CN1668742A - 具有静电层的固体支持物及其用途 - Google Patents

具有静电层的固体支持物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1668742A
CN1668742A CNA038169525A CN03816952A CN1668742A CN 1668742 A CN1668742 A CN 1668742A CN A038169525 A CNA038169525 A CN A038169525A CN 03816952 A CN03816952 A CN 03816952A CN 1668742 A CN1668742 A CN 1668742A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
solid support
acid molecule
matrix
amino
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA038169525A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100558890C (zh
Inventor
冈村浩
丹花通文
山野博文
大场光芳
龟井修一
市原辉久
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyo Kohan Co Ltd
Original Assignee
Toyo Kohan Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Kohan Co Ltd filed Critical Toyo Kohan Co Ltd
Publication of CN1668742A publication Critical patent/CN1668742A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100558890C publication Critical patent/CN100558890C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B01J2219/00529—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00608—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00635—Introduction of reactive groups to the surface by reactive plasma treatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明的目的是提供能够固定大量核酸分子的固体支持物，核酸分子与之结合具有高的键强。该固体支持物含有基质，以及在基质上提供的用于静电吸引核酸分子的静电层和能够共价结合核酸分子的功能基团。

Description

具有静电层的固体支持物及其用途
技术领域
本发明涉及固定DNA等的支持物以及固定化的核酸分子。
背景技术
一般地，见JP-A-7-75544和JP-A-7-303469，聚合酶链式反应(PCR)是从已有序列合成一个核苷酸序列的方法。
在聚合酶链式反应(PCR)中，目标DNA的两侧是一对引物，DNA聚合酶反复作用于目标DNA，通过此方法，被引物包围的区域可以被连续地扩增。
只有目标序列才能通过PCR被大量、正确地扩增，产生大量的拷贝；而且在短时间内的有效扩增也是可能的，因此目前PCR被广泛应用于生化、医学等领域内许多不同的研究、测定、试验等中。
通常认为PCR的原则是控制温度，反应是通过加热和冷却的步骤不断反复(热循环)而进行的。更具体地讲，PCR包含以下步骤：首先在高温下将扩增目标DNA双链分子变性为互补的单链；然后通过冷却使引物与DNA链退火，所选引物与DNA的一部分互补；最后再次加热，在DNA聚合酶的作用下，DNA向引物的下游延伸。如此不断循环进行，含有变性、退火和延伸三个步骤的一个循环被多次地重复，这样就可以扩增出大量的双链DNA。
具体地，需要多次重复该热循环，其由以下构成：1)提高样品的温度到95℃以破坏双链DNA的氢键；2)接着将样品的温度降低到45℃，使DNA与引物重结合以复制；3)然后再次升高样品的温度到74℃，使用耐热的聚合酶对引物进行延伸使DNA复制。在这样一个DNA扩增反应中，实现上述的热循环，需要将样品放入由合成树脂等制成的容器内，再将该容器放入一个铝制加热部件中。
但是上述的热循环消耗大量的时间，且要得到所需量的DNA需要数小时。此外，当通过控制温度(加热和冷却)进行反应时，在短时间内改变温度有一个限度，步骤之间的改变不能平稳进行，这样将要被扩增出来的核苷酸序列的精确性可能会受到影响，或者在某些情况下非目标DNA序列会被复制。而且需要特殊的仪器或技术以迅速改变温度，因此存在经济问题如对设备的投资以及技术问题。
考虑到上述的问题，WO 00/22108、WO 02/12891或JP-A-2002-82116开发出了一种固体支持物，作为一种能够容易固定DNA的支持物，并且适用于于通过DNA扩增反应来复制DNA，该支持物的基质表面包含一个经过表面处理和化学修饰的薄层，此薄层具有能够顺序与核酸分子共价结合的功能基团。
但是在上述固体支持物上并不总能固定足够量的DNA，并且结合DNA的键并不总具有足够的强度，因此一直需要有能以更高键强结合DNA的且能固定更高浓度DNA的固体支持物。
本发明的目的是提供能够以更高键强结合核酸分子且能固定高浓度核酸分子的固体支持物。
发明公开
本发明的发明者为了解决上述的问题，进行了详细的研究。结果发现，在其基质上有能共价结合核酸分子的功能基团的固体支持物上，进一步增加一个静电层以静电吸引核酸分子，可以显著增加固定化的核酸分子的量，提高结合核酸分子的键强。
具体地，本发明包括以下发明。
(1)固体支持物，它具有静电层用以静电吸引核酸分子，以及在其基质上具有能够共价结合核酸分子的功能基团。
(2)根据上述(1)中的固体支持物，其中固体支持物基质的表面由至少一种以下的物质进行表面处理：金刚石、软金刚石、含碳物质和碳化物。
(3)根据上述(1)或(2)的固体支持物，其中的静电层含有含氨基化合物，该化合物与基质不共价结合。
(4)根据上述(1)或(2)的固体支持物，其中的静电层由与基质共价结合的含氨基化合物组成，该含氨基化合物在其不与基质结合的末端有一个氨基。
(5)根据上述(1)至(3)中的任何一项的固体支持物，它通过将具有未取代或单取代氨基的化合物和碳化合物沉积在基质上，并且然后引入一个可以共价结合核酸分子的功能基团而得到。
(6)根据上述(1)至(4)中的任何一项的固体支持物，它通过将基质浸入到具有未取代或者单一取代氨基的化合物的溶液中，并且然后引入一个可以共价结合核酸分子的功能基团而得到。
(7)根据上述(6)的固体支持物，其中具有未取代或者有单一取代氨基的化合物是聚丙烯酰胺。
(8)根据上述(1)至(7)中的任何一项的固体支持物，其中的核酸分子是DNA。
(9)固定化的核酸分子，它含有固定在根据上述(1)至(8)中任何一项的固体支持物上的核酸分子。
(10)生产固体支持物的一种方法，其特征在于将具有未取代或单取代氨基的化合物和碳化合物沉积在基质上，并且然后引入可以共价结合核酸分子的功能基团。
(11)生产固体支持物的一种方法，其特征在于将基质浸入到具有未取代或单取代氨基的化合物的溶液中，并且然后引入可以共价结合核酸分子的功能基团。
(12)下述方法：将引物固定在根据上述(1)至(8)中任何一项的固体支持物上，然后使核酸分子与引物杂交，由此使得与该核酸分子互补的核酸分子得以延伸。
(13)检测核酸分子的方法，该方法包括：将引物固定在根据上述(1)至(8)中任何一项的固体支持物上，使核酸分子与引物杂交，在标记的核酸的存在下使与上述核酸分子互补的核酸分子得以延伸，以及读取来自整合入互补核酸分子中的标记核酸分子产生的信号。
(14)扩增核酸分子的方法，这包括将引物固定在根据上述(1)至(8)中任何一项的固体支持物上，使核酸分子与引物杂交并且进行PCR反应。
(15)扩增DNA的方法，这包括将引物固定在根据上述(1)至(8)中任何一项的固体支持物上，使DNA与引物杂交，并使用链取代DNA聚合酶进行反应。
(16)根据(13)的方法，该方法还包括在核酸分子与引物杂交后扩增核酸分子的步骤。
实施本发明的最佳方式
可以用作本发明中的基质的物质实例包括，例如聚硅氧烷、玻璃、纤维、木头、纸、陶瓷和塑料(例如聚酯树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、ABS树脂(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂)、尼龙、丙烯酸树脂、碳氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、甲基戊烯树脂、酚醛树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、聚氯乙烯树脂)。
在使用上面提到的物质作为基质材料时，不一定有一个经过表面处理的薄层。但是最好进行表面处理以牢固地固定化合物用以引入能在基质上共价结合核酸分子的功能基团。
对于表面处理，最好使用合成金刚石、高压合成金刚石、天然金刚石、软金刚石(如金刚石样碳)、无定形碳、含碳物质(例如石墨、碳60或者碳纳米管)、以上物质的混合物或者以上物质的层压产物。此外还可以使用碳化物，例如碳化铪、碳化铌、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、碳化锆、碳化钼、碳化铬或者碳化钒等。在这里，软金刚石是一个集合名词，代表了具有部分金刚石结构，即金刚石和碳的混合物，例如所谓的金刚石样碳(DLC)，其中金刚石和碳的比例没有特别的限制。
可以用载玻片表面形成一层软金刚石薄膜来作为一个经过表面处理的基质的实例。优选在含有0-99％(体积比)氢气和100-1％甲烷的混和气体中使用金刚石样碳，通过离子化沉积方法制备这种基质。
经过表层处理的薄层其厚度优选1纳米到100微米。
可以用如以下的已知方法在基质表面生成表面处理的薄层：微波等离子体CVD(化学蒸气沉积)法、ECRCVD(电子回旋共振器化学蒸气沉积)法、IPC(电感偶合等离子体)法、直流溅镀法、ECR(电子回旋共振器)溅镀法、离子电镀法、电弧离子电镀法、EB(电子束)沉积法、电阻加热蒸气沉积法、离子化沉积法、电弧沉积法、激光沉积法等。
在本发明中使用的基质的实例，不仅仅包括上面提到的已经形成表面处理薄层的结构，而且还包括合成金刚石、高压合成金刚石、天然金刚石、软金刚石(例如金刚石样碳)、无定形碳、金属，例如金、银、铜、铝、钨和钼、塑料(例如聚脂树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、ABS树脂、尼龙、丙烯酸树脂、碳氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、甲基戊烯树脂、酚醛树脂、三聚氰氨树脂、环氧树脂、聚氯乙烯树脂)、由上述金属的粉末和陶瓷等物质的粉末混合，使用上述的树脂作为黏合剂制成的基质、由压模机将上述金属或者陶瓷粉末压制并在高温下对该粉末进行烧结制成的基质。此外，基质还可以是一种层压产物，或者是上述材料组成的复合材料(例如由金刚石和另一种物质组成的复合材料，如一种双相的物质)。
基质的形状和大小并没有特别的限制。形状可以是盘状、线状、球状、多边形、粉末状等等。对于基质的大小，就盘状基质而言，一般0.1-100毫米宽，0.1-100毫米长，0.01-10毫米厚。
除此之外，在基质的前表面和后表面可以形成钛、金、铂、铌、铬、碳化钛、氮化钛等形成的单层作为反射层，或者由上述材料的复合材料层作为反射层。反射层的厚度应为10纳米或者更厚，最好是100纳米或者更厚，因为整个表面必须均一。
如果使用玻璃作为基质，优选将表面1-1000纳米的范围内弄粗糙表示为Ra(expressed in Ra)(JIS B 0601)。这种粗糙化的表面具有的优势是增加了基质的表面积，因此可以高密度地固定大量的DNA探针等。
本发明的固体支持物中还具有能够静电吸引核酸分子的静电层。
只要静电层能够静电吸引核酸分子并且增加被固定的核酸的量，则对于静电层就没有什么特别的限制。静电层可以由带正电的化合物，例如含氨基化合物形成。
上述含氨基化合物包括含有未取代氨基和单取代(由一个含1至6个碳原子的烃基或类似物取代的)氨基的化合物(-NHR，R是取代基)。例如，1，2-乙烷二胺、六亚甲基二胺、正丙胺、单甲胺、二甲胺、单乙胺、二乙胺、芳胺、氨基偶氮苯、氨基醇(例如乙醇胺)、利凡诺、氨基苯甲酸、氨基蒽醌、氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、苯胺、上述物质的多聚物(例如聚芳胺和聚赖氨酸)或者其共聚物、多胺(多价胺)例如4，4′，4″-三氨基三苯基甲烷、triamterene、亚精胺、精胺和腐胺。
可以不与基质或者表面处理薄层发生共价结合，或者发生共价结合而形成静电层。
如果不与基质或者表面处理薄层发生共价结合而形成静电层，则在表面处理薄层形成时，将上述含氨基化合物加入到薄膜形成装置中形成含氨基的含碳薄膜。氨气可以作为加入到薄膜形成装置中的化合物。此外，表面处理薄层可以是多个薄层，其中含有氨基的薄层在黏着层之后形成。这种情况下可以在含氨气的气氛中进行薄膜形成。
如果不与基质或者表面处理薄层发生共价结合而形成静电层，优选在基质上沉积上述含未取代或者单取代氨基的化合物和碳化合物之后引入能够共价结合核酸分子的功能基团，以提高亲和性，即静电层和基质或表面处理层之间的粘着。这里使用的碳化合物并没有特殊的限制，只要它可以以气态提供，然而优选在常温下为气态的甲烷、乙烷和丙烷。优选使用离子化沉积法作为沉积方法，其使用条件优选是工作压力0.1到50帕，且加速电压200到1000伏。
如果与基质或者表面处理薄层发生共价结合而形成静电层，则可以在氯气环境下对基质或者带有表面处理薄层的基质进行紫外辐射，使表面氯化，并与上述含氨基的化合物(例如多价胺，如聚芳胺、聚赖氨酸、4，4′，4″-三氨基三苯基甲烷或triamterene)发生反应，在不与基质结合的末端引入一个氨基。
此外，如果在溶液中进行反应将能够共价结合核酸分子的功能基团引入带有静电层的基质中(例如通过用二羧酸或者多价羧酸引入羧基)，优选在将基质浸入上述含未取代或者单取代氨基的化合物的溶液之后引入能够共价结合核酸分子的功能基团。上述溶液的溶剂可以例如为水、N-甲基吡咯烷酮和乙醇。
如果使用二羧酸或多价羧酸向带有静电层的基质引入羧基，优选事先使用N-羟基丁二酰亚胺和/或碳二亚胺将其活化，或者在N-羟基丁二酰亚胺和/或碳二亚胺的存在下进行反应。
如果将基质浸入到具有未取代氨基或者单取代氨基的化合物的溶液中而形成静电层，当使用聚芳胺作为含氨基的化合物时，与基质的附着度非常好，并且固定化的核酸分子的量将会增加。
静电层的厚度最好是1纳米到500微米。
如上所述，带有静电层的基质表面进行化学修饰以引入能够共价结合核酸分子的功能基团。
上述功能基团包括羧基、活性酯基、卤代甲酰基、羟基、硫酸基、腈基、硝基、硫醇基和氨基。
可以引入羧基作为功能基团的化合物包括：羧卤酸，用通式X-R1-COOH表示(其中X代表卤原子，R1代表含有1-12个碳原子的二价烃基基团)，例如氯乙酸、氟乙酸、溴乙酸、碘乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、或4-氯苯甲酸；二羧酸，用通式HOOC-R2-COOH表示(其中R2代表单键或含有1-12个碳原子的二价烃基基团)，例如草酸、丙二酸、丁二酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、邻苯二甲酸；多价羧酸，例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三甲酸或者丁烷四羧酸；酮酸或者醛酸，用通式R3-CO-R4-COOH表示(其中R3代表氢原子或者含有1-12个碳原子的二价烃基基团，而R4代表含有1-12个碳原子的二价烃基基团)；二羧酸的单酰卤，用通式X-OC-R5-COOH表示(其中X代表卤原子而R5代表单键或者含有1-12个碳原子的二价烃基基团)，例如丁二酸单酰氯或丙二酸单酰氯；酸酐，例如邻苯二甲酸酐、丁二酸酐、草酸酐、顺丁烯二酸酐或者丁烷四羧酸酐。
对于上面提到的被引入的羧基，可以使用脱水缩合剂，如氨腈或者碳二亚胺(如1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺或者如N-羟基丁二酰亚胺的化合物对其进行活性酯化。
用于引入卤代甲酰基作为功能基团的化合物包括：二羧酸的二卤化物，用通式X-CO-R6-CO-X表示(其中X代表卤原子，且R6代表单键或者含有1-12个碳原子的二价烃基基团)，例如丁二酰氯或者丙二酰氯。
用于引入羟基作为功能基团的化合物包括：羟基酸或酚酸，用通式HO-R7-COOH表示(其中R7代表含有1-12个碳原子的二价烃基基团)。
用于引入氨基作为功能基团的化合物包括：氨基酸。
在静电层中上述化合物通过羧基和氨基发生缩合反应形成酰胺键。
在上述的化合物中，多价羧酸例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三甲酸或者丁烷四羧酸还可以增加疏水性。
本发明中的固体支持物上可以固定DNA或者RNA两种核酸分子。DNA或RNA的碱基数目一般是1到200，最好是5到150。此外，对于DNA，可以固定单链或双链的DNA。
本发明的固体支持物可以用于核酸分子例如DNA的延伸反应。此时，首先一个引物被固定到固体支持物上，然后杂交上一个单链或者双链DNA。此后，DNA延伸反应使得与引物杂交的DNA互补的DNA得以延伸。
可以使用长度和序列已知的双链或者单链核酸作为引物。长度没有特别的限制，但是优选5到200个碱基，10到100个碱基更优选。固定引物的方法没有特别限制，例如可以采用以下方法：将引物溶解于缓冲液中制成溶液，将本发明中的固体支持物浸入该溶液中，这样引物就可以被固定到固体支持物的表面上。固定引物时，浸入溶液的温度一般是0-98摄氏度，最好是4-50摄氏度；浸入时间一般是1分钟到24小时，最好是10分钟到1小时。在浸入到溶液中一段预定的时间之后，漂洗固体支持物，去掉不能被固定的引物。此外通过使用一种被称为点样仪的装置，可以在固体支持物的表面固定多种不同的引物。在使用点样仪将引物溶液点到固体支持物上之后，把固体支持物放到烘箱内烘烤一段预定的时间，然后再进行漂洗，去掉不能被固定的引物。通过使用点样仪可以在固体支持物上的不同区域固定多种不同的引物，这样就可以一次进行大量的检测分析。因此对于需要大量检测分析的核酸检测领域，点样仪具有优势。
对于通常的固体支持物，有时在延伸反应中，加热处理会使引物脱离。而对于本发明中的固体支持物，即使加热引物也不会脱离，可以在引物被固定到固体支持物表面的状态下进行延伸反应。
在这个延伸反应中，掺入标记的核酸，在延伸反应之后读取标记物产生的信号，就可以检测出一个特异的DNA是否与引物杂交上，延伸反应是否进行了。因此可以确定在被检测的样品中是否含有能够与在支持物表面固定的引物发生杂交的DNA。这在研究和医疗实践中是一种有用的检测手段。
对于标记物没有特别的限制，只要其能够掺入到核酸分子中，例如荧光标记(Cy染料如Cy3和Cy5，FITC，RITC，罗达明、德克萨斯红、TET、TAMRA、FAM、HEX、ROX等等)，放射性标记(α-32P、γ-32P、35S等)等。如果使用荧光标记核酸，可以在延伸反应之后对固体支持物进行荧光照相。
本发明的固体支持物可以在DNA扩增反应中使用。如果用PCR扩增DNA，首先将正向引物固定在固体支持物表面，然后杂交上单链或者双链的DNA，再通过酶反应使互补链DNA得以延伸。然后，通过连续进行以下步骤：(1)退火(2)杂交和(3)延伸，所谓的PCR反应得以进行。
在通常的固体支持物上，进行PCR反应时的问题是由于热处理使引物脱离，或者不能很好地进行热循环的控制。但是在本发明的固体支持物中，即使加热引物也不会脱离。而且由于反应不是在容器内进行，而是在DNA被固定到固体支持物上的状态下进行的，PCR反应的温度可以被准确地控制，几乎不可能影响到被扩增核酸序列的准确性，或者几乎不可能复制非目标DNA。因此DNA可以被有效扩增。
通过上述PCR用本发明的固体支持物进行DNA扩增时，固体支持物的热传导率优选≥0.1W/cm·K，较优选≥0.5W/cm·K，最优选≥1W/cm·K。理由是，如果固体支持物的热传导率高，在进行PCR反应或类似反应时接下来的加热和冷却性质也是良好的。
特别地，考虑到热传导率时，最优选金刚石或者具有金刚石等物质涂层的物质作为表面处理薄层，用于许多不同基质的表面。
此外将上述的用标记核酸检测与PCR扩增相结合，即使在一个样品中只有少量的DNA能够与固定在固体支持物上的引物杂交时，DNA仍可以按照上述方式被复制。结果是，大量的DNA与固定在固体支持物上的引物杂交，互补链被延伸，从而提高了检测的灵敏度。
或者，在选择延伸反应中使用的酶时，使用链取代DNA聚合酶并加入反向引物，这样DNA可以在恒定的温度下在固体支持物上被扩增出来而不需要进行热循环。链取代DNA聚合酶是一种DNA合酶，在合成与模板DNA互补的DNA链的过程中，在延伸的方向中如果存在双链DNA区域，它可以通过打开双链区域连续地合成互补链。
对于链取代DNA聚合酶没有特别的限制，例如可以包括BCA BESTDNA聚合酶(Takara Bio)，Phi29 DNA聚合酶(Amersham Bioscience)等等。
在本发明的另一个实施方案中，使用从mRNA合成的cDNA作为目标，使RNA也可以成为扩增目标，尽管它不是直接的目标。
这时，使用逆转录反应从mRNA得到cDNA，而在得到cDNA时可以同时将其固定到固体支持物上。首先，将逆转录引物结合到固体支持物经过化学修饰的区域上。一般使用寡聚dT引物，它与特异的核酸序列互补；或者使用随机的六碱基引物。但是最好使用寡聚dT引物，其中含有大约10到20个连续的胸腺嘧啶，这与RNA 5′末端的poly(A)序列互补。
如果使用寡聚dT引物，将作为模板的RNA 5′末端的poly(A)区域退火。使用逆转录酶作用于该区域，与模板RNA互补的dNTP在引物的3′末端被一个接一个地聚合在一起，由此cDNA按照从5′到3′的方向被合成。在这个逆转录反应中，引物的结合、退火和在逆转录酶作用下互补链的聚合可以按照一般的方法，用控制温度(热循环)的方法进行。
如上所述，在固体支持物上的固定可以与逆转录反应同时进行，因此根据本发明的方法可以有效地进行所谓的RT-PCR(逆转录PCR)。因此本发明也可以用于对mRNA定量。
使用本发明的支持物将一个寡聚核苷酸的末端碱基通过氢键固定到末端羟基或者末端羧基上，进一步再固定具有与该寡聚核苷酸互补碱基序列的DNA，得到的产物可以用作DNA文库芯片。此外，通过固定核苷酸、寡聚核苷酸、DNA片段或者非DNA的类似物得到的产物可以用作文库。
使用本发明中的固体支持物进行以上描述的检测，还可以进行疾病的诊断。
实施例
以下通过实施例来阐述本发明，但是本发明并不止限于这些实施例。
〔例1〕在向基质上添加表面处理薄层时，向小室内引入含有氨基的化合物(1)
使用95％甲烷和5％氢气(体积比)的混和气体作为原材料，在载玻片(宽25毫米，长75毫米，厚1毫米)上通过离子化沉积形成10纳米厚的DLC薄层，加速电压是0.5千伏。然后使用甲烷作为载体气体，通过15摄氏度保温的二乙胺，以每分钟5立方厘米的速率被引入小室。工作压力为2帕，加速电压是0.5千伏，使用甲烷和二乙胺作为原材料，形成厚度为10纳米的含有碳、氮和氢的薄层。
之后，使多价羧酸——丁烷四羧酸酸酐与用甲烷和二乙胺作为原材料形成的厚度为10纳米的含碳、氮和氢表面处理薄层中的氨基发生缩合后，将薄层浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6)300毫升中30分钟，使其活化。
然后用微阵列合成仪将大约1纳升500bp长的Cy3标记的双链DNA(使用浓度0.1微克/微升制备的lambdaDNA作为模板通过PCR扩增出来)点在基质上。之后将基质在80摄氏度炉中烘烤3小时，用2×SSC/0.2％SDS漂洗，测量被点样DNA的荧光强度。
结果荧光强度是36,050。在95摄氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后测量荧光强度是35,540，几乎没有减弱。
作为对照，将载玻片浸入含有2％(w/w)3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中10分钟后取出，用乙醇漂洗，在110摄氏度干燥10分钟。然后将引入氨基的该基质与丁二酸酸酐缩合，将基质浸入到活化溶液(300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6))中30分钟。用同样的方法将500bp长的Cy3标记的双链DNA(使用lambdaDNA作为模板通过PCR扩增出来)固定在这样得到的基质上，用2×SSC/0.2％SDS漂洗基质。结果荧光强度是23,500。在95摄氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后测量荧光强度是23,000，几乎没有减弱。
换言之，使用共价键类型的几乎没有静电层的基质，尽管可以通过共价键更加牢固地固定DNA，荧光信号地强度却没有增加。
而且，用同样的方法将500bp长的Cy3标记的双链DNA(使用lambdaDNA作为模板通过PCR扩增出来)固定在没有静电层的基质上(载玻片上用5％聚丙烯酸水溶液处理玻片之后干燥，用紫外线辐射60分钟使其不溶。然后浸入到活化溶液(300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6))中30分钟进行活化)，基质用2×SSC/0.2％SDS漂洗。结果尽管聚丙烯酸层脱离，在薄层被保留区域荧光强度为26,220。在95摄氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗使聚丙烯酸层完全脱离。例2为基质增加表面处理薄层时向小室内引入含氨基化合物(2)
向载玻片(宽25毫米，长75毫米，厚1毫米)上通过离子化沉积方法，使用甲烷作为载体气体，通过15摄氏度保温的二乙胺，以每分钟5立方厘米的速率将其引入小室。工作压力为2帕，加速电压是0.5千伏，使用甲烷和二乙胺作为原材料，形成厚度为20纳米的含有碳、氮和氢的薄层。
之后，将多价羧酸——聚丙烯酸，与由甲烷和二乙胺构成的表面处理薄层中的氨基在0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺存在下发生缩合。然后浸入到活化溶液(300毫升，含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6))中30分钟进行活化。
然后，用微阵列合成仪将大约1纳升500bp长的Cy3标记的双链DNA(使用制备成浓度为0.1微克/微升的lambdaDNA作为模板通过PCR扩增出来)点在基质上。之后将基质在80摄氏度炉中烘烤3小时，用2×SSC/0.2％SDS漂洗，测量被点样DNA的荧光强度。
结果荧光强度是34,050。在95摄氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后测量荧光强度是33,500，几乎没有减弱。
作为对比用同样的方法将500bp长的Cy3标记的双链DNA(使用lambdaDNA作为模板通过PCR扩增出来)固定在商品化的静电吸引类基质(Matsunami Glass.，LTD.制造；是经过氨基硅烷(一种硅烷偶联试剂)处理的基质)上，用2×SSC/0.2％SDS漂洗。结果荧光强度是35,460。在95摄氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后测量荧光强度，减弱到26,210。
而且，用同样的方法将500bp长的Cy3标记的双链DNA(使用lambdaDNA作为模板通过PCR扩增出来)固定在没有静电层的基质上(载玻片上用5％聚丙烯酸溶液处理之后干燥，用紫外线辐射60分钟使其不溶。然后浸入到活化溶液(300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6))中30分钟进行活化)，基质用2×SSC/0.2％SDS漂洗。结果尽管聚丙烯酸层脱离，在薄层被保留处荧光强度为26,220。而且，在95摄氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗使聚丙烯酸层完全脱离。
例3通过后处理形成静电层
使用95％甲烷和5％氢气(体积比)的混和气体作为原材料，在载玻片(宽25毫米，长75毫米，厚1毫米)上通过离子化沉积形成10纳米厚的DLC薄层，加速电压是0.5千伏。
然后，在氯气中用紫外线照射对基质进行氯化。再将基质浸入到聚丙烯酰氨溶液(0.1g/L)中形成静电层。
之后，将多价羧酸——聚丙烯酸与静电层中的氨基在0.1M1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺存在的条件下发生缩合后，将其浸入到300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6)中30分钟，使其活化。
然后，用微阵列合成仪将大约1纳升500bp长的Cy3标记的双链DNA(使用制备的浓度为0.1微克/微升的lambdaDNA作为模板通过PCR扩增出来)点在基质上。之后将基质在80摄氏度炉中烘烤3小时，用2×SSC/0.2％SDS漂洗，测量被点样的DNA的荧光强度。
结果荧光强度是35,000。在95摄氏度用2×SSC/0.2％SDS漂洗之后测量荧光强度是34,500，几乎没有减弱。
作为对比，用5％聚丙烯酸水溶液处理其上形成有10纳米DLC薄层的载玻片并干燥后，用紫外线照射处理60分钟使其不溶。然后浸入到活化溶液(300毫升含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6))中30分钟进行活化。用同样的方法将500bp长的Cy3标记的双链DNA(使用lambdaDNA作为模板通过PCR扩增出来)固定在基质上，用2×SSC/0.2％SDS漂洗，聚丙烯酸薄层完全脱离。
例4使用浸渍法固定引物(1)
使用95％甲烷和5％氢气(体积比)的混和气体作为原材料，在切割成3毫米见方小块的硅基质上形成厚度为100纳米的DLC薄层，加速电压为0.5千伏。然后用氨气氛代替甲烷和氢气，并用等离子体方法进行胺化作用10分钟。
之后，将多价羧酸(聚丙烯酸)与表面处理薄层中引入的氨基发生缩合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6)中30分钟进行活化。
之后，将固体支持物浸入到用无菌水制备的0.1微克/微升500bp的lambdaDNA的正向引物(22bp)溶液中，室温浸渍1小时。反应之后固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
已经固定有正向引物的固体支持物浸入到500bplambdaDNA溶液中(该DNA与固定的引物互补，浓度为0.025微克/微升，缓冲液为5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98摄氏度保温5分钟后，再在42摄氏度保温12小时。反应之后用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
杂交之后的固体支持物浸入到反应溶液(1×Exbuffer/0.025mMCy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中，并在42摄氏度保温6小时。反应之后用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
漂洗之后用荧光成像扫描仪观察固体支持物，检测到了延伸反应的荧光信号。
例5用点样法固定引物(1)
使用95％甲烷和5％氢气(体积比)的混和气体作为原材料，在切割成3毫米见方小块的硅基质上形成厚度为100纳米的DLC薄层，加速电压为0.5千伏。然后用氨气氛代替甲烷和氢气，并用等离子体方法进行胺化作用10分钟。
之后，将多价羧酸(聚丙烯酸)与表面处理薄层中引入的氨基发生缩合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6)中30分钟进行活化。
然后，使用点样仪，将用20％DMSO制备的0.1微克/微升的500bp的lambdaDNA正向引物(22bp，10个样品)溶液点到固体支持物上。在80摄氏度炉中烘烤1小时之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
将已经固定有正向引物的固体支持物浸入到500bp单链lambdaDNA溶液中(该DNA与固定的引物互补，浓度为0.025微克/微升，缓冲液为5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98摄氏度保温5分钟后，再在42摄氏度保温12小时。反应之后固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
杂交之后将固体支持物浸入到反应溶液(1×Exbuffer/0.025mMCy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中，在42摄氏度保温6小时。反应之后固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
漂洗之后用荧光成像扫描仪观察固体支持物，检测到了延伸反应的荧光信号。
例6用点样法固定引物(2)
使用95％甲烷和5％氢气(体积比)的混和气体作为原材料，在载玻片(宽25毫米，长75毫米，厚1毫米)上通过离子化沉积形成10纳米厚的DLC薄层，加速电压是0.5千伏。然后用氨气氛代替甲烷和氢气，并用等离子体方法进行胺化作用10分钟。
之后，将多价羧酸(聚丙烯酸)与表面处理薄层中引入的氨基发生缩合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6)中30分钟进行活化。
然后使用点样仪，将用20％DMSO制备的浓度0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp，10个样品)溶液点到固体支持物上。在80摄氏度炉中烘烤1小时之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
向固体支持物表面加15微升与被固定的引物互补的500bplambdaDNA溶液(DNA浓度为0.025微克/微升，缓冲液为5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)，用盖玻片盖上。在42摄氏度保温5小时，进行杂交反应。之后用0.1×SSC洗去盖玻片，固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
杂交之后在固体支持物表面加15微升反应溶液(1×Exbuffer/0.025mM Cy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)，用盖玻片盖上。在42摄氏度保温5小时，进行延伸反应。之后用0.1×SSC洗去盖玻片，固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
漂洗之后用荧光成像扫描仪观察固体支持物，检测到了延伸反应的荧光信号。
例7退火、杂交和延伸反应(1)
使用95％甲烷和5％氢气(体积比)的混和气体作为原材料，在切割成3毫米见方小块的硅基质上形成厚度为100纳米的DLC薄层，加速电压为0.5千伏。然后用氨气氛代替甲烷和氢气，并用等离子体方法进行胺化作用10分钟。
之后，使用多价羧酸(聚丙烯酸)与表面处理薄层中引入的氨基发生缩合，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的磷酸缓冲液(pH6)中30分钟进行活化。
然后使用点样仪，将用20％DMSO制备的0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp，10个样品)溶液点到固体支持物上。80摄氏度烘烤1小时之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
在反应溶液(1×Exbuffer/0.025mM Cy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中加入与其中一个被固定的引物互补的500bplambdaDNA，使其终浓度为0.025微克/微升。
将反应溶液置于一个PCR小管内，并加入一个反向引物。将固定了所述引物的固体支持物浸入到反应溶液中，并进行30次下面的循环：退火(94摄氏度1分钟)、杂交(60摄氏度1分钟)和延伸(72摄氏度1分钟)。反应之后，固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
漂洗之后用荧光成像扫描仪观察固体支持物，检测到的荧光信号比在恒定温度下进行反应检测到的更强。
进一步，将已经进行过延伸反应的固体支持物置于PCR反应溶液中进行PCR反应，以扩增500bp的lambda DNA，用电泳证实500bp区域被扩增出来。
例8使用链取代DNA聚合酶进行扩增反应
使用95％甲烷和5％氢气(体积比)的混和气体作为原材料，在切割成3毫米见方小块的硅基质上形成厚度为100纳米的DLC薄层，加速电压为0.5千伏。然后用氨气氛代替甲烷和氢气，并用等离子体方法进行10分钟胺化作用。
之后，将多价羧酸(聚丙烯酸)与表面处理薄层中引入的氨基发生缩合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6)中30分钟进行活化。
然后，使用点样仪将用20％DMSO制备的0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp，10个样品)溶液点到固体支持物上。在80摄氏度炉中烘烤1小时之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
已经固定所述引物的固体支持物浸入到500bp的lambdaDNA溶液中(该DNA与固定的引物互补，浓度为0.025微克/微升，缓冲液为5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98摄氏度保温5分钟后，再在42摄氏度保温12小时。反应之后固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
杂交之后固体支持物浸入到已经加入了反向引物的反应溶液(BcaBEST DNA聚合酶/20mM Tris/10mM氯化镁)中，在60摄氏度保温6小时。反应之后固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。这里使用的酶是链取代DNA聚合酶(Takara制造)。
漂洗之后用荧光成像扫描仪观察固体支持物，检测到了延伸反应的荧光信号。
进一步将已经进行过延伸反应的固体支持物置于PCR反应溶液中进行PCR反应，以扩增500bp lambdaDNA，并用电泳证实500bp区域被扩增出来。
例9退火、杂交和延伸反应(2)
使用95％甲烷和5％氢气(体积比)的混和气体作为原材料，在切割成3毫米见方小块的硅基质上形成厚度为100纳米的DLC薄层，加速电压为0.5千伏。然后用氨气氛代替甲烷和氢气，用等离子体方法进行10分钟胺化作用。
之后，将多价羧酸(聚丙烯酸)，与表面处理薄层中引入的氨基发生缩合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6)中30分钟进行活化。
然后，使用点样仪将用20％DMSO中的0.1微克/微升正向引物(5′-GATGAGTTGTGTCCGTACAACT-3′，参见序列表中的第一个序列，22bp)溶液、0.1微克/微升正向引物(5′-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3′，参见序列表中的第二个序列，20％DMSO)溶液和0.05微克/微升正向引物+反向引物溶液(20％DMSO)点在固体支持物上。然后在80摄氏度炉中烘烤1小时之后，用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
将反应溶液1(0.025微克/微升lambdaDNA/1皮摩尔/微升反向引物/1×Exbuffer/0.025mM Cy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)加入到PCR小管中，并将固定有引物的固体支持物浸入到反应溶液中，进行30次下面的循环：退火(94摄氏度30秒)、杂交和延伸(68摄氏度30秒)。反应之后，固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
漂洗之后用荧光成像扫描仪观察固体支持物，检测到的荧光信号比在恒定温度下进行反应检测到的更强。
进一步将已经进行过延伸反应的固体支持物置于反应溶液2(1皮摩尔/微升正向引物/1皮摩尔/微升反向引物/1×Exbuffer/1.25mMdNTP/0.25U ExTaq)中，进行30次下面的循环：退火(94摄氏度30秒)、杂交和延伸(68摄氏度30秒)。电泳证实500bp区域的DNA片段被扩增出来。
例10通过浸渍法固定引物(2)
将切割成3毫米见方的载玻片浸入到调至0.1％的聚丙烯酰胺水溶液中之后，使多价羧酸(聚丙烯酸)与基质表面中引入的氨基发生缩合后，浸入到含有0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和20mM的N-羟基丁二酰亚胺的0.1M磷酸缓冲液(pH6)中30分钟进行活化。
然后将固体支持物浸入到用无菌水制备的浓度为0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp)溶液中，在室温下进行固定反应1小时。反应之后固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
已经固定有正向引物的固体支持物浸入到500bp lambdaDNA溶液中(该DNA与固定的引物互补，浓度为0.025微克/微升，缓冲液为5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98摄氏度保温5分钟后，再在42摄氏度保温12小时。反应之后固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
杂交后的固体支持物浸入反应溶液(1×Exbuffer/0.025mMCy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中，在42摄氏度保温6小时。反应之后固体支持物用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
漂洗之后用荧光成像扫描仪观察固体支持物，检测到了延伸反应的荧光信号。
比较实施例
切割成3毫米见方的玻璃基质浸入到调至4％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液(有95％的乙醇)。在100摄氏度炉中烘烤20分钟使表面胺化。
然后，将基质浸入到用无菌水制备的浓度为0.1微克/微升的(500bp的lambdaDNA的)正向引物(22bp)溶液中室温作用1小时，通过静电结合进行固定反应。反应之后用基质洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。此外再制备一个基质，其浸入到荧光标记的该500bp的lambdaDNA的正向引物(22bp)溶液中。
已经固定有正向引物的基质浸入到500bplambdaDNA溶液中(该DNA与固定的引物互补，浓度为0.025微克/微升，缓冲液为5×SSC/0.5％SDS/20％甲酰胺)。在98摄氏度保温5分钟后，再在42摄氏度保温12小时。反应之后基质用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
杂交后的基质浸入反应溶液(1×Exbuffer/0.025mMCy3-dCTP/1.25mM dNTP/0.25U ExTaq)中，在42摄氏度保温6小时。反应之后基质用洗液(2×SSC/0.2％SDS)漂洗两遍，再用无菌水润洗。
漂洗之后用荧光成像扫描仪观察基质，完全不能检测到延伸反应的荧光信号。
至于已经固定有由荧光标记的500bp的lambdaDNA的正向引物(22bp)的基质，尽管在固定反应之后可以观察到微弱的荧光信号，但是在同样的步骤进行完以后，用荧光成像观察时根本不能检测到荧光信号。这表明在基质上固定的引物在试验过程中已经脱离。
使用荧光成像扫描仪测量的前述例4到例10中的荧光强度归纳于表1。
       表1例4到例10中的荧光信号强度
 实施例  荧光信号强度
 反应以前  点A  点B
 4  4500  9000  -
 5  4500  9500  11000
 6  2500  6000  7500
 7  4500  21000  22500
 8  4500  15500  16000
 9  4500  20000  22000
 10  2000  7000  -
工业可应用性
与传统的固体支持物相比，在本发明的固体支持物上可以固定更大量的核酸分子，而且核酸可以通过共价键被牢固地固定。因此，曾经是传统DNA阵列问题的检测灵敏度和可信度可被改进。而且，由于延伸反应可以在核酸分子已经被固定时进行，或者核酸分子可以通过PCR反应被扩增，所以使DNA阵列很有可能被推广。
                            序列表
<110>Toyo Kohan Co.，Ltd.
<120>具有静电层的固体支持物及其用途
<130>2037PCT
<150>JP2002-207886
<151>2002-07-17
<150>JP2002-275797
<151>2002-09-20
<160>2
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gatgagttgt gtccgtacaa ct                22
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggttatcgaa atcagccaca gcgcc             25

Claims (16)

1.固体支持物，该支持物在基质上具有用于静电吸引核酸分子的静电层和能够共价结合核酸分子的功能基团。
2.根据权利要求1的固体支持物，其基质的表面用至少一种选自金刚石、软金刚石、含碳物质和碳化物的物质进行表面处理。
3.根据权利要求1或2的固体支持物，其静电层含有不与基质共价结合的含氨基化合物。
4.根据权利要求1或2的固体支持物，其静电层由与基质共价结合的含氨基化合物组成，并且该含氨基化合物在其不与基质结合的末端有氨基。
5.根据权利要求1至3中任一项的固体支持物，该支持物是这样得到的：将含未取代氨基或者单取代氨基的化合物和碳化合物沉积在基质上，并且再引入能够与核酸分子共价结合的功能基团。
6.根据权利要求1至4中任一项的固体支持物，该支持物是这样得到的：将基质浸入到含未取代氨基或者单取代氨基的化合物的溶液中，并且再引入能够与核酸分子共价结合的功能基团。
7.根据权利要求6的固体支持物，其中含未取代氨基或者单取代氨基的化合物是聚丙烯酰胺。
8.根据权利要求1至7中任一项的固体支持物，其中的核酸分子是DNA。
9.固定化的核酸分子，其含有固定在根据权利要求1至8中任意一项的固体支持物上的核酸分子。
10.生产固体支持物的方法，其特征在于将含未取代氨基或者单取代氨基的化合物和碳化合物沉积在基质上，并且再引入能够与核酸分子共价结合的功能基团。
11.生产固体支持物的方法，其特征在于将基质浸入到含未取代氨基或者单取代氨基的化合物的溶液中，并且再引入能够与核酸分子共价结合的功能基团。
12.下述方法，在根据权利要求1至8中任意一项的固体支持物上固定引物，使核酸分子与引物杂交，由此使与该核酸分子互补的核酸分子延伸。
13.检测核酸分子的方法，它包括以下步骤：将引物固定在根据权利要求1至8中任意一项的固体支持物上，使核酸分子与引物杂交，在标记的核酸存在下使与该核酸分子互补的核酸分子延伸，并且读取由整合入互补核酸分子中的标记核酸产生的信号。
14.扩增核酸分子的方法，包括将引物固定在根据权利要求1至8中任意一项的固体支持物上，使核酸分子与引物杂交，然后对核酸分子进行PCR反应。
15.扩增DNA的方法，包括将引物固定在根据权利要求1至8中任意一项的固体支持物上，使核酸分子与引物杂交，然后使用链取代DNA聚合酶进行反应。
16.根据权利要求13的方法，它还包括在核酸分子与引物杂交之后扩增核酸分子的步骤。
CNB038169525A 2002-07-17 2003-07-03 具有静电层的固体支持物及其用途 Expired - Lifetime CN100558890C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP207886/2002 2002-07-17
JP2002207886 2002-07-17
JP275797/2002 2002-09-20
JP2002275797A JP2004097173A (ja) 2002-07-17 2002-09-20 静電層を有する固体支持体及びその用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1668742A true CN1668742A (zh) 2005-09-14
CN100558890C CN100558890C (zh) 2009-11-11

Family

ID=30117476

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB038169525A Expired - Lifetime CN100558890C (zh) 2002-07-17 2003-07-03 具有静电层的固体支持物及其用途

Country Status (7)

Country Link
US (3) US8551765B2 (zh)
EP (1) EP1548102B1 (zh)
JP (2) JP2004097173A (zh)
KR (1) KR100684098B1 (zh)
CN (1) CN100558890C (zh)
AU (1) AU2003246264A1 (zh)
WO (1) WO2004007710A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3927580B2 (ja) * 2004-12-09 2007-06-13 住友ベークライト株式会社 Ｄｎａ鎖伸長方法、ｄｎａ鎖増幅方法およびｄｎａ鎖伸長用マイクロアレイ
JP4817798B2 (ja) * 2005-10-19 2011-11-16 東洋鋼鈑株式会社 担体および担体の製造方法
US20090218276A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-03 Brigham Young University Functionalized diamond particles and methods for preparing the same
US9192915B2 (en) 2008-05-10 2015-11-24 Brigham Young University Porous composite particulate materials, methods of making and using same, and related apparatuses
JP5459990B2 (ja) * 2008-06-30 2014-04-02 株式会社ハイペップ研究所 バイオチップ用基板及びその製造方法
JP5456355B2 (ja) * 2009-04-02 2014-03-26 東洋鋼鈑株式会社 Ｉｔｏ層を有する生体物質固定化用担体
EP2476759B1 (en) * 2009-09-10 2018-04-04 Toyo Kohan Co., Ltd. Carrier for holding nucleic acids
KR101343891B1 (ko) * 2010-08-17 2013-12-20 (주)바이오니아 써멀 사이클러용 저 비열성 복합 소재
US8658039B2 (en) 2010-11-17 2014-02-25 Brigham Young University Sonication for improved particle size distribution of core-shell particles
JP2015040729A (ja) * 2013-08-21 2015-03-02 日本軽金属株式会社 バイオチップ用基板及びその製造方法
EP3543338A4 (en) * 2016-11-18 2020-05-06 Toyo Seikan Group Holdings, Ltd. CARRIERS FOR IMMOBILIZING BIOLOGICALLY RELEVANT MOLECULES
JP6789510B2 (ja) * 2017-02-08 2020-11-25 東洋製罐グループホールディングス株式会社 生体関連分子固定化用担体
JP7333928B2 (ja) * 2018-10-05 2023-08-28 国立大学法人山形大学 電気化学式非標識核酸検出の測定方法
DE102018132120B4 (de) * 2018-12-13 2024-04-18 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Probenaufnahmeeinrichtung für biologische Proben mit einer Probenaufnahme aus Kohlenstoff-basiertem Werkstoff

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0455905T3 (da) * 1990-05-11 1998-12-07 Microprobe Corp Dipsticks til nukleinsyrehybridiseringsassays og fremgangsmåde til kovalent immobilisering af oligonukleotider
US5888723A (en) 1992-02-18 1999-03-30 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
US5688642A (en) * 1994-12-01 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces
US5929194A (en) * 1996-02-23 1999-07-27 The Dow Chemical Company Crosslinkable or chain extendable polyarylpolyamines and films thereof
EP1063286A4 (en) * 1998-02-09 2004-03-24 Toyo Kohan Co Ltd DNA IMMOBILIZATION AND AMPLIFICATION SUBSTRATES, DNA BLOCKING CRYSTALS WITH DNA BLOCKED ON THE SUBSTRATES, AND DNA AMPLIFICATION METHOD
CA2347064A1 (en) 1998-10-15 2000-04-20 Toyo Kohan Co., Ltd. Supports for immobilizing dna or the like
US6531302B1 (en) 1999-04-12 2003-03-11 Nanogen/Becton Dickinson Partnership Anchored strand displacement amplification on an electronically addressable microchip
US6066461A (en) * 1999-04-12 2000-05-23 Becton Dickinson And Company Amplification and detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli
US6162605A (en) 1999-04-12 2000-12-19 Becton Dickinson And Company Amplification and detection of shiga-like toxin I producing organisms
KR100626582B1 (ko) * 1999-05-10 2006-09-22 도요 고한 가부시키가이샤 Ｄｎａ 라이브러리의 작제 방법 및 ｄｎａ 라이브러리를고정화한 기체
EP1196539A4 (en) * 1999-07-07 2004-12-01 Mirus Corp SUBSTRATES FOR IMMOBILIZING NUCLEIC ACIDS ON SOLID SUPPORTS
JP2001204463A (ja) * 2000-01-27 2001-07-31 Toyo Kohan Co Ltd ヌクレオチド固定用担体
US6881538B1 (en) * 2000-03-05 2005-04-19 3M Innovative Properties Company Array comprising diamond-like glass film
US6911535B2 (en) * 2000-03-22 2005-06-28 Solvlink Biosciences Biomolecule/polymer conjugates
JP4730808B2 (ja) 2000-08-08 2011-07-20 東洋鋼鈑株式会社 基板の活性化キット及びこれを用いたｄｎａ等の検出方法
JP2003014747A (ja) 2001-06-27 2003-01-15 Toyo Kohan Co Ltd 表面処理層が形成された固体支持体
JP2002082116A (ja) 2000-09-06 2002-03-22 Toyo Kohan Co Ltd 表面処理層が形成されたスライドグラス
JP3523188B2 (ja) * 2000-12-13 2004-04-26 富士写真フイルム株式会社 プローブ分子が固定された検出具の水性処理液
JP4772211B2 (ja) * 2001-05-29 2011-09-14 Ｋｉｓｃｏ株式会社 Ｄｎａチップの製造方法
US6989267B2 (en) * 2001-07-02 2006-01-24 Agilent Technologies, Inc. Methods of making microarrays with substrate surfaces having covalently bound polyelectrolyte films
US7456025B2 (en) * 2001-08-28 2008-11-25 Porex Corporation Sintered polymer membrane for analyte detection device
US6916541B2 (en) * 2001-09-07 2005-07-12 Penn State Research Foundation Modified substrates for the attachment of biomolecules
FR2841908B1 (fr) * 2002-07-04 2004-09-24 Commissariat Energie Atomique Support solide comportant une surface conductrice ou semi-conductrice de l'electricite fonctionnalisee, son procede de preparation et ses utilisations

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003246264A1 (en) 2004-02-02
EP1548102A4 (en) 2010-09-22
CN100558890C (zh) 2009-11-11
EP1548102A1 (en) 2005-06-29
JP2004097173A (ja) 2004-04-02
US8551765B2 (en) 2013-10-08
US8563239B2 (en) 2013-10-22
WO2004007710A1 (ja) 2004-01-22
JP2008292482A (ja) 2008-12-04
EP1548102B1 (en) 2013-05-29
US20090098301A1 (en) 2009-04-16
US20060204959A1 (en) 2006-09-14
KR100684098B1 (ko) 2007-02-16
JP4764901B2 (ja) 2011-09-07
KR20050021504A (ko) 2005-03-07
US20090111113A1 (en) 2009-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1668742A (zh) 具有静电层的固体支持物及其用途
CN1128884C (zh) 有效进行核酸测序的方法和组合物
CN1386865A (zh) 使用对照物测定核酸的方法
CN1191575A (zh) 使用可裂解引物寡核苷酸大小测定
CN1319142A (zh) 酶原性核酸的检测方法,以及相关分子和试剂盒
CN1489632A (zh) 固相支持物上的核酸等温扩增
CN1390263A (zh) 大处理量试验系统
CN1473201A (zh) 扩增和任选表征核酸的方法
CN101065498A (zh) 在微阵列上的靶的实时pcr
CN1310700C (zh) 基片、制备和用途
CN1284168A (zh) 固相吸头及其相关应用
EP2476759B1 (en) Carrier for holding nucleic acids
CN1566366A (zh) 一种基于dna芯片的基因分型方法及其应用
CN1203169C (zh) 用于将核酸固定在固体支持物上的底物
CN1334872A (zh) 将寡核苷酸固定在载体上的方法
CN1550555A (zh) 核酸的pcr扩增方法、pcr引物组、pcr扩增产物、以及利用该扩增方法的核酸检测方法
CN1732387A (zh) 一种分析蛋白质与底物肽之间相互作用的蛋白质芯片
CN1821424A (zh) 将生物分子非共价固定到固体基质上的方法和微阵列
CN1834258A (zh) 一种鉴定结核分支杆菌菌种的多重pcr的引物设计方法
CN1203188C (zh) 一种生物芯片的纳米放大检测方法
CN2918435Y (zh) 一种检测肥胖相关基因snp的检测试剂盒
CN1186456C (zh) 通用模板核酸检测方法和试剂盒
JP4256789B2 (ja) 静電層を有する固体支持体及びその用途
CN1309827C (zh) 一种利用微波照射的简单、有效且加速的酶催化体外核酸修饰及合成方法
CN1661111A (zh) 核酸标记方法以及核酸标记用液组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20091111