JP6789510B2 - 生体関連分子固定化用担体 - Google Patents

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Description

本発明は、生体関連分子を固定化するための担体およびその製造方法に関する。
環境や食品に対する安全性及び健全性を求める要望に伴い、環境資料や食品の原料又は製品中の微生物汚染を管理するための技術開発が進んでいる。その手段としては、微生物由来の核酸などの生体関連分子を検出する方法が検出感度及び特異性などの点から有利であり、マイクロアレイやＤＮＡチップ等、表面処理を施した基板上に生体関連分子を固定化した各種担体が開発されている。これらの担体では、精密な点着装置を使用することによって、異なる生体関連分子を含有する多数の溶液が、小さなスポット状で基板上に個別にスポッティングされる。
上記のような生体関連分子を固定化するための担体としては、基材の表面線平均粗さを所定の範囲とすることによって表面処理を向上させた担体（特許文献１）、透明性の高い基材を用いて検出感度を向上する担体（特許文献１）など、数多くのものが開発されているが、特に樹脂基板を用いた場合には、依然として検出の際のバックグラウンド値が高く、生体関連分子の検出感度が悪いなどの問題があった。また、生体関連分子固定化用担体としては、検出感度以外にもスポッティング性能など様々な特性について総合的な向上が求められており、さらなる技術開発が必要とされている。
特許第４６８９４７５号公報 特許第４９０３５１８号公報
本発明は、樹脂基板を用いた生体関連分子固定化用担体について、良好なスポッティング特性を維持しつつ検出感度が向上した担体を提供することを目的とする。
本願発明者らは、樹脂基板上にアミノ基含有化合物層及び多価カルボン酸層を順に積層した担体を作製する場合において、無機顔料を含む樹脂基板を用いるとともに、該樹脂基板の中心線表面平均粗さを所定の値に制御することによって、上記の課題を解決できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、樹脂基板と、該樹脂基板上に形成されたアミノ基含有化合物層と、該アミノ基含有化合物層上に形成された多価カルボン酸層を有する生体関連分子固定化用担体であって、前記多価カルボン酸層のカルボキシル基は活性エステル化されており、前記樹脂基板は無機顔料を含み、かつ、前記樹脂基板の中心線表面平均粗さＲａは６０ｎｍ以下であることを特徴とする、生体関連分子固定化用担体を提供する。
また、本発明は、無機顔料を含み、中心線表面平均粗さＲａが６０ｎｍ以下である樹脂基板を提供する工程、前記樹脂基板の上にアミノアルキルシラン層を形成する工程、該アミノアルキルシラン層の上に多価カルボン酸層を形成する工程、及び、該多価カルボン酸層のカルボキシル基を活性エステル化する工程を含む、生体関連分子固定化用担体の製造方法を提供する。
本願発明においては、前述の通り、無機顔料を含む樹脂基板を用いるとともに、該樹脂基板の中心線表面平均粗さを所定の値に制御することによって、生体関連分子検出の際のバックグラウンド値を低下させて検出感度の高い担体を得ることができる。
参考例１〜３及び参考比較例１〜５の素板ついて、中心線表面平均粗さＲａとＢＧ値をプロットしたグラフを示す。 比較例１、２及び実施例１、２の担体についてのスポット観察画像を示す。
本願発明は、樹脂基板と、該樹脂基板上に形成されたアミノ基含有化合物層と、該アミノ基含有化合物層上に形成された多価カルボン酸層を有する生体関連分子固定化用担体であって、前記多価カルボン酸層のカルボキシル基は活性エステル化されており、前記樹脂基板は無機顔料を含み、かつ、前記樹脂基板の中心線表面平均粗さＲａは６０ｎｍ以下であることを特徴とする、生体関連分子固定化用担体を提供する。
本願発明においては樹脂の基板が使用される。樹脂の種類は特に限定されないが、核酸等の生体関連分子の検出は生体関連分子に結合している蛍光物質に基づいて行われることが多いため、自家蛍光がなるべく低い材料を用いることが好ましい。具体的な樹脂の種類としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリメチルペンテン、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料などが挙げられ、これらの２種類以上の混合樹脂を使用してもよい。樹脂基板の材料としては、本発明においては、樹脂基板の材料としてポリカーボネート又はポリプロピレンを使用することが好ましく、特に好ましくはポリカーボネートが使用される。
本発明においては、無機顔料を含む樹脂基板が使用される。無機顔料としては、黒色顔料など、基板の光透過性を低下させることができる任意の無機顔料を使用してもよく、上記のうち黒色顔料が好ましい。黒色顔料としては、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、アニリンブラック、チタンブラック、アセチレンブラック、ヘマタイト、ペリレンブラック又はこれらの混合物を使用することができる。樹脂基板の中の無機顔料の含有量は当業者が適宜決定することができるが、好ましくは樹脂１００重量部に対して０．１〜２重量部であり、より好ましくは０．２〜１重量部であり、より好ましくは０．２〜０．５重量部である。さらに、本発明に使用される樹脂基板は、検出感度の向上として、ＢＧ値の低減などの目的に応じて性能を向上できる他の物質を適宜含んでもよく、そのような物質の例としては、透明結晶核剤、紫外線吸収剤等が挙げられる。
本発明の生体関連分子固定化用担体は、樹脂基板の中心線表面平均粗さＲａが６０ｎｍ以下、好ましくは５０ｎｍ以下、より好ましくは４０ｎｍ以下、さらに好ましくは３０ｎｍ以下、さらに好ましくは２０ｎｍ以下、特に好ましくは１０ｎｍ以下であることを特徴とする。本発明において、中心線表面平均粗さとはＪＩＳ-Ｂ-０６０１-１９８２により定義される数値であり、例えば、接触式の表面粗さ・形状測定機により測定することができる。
上記のような樹脂の種類、無機顔料の種類及び配合量、中心線表面平均粗さを適宜調整することによって、本願発明に使用される樹脂基板は好ましくは波長４５０〜７５０ｎｍにおいて８０％以上、好ましくは９０％以上の光透過率を有する。
上記の樹脂基板は、射出成形、押出し成形、圧縮成形などの任意の成形方法により当業者が作製することができる。上記のうち射出成形及び押出し成形が好ましく、射出成形が特に好ましい。
本発明の生体関連分子固定化用担体では、上記の樹脂基板上にアミノ基含有化合物層が形成される。アミノ基含有化合物層に含まれるアミノ基含有化合物としては、非置換でも置換されていてもよいアミノ基を１つ又は複数有する任意の化合物を使用することが可能であり、例えばアンモニアや各種アミン、アミノアルコール、アミノアルキルシラン等を含む化合物を使用することができる。上記アミンとしては、アリルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン等が挙げられる。本発明においては、上記のうち、アミノ基含有化合物として好ましくはアミノアルキルシランが使用される。アミノアルキルシランは、例えばアルキル基の炭素数１〜１０、好ましくは２〜５のものが使用され、具体的にはアルキル基はメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基等であり得る。上記のうち、本発明においてはプロピル基が特に好ましい。また、アミノアルキルシランのシランは１つ又は複数の置換基で置換されていてもよく、例えば炭素数１〜５、好ましくは２〜４のアルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等）で置換されているものを使用することが可能であり、特にエトキシ基で３置換されていることが好ましい。具体的なアミノアルキルシランとしては、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−アミノプロピルジメトキシエチルシラン等が挙げられ、本発明においては３−アミノプロピルトリエトキシシランが特に好ましい。なお、アミノ基含有化合物層は基板の少なくとも一部の表面上に形成されていればよく、基板の表面全体を覆っている必要はない。
アミノ基含有化合物層を形成する方法は特に限定されないが、例えば、上記のアミノ基含有化合物を各種溶媒に溶解した溶液に基板を浸漬することによって、アミノ基含有化合物層を形成することができる。溶媒の種類としては水や各種有機溶媒、例えばメタノール、エタノールなどのアルコールを使用することができるが、基板の表面粗度を小さくして自家蛍光を押さえるためには、溶媒として水を使用して、アミノ基含有化合物が十分に加水分解された水溶液に基板を浸漬することが好ましい。
アミノ基含有化合物溶液の濃度及び浸漬時間は、使用する具体的な化合物の種類、及び、後述するような本発明の所定のピーク強度比が得られるように当業者が適宜設定することが可能であるが、例えば１重量％〜１０重量％、好ましくは３重量％〜８重量％の溶液を使用し、浸漬時間は１５分〜１８０分、好ましくは３０分〜１２０分とすることができる。
本発明の生体関連分子固定化用担体では、上記のアミノアルキルシラン層の上にさらに多価カルボン酸層が形成される。このように多価カルボン酸層を形成することによって、担体の表面側にカルボキシル基が導入される。本発明に使用される多価カルボン酸の種類は特に限定されないが、例えばポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリイタコン酸、アクリル酸−メタクリル酸コポリマー等のカルボキシル基を有するモノマーの単独重合体又は共重合体を使用することができる。多価カルボン酸のカルボキシル基がアミノアルキルシラン層のアミノ基とアミド結合することによって、多価カルボン酸層はアミノアルキルシラン層の上に強固に結合することが可能となる。なお、多価カルボン酸層はその下にある基板及び/又はアミノアルキルシラン層の少なくとも一部の表面上に形成されていればよく、基板及び/又はアミノアルキルシラン層の表面全体を覆っている必要はない。
多価カルボン酸層を形成する方法は特に限定されないが、例えば、アミノアルキルシラン層が形成された基板を多価カルボン酸の溶液に浸漬する方法が挙げられる。多価カルボン酸の溶液に使用される溶媒は当業者が適宜選択することが可能であり、水や各種有機溶媒、例えばメタノール、エタノールなどのアルコールを使用することができるが、本発明においては水溶液を使用することが好ましい。
多価カルボン酸層溶液の分子量、濃度及び浸漬時間は当業者が適宜設定することが可能であるが、例えば、分子量は２．５万〜１００万、好ましくは５万〜５０万、特に好ましくは１０万〜２０万が選択され、濃度としては０．１重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜１０重量％、特に好ましくは１．０重量％〜５．０重量％が選択され、浸漬時間としては例えば１分〜６０分、好ましくは５分〜３０分、特に好ましくは１０分〜２０分が選択される。
本願発明の生体関連分子固定化用担体において、上記の通り形成された多価カルボン酸層のカルボキシル基は活性エステル化される。カルボキシル基を活性エステル化して活性エステル基を形成することによって、最終的に生体関連分子固定化用担体として生体関連分子溶液をスポッティングする際に生体関連分子を安定的に固定化することが可能となる。活性エステル基の種類及びその形成手段は、生体関連分子固定化用担体としての用途に適切なものを当業者が適宜選択することが可能であり特に限定されないが、例えばニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基などが挙げられ、本発明においてはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基が好ましい。活性エステル基を形成する方法としては、例えば１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの脱水縮合剤と、上記のような活性エステル基に対応する各種求電子性基導入剤（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドなど）を緩衝液に溶解した溶液中に浸漬することによって、多価カルボン酸層のカルボキシル基を活性エステル化することができる。
上記により得られる本発明の生体関連分子固定化用担体は、その表面上に生体関連分子を固定化することができる。本発明における生体関連分子は好ましくは核酸である。核酸含有溶液を生体関連分子固定化用担体に点着し、担体上に結合されなかった未反応の核酸溶液を洗浄することにより、核酸が固定化された担体を得ることができる。担体上に核酸含有溶液をスポットする方法は核酸含有溶液を保持したピンを担体上に接触させて点着する方法、あるいは核酸含有溶液をインクジェットにより担体上に吹き付ける方法などがあるが、特に限定されず、当業者に知られる任意の装置及び方法等を使用して行うことが可能である。
上記のように作製された核酸固定化担体は、被検試料中の標的核酸の存在の検出に使用することができる。例えば、核酸としてＤＮＡを使用する場合を例示すると、被検試料からＤＮＡを抽出して増幅し、それを核酸固定化担体（ＤＮＡチップやマイクロアレイなど）上の核酸とハイブリダイズさせて検出することにより、被検試料中の特定の微生物汚染の有無などを確認することができる。ＤＮＡを抽出する方法としては、例えばフェノール抽出法、フェノール・クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法が挙げられる。また、市販のＤＮＡ抽出試薬や核酸自動抽出装置を用いてＤＮＡを抽出する方法が挙げられる。
抽出されたＤＮＡは、必要によりそのターゲット領域が核酸増幅方法により増幅される。ターゲット領域とは、染色体ＤＮＡのうち、核酸増幅方法により増幅できる領域であり、検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。核酸増幅方法としては、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction）、ＳＤＡ法（strand displacement amplification）、ＬＣＲ法（ligase chain reaction）、ＬＡＭＰ法（loop-mediated isothermal amplification）、ＩＣＡＮ法（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）などが存在し、その中でもＰＣＲ法を用いることが好ましい。例えばＰＣＲ法で増幅されるターゲット領域の長さとしては、通常８０〜１０００塩基、好ましくは１００〜５００塩基が挙げられる。
増幅されたＤＮＡは、本発明の核酸固定化担体を用いて検出される。担体上に固定化されている核酸（プローブ）は、特定の遺伝子やタンパク質などの多種の生体関連分子が混在し、他と区別しにくく直接には選択が困難である場合に、標的とする生体関連分子にのみ結合させることで、検出可能にする検出子である。例えば、生体関連分子として、特定の微生物の核酸を検出する場合、プローブには、この微生物の核酸が有する塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡ断片が用いられ、核酸とのハイブリダイゼーションが行われる。プローブには通常１〜２００塩基、好ましくは１０〜１５０塩基のＤＮＡが固定化される。ＤＮＡは一本鎖、二本鎖のいずれも固定化することができる。また、標的の生体関連分子を蛍光物質などで予め標識しておくことで、プローブに結合した生体関連分子を検出することができる。生体関連分子とプローブの結合反応に用いられる溶液には、生体関連分子の他、例えばクエン酸−生理食塩水にＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加した緩衝液などが含有される。
以下、実施例に基づいて本願の態様をさらに詳細に説明する。
１．樹脂基板の表面粗さとの検出時のＢＧ値との関係
カーボンブラックを０．５％含有するポリカーボネートを用い、表面粗さＲａが異なる基板を射出成形により作製した。表面処理前の素板を、ＤＮＡチップ検出機GENOGATE Reader（東洋製罐グループホールディングス社製）を用いて撮影した。撮影条件として、乾燥状態の素板に６４０ｎｍのレザー光を照射し、16bitモノクロカメラ（輝度範囲：0（黒）〜65536(白)）、露光時間15[s]にて撮影し、その際の各素板の３点の画像輝度の平均値をバックグランウド値（ＢＧ値）として測定した。結果を表１に示す。
表１
２．ＤＮＡ固定化担体の作製
カーボンブラックを０．５％含有するポリカーボネートを用い、表面粗度Ｒａの異なる樹脂基板を作製した。上記１と同様の方法により素板のＢＧ値を測定した。
その後、樹脂基板を５重量％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン水溶液に３０分間浸漬してアミノ基を導入した。このアミノ基が導入された基板を１重量％ポリアクリル酸水溶液に１０分間浸漬した後、純水で洗浄し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐH６．８）に１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩と５０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に１０分間浸漬することによってカルボキシル基を活性化した担体を作製した。
上記の担体に対し、マイクロアレイ作製装置を用いて１０ｍＭに調製したＤＮＡプローブ溶液を点着した。ＤＮＡプローブが点着された基板を８０℃のオーブンで１時間加熱した後、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで室温にて１０分間および６０℃にて１０分間洗浄してＤＮＡ固定化基板を作製した。
３．核酸固定化担体の検出感度の評価
ハイブリダイゼーション用バッファー４０ｍｌとプローブと相補なＤＮＡを０.１２５ ｎＭにて混合し、作製したＤＮＡ固定化担体の表面と接触させ、４５℃で６０分間反応させた。反応後、基板を０．５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で、次いで０．５×ＳＳＣ溶液で２回、それぞれ５０往復ずつ揺動洗浄し、カバーガラスをのせてGENOGATE Reader（東洋製罐グループホールディングス社製）で蛍光検出画像を得た。検出画像上の各スポットから得られる蛍光強度値およびバックグラウンド値からＳ／Ｎ比（（蛍光強度−ＢＧ値）／ＢＧ値）を算出した。ＤＮＡチップの測定は、各実施例及び比較例について４つの１６スポットを有する担体を４枚作製し、計６４スポットについて測定した平均値を求めた。担体のスポット後の画像を図２に、また、スポット特性及び検出時の測定結果を表２にそれぞれ示す。
表２
上記の結果から、表面粗さを本願所定の範囲とすることにより、スポット形状が良好であり、かつ、ＢＧ値の低い担体を得られることが分かる。

Claims (6)

  1. 樹脂基板と、該樹脂基板上に形成されたアミノ基含有化合物層と、該アミノ基含有化合物層上に形成された多価カルボン酸層を有する生体関連分子固定化用担体であって、前記多価カルボン酸層のカルボキシル基は活性エステル化されており、前記樹脂基板は黒色顔料である無機顔料を配合して含み、かつ、前記樹脂基板の中心線表面平均粗さＲａは１０ｎｍ未満であることを特徴とする、生体関連分子固定化用担体。
  2. 前記黒色顔料が、カーボンブラック、カーボンナノチューブ，アニリンブラック、チタンブラック、アセチレンブラック、ヘマタイト、ペリレンブラック及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の生体関連分子固定化用担体。
  3. 前記樹脂基板の中の無機顔料の含有量が、樹脂１００重量部に対して０．１〜５重量部であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の生体関連分子固定化用担体。
  4. 前記樹脂基板の樹脂がポリカーボネート又はポリプロピレンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体関連分子固定化用担体。
  5. 黒色顔料である無機顔料を配合して含み、中心線表面平均粗さＲａが１０ｎｍ未満である樹脂基板を提供する工程、前記樹脂基板の上にアミノアルキルシラン層を形成する工程、該アミノアルキルシラン層の上に多価カルボン酸層を形成する工程、及び、該多価カルボン酸層のカルボキシル基を活性エステル化する工程を含む、請求項１に記載の生体関連分子固定化用担体の製造方法。
  6. 前記樹脂基板を、射出成形又は押出し成形により成形することを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
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