洗い流し、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
洗浄後の固体支持体を、蛍光画像スキャナーで観察したところ、伸長反応による蛍光シグナルが検出された。
【００９３】
（実施例７）アニーリング、ハイブリダイゼーション、伸長反応
イオン化蒸着法によって、３ｍｍ角に切断したＳｉ基板上に、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１００ｎｍの厚みに形成した。その後、メタンガスと水素ガスの代わりに、アンモニアガス雰囲気とし、プラズマ法により１０分間アミノ化した。
【００９４】
その後、表面処理層に導入したアミノ基に多価カルボン酸（ポリアクリル酸）を縮合した後に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）に０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【００９５】
その後、２０％ＤＭＳＯ溶液を用いて０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基、１０種類）を、スポッター装置を用いて、固体支持体にスポットした。その後、８０℃に加熱したオーブンに１時間入れた後、洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄して、滅菌水でリンスした。
【００９６】
０．０２５μｇ／μｌの濃度になるように、固定化したプライマーのうち１種類に相補的なλＤＮＡ　５００ｂｐを、反応液（１×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ／０．０２５ｍＭ　Ｃｙ３−ｄＣＴＰ／１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ／０．２５Ｕ　ＥｘＴａｑ）に添加した。
【００９７】
反応液をＰＣＲチューブに入れ、更にリバースプライマーを加えて、プライマーを固定化した固体支持体を反応溶液に浸漬して、アニーリング（９４℃、１分）、ハイブリダイゼーション（６０℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）を３０回繰り返し行った。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【００９８】
洗浄後の固体支持体を、蛍光画像スキャナーで観察したところ、定温で反応させた場合よりも高いシグナルが検出された。
また、伸長反応を行った固体支持体をＰＣＲ反応溶液に入れ、λＤＮＡの５００ｂｐを増幅するＰＣＲ反応を行ったところ、電気泳動によって５００ｂｐ部位の増幅が確認された。
【００９９】
（実施例８）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用した増幅反応
イオン化蒸着法によって、３ｍｍ角に切断したＳｉ基板上に、メタンガス９５積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１００ｎｍの厚みに形成した。その後、メタンガスと水素ガスの代わりに、アンモニアガス雰囲気とし、プラズマ法により１０分間アミノ化した。
【０１００】
その後、表面処理層に導入したアミノ基に多価カルボン酸（ポリアクリル酸）を縮合した後に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）に０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【０１０１】
その後、２０％ＤＭＳＯ溶液を用いて０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基、１０種類）を、スポッター装置を用いて、固体支持体にスポットした。その後、８０℃に加熱したオーブンに１時間入れた後、洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄して、滅菌水でリンスした。
【０１０２】
プライマーを固定化した固体支持体を、固定化したプライマーに相補的なλＤＮＡ　５００ｂｐの溶液（０．０２５μｇ／μｌ、バッファー：５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ／２０％ホルムアミド）に浸漬し、９８℃で５分間保持したのちに４２℃で１２時間保持した。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【０１０３】
ハイブリダイゼーション後の固体支持体を、リバースプライマーを添加した反応液（ＢｃａＢＥＳＴ　ＤＮＡポリメラーゼ／２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２）に浸漬して、６０℃で６時間保持した。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。使用した酵素は鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼである（ＴＡＫＡＲＡ製）。
【０１０４】
洗浄後の固体支持体を、蛍光画像スキャナーで観察したところ、伸長反応による蛍光シグナルが検出された。
また、伸長反応を行った固体支持体をＰＣＲ反応溶液に入れ、λＤＮＡの５００ｂｐを増幅するＰＣＲ反応を行ったところ、電気泳動によって５００ｂｐ部位の増幅が確認された。
【０１０５】
（実施例９）アニーリング、ハイブリダイゼーション、伸長反応（２）
イオン化蒸着法によって、３ｍｍ角に切断したＳｉ基板上に、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１００ｎｍの厚みに形成した。その後、メタンガスと水素ガスの代わりに、アンモニアガス雰囲気とし、プラズマ法により１０分間アミノ化した。
【０１０６】
その後、表面処理層に導入したアミノ基に多価カルボン酸（ポリアクリル酸）を縮合した後に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）に０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【０１０７】
その後、０．１μｇ／μｌのフォワードプライマー溶液（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’、２２塩基、２０％ＤＭＳＯ）、０．１μｇ／μｌ　リバースプライマー溶液（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’、２０％ＤＭＳＯ）、０．０５μｇ／μｌ　フォワード＋リバースプライマー溶液（２０％ＤＭＳＯ）をスポッター装置を用いて、固体支持体にスポットした。その後、８０℃に加熱したオーブンに１時間入れた後、洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄して、滅菌水でリンスした。
【０１０８】
反応液１（０．０２５μｇ／μｌ　λＤＮＡ／１ｐｍｏｌ／μｌ　リバースプライマー／１×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ／０．０２５ｍＭ　Ｃｙ３−ｄＣＴＰ／１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ／０．２５Ｕ　ＥｘＴａｑ）をＰＣＲチューブに入れ、プライマーを固定化した固体支持体を反応液に浸漬して、アニーリング（９４℃、３０秒）、ハイブリダイゼーション、伸長反応（６８℃、３０秒）を３０回繰り返し行った。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【０１０９】
洗浄後の固体支持体を、蛍光画像スキャナーで観察したところ、定温で反応させた場合よりも高いシグナルが検出された。
また、伸長反応を行った固体支持体を反応液２（１ｐｍｏｌ／μｌ　フォワードプライマー／１ｐｍｏｌ／μｌ　リバースプライマー／１×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ／１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ／０．２５Ｕ　ＥｘＴａｑ）に入れ、アニーリング（９４℃、３０秒）、ハイブリダイゼーション、伸長反応（６８℃、３０秒）を３０回繰り返し行ったところ、電気泳動によって５００ｂｐにＤＮＡ断片の増幅が確認された。
【０１１０】
（実施例１０）浸漬法によるプライマーの固定化（２）
３ｍｍ角に切断したガラス基板を、０．１％に調整したポリアリルアミン水溶液に浸漬した後、基板表面に導入したアミノ基に多価カルボン酸（ポリアクリル酸）を縮合した後に、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）に０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドと２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【０１１１】
その後、滅菌水を用いて０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基）に固体支持体を室温で１時間浸漬することによって固定化反応を行った。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【０１１２】
フォワードプライマーを固定化した固体支持体を、固定化したプライマーに相補的なλＤＮＡ　５００ｂｐの溶液（０．０２５μｇ／μｌ、バッファー：５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ／２０％ホルムアミド）に浸漬し、９８℃で５分間保持したのちに４２℃で１２時間保持した。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【０１１３】
ハイブリダイゼーション後の固体支持体を、反応液（１×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ／０．０２５ｍＭ　Ｃｙ３−ｄＣＴＰ／１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ／０．２５Ｕ　ＥｘＴａｑ）に浸漬して、４２℃で６時間保持した。反応後、固体支持体を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
洗浄後の固体支持体を、蛍光画像スキャナーで観察したところ、伸長反応による蛍光シグナルが検出された。
【０１１４】
（比較例）
３ｍｍ角に切断したガラス基板を、９５％エタノールで４％の濃度に調整した３−アミノプロピルトリエトキシシラン溶液に１０分間浸漬した後、１００℃のオーブンで２０分間ベーキングする事によって、表面をアミノ化した。
【０１１５】
その後、滅菌水を用いて０．１μｇ／μｌに調製したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基）に基板を室温で１時間浸漬することによって静電結合による固定化反応を行った。反応後、基板を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。また、蛍光標識したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基）に浸漬した基板も作成した。
【０１１６】
フォワードプライマーを固定化した基板を、固定化したプライマーに相補的なλＤＮＡ　５００ｂｐの溶液（０．０２５μｇ／μｌ、バッファー：５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ／２０％ホルムアミド）に浸漬し、９８℃で５分間保持したのちに４２℃で１２時間保持した。反応後、基板を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【０１１７】
ハイブリダイゼーション後の基板を、反応液（１×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ／０．０２５ｍＭ　Ｃｙ３−ｄＣＴＰ／１．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ／０．２５Ｕ　ＥｘＴａｑ）に浸漬して、４２℃で６時間保持した。反応後、基板を洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）で２回洗浄した後、滅菌水でリンスした。
【０１１８】
洗浄後の基板を、蛍光画像スキャナーで観察したところ、伸長反応による蛍光シグナルが全く検出されなかった。
蛍光標識したλＤＮＡ　５００ｂｐのフォワードプライマー溶液（２２塩基）を固定化した基板については、固定化反応後には若干の蛍光シグナルが観察できたが、同様な操作を行って蛍光画像で観察したところ蛍光シグナルは全く見られなかった。このことは、基板に固定化したプライマーが操作中に剥離したことを意味している。
【０１１９】
上記実施例４〜１０において蛍光画像スキャナーで測定した蛍光強度を以下の表１にまとめる。
【０１２０】
【表１】

【０１２１】
【発明の効果】
本発明の固体支持体は、従来の固体支持体よりも核酸分子を大量に固定化することができ、かつ共有結合により強固に固定化できることから、従来ＤＮＡアレイの課題であった検出感度と信頼性を改良することができ、また、核酸分子を固定化した状態で伸長反応を行ったり、ＰＣＲ反応を実施して核酸分子を増幅することもできるので、広くＤＮＡアレイの普及を図ることが可能となる。

Claims

基板上に、核酸分子を静電的に引き寄せるための静電層、及び核酸分子と共有結合しうる官能基を有する固体支持体。
基板の表面がダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種で表面処理されている請求項１に記載の固体支持体。
静電層が、基板と共有結合していないアミノ基含有化合物を含む請求項１又は２に記載の固体支持体。
静電層が、基板と共有結合しているアミノ基含有化合物で構成され、該アミノ基含有化合物が、基板と結合していない側の末端にアミノ基を有する請求項１又は２に記載の固体支持体。
基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入して得られる請求項１〜３のいずれか１項に記載の固体支持体。
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入して得られる請求項１〜４のいずれか１項に記載の固体支持体。
非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物がポリアリルアミンである請求項６に記載の固体支持体。
核酸分子がＤＮＡである請求項１〜７のいずれか１項に記載の固体支持体。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体に核酸分子が固定化されてなる固定化核酸分子。
基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入することを特徴とする固体支持体の製造方法。
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸分子と共有結合しうる官能基を導入することを特徴とする固体支持体の製造方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせて、該核酸分子に相補的な核酸分子を伸長する方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせ、標識した核酸の存在下で該核酸分子に相補的な核酸分子を伸長させ、該相補的な核酸分子に取り込まれた標識核酸に由来するシグナルを読みとることを含む、核酸分子の検出方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせ、これをＰＣＲ反応に付すことにより、核酸分子を増幅する方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーにＤＮＡをハイブリダイズさせて、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと反応させることにより、該ＤＮＡを増幅する方法。
プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせた後に、該核酸分子を増幅する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。