DE202019005530U1 - Träger mit geringer Bindung für verbesserte Festphasen-DNA-Hybridisierung und -Amplifikation - Google Patents

Träger mit geringer Bindung für verbesserte Festphasen-DNA-Hybridisierung und -Amplifikation Download PDF

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Abstract

System zum Verarbeiten eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend:
eine Oberfläche, an die mindestens eine hydrophile Polymerschicht gekoppelt ist, die ein Polymer umfasst, das an ein erstes Nukleinsäuremolekül gekoppelt ist;
ein zweites Nukleinsäuremolekül, das an das erste Nukleinsäuremolekül gekoppelt ist,
wobei eine Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis von größer oder gleich etwa 5 aufweist, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül oder ein Derivat davon mit einem Cyaninfarbstoff-3-Fluorophor markiert ist und wenn die Fluoreszenzaufnahme unter Verwendung eines inversen Fluoreszenzmikroskops, das ein Objektiv mit 20-facher Vergrößerung, 0,75 NA, eine Lichtquelle mit 532 nm, ein Set aus Bandpassfilter und dichroitischem Spiegel, optimiert für eine Langpassanregung bei 532 nm, und einen Cyaninfarbstoff-3-Fluoreszenzemissionsfilter, einen dichroitischen Reflektor für 532 nm und eine Kamera aufweist, unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einen Puffer eingetaucht ist, wobei eine Bildgebungszeit mindestens 0,5 s beträgt und es sich bei dem Puffer um 50 mM N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure mit einem pH-Wert von 7,4 handelt, erfasst wird.

Description

  • QUERVERWEIS
  • Diese Anmeldung beansprucht den Nutzen der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/767 343 , eingereicht am 14. November 2018, der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 62/776 898 , eingereicht am 07. Dezember 2018, und der US-Anmeldung 16/363 842 , eingereicht am 25. März 2019; jede dieser Anmeldungen wird durch Bezugnahme vollumfänglich hierin aufgenommen.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Im Laufe der letzten zwanzig Jahre wurden einige Methodiken der DNA-Sequenzierung entwickelt und gewerblich nutzbar gemacht (ein aktueller Überblick findet sich zum Beispiel in E. Mardis (2008), „Next-Generation DNA Sequencing Methods", Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387-402; und J. Heather und B. Chain, (2016), „The Sequence of Sequencers: The History of Sequencing DNA", Genomics 107:1-8). Bei vielen Technologien der Sequenzierung „der zweiten Generation“ und „dritten Generation“ wird eine Herangehensweise an die Sequenzierung per Synthese (Sequencing-by-Synthesis - SBS) eines zyklischen Arrays mit sehr vielen parallel ablaufenden Durchgängen genutzt, bei welcher ein exaktes Dekodieren einer einzelsträngigen Matrizen-Oligonukleotidsequenz, die an einen festen Träger angebunden ist, auf dem erfolgreichen Klassifizieren von Signalen beruht, die vom stufenweisen Anbau von A-, G-, C- und T-Nukleotiden durch eine Polymerase an einen komplementären Oligonukleotidstrang herrühren. Bei diesen Verfahren ist es typischerweise erforderlich, die Oligonukleotidmatrize mit einer bekannten Adaptorsequenz mit festgelegter Länge zu modifizieren, in einem zufällig oder nach einem Muster angeordneten Array mittels Hybridisierung an an eine Oberfläche angebundene Sonden mit bekannter Sequenz, die komplementär zu jener der Adaptorsequenz ist, an einen festen Träger zu fixieren, und dann eine Untersuchung vorzunehmen, was beispielsweise anhand einer Herangehensweise einer synchronen Sequenzierung mittels Synthese (smSBS) an einem (nicht amplifizierten) einzelnen Molekül (bspw. der Helicos-Technologie) oder einer Herangehensweise einer asynchronen Sequenzierung mittels Synthese (smASBS) an einem einzelnen Molekül (bspw. der Technologie von Pacific Biosciences) erfolgt. Bei der smSBS-Herangehensweise kommen Terminatornukleotide, die mit Fluoreszenzmarkern kodiert sind, zur Verwendung, sodass ein Replikationsenzym pro Zyklus nur eine einzelne Basis einbauen kann. Die Helicos-Technologie verwendete beispielsweise einen einzelnen Fluoreszenzmarker; dabei erfolgte eine sequenzielle Einbringung von A, G, C, T mit einer Basis pro Zyklus. Bei jedem Zyklus wurde ein Bildgebungsschritt vorgenommen, um die korrekte „Basis“ für jede einzelne Molekülmatrize an einem Array zu klassifizieren. Nach den Bildgebungsschritten werden die Marker mit umkehrbarer Verknüpfung entfernt, sodass das replizierende Enzym (Polymerase) die nächste als Matrize dienende Base einbauen kann. Diese Zyklen werden vielfach wiederholt, um irgendwann die Matrizen-Oligonukleotid-Stränge an dem zufällig angeordneten Array zu dekodieren und ihre jeweiligen Sequenzen zu bestimmen.
  • Obwohl sich mit ihr Erfolge zeitigen lassen, geht die Herangehensweise des zyklischen Arrays allgemein mit zwei grundlegenden Unzulänglichkeiten einher: (i) die Zyklusdauer für den Anbau jedes nachfolgenden Nukleotids an den komplementären Strang ist zu lang und (ii) die Signale, die durch den stufenweisen Anbau einzelner Nukleotide entstehen, sind schwach (typischerweise werden sie durch die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen und auf Fluoreszenz basierenden Bildgebungstechniken detektiert) und weisen geringe Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisse (CNRs) auf, wie nachstehend näher erläutert, weshalb dafür lange Zeitspannen für die Bildgebung unter Verwendung kostspieliger Instrumente erforderlich sind, die hochpräzise optische Geräte zum Erzielen einer exakten Basenzuordnung umfassen.
  • Es wurden Versuche unternommen, das Zyklusdauerproblem bei Herangehensweisen der zyklischen Array-Sequenzierung zu beheben, beispielsweise mit dem Aufkommen der asynchronen Sequenzierung per Synthese (smASBS) an einem einzelnen Molekül, bspw. der Technologie von Pacific Biosciences, bei welcher vier Fluoreszenzmarker mit unterschiedlichen Spektren an das jeweilige A-, G-, C- und T-Nukleotid geknüpft werden, deren Anbau dann in „Echtzeit“ klassifiziert werden kann. Bei dieser Herangehensweise werden alle vier markierten Nukleotide simultan eingearbeitet, und während des gesamten Vorgangs der Strangreplikation werden Aufnahmen erfasst. Jede Position in der Sequenz wird auf der Grundlage des Spektrums des erfassten Lichts als ,A', , G', ,C' und, T' klassifiziert. Hierbei können die Zykluszeiten theoretisch so schnell wie die Geschwindigkeit der Replikation durch Polymerasekatalysation sein, ein Manko besteht jedoch im verringerten CNR, wodurch sich Klassifizierungsfehler einschleichen, die letztlich zu einer geminderten Exaktheit führen, und man stärker auf hochpräzise optische Geräte und kostspielige Instrumente angewiesen ist.
  • Es wurden Versuche unternommen, die signalbedingten Einschränkungen bei manchen Herangehensweisen der zyklischen Array-Sequenzierung (d. h. bei Herangehensweisen, die nicht auf Einzelmolekülen beruhen) zu beheben, indem in ein Amplifikationsschritt in den Prozess eingegliedert wurde. Die Festphasen-Amplifikation von Matrizen-DNA-Molekülen, die an einen festen Träger in einem zufällig oder in einem Muster angeordneten Array angebunden sind, steigert die Anzahl der Kopien des Ziels, das sequenziert werden soll, sodass das Signal, das aus einer „Kolonie“ von Replikat-Matrizen-Molekülen beim stufenweisen Anbau nachweisbarer Basen an ihre jeweiligen komplementären Stränge entsteht, als ,A', ,G', ,C' oder ,T' klassifiziert werden kann. Die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Klassifikation (und damit der Exaktheit der Basenzuordnung) ist vom jeweiligen CNR bei jedem Nachweisereignis abhängig, was oftmals eine Einschränkung darstellt.
  • Demnach besteht ein Bedarf an verbesserten festen Trägern und Verfahren zur Festphasen-Amplifikation zur Sequenzierung von Nukleinsäure, welche für eine Erhöhung der Magnitude auf Basenanbau zurückgehender Signale, eine Verringerung unspezifischer Hintergrundsignale und somit für eine Verbesserung des CNR sorgen, wodurch die Exaktheit der Basenzuordnung verbessert wird, potenziell die Zyklusdauer verkürzt und die Abhängigkeit des Sequenzierungsvorgangs von hochpräzisen optischen Geräten und kostspieligen Instrumenten reduziert wird.
  • KURZDARSTELLUNG
  • Einige Ausführungsformen betreffen ein Verfahren zum Vornehmen einer Nukleinsäuresequenzbestimmung, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Oberfläche; wobei die Oberfläche umfasst: i) ein Substrat; ii) mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht; iii) eine Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen, die an mindestens einer hydrophilen Polymerüberzugsschicht angelagert sind; und iv) mindestens eine separate Region der Oberfläche, die eine Vielzahl von klonal amplifizierten Probenukleinsäuremolekülen, welche an die Vielzahl von angelagerten Oligonukleotidmolekülen immobilisiert sind, umfasst, wobei die Vielzahl immobilisierter klonal amplifizierter Probenukleinsäuremoleküle in einer Oberflächendichte von mindestens 5000 Molekülen/mm2 vorliegen, b) Vornehmen einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion an Probenukleinsäuremolekülen, bevor oder nachdem sie an die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen annealt werden; und c) Vornehmen wenigstens einer einzelnen Nukleotidbindungs- oder -einbaureaktionen, wobei die Nukleotide mit einem nachweisbaren Marker versehen werden. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren des Weiteren ein Nachweisen oder Charakterisieren des Nukleotids auf der Grundlage des nachweisbaren Markers.
  • In der vorliegenden Schrift sind Oberflächen offenbart, umfassend ein Substrat, mindestens eine Schicht aus einem hydrophilen Überzug mit geringer unspezifischer Bindung (d. h. mit wenig Hintergrund) und eine Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen, die an mindestens einer Schicht aus einem hydrophilen Überzug mit geringer Bindung und wenig Hintergrund angelagert sind.
  • Die offenbarten festen Träger mit geringer unspezifischer Bindung können für viele verschiedene Bioassays verwendet werden, darunter zur DNA-Sequenzierung und Genotypisierung. Diese Träger umfassen temperatur- und chemisch stabile funktionalisierte Substrate, die der Exposition gegenüber mehrfachem Lösungsmittelaustausch und Temperaturwechsel standhalten und die über die Dauer des Assays hinweg Eigenschaften einer geringen unspezifischen Bindung verschaffen. Die offenbarten Träger können einige oder alle der folgenden Eigenschaften aufweisen:
    1. 1. Oberflächenfunktionalisierung, die unter Verwendung einer beliebigen Kombination aus protisch-polaren, aprotisch-polaren und/oder unpolaren Lösungsmitteln vorgenommen wird, was zu einer Effizienzsteigerung der Leistung des Bioassays um mehr als ein 5-Faches (z. B. zu einer Verbesserung der Reaktionsgeschwindigkeit bzw. der gewünschten Produktbildung) im Vergleich zu traditionellen Herangehensweisen führt.
    2. 2. Messung des Mindestkontaktwinkels nach Funktionalisierung (z. B., < 35 Grad), der über aufeinanderfolgende Lösungsmittel- und Temperaturwechsel hinweg beibehalten wird.
    3. 3. Biomoleküle mit geringer unspezifischer Bindung im Gegensatz zu spezifisch gebundenen Molekülen (bspw. mehr als 1 spezifisch gebundenes Molekül im Gegensatz zu < 0,25 unspezifisch gebundenes Molekül pro interessierende Region). Dies schlägt sich direkt als verbessertes Kontrast-zu-Rausch (CNR) nieder, wenn eine beliebige von vielen verschiedenen Nachweismethodiken verwendet wird.
  • Vorliegend sind Oberflächen offenbart, umfassend: a) ein Substrat; b) mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht; c) eine Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen, die an mindestens einer hydrophilen Polymerüberzugsschicht angelagert sind; und d) mindestens eine separate Region der Oberfläche, die eine Vielzahl von klonal amplifizierten Probenukleinsäuremolekülen, welche an die Vielzahl von angelagerten Oligonukleotidmolekülen annealt worden sind, umfasst, wobei eine Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 20 zeigt.
  • In einigen Ausführungsformen weist die Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 20 auf, wenn die Probenukleinsäuremoleküle oder komplementäre Sequenzen davon mit einem Cyaninfarbstoff-3(Cy3)-Fluorophor markiert ist und wenn die Fluoreszenzaufnahme unter Verwendung eines umgekehrten Fluoreszenzmikroskops, Olympus IX83, mit einem Objektiv mit 20x, 0,75 NA, einer Lichtquelle mit 532 nm, einem Set aus Bandpassfilter und dichroitischem Spiegel, optimiert für eine Anregung bei 532 nm und Cy3-Fluoreszenzemission, und einer Kamera (bspw. Andor sCMOS, Zyla 4.2) unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einen Puffer getaucht ist (z. B. 25 mM ACES-Puffer, pH 7,4) erlangt wurde.
  • In einigen Ausführungsformen weist die Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 40 auf. In einigen Ausführungsformen weist die Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 60 auf. In einigen Ausführungsformen umfasst das Substrat Glas. In einigen Ausführungsformen umfasst das Substrat Kunststoff. In einigen Ausführungsformen umfasst die mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht PEG. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche ferner eine zweite hydrophile Polymerüberzugsschicht. In einigen Ausführungsformen umfasst wenigstens eine hydrophile Polymerschicht ein verzweigtes hydrophiles Polymer, z. B. PEG, das mindestens 4 Verzweigungen aufweist. In einigen Ausführungsformen umfasst wenigstens eine hydrophile Polymerschicht ein verzweigtes hydrophiles Polymer, z.B. PEG, das mindestens 8 Verzweigungen aufweist. In einigen Ausführungsformen umfasst wenigstens eine hydrophile Polymerschicht ein verzweigtes hydrophiles Polymer, z. B. PEG, das mindestens
    16 Verzweigungen aufweist. In einigen Ausführungsformen umfasst wenigstens eine hydrophile Polymerschicht ein verzweigtes hydrophiles Polymer, z. B. PEG, das mindestens
    32 Verzweigungen aufweist. In einigen Ausführungsformen liegt die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen in einer Oberflächendichte von mindestens 50.000 Molekülen/µm2 vor. In einigen Ausführungsformen liegt die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen in einer Oberflächendichte von mindestens 100.000 Molekülen/µm2 vor. In einigen Ausführungsformen liegt die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen in einer Oberflächendichte von mindestens 500.000 Molekülen/µm2 vor. In einigen Ausführungsformen wurden die Probenukleinsäuremoleküle bei einer Konzentration von nicht mehr als 500 nM vor dem Annealing und der klonalen Amplifikation verabreicht. In einigen Ausführungsformen wurden die Probenukleinsäuremoleküle bei einer Konzentration von nicht mehr als 20 pM vor dem Annealing und der klonalen Amplifikation verabreicht. In einigen Ausführungsformen umfassen die Probenukleinsäuremoleküle einzelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle, welche Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit umfassen. In einigen Ausführungsformen weisen die einzelsträngigen multimeren Nukleinsäuremoleküle eine Länge von mindestens 10 kb auf. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche ferner doppelsträngige monomere Kopien der regelmäßig auftretenden Monomereinheit. In einigen Ausführungsformen ist die Oberfläche auf der Innenseite eines Strömungskanals positioniert. In einigen Ausführungsformen liegt die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen in einer gleichmäßigen Oberflächendichte über die Oberfläche hinweg vor. In einigen Ausführungsformen liegt die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen in einer lokalen Oberflächendichte von mindestens 100.000 Molekülen/µm2 an einer ersten Stelle auf der Oberfläche und in einer zweiten lokalen Oberflächendichte an einer zweiten Stelle auf der Oberfläche vor. In einigen Ausführungsformen beträgt die Hintergrundfluoreszenzintensität, gemessen an einer Region der Oberfläche, die seitlich von der mindestens einen separaten Region versetzt ist, nicht mehr als ein 2-Faches der Intensität, welche vor der klonalen Amplifikation an der mindestens einen separaten Region gemessen wurde. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche eine erste Schicht, die eine Monoschicht aus Polymermolekülen, die an eine Oberfläche des Substrats angebunden sind, umfasst; eine zweite Schicht, welche an die Polymermoleküle der ersten Schicht angebundene Polymermoleküle umfasst; und eine dritte Schicht, die an die Polymermoleküle der zweiten Schicht angebundene Polymermoleküle umfasst, wobei mindestens eine Schicht verzweigte Polymermoleküle umfasst. In einigen Ausführungsformen umfasst die dritte Schicht ferner Oligonukleotide, die an die Polymermoleküle der dritten Schicht angebunden sind. In einigen Ausführungsformen sind die an die Polymermoleküle der dritten Schicht angebundenen Oligonukleotide in einer Vielzahl von Tiefen in der gesamten dritten Schicht verteilt. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche ferner eine vierte Schicht, die verzweigte Polymermoleküle umfasst, welche an die Polymermoleküle der dritten Schicht angebunden sind, und eine fünfte Schicht, die an die verzweigten Polymermoleküle der vierten Schicht angebundene Polymermoleküle umfasst. In einigen Ausführungsformen umfassen die Polymermoleküle der fünften Schicht ferner Oligonukleotide, die an die Polymermoleküle der fünften Schicht angebunden sind. In einigen Ausführungsformen sind die an die Polymermoleküle der fünften Schicht angebundenen Oligonukleotide in einer Vielzahl von Tiefen in der gesamten fünften Schicht verteilt. In einigen Ausführungsformen umfasst die mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht ein Molekül, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Polyethylenglycol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(acrylsäure) (PAA), Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(methylmethacrylat) (PMA), Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglycol)methylethermethacrylat) (POEGMA), Polyglutaminsäure (PGA), Polylysin, Polyglucosid, Streptavidin und Dextran besteht. In einigen Ausführungsformen weist die Aufnahme der Oberfläche ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von spezifisch amplifizierten, mit Cy3 markierten Probenukleinsäuremolekülen oder komplementären Sequenzen davon zum unspezifischem Hintergrund aufgrund der Adsorption des Cy3-Farbstoffs (Binter) von mindestens 3:1 auf. In einigen Ausführungsformen weist die Aufnahme der Oberfläche ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von spezifisch amplifizierten, mit Cy3 markierten Probenukleinsäuremolekülen oder komplementären Sequenzen davon zu einer Kombination aus unspezifischem Hintergrund aufgrund der Adsorption des Cy3-Farbstoffs und unspezifischem Amplifikationshintergrund (Binter + Bintra) von mindestens 3:1 auf. In einigen Ausführungsformen weist die Aufnahme der Oberfläche ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von spezifisch amplifizierten, mit Cy3 markierten Probenukleinsäuremolekülen oder komplementären Sequenzen davon zu unspezifischem Hintergrund aufgrund der Farbstoffadsorption (Binter) von mindestens 5:1 auf. In einigen Ausführungsformen weist die Aufnahme der Oberfläche ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten von spezifisch amplifizierten, mit Cy3 markierten Probenukleinsäuremolekülen oder komplementären Sequenzen davon zu einer Kombination aus unspezifischem Hintergrund aufgrund der Adsorption des Cy3-Farbstoffs und unspezifischem Amplifikationshintergrund (Binter + Bintra) von mindestens 5:1 auf.
  • In der vorliegenden Schrift sind zudem Oberflächen offenbart, umfassend: a) ein Substrat; b) mindestens eine Schicht eines hydrophilen Polymerüberzugs; und c) eine Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen, die an mindestens eine der hydrophilen Polymerüberzugsschichten angelagert sind, wobei die Oberfläche ein Maß an unspezifischer Cy3-Farbstoffadsorption von unter etwa 0,25 Molekülen/µm2 aufweist.
  • In einigen Ausführungsformen weist die Oberfläche ein Maß an unspezifischer Cy3-Farbstoffadsorption von unter etwa 0,1 Molekülen/µm2 auf. In einigen Ausführungsformen weist die Oberfläche ein Verhältnis von spezifischer Cy3-Oligonukleotid-Markierung zu unspezifischer Cy3-Farbstoffadsorption auf, das mehr als etwa 4:1 beträgt. In einigen Ausführungsformen weist die Oberfläche ein Verhältnis von spezifischer Cy3-Oligonukleotid-Markierung zu unspezifischer Cy3-Farbstoffadsorption auf, das über etwa 10:1 liegt. In einigen Ausführungsformen wird die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen mit einer Oberflächendichte von mindestens 10.000 Molekülen/µm2 angelagert. In einigen Ausführungsformen wird die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen mit einer Oberflächendichte von mindestens 100.000 Molekülen/µm2 angelagert. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche ferner eine Vielzahl klonal amplifizierter Cluster von Matrizenmolekülen, die an die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen annealt worden sind, und wobei die Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 20 aufweist. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 50. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 100. In einigen Ausführungsformen umfasst wenigstens eine der mindestens zwei hydrophilen Polymerschichten ein verzweigtes Polyethylenglycol(PEG)-Molekül. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche eine Oberfläche eines kapillaren Lumens oder mindestens eine Innenfläche einer Durchflusszelle. In einigen Ausführungsformen ist das kapillare Lumen oder die Durchflusszelle zur Verwendung beim Vornehmen einer Nukleinsäurehybridisierungs-, -amplifikations- oder -sequenzierungsreaktion oder einer beliebigen Kombination daraus ausgelegt. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche ferner eine Blockierschicht aus verzweigtem Polymer. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei der Blockierschicht aus verzweigtem Polymer um eine Blockierschicht aus verzweigtem PEG. In einigen Ausführungsformen ist die Blockierschicht aus verzweigtem Polymer kovalent an die oberste hydrophile Polymerschicht angebunden. In einigen Ausführungsformen umfassen die Polymere der ersten Schicht funktionelle Gruppen aus Primäraminen und die Polymere der zweiten Schicht funktionelle N-Hydroxysuccinimid(NHS)-Ester-Gruppen; nach der Ablagerung der zweiten Schicht wird die zweite Schicht mittels einer kovalenten Amidverbindung an die erste Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen umfassen die Polymere der ersten Schicht funktionelle N-Hydroxysuccinimid(NHS)-Ester-Gruppen und die Polymere der zweiten Schicht funktionelle Gruppen aus Primäraminen; nach der Ablagerung der zweiten Schicht wird die zweite Schicht mittels einer kovalenten Amidverbindung an die erste Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 1:5 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 2:5 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 3:5 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 4:5 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 1:1 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 4:1 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 8:1 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 16:1 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide bei einem Oligonukleotid-zu-Polymer-Molverhältnis von etwa 32:1 an die Polymermoleküle der zweiten oder einer dritten Schicht angebunden. In einigen Ausführungsformen liegen die Oligonukleotide in einer Oberflächendichte von mindestens 10.000 Molekülen pro Quadratmikrometer vor. In einigen Ausführungsformen liegen die Oligonukleotide in einer Oberflächendichte von mindestens 100.000 Molekülen pro Quadratmikrometer vor. In einigen Ausführungsformen sind die Oligonukleotide gleichmäßig in der dritten Schicht verteilt.
  • In der vorliegenden Schrift sind Verfahren zum Ablagern von Oligonukleotiden auf eine Substratoberfläche offenbart, wobei das Verfahren umfasst: a) Konjugieren eines ersten hydrophilen Polymers an die Substratoberfläche in einer ersten Schicht; b) Konjugieren eines zweiten hydrophilen Polymers an die erste Schicht, um eine zweite Schicht auszubilden, wobei die hydrophilen Polymermoleküle der zweiten Schicht durch mindestens zwei kovalente Bindungen pro Molekül an die erste Schicht angefügt werden; und c) Konjugieren eines äußersten hydrophilen Polymers an die zweite Schicht, wobei die äußersten hydrophilen Polymermoleküle Oligonukleotidmoleküle umfassen, die vor dem Konjugieren an die zweite Schicht kovalent daran angelagert werden.
  • In einigen Ausführungsformen werden die hydrophilen Polymermoleküle der zweiten Schicht durch mindestens vier kovalente Bindungen pro Molekül an die erste Schicht angefügt. In einigen Ausführungsformen werden die hydrophilen Polymermoleküle der zweiten Schicht durch mindestens acht kovalente Bindungen pro Molekül an die erste Schicht angefügt. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren des Weiteren ein direktes Konjugieren des äußersten hydrophilen Polymers an die zweite Schicht. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren des Weiteren ein Konjugieren eines dritten hydrophilen Polymers an die zweite Schicht, um eine dritte Schicht auszubilden, und ein Konjugieren des äußersten hydrophilen Polymers an die zweite Schicht über die dritte Schicht. In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren des Weiteren ein Konjugieren eines dritten hydrophilen Polymers an die zweite Schicht, um eine dritte Schicht auszubilden, ein Konjugieren eines vierten hydrophilen Polymers an die dritte Schicht, um eine vierte Schicht auszubilden, und ein Konjugieren des äußersten hydrophilen Polymers an die zweite Schicht über die vierte und dritte Schicht. In einigen Ausführungsformen umfasst das erste hydrophile Polymer PEG. In einigen Ausführungsformen umfasst das erste hydrophile Polymer PGA. In einigen Ausführungsformen umfasst wenigstens eine der hydrophilen Polymerschichten ein verzweigtes Polymer. In einigen Ausführungsformen umfasst das verzweigte Polymer mindestens 4 Verzweigungen. In einigen Ausführungsformen umfasst das verzweigte Polymer mindestens 8 Verzweigungen. In einigen Ausführungsformen umfasst das verzweigte Polymer 16 bis 32 Verzweigungen. In einigen Ausführungsformen werden die hydrophilen Polymermoleküle der vierten Schicht durch mindestens zwei kovalente Bindungen pro Molekül an die dritte Schicht angefügt. In einigen Ausführungsformen werden die hydrophilen Polymermoleküle der vierten Schicht durch mindestens vier kovalente Bindungen pro Molekül an die dritte Schicht angefügt. In einigen Ausführungsformen werden die hydrophilen Polymermoleküle der vierten Schicht durch mindestens acht kovalente Bindungen pro Molekül an die dritte Schicht angefügt. In einigen Ausführungsformen wird das hydrophile Polymer in einem Ethanol umfassenden Lösungsmittel an die Substratoberfläche abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das hydrophile Polymer in einem Methanol umfassenden Lösungsmittel an die Substratoberfläche abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das hydrophile Polymer in einem Dimethylsulfoxid (DMSO) umfassenden Lösungsmittel an die Substratoberfläche abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das hydrophile Polymer in einem Acetonitril umfassenden Lösungsmittel an die Substratoberfläche abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das hydrophile Polymer in einem Pufferphosphat umfassenden Lösungsmittel an die Substratoberfläche abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das hydrophile Polymer in einem Puffer-3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS) umfassenden Lösungsmittel an die Substratoberfläche abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das hydrophile Polymer in einem Lösungsmittel, das 75 % Acetonitril, 25 % Phosphatpuffer umfasst, an die Substratoberfläche abgegeben. In einigen Ausführungsformen wird das hydrophile Polymer in einem Lösungsmittel, das 90 % Methanol, 10 % MOPS-Puffer umfasst, an die Substratoberfläche abgegeben.
  • In der vorliegenden Schrift sind Oberflächen offenbart, die Oligonukleotide in einer Dichte von mindestens 10.000 Molekülen pro Quadratmikrometer umfassen, wobei die Oligonukleotide über ein mehrschichtiges hydrophiles polymeres Stratum an die Oberfläche angebunden werden und wobei die Oligonukleotide homogen über die Gesamtheit einer äußersten Schicht des mehrschichtigen hydrophilen polymeren Stratums verteilt werden.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide mit einer Oberflächendichte von mindestens 50.000 Molekülen pro Quadratmikrometer verteilt. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide mit einer Oberflächendichte von mindestens 100.000 Molekülen pro Quadratmikrometer verteilt. In einigen Ausführungsformen werden die Oligonukleotide mit einer Oberflächendichte von mindestens 500.000 Molekülen pro Quadratmikrometer verteilt. In einigen Ausführungsformen werden mindestens 10 % der angebundenen Oligonukleotid an Ziel-(oder Probe-)Oligonukleotide annealt. In einigen Ausführungsformen wird das mehrschichtige hydrophile polymere Stratum anhand eines hydrophilen Lösungsmittels gesättigt. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche ein aus Glas, Quarzglas, Silicium oder Polymer (z. B. Kunststoff) bestehendes Substrat. In einigen Ausführungsformen umfasst das mehrschichtige hydrophile polymere Stratum drei oder mehr Polymerschichten. In einigen Ausführungsformen umfasst das mehrschichtige hydrophile polymere Stratum fünf oder mehr Polymerschichten. In einigen Ausführungsformen umfassen eine oder mehrere Schichten des hydrophilen polymeren Stratums verzweigtes PEG, verzweigtes PVA, verzweigtes Poly(vinylpyridin), verzweigtes PVP, verzweigtes PAA, verzweigtes PNIPAM, verzweigtes PMA, verzweigtes PHEMA, verzweigtes PEGMA, verzweigtes PGA, verzweigtes Polylysin, verzweigtes Polyglucosid oder Dextran. In einigen Ausführungsformen umfassen eine oder mehrere Schichten des hydrophilen polymeren Stratums verzweigte PEG-Moleküle. In einigen Ausführungsformen umfassen die verzweigten PEG-Moleküle mindestens 4 Verzweigungen. In einigen Ausführungsformen umfassen die verzweigten PEG-Moleküle mindestens 8 Verzweigungen. In einigen Ausführungsformen umfassen die verzweigten PEG-Moleküle 16 bis 32 Verzweigungen. In einigen Ausführungsformen werden mindestens eine erste Schicht und eine zweite Schicht des hydrophilen polymeren Stratums durch eine kovalente Amidbindung aneinander angebunden. In einigen Ausführungsformen werden mindestens eine erste Schicht und eine zweite Schicht des hydrophilen polymeren Stratums durch mindestens zwei kovalente Bindungen pro Polymermolekül aneinander angebunden. In einigen Ausführungsformen werden mindestens eine erste Schicht und eine zweite Schicht des hydrophilen polymeren Stratums durch mindestens vier kovalente Bindungen pro Polymermolekül aneinander angebunden. In einigen Ausführungsformen werden mindestens eine erste Schicht und eine zweite Schicht des hydrophilen polymeren Stratums durch mindestens acht kovalente Bindungen pro Polymermolekül aneinander angebunden. In einigen Ausführungsformen beträgt die Oberflächendichte angebundener Oligonukleotide mindestens 50.000 Moleküle pro Quadratmikrometer. In einigen Ausführungsformen beträgt die Oberflächendichte angebundener Oligonukleotide mindestens 100.000 Moleküle pro Quadratmikrometer. In einigen Ausführungsformen weist die Oberfläche eine unspezifische Bindung von CY3-Farbstoff von unter 0,25 Molekülen/µm2 auf. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche ferner Cluster aus klonal amplifizierten Kopien der annealten Zieloligonukleotide, wobei im Wesentlichen alle der klonal amplifizierten Kopien der annealten Zieloligonukleotide ein mit Cy3 markiertes Nukleotid, das an eine erste Stelle annealt ist, umfassen und wobei eine Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 20 aufweist. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 50. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 100. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 150. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 200. In einigen Ausführungsformen werden die klonal amplifizierten Kopien der annealten Zieloligonukleotide unter Verwendung eines Protokolls der Brückenamplifikation präpariert. In einigen Ausführungsformen werden die klonal amplifizierten Kopien der annealten Zieloligonukleotide unter Verwendung eines Protokolls der isothermen Brückenamplifikation präpariert. In einigen Ausführungsformen werden die klonal amplifizierten Kopien der annealten Zieloligonukleotide unter Verwendung eines Protokolls der Rolling-Circle-Amplifikation präpariert. In einigen Ausführungsformen werden die klonal amplifizierten Kopien der annealten Zieloligonukleotide unter Verwendung eines Protokolls der Amplifikation mittels Helikase präpariert. In einigen Ausführungsformen werden die klonal amplifizierten Kopien der annealten Zieloligonukleotide unter Verwendung eines Protokolls der Amplifikation mittels Rekombinase präpariert. In einigen Ausführungsformen werden die klonal amplifizierten Kopien der annealten Zieloligonukleotide unter Verwendung eines Protokolls der Amplifikation mittels Einzelstrang-bindender Proteine (SSB-Proteine) präpariert. In einigen Ausführungsformen umfasst die Oberfläche eine Oberfläche eines kapillaren Lumens oder mindestens eine Innenfläche einer Durchflusszelle. In einigen Ausführungsformen ist das kapillare Lumen oder die Durchflusszelle zur Verwendung beim Vornehmen einer Nukleinsäurehybridisierungs-, -amplifikations- oder -sequenzierungsreaktion oder einer beliebigen Kombination daraus ausgelegt.
  • Vorliegend sind Verfahren zum Vornehmen einer Festphasen-Nukleinsäurehybridisierung offenbart, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer beliebigen der vorliegend offenbarten Oberflächen; und b) Vornehmen einer Reaktion der Festphasen-Nukleinsäurehybridisierung, wobei Matrizen-Nukleinsäuremoleküle an die angebundenen Oligonukleotide annealt werden. Zudem sind vorliegend Verfahren zum Vornehmen einer Festphasen-Nukleinsäureamplifikation offenbart, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer beliebigen der vorliegend offenbarten Oberflächen; und b) Vornehmen einer Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung von Matrizen-Nukleinsäuremolekülen, welche an die angebundenen Oligonukleotide hybridisiert werden.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Festphasen-Nukleinsäureamplifikation ein Durchführen von Temperaturzyklen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine isotherme Amplifikation. In einigen Ausführungsformen umfasst die Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Rolling-Circle-Amplifikation. In einigen Ausführungsformen umfasst die Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Brückenamplifikation. In einigen Ausführungsformen umfasst die Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine isotherme Brückenamplifikation. In einigen Ausführungsformen umfasst die Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Multi-Displacement-Amplifikation. In einigen Ausführungsformen umfasst die Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Helikasebehandlung. In einigen Ausführungsformen umfasst die Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Rekombinasebehandlung. In einigen Ausführungsformen gibt es über mindestens 30 Zyklen der Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation hinweg keine Änderung im Hinblick auf eine Oberflächendichte der angebundenen Oligonukleotide. In einigen Ausführungsformen gibt es über mindestens 40 Zyklen der Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation hinweg keine Änderung im Hinblick auf eine Oberflächendichte angebundener Oligonukleotide. In einigen Ausführungsformen gibt es über mindestens 50 Zyklen der Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation hinweg keine Änderung im Hinblick auf eine Oberflächendichte angebundener Oligonukleotide.
  • In der vorliegenden Schrift sind Verfahren zum Vornehmen einer Nukleinsäuresequenzbestimmung offenbart, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer beliebigen der vorliegend offenbarten Oberflächen; b) Vornehmen einer Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung von Matrizen-Nukleinsäuremolekülen, welche an die angebundenen Oligonukleotide hybridisiert werden; und c) Vornehmen einer zyklischen Reihe einzelner Nukleotidbindungs- und -einbaureaktionen, wobei die Nukleotide mit einem nachweisbaren Marker markiert werden.
  • In einigen Ausführungsformen ist der nachweisbare Marker ein Fluorophor. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Fluorophor um Cy3, und wobei eine Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche wie an anderer Stelle in dieser Schrift beschrieben unter Bedingungen ohne Signalsättigung erfasst wird, nachdem die Bindung oder der Einbau eines ersten mit Cy3 markierten Nukleotids ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 20 aufweist. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 50. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 100. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 150. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) mindestens 200. In einigen Ausführungsformen umfasst die Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Brückenamplifikationsreaktion. In einigen Ausführungsformen umfasst die Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Reaktion einer isothermen Brückenamplifikation. In einigen Ausführungsformen umfasst die Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Reaktion einer Rolling-Circle-Amplifikation (RCA). In einigen Ausführungsformen umfasst die Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Amplifikationsreaktion mittels Helikase. In einigen Ausführungsformen umfasst die Reaktion der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation eine Amplifikationsreaktion mittels Rekombinase.
  • In der vorliegenden Schrift sind Vorrichtungen zum Vornehmen einer Nukleinsäureamplifikation offenbart, wobei die Vorrichtung umfasst: a) eine beliebige der vorliegend offenbarten Oberflächen; wobei die Oberfläche eine Oberfläche eines kapillaren Lumens oder mindestens eine Innenfläche einer Durchflusszelle umfasst.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Vorrichtung ferner wenigstens einen Fluideinlass in das kapillare Lumen. In einigen Ausführungsformen umfasst die Vorrichtung ferner wenigstens einen Fluidauslass. In einigen Ausführungsformen umfasst die Vorrichtung ferner wenigstens eine Pumpe. In einigen Ausführungsformen umfasst die Vorrichtung ferner wenigstens einen Verteiler zum Vermischen von Fluid. In einigen Ausführungsformen umfasst die Vorrichtung ferner wenigstens ein Temperaturkontrollelement. In einigen Ausführungsformen umfasst die Vorrichtung ferner wenigstens ein Sichtfenster.
  • In der vorliegenden Schrift sind Systeme zum Vornehmen einer Nukleinsäuresequenzierung offenbart, wobei das System umfasst: a) wenigstens eine der vorliegend offenbarten Vorrichtungen; b) ein Fluidkontrollmodul; und c) ein Bildgebungsmodul.
  • AUFNAHME DURCH BEZUGNAHME
  • Jegliche Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Schrift genannt werden, werden hiermit durch Bezugnahme vollumfänglich in gleichem Maße aufgenommen, als ob im Falle jeder einzelnen Veröffentlichung, jedes einzelnen Patents oder jeder einzelnen Patentanmeldung ausdrücklich und einzeln angegeben wäre, dass sie durch Bezugnahme vollumfänglich aufgenommen ist. Im Falle eines Widerspruchs zwischen einem Ausdruck in der vorliegenden Schrift und einem Ausdruck in einer aufgenommenen Referenz ist der Ausdruck in der vorliegenden Schrift ausschlaggebend.
  • Figurenliste
  • Das Gebrauchsmuster oder Anmeldungsdossier enthält wenigstens eine in Farbe ausgeführte Zeichnung. Kopien dieses Gebrauchsmuster oder dieser Gebrauchsmusterveröffentlichung mit einer farbigen Zeichnung bzw. mit farbigen Zeichnungen werden auf Anfrage und nach Entrichtung der entsprechenden Gebühr durch das Amt zur Verfügung gestellt.
  • Die neuartigen Merkmale der Erfindung werden in den zugehörigen Ansprüchen im Einzelnen dargelegt. Die Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung erschließen sich besser bei Hinzunahme der folgenden detaillierten Beschreibung, die veranschaulichende Ausführungsformen darlegt, in denen die Grundsätze der Erfindung verwendet werden, und der zugehörigen Zeichnungen, für die gilt:
    • 1 stellt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der festen Träger mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, in welcher der Träger ein Glassubstrat und wechselnde Schichten aus hydrophilen Überzügen umfasst, die kovalent oder nichtkovalent an dem Glas haften, und der weiterhin chemisch reaktive funktionelle Gruppen umfasst, die als Anlagerungsstellen für Oligonukleotidprimer dienen.
    • 2 stellt eine schematische Darstellung der Verwendung einer Silanreaktion zum kovalenten Kuppeln eines ersten Polymers an eine Substratoberfläche (bspw. Glasoberfläche) bereit, um eine erste Polymerschicht zu schaffen.
    • 3 stellt eine schematische Darstellung der kovalenten Kupplung eines verzweigten Polymers an eine Oberfläche wie bspw. die in 2 dargestellte bereit, um eine zweite Polymerschicht auf einer Substratoberfläche auszubilden.
    • 4 stellt eine schematische Darstellung einer Kupplungsreaktion bereit, die zum kovalenten Anlagern einer oder mehrerer Oligonukleotidadaptor- oder -primersequenzen (z. B. Sequenz 1 (gepunktete Linie) und Sequenz 2 (gestrichelte Linie)) an ein verzweigtes Polymer verwendet wird.
    • 5 stellt eine schematische Darstellung der kovalenten Kupplung eines verzweigten Polymers, das kovalent angelagerte Oligonukleotidadaptor- oder -primersequenzen umfasst, an eine Oberfläche wie bspw. die in 3 dargestellte bereit, um eine dritte Polymerschicht auf einer Substratoberfläche auszubilden.
    • 6A-B stellen Beispiele für simulierte Fluoreszenzintensitätsdaten bereit, die den Unterschied zwischen dem Verwenden des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses (SNR) und Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisses (CNR) als Kennzahlen für qualitätsbezogene Daten in Anwendungen der Sequenzierung von Nukleinsäuren und Basenzuordnung darstellen. 6A: Beispiel für simulierte Daten, für die gilt: SNR = 2 und CNR = 1,25. 6B: Beispiel für simulierte Daten, für die gilt: SNR = 2 und CNR = 12,29.
    • 7 stellt ein Beispiel dafür bereit, wie sich ein verbessertes CNR auf die Bildgebungszeiten auswirkt, die für einen exakten Nachweis von und eine Signalklassifikation (Basenzuordnung) für klonal amplifizierte Nukleinsäurekolonien auf einem festen Träger erforderlich sind.
    • 8 stellt die verschiedenen Aufnahmen dar, die bei verschiedenen Zyklen einer Nukleinsäuresequenzierungsreaktion erlangt wurden, welche auf einem festen Träger vorgenommen wurde, und die auf die verschiedenen markierten Nukleotide zurückzuführen sind, welche im Falle jedes klonal amplifizierten Matrizenmoleküls in die komplementären Stränge eingebaut wurden. Die Figur stellt zudem die verschiedenen Hintergrundbeiträge am gesamten Detektionssignal im Falle von Detektionsplattformen dar, bei denen eine iterative Lichtfleckdetektion durch Unterscheiden eines nukleotidspezifischen Signals vom verrauschten interstitialen Hintergrund und intrastitialen Hintergrundaufnahmen erforderlich ist.
    • 9 stellt ein Beispiel für Bilddaten bereit, die aus einer Studie zum Bestimmen der relativen Grade der unspezifischen Bindung eines grün fluoreszierenden Farbstoffs an Glassubstratoberflächen stammen, welche gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden.
    • 10 stellt ein Beispiel für Bilddaten bereit, die aus einer Studie zum Bestimmen der relativen Grade der unspezifischen Bindung eines rot fluoreszierenden Farbstoffs an Glassubstratoberflächen, die gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden, stammen.
    • 11 stellt ein Beispiel für Daten aus einer Oligonukleotidprimer-Transplantation im Falle von Substratoberflächen bereit, die gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden.
    • 12 stellt Beispiele für Replikatbilder bereit, die während eines Tests zur unspezifischen Bindung an Substratoberflächen, welche gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden, erfasst wurden.
    • 13 stellt ein Beispiel für Daten zur unspezifischen Bindung eines Sequenzierungsfarbstoffgemischs an Substratoberflächen bereit, die gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden. Zum Vergleich beträgt die unter der gleichen Kombination an Versuchsbedingungen gemessene Fluoreszenzintensität zur unspezifischen Bindung des Sequenzierungsfarbstoffgemischs an ein einzelnes Kügelchen, das mithilfe von Cy3-markierten Oligonukleotiden transplantiert worden war, etwa 1.500 Zählungen.
    • 14 stellt ein Beispiel für Bilder und Daten zur unspezifischen Bindung eines grün und rot fluoreszierenden Farbstoffs an Substratoberflächen bereit, die gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden. Zum Vergleich beträgt die unter der gleichen Kombination an Versuchsbedingungen gemessene Fluoreszenzintensität einer klonal amplifizierten Matrizenkolonie nach dem Kuppeln einer einzelnen, mit Cy3 markierten Nukleotidbase etwa 1.500 Zählungen.
    • 15 stellt ein Beispiel für Bilder und Daten bereit, die eine „abstimmbare“ Nukleinsäureamplifikation an einem festen Träger mit geringer Bindung durch Variieren der Oligonukleotidprimerdichte auf dem Substrat demonstrieren. Blaues Histogramm: geringe Primerdichte. Rotes Histogramm: hohe Primerdichte. Die Kombination aus der geringen unspezifischen Bindung und der abstimmbaren Nukleinsäureamplifikationseffizienz durch Einstellen der Oligonukleotidprimerdichte ergibt hohe CNRs und daraus folgende Verbesserungen der Leistung der Nukleinsäuresequenzierung.
    • 16 stellt Beispiele für Fluoreszenzaufnahmen der festen Träger mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, auf denen angebundene Oligonukleotide unter Verwendung von verschiedenen Primerdichten, Verfahren der isothermen Amplifikation und Amplifikationspufferzusatzstoffen amplifiziert wurden.
    • 17 stellt Beispiele für Gelaufnahmen bereit, die eine Reduktion der unspezifischen Nukleinsäureamplifikation durch Verwendung von Amplifikationspufferzusatzstoffen bei gleichzeitiger Beibehaltung der spezifischen Amplifikation der Zielsequenz demonstrieren. Die Gelaufnahmen zeigen eine Bande auf, die der spezifischen Amplifikation an das Ziel (Pfeil) und anderen mittels Gels quantifizierten Amplifikationsprodukten entspricht.
    • 18 stellt Beispiele für Fluoreszenzaufnahmen bereit, welche die Auswirkung durch eine Formulierung ausgelöster Veränderungen zum Verbessern der Amplifikationsspezifität auf einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung demonstrieren.
    • 19A-B stellen nicht einschränkende Beispiele für Bilddaten bereit, welche die Verbesserungen der Hybridisierungsstringenz, -geschwindigkeit und -effizienz demonstrieren, die durch Neuformulierung des Hybridisierungspuffers, der zur Festphasen-Nukleinsäureamplifikation verwendet wird, wie vorliegend beschrieben, erreicht werden kann. 19A stellt Beispiele für Bilddaten im Falle zweier verschiedener Hybridisierungspufferformulierungen und -protokolle bereit. 19B stellt ein Beispiel für die entsprechenden Bilddaten bereit, die anhand eines standardmäßigen Hybridisierungspuffers und -protokolls erlangt wurden.
    • 20 stellt einen Arbeitsablauf zur Nukleinsäuresequenzierung unter Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung und Amplifikationsreaktionsformulierungen der vorliegenden Offenbarung und nicht einschränkende Beispiele für die Verarbeitungszeiten, die erreicht werden können, dar.
    • 21 stellt ein Beispiel für eine Fluoreszenzaufnahme und Fluoreszenzintensitätsdaten bezüglich eines Trägers mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, an dem eine Festphasen-Nukleinsäureamplifikation vorgenommen wurde, um klonal amplifizierte Cluster einer als Matrize dienenden Oligonukleotidsequenz zu schaffen.
    • 22 stellt ein zweites Beispiel für eine Fluoreszenzaufnahme und Fluoreszenzintensitätsdaten bezüglich eines Trägers mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, an dem eine Festphasen-Nukleinsäureamplifikation vorgenommen wurde, um klonal amplifizierte Cluster einer als Matrize dienenden Oligonukleotidsequenz zu schaffen.
    • 23 stellt ein Beispiel für eine Fluoreszenzaufnahme und Fluoreszenzintensitätsdaten bezüglich eines Trägers mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, an dem eine Festphasen-Nukleinsäureamplifikation vorgenommen wurde, um klonal amplifizierte Cluster einer als Matrize dienenden Oligonukleotidsequenz zu schaffen.
    • 24 stellt Beispiele für eine Fluoreszenz-Eichkurve bereit, die zum Schätzen der Oberflächendichte von an eine Trägeroberfläche angebundenen Primeroligonukleotiden verwendet wird.
    • 25A-B stellen nicht einschränkende Beispiele für modifizierte Glas- und Polymeroberflächen der vorliegenden Offenbarung bereit, die gebundene Amplicons aufweisen, welche fluoreszierend markierte Nukleotide umfassen. 25A: modifizierte Glasoberfläche. An den eingefügten Daten lässt sich ablesen, dass die Oberfläche ein CNR von 226 ergibt. 25B: modifizierte Kunststoffoberfläche. An den eingefügten Daten lässt sich ablesen, dass die Oberfläche ein CNR von 109 ergibt.
    • 26A-B stellen eine Analyse der Bilder in 25A und 25B bereit. In 26A sind links die Signalintensität und rechts die Hintergrundintensität jeweils in Bezug auf die Glas- und Kunststoffoberfläche zu sehen. Die Signalintensität ist jeweils im Wesentlichen höher als die Hintergrundintensität. In 26B ist die grafische Darstellung von CNR-Werten jeweils in Bezug auf die Glas- und Kunststoffoberfläche zu sehen. Das Glas, links, ergibt ein CNR von 226, wohingegen Kunststoff, rechts, ein CNR von 109 ergibt, was mit den eingefügten Daten in 25A und 25B übereinstimmt.
    • 27 stellt eine Analyse von Oberflächen in Bezug auf die Exaktheit ihrer Daten bereit. Die Daten wurden in zwei Kanälen erhoben und im Streudiagramm (oben) und in quantifizierter Form (unten) abgebildet, was bei jeder von einer gewerblich erhältlichen Oberfläche mit niedrigem CNR und hohem CNR, von links nach rechts, erfolgte.
    • 28 stellt eine schematische Darstellung einer Sequenz eines multimeren Zieloligonukleotids bereit, hybridisiert an eine Oberfläche, die eine hohe Oberflächendichte an Oligonukleotidadaptor- oder -primermolekülen aufweist (links), und an eine Oberfläche, welche eine geringere Oberflächendichte an Oligonukleotidadaptor- oder -primermolekülen aufweist (rechts).
    • 29 stellt einen Vergleich der Versuchsergebnisse bzgl. des Vornehmens einer traditionellen Hybridisierungsreaktion auf einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung und bzgl. des Vornehmens einer optimierten Hybridisierungsreaktion auf der Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit.
    • 30 stellt eine Darstellung des Versuchsergebnisses bzgl. des Vornehmens einer traditionellen Hybridisierungsreaktion auf einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung, gefolgt vom Vornehmen einer RCA oder Brückenamplifikation, bereit.
    • 31 stellt eine Darstellung des Versuchsergebnisses bzgl. des Vornehmens einer traditionellen Hybridisierungsreaktion auf einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung, gefolgt vom Vornehmen einer RCA oder Brückenamplifikation, bereit.
    • 32 stellt eine Darstellung des Versuchsergebnisses bzgl. des Vornehmens einer traditionellen Hybridisierungsreaktion an einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung, die unter Verwendung verbesserter Kupplungschemie zum Anlagern von Oligonukleotidadaptor- oder -primermolekülen an die Oberfläche, gefolgt vom Vornehmen einer RCA oder Brückenamplifikation, bereit.
    • 33 stellt nicht einschränkende Beispiele für Fluoreszenzaufnahmen einer traditionellen Trägeroberfläche und einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung, an die Zieloligonukleotide hybridisiert und amplifiziert worden sind, bereit. Das Diagramm stellt die Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisse dar, die auf Aufnahmen gemessen wurden, wie bspw. jenen, die in den Beispielen im Falle einer Polyacrylamidoberfläche mit Brückenamplifikationsprotokoll, eines Trägers mit geringer Bindung mit standardmäßigem Brückenamplifikationsprotokoll und einer Primerdichte von < 1000 Oligonukleotiden/µm2 und einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung in Kombination mit einem verbesserten Verfahren der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation auf einer Oberfläche mit einer Primerdichte von > 1000 Oligonukleotiden/µm2 bereitgestellt sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • In der vorliegenden Schrift sind neuartige feste Träger zur Verwendung bei der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation und -sequenzierung oder in anderen Anwendungen von Bioassays offenbart. Die vorliegend offenbarten festen Träger weisen eine geringe unspezifische Bindung von Proteinen und anderen Amplifikationsreaktionskomponenten sowie eine verbesserte Stabilität bei wiederholter Exposition gegenüber verschiedenen Lösungsmitteln, Temperaturänderungen, chemischen Provokationen wie bspw. einem niedrigen pH-Wert oder bei langfristiger Lagerung auf.
  • Einige vorliegend offenbarte Träger führen allein oder in Kombination mit verbesserten Protokollen zur Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation zu einem oder mehreren von: (i) verringerte Erfordernisse der Menge des benötigten Ausgangsmaterials, (ii) geringere Temperaturerfordernisse für Protokolle der isothermen Amplifikation oder Amplifikation mit stufenweiser Temperaturänderung, (iii) erhöhte Amplifikationsraten, (iv) erhöhte Amplifikationsspezifität (sprich, selektivere Amplifikation der einzelsträngigen Matrizenmoleküle der amplifizierten Kolonien bei gleichzeitiger Verringerung der unspezifischen Amplifikation von Oberflächenprimern und Primer-Dimeren) und (v) Ermöglichen einer besseren Unterscheidung eines sequenzspezifischen Signals von Hintergrundsignalen (wie bspw. von Signalen, die sowohl auf den interstitialen als auch intrastitialen Hintergrund zurückzuführen sind), wodurch ein verbessertes Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) und eine verbesserte Exaktheit der Basenzuordnung im Vergleich zu herkömmlichen Methodiken der Nukleinsäurehybridisierung und -sequenzierung bereitgestellt werden.
  • Den Ausgangspunkt zum Erreichen der vorgenannten Verbesserungen oder einer beliebigen Kombination daraus bilden die offenbarten Träger mit geringer unspezifischer Bindung, die einen oder mehrere Polymerüberzüge, z. B. PEG-Polymerfilme, umfassen, welche die unspezifische Bindung von Protein und markierten Nukleotiden an den festen Träger minimieren. Die darauffolgende Demonstration der verbesserten Nukleinsäurehybridisierungs- und - amplifikationsraten und -spezifität kann durch einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Aspekte der vorliegenden Offenbarung erreicht werden: (i) Primergestaltung (Sequenz und/oder Modifikationen), (ii) Kontrolle der Dichte der angebundenen Primer auf dem festen Träger, (iii) die Oberflächenzusammensetzung des festen Trägers, (vi) die Oberflächenpolymerdichte des festen Trägers, (v) die Verwendung verbesserter Hybridisierungsbedingungen vor und während der Amplifikation und/oder (vi) die Verwendung verbesserter Amplifikationsformulierungen, welche die unspezifische Primeramplifikation verringern oder die Matrizenamplifikationseffizienz erhöhen.
  • Die Vorteile der offenbarten Träger mit geringer unspezifischer Bindung und die damit verbundenen Hybridisierungs- und Amplifikationsverfahren verschaffen einen oder mehrere der folgenden zusätzlichen Vorteile für ein beliebiges Sequenzierungssystem: (i) verkürzte Fluidwaschzeiten (aufgrund der reduzierten unspezifischen Bindung und damit kürzeren Sequenzierungszykluszeiten), (ii) verkürzte Bildgebungszeiten (und damit kürzere Umschlagszeiten für Assay-Auslesung und Sequenzierungszeiten), (iii) verringerte Erfordernisse der Arbeitsablaufzeit insgesamt (aufgrund der kürzeren Zykluszeiten), (iv) verringerte Kosten für Nachweisinstrumente (wegen der Verbesserungen des CNR), (v) verbesserte Exaktheit der Auslesung (Basenzuordnung) (wegen der Verbesserungen des CNR), (vi) verbesserte Reagensstabilität und verringerte Erfordernisse des Reagensgebrauchs (und damit reduzierte Kosten für Reagenzien) und (vii) weniger Laufzeitausfälle wegen mangelhafter Nukleinsäureamplifikation.
  • Die hydrophilen Oberflächen mit geringer Bindung (Mehrfachschicht und/oder Monoschicht) für Oberflächen-Bioassays, z. B. Genotypisierung und Sequenzierungsassays werden mithilfe einer beliebigen Kombination der Folgenden geschaffen.
  • Protisch-polare, aprotisch-polare und/oder unpolare Lösungsmittel zum Ablagern und/oder Kuppeln linearer oder mehrfach verzweigter hydrophiler Polymeruntereinheiten auf einer Substratoberfläche. Manche mehrfach verzweigte hydrophile Polymeruntereinheiten können funktionelle Endgruppen zum Fördern der kovalenten Kupplung oder von nichtkovalenten Bindungsinteraktionen mit anderen Polymeruntereinheiten enthalten. Beispiele für geeignete funktionelle Endgruppen sind u. a. Biotin-, Methoxyether-, Carboxylat-, Amin-, Esterverbindungen, Azid-, Alkin-, Maleimid-, Thiol- und Silangruppen.
  • Eine jede Kombination aus linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymeruntereinheiten, gekuppelt durch aufeinanderfolgendes geschichtetes Hinzufügen mittels modifizierter Kupplungschemie-/Lösungsmittel-/Puffersysteme, die einzelne Untereinheiten mit Kupplungschemie für orthogonale Enden beinhalten kann oder eine beliebige der jeweiligen Kombinationen, sodass die daraus entstehende Oberfläche hydrophil ist und eine geringe unspezifische Bindung von Proteinen und anderen Komponenten von Assays auf molekularer Basis aufweist. In einigen Fällen weisen die hydrophilen, funktionalisierten Substratoberflächen der vorliegenden Offenbarung gemessene Kontaktwinkel auf, die 35 Grad nicht überschreiten.
  • Kompatible Puffersysteme zusätzlich zu den vorgenannten Lösungsmitteln, mit einem wünschenswerten pH-Bereich von 5-10. Beispiele sind u. a. phosphatgepufferte Salzlösung, Phosphatpuffer, TAPS, MES, MOPS oder eine beliebige Kombination aus diesen.
  • Nachfolgende Anlagerung von Biomolekülen (z. B. Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden oder Zellen) an die hydrophilen Substrate/Substrate mit geringer Bindung mittels beliebiger von vielen verschiedenen einzelnen Konjugationschemien, die weiter unten beschrieben werden oder einer Kombination daraus. Schichtablagerungs- und/oder Konjugationsreaktionen können unter Verwendung von Lösungsmittelgemischen vorgenommen werden, die ein beliebiges Verhältnis der folgenden Komponenten enthalten: Ethanol, Methanol, Acetonitril, Aceton, DMSO, DMF, H2O und dergleichen. Zusätzlich dazu können kompatible Puffersysteme im wünschenswerten pH-Bereich von 5-10 zum Kontrollieren der Rate und Effizienz der Ablagerung und Kupplung verwendet werden, wodurch sich Kupplungsraten von > 5x im Vergleich zu jenen herkömmlicher Verfahren, die auf wässrigem Puffer beruhen, erreichen lassen.
  • Begriffsbestimmungen: Sämtliche in der vorliegenden Schrift verwendeten Fachausdrücke besitzen die Bedeutung nach Auffassung des Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet, dem diese Offenbarung zuzuordnen ist, es sei denn, es ist etwas anderes definiert.
  • Im in dieser Beschreibung und den zugehörigen Ansprüchen verwendeten Sinne schließen die Singularformen „ein“, „eine“ und „der/die/das“ die entsprechenden Begriffe im Plural ein, es sei denn, der Kontext gibt eindeutig etwas anderes vor. Eine jede Bezugnahme auf „oder“ in der vorliegenden Schrift ist so gemeint, dass sie „und/oder“ einschließt, es sei denn, es ist etwas anderes angegeben.
  • Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck „etwa“ eine Zahl auf eben diese Zahl plus oder minus 10 % dieser Zahl. Wenn er im Zusammenhang mit einem Bereich verwendet wird, so bezieht sich der Ausdruck „etwa“ auf diesen Bereich minus 10 % von dessen niedrigstem Wert und plus 10 % von dessen höchstem Wert.
  • Im vorliegenden Zusammenhang umfängt der Ausdruck „wenigstens eines von“ im Zusammenhang von Reihen Auflistungen, die ein einzelnes Mitglied der Reihe, zwei Mitglieder der Reihe, bis zu und einschließlich aller Mitglieder der Reihe, für sich oder in einigen Fällen in Kombination mit nicht aufgelisteten Komponenten einschließen.
  • Im vorliegenden Zusammenhang ist eine Fluoreszenz „spezifisch“, wenn sie durch Fluorophore entsteht, die an die Oberfläche annealt oder anderweitig angebunden worden sind, bspw. durch eine Nukleinsäure mit einer Region umgekehrter Komplementarität für ein entsprechendes Segment eines Oligos auf der Oberfläche, und die an das entsprechende Segment annealt ist. Diese Fluoreszenz steht im Gegensatz zu jener Fluoreszenz, die durch Fluorophore entsteht, welche nicht durch einen solchen Annealingprozess an die Oberfläche angebunden sind; oder, in einigen Fällen, zur Hintergrundfluoreszenz der Oberfläche.
  • Nukleinsäuren: Im hier verwendeten Sinne ist eine „Nukleinsäure“ (auch als „Polynukleotid“, „Oligonukleotid“, Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) bezeichnet) ein lineares Polymer aus zwei oder mehr Nukleotiden, die durch kovalente Internucleosid-Bindungen aneinandergefügt sind, oder Varianten oder funktionelle Fragmente davon. Bei Beispielen natürlich vorkommender Nukleinsäuren handelt es sich bei der Internucleosid-Bindung typischerweise um eine Phosphodiesterbindung. Andere Beispiele dagegen umfassen optional andere Internucleosid-Bindungen wie bspw. Phosphorothiolatbindungen und können eine Phosphatgruppe umfassen oder nicht. Nukleinsäuren schließen doppel- und einzelsträngige DNA wie auch doppel- und einzelsträngige RNA, DNA/RNA-Hybride, Peptid-Nukleinsäuren (PNAs), Hybride aus PNAs und DNA oder RNA ein und können auch andere Arten von Nukleinsäuremodifikationen einschließen.
  • Im vorliegenden Zusammenhang wird mit „Nukleotid“ ein Nukleotid, Nukleosid oder Analogon davon bezeichnet. In einigen Fällen ist das Nukleotid ein N- oder C-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase (bspw. ein Desoxyribonukleosid, das 2-Desoxy-D-ribose enthält oder ein Ribonukleosid, das D-Ribose enthält). Beispiele für Nukleotidanaloga sind u. a. Phosphorthioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, Chiral-Methylphosphonate, 2-O-Methyl-ribonukleotide und dergleichen.
  • Nukleinsäuren können optional an einen oder mehrere Molekülteile, die keine Nukleotide sind, bspw. Markierungen und andere kleine Moleküle, große Moleküle (wie bspw. Proteine, Lipide, Zucker usw.) und feste oder halbfeste Träger angelagert werden, zum Beispiel durch kovalente oder nichtkovalente Verknüpfungen entweder mit dem 5'- oder 3'-Ende der Nukleinsäure. Markierungen schließen ein jedes Molekülteil ein, das anhand einer beliebigen von vielen verschiedenen Nachweismitteln, die Fachleuten bekannt sind, nachweisbar ist, wodurch sie das angelagerte Oligonukleotid oder die angelagerte Nukleinsäure gleichermaßen nachweisbar machen. Manche Markierungen emittieren elektromagnetische Strahlung, die optisch nachweisbar oder sichtbar ist. Alternativ oder damit kombiniert umfassen manche Markierungen einen Massenmarker, der das markierte Oligonukleotid oder die markierte Nukleinsäure in Massenspektrumdaten sichtbar macht, oder einen Redoxmarker, der das markierte Oligonukleotid oder die markierte Nukleinsäure mittels Amperometrie oder Voltammetrie nachweisbar macht. Manche Markierungen umfassen einen magnetischen Marker, der die Abscheidung und/oder Reinigung des markierten Oligonukleotids oder der markierten Nukleinsäure ermöglicht. Das Nukleotid oder Polynukleotid ist oftmals nicht an eine Markierung angelagert, und das Vorhandensein des Oligonukleotids oder der Nukleinsäure wird direkt nachgewiesen.
  • Die offenbarten Träger mit geringer unspezifischer Bindung und damit verbundene Verfahren der Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation können zur Analyse von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, die von einem beliebigen einer Vielfalt an verschiedenen Zell-, Gewebe- oder Probenarten, die Fachleuten bekannt sind, stammen. So können Nukleinsäuren beispielsweise aus Zellen oder Gewebeproben extrahiert werden, die eine oder mehrere Zellenarten umfassen, welche von Eukaryoten (wie bspw. Tiere, Pflanzen, Pilze, Protista), Archaebakterien oder Eubakterien stammen. In einigen Fällen können Nukleinsäuren aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen wie bspw. adhärierenden oder nicht adhärierenden eukaryotischen Zellen extrahiert werden. Nukleinsäuren werden verschiedentlich extrahiert, beispielsweise aus primären oder immortalisierten Zelllinien von Nagetieren, Schweinen, Katzen, Hunden, Rindern, Pferden, Primaten oder Menschen. Nukleinsäuren können aus einer beliebigen von einer Vielfalt an verschiedenen Zell-, Organ- oder Gewebearten extrahiert werden (z. B. Leukozyten, Erythrozyten, Blutplättchen, Epithelzellen, Endothelzellen, Neuronen, Gliazellen, Astrozyten, Fibroblasten, Skelettmuskelzellen, Zellen der glatten Muskulatur, Keimzellen oder Zellen aus Herz, Lunge, Hirn, Leber, Nieren, Milz, Bauchspeicheldrüse, Thymus, Blase, Magen, Kolon oder Dünndarm).
  • Nukleinsäuren können aus normalen oder gesunden Zellen extrahiert werden. Alternativ oder damit kombiniert werden Säuren aus erkrankten Zellen extrahiert, bspw. aus kanzerösen Zellen oder aus pathogenen Zellen, die einen Wirt infizieren. Einige Nukleinsäuren können aus einer speziellen Unterart von Zelltypen extrahiert werden, z. B. Immunzellen (wie bspw. T-Zellen, zytotoxischen T-Zellen (T-Killerzellen), T-Helferzellen, alpha/beta-T-Zellen, gamma/delta-T-Zellen, T-Zell-Vorläufer, B-Zellen, B-Zell-Vorläufer, lymphoiden Stammzellen, myeloiden Vorläuferzellen, Lymphozyten, Granulozyten, natürlichen Killerzellen, Plasmazellen, Gedächtniszellen, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen, Mastzellen, Monozyten, dendritischen Zellen und/oder Makrophagen oder einer beliebigen Kombination daraus), undifferenzierten menschlichen Stammzellen, menschlichen Stammzellen, die zur Differenzierung induziert worden sind, seltenen Zellen (z. B. zirkulierenden Tumorzellen (CTCs), zirkulierenden Epithelzellen, zirkulierenden Endothelzellen, zirkulierenden endometrialen Zellen, Knochenmarkszellen, Vorläuferzellen, Schaumzellen, mesenchymalen Zellen oder Trophoblasten). Andere Zellen werden in Erwägung gezogen und stehen mit der vorliegenden Offenbarung im Einklang.
  • Die Nukleinsäureextraktion aus Zellen oder anderen biologischen Proben kann anhand beliebiger von mehreren Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, vorgenommen werden. Eine typische Prozedur der DNA-Extraktion umfasst beispielsweise: (i) Entnahme der Zellprobe oder Gewebeprobe, aus der DNA extrahiert werden soll, (ii) Aufschluss von Zellmembranen (d. h. Zelllyse), damit DNA und andere cytoplasmatische Komponenten freigegeben werden, (iii) Behandlung der lysierten Probe mit einer konzentrierten Salzlösung, um Proteine, Lipide und RNA auszufällen, gefolgt von einer Zentrifugierung, um die ausgefällten Proteine, Lipide und RNA herauszutrennen, und (iv) Herausreinigen von DNA aus dem Überstand, um Detergenzien, Proteine, Salze oder andere Reagenzien, die während des Schritts der Zellmembranlyse verwendet wurden, zu beseitigen.
  • Eine Vielfalt an geeigneten gewerblichen Kits zur Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure steht mit der vorliegenden Offenbarung im Einklang. Beispiele sind u. a. die QIAamp Kits (zur Isolation genomischer DNA aus menschlichen Proben) und DNAeasy Kits (zur Isolation genomischer DNA aus tierischen oder pflanzlichen Proben) von Qiagen (Germantown, MD, USA) oder die Kits-Reihe Maxwell® und ReliaPrep™ von Promega (Madison, WI, USA).
  • Träger mit geringer unspezifischer Bindung zur Festphasen-Nukleinsäurehybridisierung und - amplifikation: Vorliegend sind feste Träger offenbart, die Oberflächenzusammensetzungen mit geringer unspezifischer Bindung umfassen, welche eine verbesserte Leistung der Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation ermöglichen. Im Allgemeinen können die offenbarten Träger ein Substrat (oder eine Trägerstruktur), eine oder mehrere Lagen von kovalent oder nichtkovalent angelagerten Schichten mit chemischer Modifikation und geringer Bindung, z. B. Silanschichten, Polymerfilme, und eine oder mehrere kovalent oder nichtkovalent angelagerte Primersequenzen, die zum Anbinden einzelsträngiger Matrizenoligonukleotide an die Trägeroberfläche verwendet werden können (1), umfassen. In einigen Fällen können die Formulierung der Oberfläche, z. B. die chemische Zusammensetzung einer oder mehrerer Schichten, die Kupplungschemie, die zum Vernetzen der einen oder mehreren Schichten mit der Trägeroberfläche und/oder miteinander verwendet wird, und die Gesamtanzahl der Schichten variiert werden, sodass die unspezifische Bindung von Proteinen, Nukleinsäuremolekülen und anderen Hybridisierungs- und Amplifikationsreaktionskomponenten an die Trägeroberfläche in Bezug auf eine vergleichbare Monoschicht minimiert oder reduziert ist. Die Formulierung der Oberfläche kann oftmals variiert werden, sodass die unspezifische Hybridisierung auf der Trägeroberfläche im Verhältnis zu einer vergleichbaren Monoschicht minimiert oder reduziert wird. Die Formulierung der Oberfläche kann variiert werden, sodass die unspezifische Amplifikation auf der Trägeroberfläche im Verhältnis zu einer vergleichbaren Monoschicht minimiert oder reduziert wird. Die Formulierung der Oberfläche kann variiert werden, sodass spezifische Amplifikationsraten und/oder -ausbeuten auf der Trägeroberfläche maximiert werden. Amplifikationswerte, die zum Nachweis geeignet sind, werden in nicht mehr als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 oder mehr als 30 Amplifikationszyklen, in einigen Fällen, wie vorliegend offenbart, erreicht.
  • Beispiele für Materialien, aus denen das Substrat oder die Trägerstruktur hergestellt werden kann, sind u. a. Glas, Quarzglas, Silicium oder ein Polymer (z. B. Polystyrol (PS), makroporöses Polystyrol (MPPS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polypropylen (PP), Polyethylen (PE), Polyethylen hoher Dichte (HDPE), cyclische Olefinpolymere (COP), cyclische Olefincopolymere (COC), Polyethylenterephthalat (PET)) oder eine jede Kombination daraus. Es werden unterschiedliche Zusammensetzungen sowohl von Glas- als auch Kunststoffsubstraten in Erwägung gezogen.
  • Das Substrat oder die Trägerstruktur kann in einer beliebigen von einer Vielfalt an Geometrien und Abmessungen gestaltet werden, die Fachleuten bekannt sind, und ein beliebiges von einer Vielfalt an Materialien, die Fachleuten bekannt sind, umfassen. In einigen Fällen kann das Substrat oder die Trägerstruktur zum Beispiel stellenweise planar sein (z. B. einen Objektträger oder die Oberfläche eines Objektträgers umfassen). Insgesamt kann das Substrat oder die Trägerstruktur zylindrisch sein (bspw. eine Kapillare oder die Innenfläche einer Kapillare umfassen), sphärisch sein (bspw. die Außenfläche eines nicht porösen Kügelchens umfassen) oder unregelmäßig sein (bspw. die Außenfläche eines unregelmäßig geformten, nicht porösen Kügelchens oder Partikels umfassen). In einigen Fällen kann die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur, die zur Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation verwendet wird, eine feste, nicht poröse Fläche sein. In einigen Fällen kann die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur, die zur Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation verwendet wird, porös sein, sodass die vorliegend beschriebenen Bezüge in die poröse Oberfläche eindringen und die dort vorgenommenen Reaktionen der Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation in den Poren stattfinden kann.
  • Das Substrat oder die Trägerstruktur, das bzw. die die eine oder mehreren chemisch modifizierten Schichten, z. B. Schichten aus einem Polymer mit geringer unspezifischer Bindung, umfasst, kann unabhängig oder in eine andere Struktur oder Anordnung integriert sein. Beispielsweise kann das Substrat oder die Trägerstruktur in einigen Fällen eine oder mehrere Oberflächen in einer integrierten oder zusammengebauten mikrofluidischen Durchflusszelle umfassen. Das Substrat oder die Trägerstruktur kann eine oder mehrere Oberflächen in einem Mikrotiterplattenformat, z. B. der Bodenfläche der Näpfchen in einer Mikrotiterplatte, umfassen. Wie oben vermerkt, kann das Substrat oder die Trägerstruktur in einigen bevorzugten Ausführungsformen die Innenfläche (wie bspw. die Lumenfläche) einer Kapillare umfassen. In alternativen bevorzugten Ausführungsformen kann das Substrat oder die Trägerstruktur die Innenfläche (wie bspw. die Lumenfläche) einer Kapillare umfassen, die in einen planaren Chip geätzt ist.
  • Die chemische Modifikationen aufweisenden Schichten können gleichmäßig auf die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur aufgebracht werden. Alternativ kann die Oberfläche des Substrats oder der Trägerstruktur ungleichmäßig verteilt oder gemustert sein, sodass die chemische Modifikationen aufweisenden Schichten auf eine oder mehrere separate Regionen des Substrats eingegrenzt sind. Die Substratoberfläche kann zum Beispiel unter Verwendung photolithographischer Techniken gemustert werden, um eine geordnete Anordnung oder ein zufälliges Muster chemisch modifizierter Regionen auf der Oberfläche zu schaffen. Alternativ oder damit kombiniert kann die Substratoberfläche bspw. unter Verwendung von Kontaktbelichtungs- und/oder Tintenstrahldruckverfahren gemustert werden. In einigen Fällen kann eine geordnete Anordnung oder ein zufälliges Muster chemisch modifizierter separater Regionen mindestens 1,5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 oder 10.000 oder mehr separate Regionen oder eine beliebige Zahl innerhalb dieser Wertespanne umfassen.
  • Um Oberflächen mit geringer unspezifischer Bindung (vorliegend auch als Oberflächen „mit geringer Bindung“ oder „passivierte“ Oberflächen bezeichnet) zu erlangen, können hydrophile Polymere auf das Substrat oder die Trägeroberfläche unspezifisch adsorbiert oder kovalent transplantiert werden. Die Passivierung erfolgt typischerweise unter Verwendung von Poly(ethylenglycol) (PEG, auch Polyethylenoxid (PEO) oder Polyoxyethylen genannt), Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(acrylsäure) (PAA), Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(methylmethacrylat) (PMA), Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglycol)methylethermethacrylat) (POEGMA), Polyglutaminsäure (PGA), Polylysin, Polyglucosid, Streptavidin, Dextran oder anderen hydrophilen Polymeren mit unterschiedlichen Molekülmassen und Endgruppen, die beispielsweise mittels Silanchemie an eine Oberfläche gebunden werden. Bei den von der Oberfläche entfernt liegenden Endgruppen kann es sich u. a. um Biotin, Methoxyether, Carboxylat, Amin, NHS-Ester, Maleimid und bis-Silan handeln. In einigen Fällen können zwei oder mehr Schichten eines hydrophilen Polymers, z. B. eines linearen Polymers, verzweigten Polymers oder mehrfach verzweigten Polymers, auf die Oberfläche abgelagert werden. In einigen Fällen können zwei oder mehr Schichten kovalent aneinander gekuppelt oder intern vernetzt werden, um die Stabilität der resultierenden Oberfläche zu verbessern. In einigen Fällen können Oligonukleotidprimer mit verschiedenen Basensequenzen und Basenmodifikationen (oder andere Biomoleküle, z. B. Enzyme oder Antikörper) mit unterschiedlichen Oberflächendichten an die resultierende Oberflächenschicht angebunden werden. In einigen Fällen können zum Beispiel sowohl die Dichte der funktionellen Gruppen an der Oberfläche als auch die Oligonukleotidkonzentration variiert werden, um einen bestimmten Bereich der Primerdichte zu erzielen. Des Weiteren kann die Primerdichte durch Verdünnen eines Oligonukleotids mit anderen Molekülen, welche die gleiche funktionelle Gruppe tragen, kontrolliert werden. So kann zum Beispiel ein mit Amin markiertes Oligonukleotid mit aminmarkiertem Polyethylenglycol verdünnt werden; dies erfolgt in einer Reaktion mit einer mit NHS-Ester überzogenen Oberfläche, um die finale Primerdichte zu reduzieren. Primer mit unterschiedlichen Verbindungsstücklängen zwischen der Hybridisierungsregion und der funktionellen Oberflächenanlagerungsgruppe können ebenfalls angewendet werden, um die Oberflächendichte zu kontrollieren. Beispiele für geeignete Verbindungsstücke sind u. a. Poly-T- und Poly-A-Stränge am 5'-Ende des Primers (bspw. 0 bis 20 Basen), PEG-Verbindungsstücke (bspw. 3 bis 20 Monomereinheiten) und eine Kohlenstoffkette (bspw. C6, C12, C18 usw.). Zum Messen der Primerdichte können fluoreszierend markierte Primer an die Oberfläche angebunden und eine Fluoreszenzablesung anschließend mit jener einer Farbstofflösung bekannter Konzentration verglichen werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann das hydrophile Polymer ein vernetztes Polymer sein. In einigen Ausführungsformen kann das vernetzte Polymer einen Polymertyp umfangen, der mit einem anderen Polymertyp vernetzt ist. Beispiele für das vernetzte Polymer können u. a. sein: Poly(ethylenglycol), vernetzt mit einem anderen Polymer, ausgewählt unter Polyethylenoxid (PEO) oder Polyoxyethylen, Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(acrylsäure) (PAA), Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(methylmethacrylat) (PMA), Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglycol)methylethermethacrylat) (POEGMA), Polyglutaminsäure (PGA), Polylysin, Polyglucosid, Streptavidin, Dextran oder andere hydrophile Polymere. In einigen Ausführungsformen kann es sich bei dem vernetzten Polymer um ein mit Polyacrylamid vernetztes Poly(ethylenglycol) handeln.
  • Infolge der vorliegend offenbarten Verfahren der Oberflächenpassivierung „kleben“ Proteine, Nukleinsäuren und andere Biomoleküle nicht an den Substraten, das heißt, sie weisen eine geringe unspezifische Bildung (nonspecific binding, NSB) auf. Nachfolgend sind Beispiele gezeigt, für die standardmäßige Monoschichtoberflächenpräparationen mit variierenden Glaspräparationsbedingungen verwendet werden. Für hydrophile Oberflächen, die passiviert wurden, um eine ultrageringe NSB für Proteine und Nukleinsäuren zu erreichen, sind neuartige Reaktionsbedingungen erforderlich, um die Reaktionseffizienzen für die Primerablagerung und Hybridisierungsleistung zu verbessern und eine effektive Amplifikation zu induzieren. Bei all diesen Prozessen sind eine Oligonukleotidanlagerung und darauffolgende Proteinbindung und - abgabe an eine Oberfläche mit geringer Bindung erforderlich. Wie nachfolgend beschrieben, ergab die Kombination aus einer neuen Formulierung zur Primeroberflächenkonjugation (Cy3-Oligonukleotidtransplantationstitrierung) und dem daraus resultierenden ultrageringen unspezifischen Hintergrund (die Funktionstests zur NSB wurden anhand von rot und grün fluoreszierendem Farbstoff durchgeführt) Ergebnisse, welche die Brauchbarkeit der offenbarten Herangehensweisen demonstrieren. Einige vorliegend offenbarte Oberflächen weisen ein Verhältnis von spezifischer (z. B. Hybridisierung eines angebundenen Primers oder einer angebundenen Sonde) zu unspezifischer Bindung (z. B. Binter) eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 50:1, 75:1, 100:1 oder über 100:1 oder einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs auf. Einige vorliegend offenbarte Oberflächen zeigen ein Verhältnis von spezifischem zu unspezifischem Fluoreszenzsignal (bspw. für spezifisch hybridisierte zu unspezifisch gebundenen Oligonukleotiden oder für spezifisch amplifizierte zu unspezifisch gebundenen (Binter) oder unspezifisch amplifizierten (Bintra) markierten Oligonukleotiden oder eine Kombination daraus (Binter + Bintra)) im Falle eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 50:1, 75:1, 100:1 oder über 100:1 oder einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs.
  • Um die Primeroberflächendichte zu skalieren und hydrophilen oder amphoteren Oberflächen eine zusätzliche Dimensionalität zu verleihen, wurden Substrate entwickelt, die mehrschichtige Überzüge aus PEG und anderen hydrophilen Polymeren umfassen. Durch das Verwenden von Herangehensweisen der Schichtenbildung von hydrophilen und amphoteren Oberflächen, die u. a. die nachbeschriebenen Polymer/Copolymermaterialien beinhalten, ist es möglich, die Dichte der Primerbeladung auf der Oberfläche beträchtlich zu erhöhen. Bei traditionellen Herangehensweisen für PEG-Überzüge wird die monoschichtige Primerablagerung verwendet; davon wurde allgemein im Falle von Einzelmolekülanwendungen berichtet, sie ergeben jedoch keine hohen Kopienzahlen bei Anwendungen der Nukleinsäureamplifikation. Wie vorliegend beschrieben, kann eine „Schichtenbildung“ mithilfe traditioneller Vernetzungsherangehensweisen mit beliebigen kompatiblen Polymer- oder Monomeruntereinheiten bewerkstelligt werden, sodass eine Oberfläche, die zwei oder mehr stark vernetzte Schichten umfasst, sequenziell gebildet werden kann. Beispiele für geeignete Polymere sind u. a. Streptavidin, Polyacrylamid, Polyester, Dextran, Polylysin und Copolymere von Polylysin und PEG. In einigen Fällen können die verschiedenen Schichten durch eine beliebige von einer Vielfalt an Konjugationsreaktionen aneinander angebracht werden, darunter Biotin-Streptavidin-Bindung, Azid-Alkin-Click-Reaktion, Amin-NHS-Ester-Reaktion, Thiol-Maleimid-Reaktion und ionische Wechselwirkungen zwischen positiv geladenem Polymer und negative geladenem Polymer. In einigen Fällen können Materialien mit hoher Primerdichte in einer Lösung gebildet und anschließend in mehreren Schritten auf die Oberfläche geschichtet werden.
  • 2 stellt eine schematische Darstellung eines nicht einschränkenden Beispiels des Transplantierens einer ersten hydrophilen Polymerschicht auf ein Substrat, z. B. ein Glassubstrat, dar. Nach dem Reinigen der Glasoberfläche mithilfe eines beliebigen von einer Vielfalt an Verfahren, die Fachleuten bekannt sind (z. B. Behandlung mit einer Piranha-Lösung, Plasmareinigung usw.) wird das Substrat mit einer Silanlösung (z. B. einer Silan-PEG-Lösung, 5 K) behandelt, gespült, getrocknet und bei einer erhöhten Temperatur ausgehärtet, um eine kovalente Bindung mit der Oberfläche zu bilden. Das von der Oberfläche entfernt liegende Ende des Polymers kann eine beliebige von einer Vielfalt an chemisch reaktionsfähigen funktionellen Gruppen oder geschützten funktionellen Gruppen umfassen. Eine aminreaktive NHS-Gruppe ist in 2 dargestellt.
  • 3 zeigt eine schematische Darstellung eines nicht einschränkenden Beispiels für das Kuppeln eines derivatisierten Substrats, das eine erste Polymerschicht mit einer funktionellen NHS-Gruppe wie jene in 2 dargestellte aufweist, mit einem primären aminfunktionalisierten verzweigten Polymer (z. B. einem PEG-Polymer mit 16 Verzweigungen oder 32 Verzweigungen (auch als PEG mit 16 Armen bzw. 32 Armen bezeichnet)), um eine zweite hydrophile Polymerschicht zu schaffen, die einen Überschuss an nicht umgesetzten funktionellen Gruppen umfasst.
  • 4 zeigt eine schematische Darstellung eines nicht einschränkenden Beispiels für das Umsetzen eines verzweigten Polymers, das reaktionsfähige funktionelle Gruppen (z. B. ein NHS-PEG mit 4 Verzweigungen) umfasst, mit einer oder mehreren Oligonukleotidadaptor- oder - primersequenzen in einer Lösung (z. B. Oligonukleotide, die ein primäres Amin umfassen, wie anhand der gepunkteten und gestrichelten Linien dargestellt) vor dem Ablagern auf eine Substratoberfläche, um eine hydrophile Schicht zu schaffen, die kovalent angelagerte Oligonukleotidmoleküle umfasst. Durch Variieren des Molverhältnisses des Oligonukleotidmoleküls bzw. der Oligonukleotidmoleküle (oder anderer Biomoleküle, die angebunden werden sollen, z. B. Peptide, Proteine, Enzyme, Antikörper usw.) zu jenem des verzweigten Polymers kann die resultierende Oberflächendichte angelagerter Oligonukleotidsequenzen in kontrollierter Art und Weise variiert werden. In einigen Fällen können ein oder mehrere Oligonukleotidmoleküle (oder andere Biomoleküle) kovalent an eine bestehende Polymerschicht angebunden werden, nachdem die Schicht auf eine Oberfläche abgelagert worden ist.
  • 5 stellt eine schematische Darstellung eines nicht einschränkenden Beispiels für das Kuppeln eines verzweigten Polymers, das kovalent angelagerte Oligonukleotidprimer umfasst, an eine geschichtete hydrophile Oberfläche wie bspw. jene in 3. In diesem Beispiel wird ein verzweigtes Polymer, das zwei verschiedene Oligonukleotidprimer (anhand gepunkteter und gestrichelter Linien wiedergegeben) und aminreaktive NHS-Gruppen umfasst, an die primären Amine der vorherigen Schicht gekuppelt, um eine mehrschichtige, dreidimensionale hydrophile Oberfläche zu schaffen, die eine kontrollierte Oberflächendichte an angebundenen Oligonukleotidprimern umfasst.
  • Die Anlagerungschemie, die zum Transplantieren einer ersten chemisch modifizierten Schicht auf eine Trägeroberfläche verwendet wird, ist im Allgemeinen sowohl vom Material, aus dem der Träger hergestellt ist, als auch der chemischen Eigenschaften der Schicht abhängig. In einigen Fällen kann die erste Schicht kovalent an die Trägeroberfläche angelagert werden. In einigen Fällen kann die erste Schicht nichtkovalent an die Oberfläche angelagert, z. B. durch nichtkovalente Wechselwirkungen daran adsorbiert werden, wie bspw. durch elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbindung, Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche und den molekularen Komponenten der ersten Schicht. In jedem Fall kann die Substratoberfläche vor der Anlagerung oder Ablagerung der ersten Schicht behandelt werden. Zum Reinigen oder Behandeln der Trägeroberfläche kann ein jedes von einer Vielfalt an Oberflächenpräparationsverfahren, die Fachleuten bekannt sind, verwendet werden. Beispielsweise können Glas- oder Siliciumoberflächen unter Verwendung einer Piranha-Lösung (ein Gemisch aus Schwefelsäure (H2SO4) und Wasserstoffperoxid (H2O2)) säuregewaschen und/oder unter Verwendung eines Verfahrens der Sauerstoffplasmabehandlung gereinigt werden.
  • Silanchemien stellen eine nicht einschränkende Herangehensweise zum kovalenten Modifizieren der Solanolgruppen auf Glas- oder Siliciumoberflächen zum Anlagern von mehr reaktionsfähigen funktionellen Gruppen (z. B. Aminen oder Carboxylgruppen) dar, welche dann verwendet werden können, um als Verbindungsstücke dienende Moleküle (z. B. lineare Kohlenwasserstoffmoleküle unterschiedlicher Länge, etwa C6-, C12-, C18-Kohlenwasserstoffe oder lineare Polyethylenglycol(PEG)-Moleküle) oder Schichtmoleküle (z. B. verzweigte PEG-Moleküle oder andere Polymere) an die Oberfläche zu konjugieren. Beispiele für geeignete Silane, die beim Schaffen einer jeden der offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung verwendet werden können, sind u. a. (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS), (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES), ein jedes von einer Vielfalt an PEG-Silanen (bspw. Molekülmassen von 1 K, 2 K, 5 K, 10 K, 20 K usw. umfassend), Amino-PEG-Silan (d. h., die eine freie funktionelle Aminogruppe umfassen), Maleimid-PEG-Silan, Biotin-PEG-Silan und dergleichen.
  • Von einer Vielfalt an Molekülen, die Fachleuten bekannt sind, darunter Aminosäuren, Peptide, Nukleotide, Oligonukleotide, andere Monomere oder Polymere oder Kombinationen daraus, kann ein jedes beim Schaffen der einen oder mehreren chemisch modifizierten Schichten auf der Trägeroberfläche verwendet werden, wobei die Wahl der verwendeten Komponente variiert werden kann, um eine oder mehrere Eigenschaften der Trägeroberfläche zu variieren, z. B. die Oberflächendichte von funktionellen Gruppen und/oder angebundenen Oligonukleotidprimern, die Hydrophilie/Hydrophobie der Trägeroberfläche oder die dreidimensionale Eigenschaft (d. h. „Dicke“) der Trägeroberfläche. Beispiele für bevorzugte Polymere, die zum Schaffen einer oder mehrerer Schichten von Material mit geringer unspezifischer Bindung in einer jeden der offenbarten Trägeroberflächen verwendet werden können, sind u. a. Polyethylenglycol (PEG) mit unterschiedlichen Molekülmassen und Verzweigungsstrukturen, Streptavidin, Polyacrylamid, Polyester, Dextran, Polylysin und Polylysincopolymere oder eine beliebige Kombination daraus. Beispiele für Konjugationschemien, die zum Transplantieren einer oder mehrerer Materialschichten (z. B. Polymerschichten) auf die Trägeroberfläche und/oder zum Vernetzen der Schichten miteinander verwendet werden können, sind u. a. Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen (oder Variationen davon), His-Tag - Ni/NTA-Konjugationschemien, Methoxyether-Konjugationschemien, Carboxylat-Konjugationschemien, Amin-Konjugationschemien, NHS-Ester, Maleimide, Thiol, Epoxy, Azid, Hydrazid, Alkin, Isocyanat und Silan.
  • Ein oder mehrere Schichten einer mehrschichtigen Oberfläche können ein verzweigtes Polymer umfassen, oder es kann linear sein. Beispiele für geeignete verzweigte Polymere sind u. a. verzweigtes PEG, verzweigter Poly(vinylalkohol) (verzweigter PVA), verzweigtes Poly(vinylpyridin), verzweigtes Poly(vinylpyrrolidon) (verzweigtes PVP), verzweigte Poly(acrylsäure) (verzweigte PAA), verzweigtes Polyacrylamid, verzweigtes Poly(N-isopropylacrylamid) (verzweigtes PNIPAM), verzweigtes Poly(methylmethacrylat) (verzweigtes PMA), verzweigtes Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (verzweigtes PHEMA), verzweigtes Poly(oligo(ethylenglycol)methylethermethacrylat) (verzweigtes POEGMA), verzweigte Polyglutaminsäure (verzweigte PGA), verzweigtes Polylysin, verzweigtes Polyglucosid und Dextran.
  • In einigen Fällen können die verzweigten Polymere, die zum Schaffen einer oder mehrerer Schichten einer jeden der vorliegend offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, mindestens 4 Verzweigungen, mindestens 5 Verzweigungen, mindestens 6 Verzweigungen, mindestens 7 Verzweigungen, mindestens 8 Verzweigungen, mindestens 9 Verzweigungen, mindestens 10 Verzweigungen, mindestens 12 Verzweigungen, mindestens 14 Verzweigungen, mindestens 16 Verzweigungen, mindestens 18 Verzweigungen, mindestens 20 Verzweigungen, mindestens 22 Verzweigungen, mindestens 24 Verzweigungen, mindestens 26 Verzweigungen, mindestens 28 Verzweigungen, mindestens 30 Verzweigungen, mindestens 32 Verzweigungen, mindestens 34 Verzweigungen, mindestens 36 Verzweigungen, mindestens 38 Verzweigungen oder mindestens 40 Verzweigungen umfassen. Moleküle weisen oftmals eine Anzahl an Verzweigungen auf, bei denen es sich um eine „Zweierpotenz“ handelt, etwa 2, 4, 8, 16, 32, 64 oder 128 Verzweigungen.
  • Beispielhafte PEG-Mehrfachschichten weisen PEG (8,16,8) (8-armig, 16-armig, 8-armig)? an PEG-Amin-APTES auf. Ähnliche Konzentrationen ließen sich im Falle von 3-schichtigem mehrarmigem PEG (8-armig, 16-armig, 8-armig) und (8-armig, 64-armig, 8-armig) an PEG-Amin-APTES, 8 µM Primer ausgesetzt, beobachten, und 3-schichtiges mehrarmiges PEG (8-armig, 8-armig, 8-armig) unter Verwendung von sternförmigem PEG-Amin zum Ersetzen von 16-Arm- und 64-Arm-PEG-Mehrfachschichten mit einer vergleichbaren ersten, zweiten und dritten PEG-Schicht werden ebenfalls in Erwägung gezogen.
  • Lineare, verzweigte oder mehrfach verzweigte Polymere, die zum Schaffen einer oder mehrerer Schichten einer jeden der vorliegend offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, können eine Molekülmasse von mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 1.500, mindestens 2.000, mindestens 2.500, mindestens 3.000, mindestens 3.500, mindestens 4.000, mindestens 4.500, mindestens 5.000, mindestens 7.500, mindestens 10.000, mindestens 12.500, mindestens 15.000, mindestens 17.500, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000 oder mindestens 50.000 Dalton aufweisen. In einigen Fällen können die linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymere, die zum Schaffen einer oder mehrerer Schichten einer jeden der vorliegend offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, eine Molekülmasse von höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 17.500, höchstens 15.000, höchstens 12.500, höchstens 10.000, höchstens 7.500, höchstens 5.000, höchstens 4.500, höchstens 4.000, höchstens 3.500, höchstens 3.000, höchstens 2.500, höchstens 2.000, höchstens 1.500, höchstens 1.000 oder höchstens 500 Dalton aufweisen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Molekülmasse von linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymeren, die zum Schaffen einer oder mehrerer Schichten einer jeden der vorliegend offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, im Bereich von etwa 1.500 bis etwa 20.000 Dalton liegen. Fachleuten ergibt es sich, dass die Molekülmasse von linearen, verzweigten oder mehrfach verzweigten Polymere, die zum Schaffen einer oder mehrerer Schichten einer jeden der vorliegend offenbarten mehrschichtigen Oberflächen verwendet werden, einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 1.260 Dalton, annehmen kann.
  • In einigen Fällen, wenn z. B. wenigstens eine Schicht einer mehrschichtigen Oberfläche ein verzweigtes Polymer umfasst, kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der Schicht, die abgelagert wird, und Molekülen der vorherigen Schicht im Bereich von etwa einer kovalenten Bindung pro Molekül und etwa 32 kovalenten Bindungen pro Molekül liegen. In einigen Fällen kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 12, mindestens 14, mindestens 16, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 22, mindestens 24, mindestens 26, mindestens 28, mindestens 30 oder mindestens 32 oder über 32 kovalente Bindungen pro Molekül betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht höchstens 32, höchstens 30, höchstens 28, höchstens 26, höchstens 24, höchstens 22, höchstens 20, höchstens 18, höchstens 16, höchstens 14, höchstens 12, höchstens 10, höchstens 9, höchstens 8, höchstens 7, höchstens 6, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder höchstens 1 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht beispielsweise im Bereich von etwa 4 bis etwa 16 liegen. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Anzahl der kovalenten Bindungen zwischen einem verzweigten Polymermolekül der neuen Schicht und Molekülen der vorherigen Schicht einen jeden Wert innerhalb dieses Bereichs annehmen kann, in einigen Fällen bspw. etwa 11 oder, in anderen Fällen, eine durchschnittliche Anzahl von etwa 4,6.
  • Beliebige reaktionsfähige funktionelle Gruppen, die nach dem Kuppeln einer Materialschicht an die Trägeroberfläche zurückbleiben, können optional durch Kuppeln eines kleinen, inerten Moleküls unter Verwendung einer Kupplungschemie mit hoher Ausbeute blockiert werden. Falls zum Beispiel eine Amkupplungschemie verwendet wird, um eine neue Materialschicht an die vorherige anzubringen, können restliche Amingruppen nachfolgend acetyliert oder deaktiviert werden, indem sie mit einer kleinen Aminosäure wie bspw. Glycin gekuppelt werden.
  • Die Anzahl der Schichten eines Materials mit geringer unspezifischer Bindung, bspw. eines hydrophilen Polymermaterials, das auf die Oberfläche der offenbarten Träger mit geringer Bindung abgelagert wird, kann im Bereich von 1 bis etwa 10 liegen. In einigen Fällen beträgt die Anzahl der Schichten mindestens 1, mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder mindestens 10. In einigen Fällen kann die Anzahl der Schichten höchstens 10, höchstens 9, höchstens 8, höchstens 7, höchstens 6, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder höchstens 1 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Anzahl der Schichten beispielsweise im Bereich von etwa 2 bis etwa 4 liegen. In einigen Fällen können alle der Schichten das gleiche Material umfassen. In einigen Fällen kann jede Schicht ein anderes Material umfassen. In einigen Fällen kann die Vielzahl von Schichten eine Vielzahl von Materialien umfassen. In einigen Fällen kann mindestens eine Schicht ein verzweigtes Polymer umfassen. In einigen Fällen können alle der Schichten ein verzweigtes Polymer umfassen.
  • Eine oder mehrere Schichten des Materials mit geringer unspezifischer Bindung können in einigen Fällen unter Verwendung eines protisch-polaren Lösungsmittels, eines aprotisch-polaren Lösungsmittels, eines unpolaren Lösungsmittels oder einer beliebigen Kombination daraus auf die Substratoberfläche abgelagert und/oder daran konjugiert werden. In einigen Fällen kann das Lösungsmittel, das zur Schichtablagerung und/oder -kupplung verwendet wird, Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol, Propanol, usw.), ein anderes organisches Lösungsmittel (z. B. Acetonitril, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) usw.), Wasser, eine wässrige Pufferlösung (z. B. Phosphatpuffer, phosphatgepufferte Salzlösung, 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS) usw.) oder eine beliebige Kombination daraus umfassen. In einigen Fällen kann eine organische Komponente des verwendeten Lösungsmittelgemischs mindestens 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % am Gesamtumfang oder einen jeden Prozentsatz, der von dem Bereich umfangen wird oder nahe an ihn angrenzt, umfassen, wobei der Rest aus Wasser oder einer wässrigen Pufferlösung besteht. In einigen Fällen kann eine wässrige Komponente des verwendeten Lösungsmittelgemischs mindestens 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % am Gesamtumfang oder einen jeden Prozentsatz, der von dem Bereich umfangen wird oder nahe an ihn angrenzt, umfassen, wobei der Rest aus einem organischen Lösungsmittel besteht. Der pH-Wert des Lösungsmittelgemischs kann bei unter 5, 5, 5, 5, 6, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, über 10 oder einem jeden Wert liegen, der von dem hier beschriebenen Bereich umfangen wird oder nahe an ihn angrenzt.
  • In einigen Fällen können eine oder mehrere Schichten des Materials mit geringer unspezifischer Bindung unter Verwendung eines Gemischs aus organischen Lösungsmitteln auf die Substratoberfläche abgelagert und/oder daran konjugiert werden, wobei die Dielektrizitätskonstante wenigstens einer Komponente weniger als 40 beträgt und mindestens 50 % am Gesamtgemisch nach Volumen ausmacht. In einigen Fällen kann die Dielektrizitätskonstante der wenigstens einen Komponente unter 10, unter 20, unter 30, unter 40 betragen. In einigen Fällen stellt die wenigstens eine Komponente mindestens 20 %, mindestens 30 %, mindestens 40 %, mindestens 50 %, mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 % oder mindestens 80 % am Gesamtgemisch nach Volumen dar.
  • Wie erwähnt, weisen die Träger mit geringer unspezifischer Bindung der vorliegenden Offenbarung eine reduzierte unspezifische Bindung von Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Komponenten der Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsformulierung auf, die zur Festphasen-Nukleinsäureamplifikation verwendet wird. Der Grad an unspezifischer Bindung, den eine jeweilige Trägeroberfläche aufweist, kann entweder qualitativ oder quantitativ bewertet werden. So kann in einigen Fällen zum Beispiel das Aussetzen der Oberfläche gegenüber Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. Cy3, Cy5 usw.), fluoreszierend markierten Nukleotiden, fluoreszierend markierten Oligonukleotiden und/oder fluoreszierend markierten Proteinen (z. B. Polymerasen) unter einer standardisierten Reihe an Bedingungen, gefolgt von einem spezifischen Spülprotokoll und Fluoreszenzbildgebung, als qualitatives Werkzeug zum Vergleich der unspezifischen Bindung an Träger, die verschiedene Oberflächenformulierungen umfassen, verwendet werden. In einigen Fällen kann das Aussetzen der Oberfläche gegenüber Fluoreszenzfarbstoffen, fluoreszierend markierten Nukleotiden, fluoreszierend markierten Oligonukleotiden und/oder fluoreszierend markierten Proteinen (z. B. Polymerasen) unter einer standardisierten Reihe an Bedingungen, gefolgt von einem spezifischen Spülprotokoll und Fluoreszenzbildgebung, als quantitatives Werkzeug zum Vergleich der unspezifischen Bindung an Träger, die verschiedene Oberflächenformulierungen umfassen, verwendet werden - vorausgesetzt, es wurde dafür Sorge getragen, dass die Fluoreszenzbildgebung unter Bedingungen vorgenommen wird, in denen das Fluoreszenzsignal linear (oder in vorhersagbarer Weise) mit der Anzahl der Fluorophore auf der Trägeroberfläche ins Verhältnis gesetzt wird (bspw. unter Bedingungen, in denen die Signalsättigung und/oder Selbstlöschung des Fluorophors kein Problem darstellt) und geeignete Kalibrierungsstandards verwendet werden. In einigen Fällen können andere Fachleuten bekannte Techniken, zum Beispiel Verfahren der Radioisotopenmarkierung und -zählung, zur quantitativen Bewertung des Grads verwendet werden, in dem verschiedene Trägeroberflächenformulierungen der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Bindung aufweisen.
  • Einige vorliegend offenbarte Oberflächen weisen ein Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Bindung eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder über 100 oder einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs auf. Einige vorliegend offenbarte Oberflächen weisen ein Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Fluoreszenz eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder über 100 oder einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs auf.
  • Wie genannt, kann der Grad der unspezifischen Bindung, den die offenbarten Träger mit geringer Bindung aufweisen, bewertet werden unter Verwendung eines standardisierten Protokolls zum Inkontaktbringen der Oberfläche mit einem markierten Protein (z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Streptavidin, einer DNA-Polymerase, einer reversen Transkriptase, einer Helikase, einem Einzelstrang-bindendem Protein (SBB) usw. oder einer Kombination daraus), einem markierten Nukleotid, einem markierten Oligonukleotid usw., unter einer standardisierten Reihe an Inkubations- und Spülbedingungen, gefolgt vom Nachweis der Menge an Markierung, die auf der Oberfläche zurückbleibt, und Vergleich des daraus entstehenden Signals mit einem passenden Kalibrierungsstandard. In einigen Fällen kann die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung umfassen. In einigen Fällen kann die Markierung ein Radioisotop umfassen. In einigen Fällen kann die Markierung eine beliebige andere nachweisbare Markierung umfassen, die Fachleuten bekannt ist. In einigen Fällen kann der Grad der unspezifischen Bindung, den eine jeweilige Trägeroberflächenformulierung aufweist, somit im Hinblick auf die Anzahl der unspezifisch gebundenen Proteinmoleküle (oder von anderen Molekülen) pro Flächeneinheit bewertet werden. In einigen Fällen können die Träger mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Proteinbindung (oder unspezifische Bindung anderer bestimmter Moleküle, z. B. Cy3-Farbstoff) von unter 0,001 Molekülen pro µm2, unter 0,01 Molekülen pro µm2, unter 0,1 Molekülen pro µm2, unter 0,25 Molekülen pro µm2, unter 0,5 Molekülen pro µm2, unter 1 Molekül pro µm2, unter 10 Molekülen pro µm2, unter 100 Molekülen pro µm2 oder unter 1.000 Molekülen pro µm2 aufweisen. Für Fachleute ergibt es sich, dass eine jeweilige Trägeroberfläche der vorliegenden Offenbarung eine unspezifische Bindung aufweisen kann, die auf einen beliebigen Wert in diesem Bereich fallen kann, beispielsweise unter 86 Moleküle pro µm2. Einige vorliegend offenbarte modifizierte Oberflächen weisen zum Beispiel eine unspezifische Proteinbindung von unter 0,5 Molekülen/µm2 nach 15-minütigem Kontakt mit 1 µM Lösung aus Cy3-markiertem Streptavidin (GE Amersham) in einem Puffer, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), gefolgt von 3 Spülvorgängen mit deionisiertem Wasser, auf. Einige vorliegend offenbarte modifizierte Oberflächen weisen eine unspezifische Bindung von Cy3-Farbstoffmolekülen von unter 0,25 Molekülen pro µm2 auf. In unabhängigen Assays zur unspezifischen Bindung wurden 1 µM markierter Cy3 SA (ThermoFisher), 1 µM Cy5-SA-Farbstoff (ThermoFisher), 10 µM Aminoallyl-dUTP-ATTO-647N (Jena Biosciences), 10 µM Aminoallyl-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 µM Aminoallyl-dUTP-ATTO-Rho11 (Jena Biosciences), 10 µM 7-Propargylamino-7-deaza-dGTP-Cy5 (Jena Biosciences) und 10 µM 7-Propargylamino-7-deaza-dGTP-Cy3 (Jena Biosciences) 15 Minuten lang bei 37 °C in einem Plattenformat mit 384 Näpfchen inkubiert. Jedes Näpfchen wurde 2-3x mit 50 µl deionisiertem RNase/DNase-freiem Wasser und 2-3x mit 25 mM ACES-Puffer, pH 7,4, gespült. Die Bildgebung der 384-Well-Platten erfolgte an einem GE Typhoon (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA, USA) unter Verwendung der Filterreihe Cy3, AF555 oder Cy5 (je nach durchgeführtem Farbstofftest) gemäß Herstelleranleitung bei einer Einstellung der PMT-Verstärkung von 800 und einer Auflösung von 50-100 µm. Für eine Bildgebung mit höherer Auflösung wurden Aufnahmen anhand eines Olympus-IX83-Mikroskops (Olympus Corp., Center Valley, PA, USA) mit einem Objektiv für interne Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF) (20x, 0,75 NA oder 100x, 1,5 NA, Olympus), einer sCMOS-Andor-Kamera (Zyla 4.2) und Anregungswellenlängen von 532 nm oder 635 nm erfasst. Dichroitische Spiegel wurden von Semrock erworben (IDEX Health & Science, LLC, Rochester, New York), z. B. dichroitische Reflektoren/Strahlteiler à 405, 488, 532 oder 633 nm, und Bandpassfilter wurden entsprechend der jeweiligen Anregungswellenlänge als 532 LP oder 645 LP gewählt. Einige vorliegend offenbarte modifizierte Oberflächen weisen eine unspezifische Bindung von Farbstoffmolekülen von unter 0,25 Molekülen pro µm2 auf.
  • In einigen Fällen weisen die vorliegend offenbarten Oberflächen ein Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Bindung eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder über 100 oder einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs auf. In einigen Fällen weisen die vorliegend offenbarten Oberflächen ein Verhältnis von spezifischen zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen im Falle eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 oder über 100 oder einem beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs auf.
  • Die Oberflächen mit geringem Hintergrund gemäß der vorliegenden Offenbarung können Verhältnisse von spezifischer Farbstoffanlagerung (z. B. Cy3-Anlagerung) zu unspezifischer Farbstoffadsorption (z. B. Cy3-Farbstoffadsorption) von mindestens 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1 oder über 50 spezifischen Farbstoffmolekülen aufweisen, die pro unspezifisch adsorbiertem Molekül angelagert sind. Dem ähnlich können Oberflächen mit geringem Hintergrund gemäß der vorliegenden Offenbarung, an welche Fluorophore, z. B. Cy3, angelagert wurden, wenn sie einer Anregungsenergie ausgesetzt werden, Verhältnisse von einem spezifischen Fluoreszenzsignal (das z. B. durch Cy3-markierte Oligonukleotide entsteht, die an der Oberfläche angelagert sind) zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen aufgrund von adsorbiertem Farbstoff von mindestens 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1 oder über 50:1 aufweisen.
  • In einigen Fällen kann der Grad der Hydrophilie (oder „Benetzbarkeit“ mit wässrigen Lösungen) der offenbarten Trägeroberflächen beispielsweise durch die Messung von Wasserkontaktwinkeln bewertet werden, wobei ein Tröpfchen Wasser auf der Oberfläche platziert wird und dessen Kontaktwinkel zur Oberfläche bspw. unter Verwendung eines optischen Tensiometers gemessen wird. In einigen Fällen kann ein statischer Kontaktwinkel bestimmt werden. In einigen Fällen kann ein Fortschreite- oder Rückzugswinkel bestimmt werden. In einigen Fällen kann der Wasserkontaktwinkel im Falle der vorliegend offenbarten hydrophilen Trägeroberflächen mit geringer Bindung in einem Bereich von etwa 0 Grad bis etwa 50 Grad liegen. In einigen Fällen kann der Wasserkontaktwinkel im Falle der vorliegend offenbarten hydrophilen Trägeroberflächen mit geringer Bindung unter 50 Grad, 45 Grad, 40 Grad, 35 Grad, 30 Grad, 25 Grad, 20 Grad, 18 Grad, 16 Grad, 14 Grad, 12 Grad, 10 Grad, 8 Grad, 6 Grad, 4 Grad, 2 Grad oder 1 Grad liegen. In vielen Fällen beträgt der Kontaktwinkel nicht mehr als einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs, z. B. nicht mehr als 40 Grad. Für Fachleute ergibt es sich, dass eine jeweilige hydrophile Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung einen Wasserkontaktwinkel mit einem Wert aufweisen kann, der irgendwo in diesem Bereich liegt, z. B. etwa 27 Grad.
  • In einigen Fällen ermöglichen die vorliegend offenbarten hydrophilen Oberflächen reduzierte Waschzeiten für Bioassays, die oft auf die unspezifische Bindung von Biomolekülen an die Oberflächen mit geringer Bindung zurückzuführen sind. In einigen Fällen können adäquate Waschschritte in unter 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 oder unter 10 Sekunden durchgeführt werden. In einigen Fällen können adäquate Waschschritte beispielsweise in unter 30 Sekunden durchgeführt werden.
  • Einige Oberflächen mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung weisen eine signifikante Verbesserung hinsichtlich der Stabilität oder Strapazierfähigkeit bei längerem Aussetzen gegenüber Lösungsmitteln und erhöhten Temperaturen oder gegenüber wiederholten Zyklen der Lösungsmittelexposition oder von Temperaturwechseln auf. Beispielsweise kann die Stabilität der offenbarten Oberfläche in einigen Fällen durch fluoreszierendes Markieren einer funktionellen Gruppe auf der Oberfläche oder eines angebundenen Biomoleküls (z. B. eines Oligonukleotidprimers) auf der Oberfläche und Überwachen des Fluoreszenzsignals vor, während oder nach längerem Aussetzen gegenüber Lösungsmitteln und erhöhten Temperaturen oder gegenüber wiederholten Zyklen der Lösungsmittelexposition oder von Temperaturwechseln getestet werden. In einigen Fällen kann der Änderungsgrad der Fluoreszenz, der zum Bewerten der Qualität der Oberfläche verwendet wird, für einen Zeitraum von 1 Minute, 2 Minuten, 3 Minuten, 4 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten, 30 Minuten, 40 Minuten, 50 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden, 9 Stunden, 10 Stunden, 15 Stunden, 20 Stunden, 25 Stunden, 30 Stunden, 35 Stunden, 40 Stunden, 45 Stunden, 50 Stunden oder 100 Stunden des Aussetzens gegenüber Lösungsmitteln und/oder erhöhten Temperaturen bei unter 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % oder 25 % liegen (oder einer beliebigen Kombination dieser prozentualen Anteile, welche über diese Zeiträume hinweg gemessen werden). In einigen Fällen kann der Änderungsgrad der Fluoreszenz, der zum Bewerten der Qualität der Oberfläche verwendet wird, über 5 Zyklen, 10 Zyklen, 20 Zyklen, 30 Zyklen, 40 Zyklen, 50 Zyklen, 60 Zyklen, 70 Zyklen, 80 Zyklen, 90 Zyklen, 100 Zyklen, 200 Zyklen, 300 Zyklen, 400 Zyklen, 500 Zyklen, 600 Zyklen, 700 Zyklen, 800 Zyklen, 900 Zyklen oder 1.000 Zyklen des wiederholten Aussetzens gegenüber Lösungsmittelwechseln und/oder Temperaturänderungen unter 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % oder 25 % betragen (oder eine beliebige Kombination dieser prozentualen Anteile, welche über diesen Bereich von Zyklen hinweg gemessen werden).
  • In einigen Fällen können die vorliegend offenbarten Oberflächen ein hohes Verhältnis von spezifischem Signal zu unspezifischem Signal oder einem anderen Hintergrund aufweisen. Wenn sie zum Beispiel zur Nukleinsäureamplifikation verwendet werden, können manche Oberflächen ein Amplifikationssignal aufweisen, das mindestens 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 30-, 40-, 50-, 75-, 100- oder mehr als 100-mal größer als ein Signal einer benachbarten nicht besiedelten Region der Oberfläche ist. Dem ähnlich weisen manche Oberflächen ein Amplifikationssignal auf, das mindestens 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 30-, 40-, 50-, 75-, 100- oder mehr als 100-mal größer als ein Signal einer benachbarten Region der Oberfläche mit einer Population amplifizierter Nukleinsäure ist.
  • Energien zur Fluoreszenzanregung variieren je nach den jeweiligen Fluorophoren und Protokollen; ihre Anregungswellenlänge kann im Bereich von unter 400 nm bis über 800 nm liegen, was sich nach der Auswahl des Fluorophors oder anderen Parametern der Verwendung einer vorliegend offenbarten Oberfläche richtet.
  • Dementsprechend weisen wie vorliegend offenbarte Oberflächen mit geringem Hintergrund Fluoreszenzsignale mit geringem Hintergrund oder hohe Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisse (CNR) im Verhältnis zu vorbekannten Oberflächen auf. Beispielsweise kann die Hintergrundfluoreszenz der Oberfläche an einer Stelle, die räumlich von einem markierten Merkmal auf der Oberfläche (z. B. markierter Lichtfleck, Cluster, separate Region, Unterabschnitt oder Teilbereich der Oberfläche) getrennt oder entfernt ist, das ein hybridisiertes Cluster von Nukleinsäuremolekülen oder ein klonal amplifiziertes Cluster von Nukleinsäuremolekülen umfasst, hergestellt z. B. durch 20 Zyklen der Nukleinsäureamplifikation mittels Temperaturzyklen, in einigen Fällen nicht mehr als 20x, 10x, 5x, 2x, 1x, 0,5x, 0,1x oder weniger als 0,1x größer als die Hintergrundfluoreszenz sein, die an derselben Stelle vor dem Vornehmen der Hybridisierung oder der 20 Zyklen der Nukleinsäureamplifikation gemessen wurde.
  • In einigen Fällen weisen Fluoreszenzaufnahmen der offenbarten Oberflächen mit geringem Hintergrund, wenn sie in Anwendungen der Nukleinsäurehybridisierung oder -amplifikation verwendet werden, um Cluster hybridisierter oder klonal amplifizierter Nukleinsäuremoleküle zu schaffen (die z. B. direkt oder indirekt mit einem Fluorophor markiert wurden) Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisse (CNRs) von mindestens 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 210, 220, 230, 240, 250 oder über 250 auf.
  • Oligonukleotidprimer und Adaptorsequenzen: Im Allgemeinen kann wenigstens eine Schicht von der einen oder den mehreren Schichten des Materials mit geringer unspezifischer Bindung funktionelle Gruppen zum kovalenten oder nichtkovalenten Anlagern von Oligonukleotidmolekülen, z. B. Adaptor- oder Primersequenzen, umfassen, oder die wenigstens eine Schicht kann zu dem Zeitpunkt, zu dem sie auf die Trägeroberfläche abgelagert wird, bereits kovalent oder nichtkovalent angelagerte Oligonukleotidadaptor- oder -primersequenzen umfassen. In einigen Fällen können die an die Polymermoleküle der wenigstens einen dritten Schicht angebundenen Oligonukleotide in einer Vielzahl von Tiefen in der gesamten Schicht verteilt werden.
  • In einigen Fällen werden die Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle kovalent an das Polymer in der Lösung gekuppelt, d. h. vor dem Kuppeln oder Ablagern des Polymers an bzw. auf die Oberfläche. In einigen Fällen werden die Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle kovalent an das Polymer gekuppelt, nachdem es an die Oberfläche gekuppelt oder darauf abgelagert worden ist. In einigen Fällen umfasst die mindestens eine hydrophile Polymerschicht eine Vielzahl von kovalent angelagerten Oligonukleotidadaptor- oder -primermolekülen. In einigen Fällen umfassen wenigstens zwei, wenigstens drei, wenigstens vier oder wenigstens fünf Schichten aus hydrophilem Polymer eine Vielzahl von kovalent angelagerten Adaptor- oder Primermolekülen.
  • In einigen Fällen können die Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle mithilfe einer beliebigen von einer Vielfalt an gekoppelten Konjugationschemien, die Fachleuten bekannt sind, an die eine oder mehreren Schichten aus hydrophilem Polymer gekuppelt werden. Beispielsweise können die Oligonukleotidadaptor- oder -primersequenzen Molekülteile umfassen, die mit Amingruppen, Carboxylgruppen, Thiolgruppen und dergleichen Reaktionen eingehen. Zu Beispielen für geeignete aminreaktive Konjugationschemien, die verwendet werden können, zählen Reaktionen, die Isothiocyanat, Isocyanat, Acylazid, NHS-Ester, Sulfonylchlorid, Aldehyd, Glyoxal, Epoxid, Oxiran, Carbonat, Arylhalid, Imidoester, Carbodiimid, Anhydrid und Fluorphenylestergruppen beinhalten. Zu Beispielen für geeignete carboxylreaktive Konjugationschemien zählen Reaktionen, die Carbodiimidverbindungen, z. B. wasserlösliches EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCL) beinhalten. Zu Beispielen für geeignete sulfydrylreaktive Konjugationschemien zählen Maleimide, Haloacetyle und Pyridyldisulfide.
  • Eine oder mehrere Arten von Oligonukleotidmolekülen können an die Trägeroberfläche angelagert oder angebunden werden. In einigen Fällen können die eine oder mehreren Arten von Oligonukleotidadaptoren oder -primern Spacer-Sequenzen, Adaptorsequenzen zur Hybridisierung an adaptorligierte Matrizen-Nukleinsäuresequenzen, die als Bibliothek dienen, Amplifikationsvorwärtsprimer, Amplifikationsrückwärtsprimer, Sequenzierungsprimer und/oder molekulare Barcoding-Sequenzen oder eine jede Kombination daraus umfassen. In einigen Fällen kann 1 Primer- oder Adaptorsequenz an wenigstens eine Schicht der Oberfläche angebunden werden. In einigen Fällen können mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr als 10 verschiedene Primer- oder Adaptorsequenzen an wenigstens eine Schicht der Oberfläche angebunden werden.
  • In einigen Fällen können die angebundenen Oligonukleotidadaptor- und/oder -primersequenzen eine Länge im Bereich von etwa 10 Nukleotiden bis etwa 100 Nukleotiden aufweisen. In einigen Fällen können die angebundenen Oligonukleotidadaptor- und/oder -primersequenzen eine Länge von mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90 oder mindestens 100 Nukleotiden aufweisen. In einigen Fällen können die angebundenen Oligonukleotidadaptor- und/oder -primersequenzen eine Länge von höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20 oder höchstens 10 Nukleotiden aufweisen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; beispielsweise kann die Länge der angebundenen Oligonukleotidadaptor- und/oder -primersequenzen in einigen Fällen in einem Bereich von etwa 20 Nukleotiden bis etwa 80 Nukleotiden liegen. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Länge der angebundenen Oligonukleotidadaptor- und/oder -primersequenzen einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 24 Nukleotide, annehmen kann.
  • In einigen Fällen können die angebundenen Adaptor- und/oder Primersequenzen Modifikationen umfassen, die derart gestaltet sind, dass sie die Spezifität und Effizienz der Nukleinsäureamplifikation fördern, die an den Trägern mit geringer Bindung vorgenommen wird. So kann der Primer in einigen Fällen zum Beispiel Polymerasestopppunkte umfassen, sodass der Abschnitt der Primersequenz zwischen dem Oberflächenkonjugationspunkt und der Modifikationsstelle stets eine einzelsträngige Form aufweist und in Verfahren der isothermen Amplifikation mittels Helikase als Aufbringungsstelle für 5'-zu-3'-Helikasen dient. Zu anderen Beispielen für Primermodifikationen, die zum Schaffen von Polymerasestopppunkten verwendet werden können, zählen u. a. ein Einschub einer PEG-Kette in die Hauptkette des Primers zwischen zwei Nukleotiden zum 5'-Ende hin, ein Einschub eines abasischen Nukleotids (d. h. eines Nukleotids, das weder eine Purin- noch Pyrimidinbase besitzt) oder eine Läsionsstelle, die von der Helikase umgangen werden kann.
  • Wie in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert, kann es wünschenswert sein, die Oberflächendichte von angebundenen Oligonukleotidadaptoren oder -primern auf der Trägeroberfläche und/oder die Beabstandung der angebundenen Adaptoren oder Primer von der Trägeroberfläche zu variieren (bspw. durch Variieren der Länge eines Linkermoleküls, das zum Anbinden der Adaptoren oder Primer an die Oberfläche verwendet wird), um den Träger für eine optimale Leistung bei Verwenden eines jeweiligen Amplifikationsverfahrens zu „justieren“. Wie nachstehend angemerkt, kann das Anpassen der Oberflächendichte von angebundenen Oligonukleotidadaptoren oder -primern den Umfang der auf dem Träger beobachteten spezifischen und/oder unspezifischen Amplifikation in einer Weise beeinflussen, die je nach ausgewähltem Amplifikationsverfahren variiert. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von angebundenen Oligonukleotidadaptoren oder -primern durch Anpassen des Verhältnisses molekularer Komponenten, die zum Schaffen der Trägeroberfläche verwendet werden, variiert werden. Falls beispielsweise ein Oligonukleotidprimer-PEG-Konjugat verwendet wird, um die finale Schicht eines Trägers mit geringer Bindung zu schaffen, kann das Verhältnis des Oligonukleotidprimer-PEG-Konjugats zu einem nicht konjugierten PEG-Molekül variiert werden. Die sich daraus ergebende Oberflächendichte an angebundenen Primermolekülen kann dann mithilfe einer beliebigen von einer Vielfalt an Techniken, die Fachleuten bekannt sind, geschätzt oder gemessen werden. Zu Beispielen zählen u. a. die Verwendung von Verfahren der Radioisotopenmarkierung und -zählung, kovalentes Kuppeln eines abspaltbaren Moleküls, das einen optisch nachweisbaren Marker (z. B. einen Fluoreszenzmarker) umfasst und das von einer Trägeroberfläche eines definierten Bereichs abgespaltet werden kann, gesammelt in einem festgelegten Volumen eines geeigneten Lösungsmittels, und anschließend durch Vergleich von Fluoreszenzsignalen mit jenen einer Kalibrierungslösung mit einer bekannten Konzentration eines optischen Markers quantifiziert werden kann oder das Verwenden von Techniken der Fluoreszenzbildgebung, vorausgesetzt, die Markierungsreaktionsbedingungen und Einstellungen der Bildaufnahme wurden sorgfältig gewählt, um zu gewährleisten, dass die Fluoreszenzsignale in einem linearen Verhältnis zur Anzahl der Fluorophore auf der Oberfläche stehen (dass bspw. keine erhebliche Selbstauslöschung der Fluorophore auf der Oberfläche besteht).
  • In einigen Fällen kann die resultierende Oberflächendichte von Oligonukleotidadaptoren oder - primern auf den Trägeroberflächen mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung im Bereich von etwa 100 Primermolekülen pro µm2 bis etwa 1.000.000 Primermolekülen pro µm2 liegen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidadaptoren oder -primern mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400, mindestens 500, mindestens 600, mindestens 700, mindestens 800, mindestens 900, mindestens 1.000, mindestens 1.500, mindestens 2.000, mindestens 2.500, mindestens 3.000, mindestens 3.500, mindestens 4.000, mindestens 4.500, mindestens 5.000, mindestens 5.500, mindestens 6.000, mindestens 6.500, mindestens 7.000, mindestens 7.500, mindestens 8.000, mindestens 8.500, mindestens 9.000, mindestens 9.500, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000 oder mindestens 1.000.000 Moleküle pro µm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Oligonukleotidadaptoren oder -primern höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.500, höchstens 9.000, höchstens 8.500, höchstens 8.000, höchstens 7.500, höchstens 7.000, höchstens 6.500, höchstens 6.000, höchstens 5.500, höchstens 5.000, höchstens 4.500, höchstens 4.000, höchstens 3.500, höchstens 3.000, höchstens 2.500, höchstens 2.000, höchstens 1.500, höchstens 1.000, höchstens 900, höchstens 800, höchstens 700, höchstens 600, höchstens 500, höchstens 400, höchstens 300, höchstens 200 oder höchstens 100 Moleküle pro µm2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Oberflächendichte von Adaptoren oder Primern beispielsweise im Bereich von etwa 10.000 Molekülen pro µm2 bis etwa 100.000 Molekülen pro µm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte von Adaptor- oder Primermolekülen einen jeden Wert in diesem Bereich annehmen kann, z. B. etwa 3.800 Moleküle pro µm2 in einigen Fällen oder etwa 455.000 Moleküle pro µm2 in anderen. In einigen Fällen, wie nachstehend näher erläutert, kann die Oberflächendichte von Matrizen-Nukleinsäuresequenzen, die als Bibliotheken dienen (z. B. Probe-DNA-Molekülen) und anfänglich an Adapter- oder Primersequenzen auf der Trägeroberfläche hybridisiert wurden, im Verhältnis zu jener für die Oberflächendichte angebundener Oligonukleotidprimer angegebenen kleiner oder gleich sein. In einigen Fällen, wie ebenfalls nachstehend näher erläutert, kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Matrizen-Nukleinsäuresequenzen, die als Bibliotheken dienen und an Adapter- oder Primersequenzen auf der Trägeroberfläche hybridisiert wurden, im Verhältnis zu jener für die Oberflächendichte angebundener Oligonukleotidadaptoren oder -primer angegebenen den gleichen oder einen anderen Wertebereich umspannen.
  • Lokale Oberflächendichten von Adapter- oder Primermolekülen, wie oben aufgeführt, schließen eine Dichtevariation über eine Oberfläche hinweg nicht aus, sodass eine Oberfläche eine Region mit einer Oligodichte von beispielsweise 500.000/µm2 umfassen kann und zugleich auch wenigstens eine zweite Region mit einer im Wesentlichen anderen lokalen Dichte umfasst.
  • Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen an Träger mit geringer Bindung: In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung sind Hybridisierungspufferformulierungen beschrieben, die in Kombination mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung verbesserte Hybridisierungsraten, eine verbesserte Hybridisierungsspezifität (oder -stringenz) und Hybridisierungseffizienz (oder - ausbeute) ermöglichen. Die Hybridisierungsspezifität ist im hier verwendeten Sinne ein Maß für die Fähigkeit von angebundenen Adaptorsequenzen, Primersequenzen oder Oligonukleotidsequenzen im Allgemeinen, nur an komplett komplementäre Sequenzen korrekt zu hybridisieren, wohingegen die Hybridisierungseffizienz ein Maß für den Anteil der insgesamt verfügbaren angebundenen Adaptorsequenzen, Primersequenzen oder Oligonukleotidsequenzen im Allgemeinen ist, die an komplementäre Sequenzen hybridisiert sind.
  • Eine verbesserte Hybridisierungsspezifität und/oder -effizienz kann durch Optimierung der Hybridisierungspufferformulierung erreicht werden, die mit den offenbarten Oberflächen mit geringer Bindung verwendet werden, wie in den nachstehenden Beispielen ausführlicher erläutert. Beispiele für Hybridisierungspufferkomponenten, die angepasst werden können, um eine verbesserte Leistung zu erreichen, sind u. a. die Art des Puffers, organische Lösungsmittelgemische, der pH-Wert des Puffers, die Viskosität des Puffers, Detergenzien und zwitterionische Komponenten, die Ionenstärke (einschließlich der Anpassung von Konzentrationen sowohl monovalenter als auch divalenter Ionen), Antioxidanzien und Reduktionsmittel, Kohlenhydrate, BSA, Polyethylenglycol, Dextransulfat, Betain, andere Zusatzstoffe und dergleichen.
  • Als nicht einschränkendes Beispiel können geeignete Puffer zur Verwendung beim Formulieren eines Hybridisierungspuffers u. a. phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Succinat, Citrat, Histidin, Acetat, Tris, TAPS, MOPS, PIPES, HEPES, MES und dergleichen sein. Die Wahl des passenden Puffers wird im Allgemeinen vom angestrebten pH-Wert der Hybridisierungspufferlösung abhängen. Der gewünschte pH-Wert der Pufferlösung wird im Allgemeinen im Bereich von pH 4 bis etwa pH 8,4 liegen. In einigen Ausführungsformen kann der pH-Wert des Puffers mindestens 4,0, mindestens 4,5, mindestens 5,0, mindestens 5,5, mindestens 6,0, mindestens 6,2, mindestens 6,4, mindestens 6,6, mindestens 6,8, mindestens 7,0, mindestens 7,2, mindestens 7,4, mindestens 7,6, mindestens 7,8, mindestens 8,0, mindestens 8,2 oder mindestens 8,4 betragen. In einigen Ausführungsformen kann der pH-Wert des Puffers höchstens 8,4, höchstens 8,2, höchstens 8,0, höchstens 7,8, höchstens 7,6, höchstens 7,4, höchstens 7,2, höchstens 7,0, höchstens 6,8, höchstens 6,6, höchstens 6,4, höchstens 6,2, höchstens 6,0, höchstens 5,5, höchstens 5,0, höchstens 4,5 oder höchstens 4,0 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann der gewünschte pH-Wert zum Beispiel im Bereich von etwa 6,4 bis etwa 7,2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass der pH-Wert des Puffers einen jeden Wert in diesem Bereich, zum Beispiel etwa 7,25, annehmen kann.
  • Geeignete Detergenzien zur Verwendung in einer Hybridisierungspufferformulierung sind u. a. zitterionische Detergenzien (bspw. 1-Dodecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 3-(4-tert-Butyl-1-pyridinio)-1 -propansulfonat, 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propansulfonat, 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)-propansulfonat, ASB-C80, C7BzO, CHAPS, CHAPS-Hydrat, CHAPSO, DDMAB, Dimethylethylammoniumpropansulfonat, N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid, N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat oder N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat) und anionische, kationische und nichtionische Detergenzien. Zu Beispielen für nichtionische Detergenzien zählen u. a. Poly(oxyethylen)ether und verwandte Polymere (z. B. Brij®, TWEEN®, TRITON®, TRITON X-100 und IGEPAL® CA-630), Gallensalze und glycosidische Detergenzien.
  • Die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung entweder für sich oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen kann relative Hybridisierungsraten ergeben, die im Bereich von etwa 2x bis etwa 20x schneller als jene mit einem herkömmlichen Hybridisierungsprotokoll sind. In einigen Fällen kann die relative Hybridisierungsrate mindestens 2x, mindestens 3x, mindestens 4x, mindestens 5x, mindestens 6x, mindestens 7x, mindestens 8x, mindestens 9x, mindestens 10x, mindestens 12x, mindestens 14x, mindestens 16x, mindestens 18x, mindestens 20x, mindestens 25x, mindestens 30x oder mindestens 40x jene mit einem herkömmlichen Hybridisierungsprotokoll sein.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung entweder für sich oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen Gesamthybridisierungsreaktionszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % des vollständigen Abschlusses der Hybridisierungsreaktion zu erreichen) von unter 60 Minuten, 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten, 15 Minuten, 10 Minuten oder 5 Minuten in Bezug auf eine jede dieser Abschlusskennzahlen ergeben.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung entweder für sich oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen eine verbesserte Hybridisierungsspezifität im Vergleich zu jener mit einem herkömmlichen Hybridisierungsprotokoll ergeben. In einigen Fällen ist die Hybridisierungsspezifität, die erreicht werden kann, besser als 1 Basenfehlpaarung bei 10 Hybridisierungsereignissen,
    1 Basenfehlpaarung bei 20 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 30 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 40 Hybridisierungsereignissen,
    1 Basenfehlpaarung bei 50 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 75 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 100 Hybridisierungsereignissen,
    1 Basenfehlpaarung bei 200 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 300 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 400 Hybridisierungsereignissen,
    1 Basenfehlpaarung bei 500 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 600 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 700 Hybridisierungsereignissen,
    1 Basenfehlpaarung bei 800 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 900 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 1.000 Hybridisierungsereignissen,
    1 Basenfehlpaarung bei 2.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 3.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 4.000 Hybridisierungsereignissen,
    1 Basenfehlpaarung bei 5.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 6.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 7.000 Hybridisierungsereignissen,
    1 Basenfehlpaarung bei 8.000 Hybridisierungsereignissen, 1 Basenfehlpaarung bei 9.000 Hybridisierungsereignissen oder 1 Basenfehlpaarung bei 10.000 Hybridisierungsereignissen.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung entweder für sich oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen eine verbesserte Hybridisierungseffizienz (bspw. der Anteil der verfügbaren Oligonukleotidprimer auf der Trägeroberfläche, die erfolgreich mit Oligonukleotidzielsequenzen hybridisiert sind) im Vergleich zu jener mit einem herkömmlichen Hybridisierungsprotokoll ergeben. In einigen Fällen ist die Hybridisierungseffizienz, die erreicht werden kann, besser als 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % für beliebige der Eingangskonzentrationen für Zieloligonukleotide, die nachstehend angegeben sind, und in beliebigen der Hybridisierungsreaktionszeiten, die vorstehend angegeben sind. In einigen Fällen, in denen die Hybridisierungseffizienz z. B. geringer als 100 % ist, kann die resultierende Oberflächendichte der Nukleinsäurezielsequenzen, die an die Trägeroberfläche hybridisiert sind, geringer als die Oberflächendichte der Oligonukleotidadaptor- oder Primersequenzen auf der Oberfläche sein.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für Anwendungen der Nukleinsäurehybridisierung (oder -amplifikation) mithilfe herkömmlicher Hybridisierungsprotokolle (oder Amplifikationsprotokolle) oder optimierter Hybridisierungsprotokolle (oder Amplifikationsprotokolle) zu einer reduzierten Erfordernis bezüglich der Eingangskonzentration von Ziel-(oder Probe-)Nukleinsäuremolekülen führen, die mit der Trägeroberfläche in Kontakt gebracht werden. In einigen Fällen können die Ziel-(oder Probe-)Nukleinsäuremoleküle zum Beispiel bei einer Konzentration im Bereich von etwa 10 pM bis etwa 1 µM (d. h. vor dem Annealing oder der Amplifikation) mit der Trägeroberfläche in Kontakt gebracht werden. In einigen Fällen können die Ziel-(oder Probe-)Nukleinsäuremoleküle in einer Konzentration von mindestens 10 pM, mindestens 20 pM, mindestens 30 pM, mindestens 40 pM, mindestens 50 pM, mindestens 100 pM, mindestens 200 pM, mindestens 300 pM, mindestens 400 pM, mindestens 500 pM, mindestens 600 pM, mindestens 700 pM, mindestens 800 pM, mindestens 900 pM, mindestens 1 nM, mindestens 10 nM, mindestens 20 nM, mindestens 30 nM, mindestens 40 nM, mindestens 50 nM, mindestens 60 nM, mindestens 70 nM, mindestens 80 nM, mindestens 90 nM, mindestens 100 nM, mindestens 200 nM, mindestens 300 nM, mindestens 400 nM, mindestens 500 nM, mindestens 600 nM, mindestens 700 nM, mindestens 800 nM, mindestens 900 nM oder mindestens 1 µM verabreicht werden. In einigen Fällen können die Ziel-(oder Probe-)Nukleinsäuremoleküle in einer Konzentration von höchstens 1 µM, höchstens 900 nM, höchstens 800 nm, höchstens 700 nM, höchstens 600 nM, höchstens 500 nM, höchstens 400 nM, höchstens 300 nM, höchstens 200 nM, höchstens 100 nM, höchstens 90 nM, höchstens 80 nM, höchstens 70 nM, höchstens 60 nM, höchstens 50 nM, höchstens 40 nM, höchstens 30 nM, höchstens 20 nM, höchstens 10 nM, höchstens 1 nM, höchstens 900 pM, höchstens 800 pM, höchstens 700 pM, höchstens 600 pM, höchstens 500 pM, höchstens 400 pM, höchstens 300 pM, höchstens 200 pM, höchstens 100 pM, höchstens 90 pM, höchstens 80 pM, höchstens 70 pM, höchstens 60 pM, höchstens 50 pM, höchstens 40 pM, höchstens 30 pM, höchstens 20 pM oder höchstens 10 pM verabreicht werden. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen können die Ziel-(oder Probe-)Nukleinsäuremoleküle zum Beispiel in einer Konzentration im Bereich von etwa 90 pM bis etwa 200 nM verabreicht werden. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Ziel-(oder Probe-)Nukleinsäuremoleküle in einer Konzentration verabreicht werden können, die einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 855 nM, annehmen kann.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Hybridisierungspufferformulierungen eine Oberflächendichte von hybridisierten Ziel- (oder Probe-)Oligonukleotidmolekülen (d. h. vor dem Vornehmen einer nachfolgenden Festphasen- oder klonalen Amplifikationsreaktion) ergeben, die im Bereich von etwa 0,0001 Zieloligonukleotidmolekülen pro µm2 bis etwa 1.000.000 Zieloligonukleotidmolekülen pro µm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der hybridisierten Zieloligonukleotidmoleküle mindestens 0,0001, mindestens 0,0005, mindestens 0,001, mindestens 0,005, mindestens 0,01, mindestens 0,05, mindestens 0,1, mindestens 0,5, mindestens 1, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 200, mindestens 300, mindestens 400, mindestens 500, mindestens 600, mindestens 700, mindestens 800, mindestens 900, mindestens 1.000, mindestens 1.500, mindestens 2.000, mindestens 2.500, mindestens 3.000, mindestens 3.500, mindestens 4.000, mindestens 4.500, mindestens 5.000, mindestens 5.500, mindestens 6.000, mindestens 6.500, mindestens 7.000, mindestens 7.500, mindestens 8.000, mindestens 8.500, mindestens 9.000, mindestens 9.500, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000 oder mindestens 1.000.000 Moleküle pro µm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der hybridisierten Zieloligonukleotidmoleküle höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.500, höchstens 9.000, höchstens 8.500, höchstens 8.000, höchstens 7.500, höchstens 7.000, höchstens 6.500, höchstens 6.000, höchstens 5.500, höchstens 5.000, höchstens 4.500, höchstens 4.000, höchstens 3.500, höchstens 3.000, höchstens 2.500, höchstens 2.000, höchstens 1.500, höchstens 1.000, höchstens 900, höchstens 800, höchstens 700, höchstens 600, höchstens 500, höchstens 400, höchstens 300, höchstens 200, höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 1, höchstens 0,5, höchstens 0,1, höchstens 0,05, höchstens 0,01, höchstens 0,005, höchstens 0,001, höchstens 0,0005 oder höchstens 0,0001 Moleküle pro µm2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Oberflächendichte der hybridisierten Zieloligonukleotidmoleküle zum Beispiel im Bereich von etwa 3.000 Molekülen pro µm2 bis etwa 20.000 Molekülen pro µm2 liegen. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Oberflächendichte der hybridisierten Zieloligonukleotidmoleküle einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 2.700 Moleküle pro µm2, annehmen kann.
  • Anders formuliert, kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Hybridisierungspufferformulierungen in einigen Fällen eine Oberflächendichte der hybridisierten Ziel-(oder Probe-)Nukleinsäuremoleküle (d. h. vor dem Vornehmen einer nachfolgenden Festphasen- oder klonalen Amplifikationsreaktion) ergeben, die im Bereich etwa 100 hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen pro mm2 bis etwa 1x 107 Oligonukleotidmolekülen pro mm2 oder von etwa 100 hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen pro mm2 bis etwa 1x 1012 hybridisierten Zieloligonukleotidmolekülen pro mm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der hybridisierten Zieloligonukleotidmoleküle mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 4.000, mindestens 5.000, mindestens 6.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, mindestens 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Moleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der hybridisierten Zieloligonukleotidmoleküle höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Moleküle pro mm2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Oberflächendichte der hybridisierten Zieloligonukleotidmoleküle zum Beispiel im Bereich von etwa 5.000 Molekülen pro mm2 bis etwa 50.000 Molekülen pro mm2 liegen. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Oberflächendichte der hybridisierten Zieloligonukleotidmoleküle einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 50.700 Moleküle pro mm2, annehmen kann.
  • In einigen Fällen kann die Länge der Ziel- (oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle (oder - Nukleinsäuremoleküle), die an die Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle hybridisiert sind, welche an die Trägeroberfläche mit geringer Bindung angelagert sind, im Bereich von etwa 0,02 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb oder von etwa 0,1 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb liegen. In einigen Fällen können die Zieloligonukleotidmoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 0,6 kb lang, mindestens 0,7 kb lang, mindestens 0,8 kb lang, mindestens 0,9 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang, mindestens 20 kb lang, mindestens 30 kb lang oder mindestens 40 kb lang sein oder eine Länge mit einem beliebigen Zwischenwert innerhalb des hier beschriebenen Bereichs annehmen, bspw. mindestens 0,85 kb lang sein.
  • In einigen Fällen können die Ziel-(oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle (oder - Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige, multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, ferner umfassend Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit. In einigen Fällen können die einzelsträngigen oder doppelsträngigen, multimeren Nukleinsäuremoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang oder mindestens 20 kb lang, mindestens 30 kb lang oder mindestens 40 kb lang sein oder eine Länge mit einem beliebigen Zwischenwert innerhalb des hier beschriebenen Bereichs annehmen, bspw. etwa 2,45 kb lang sein.
  • In einigen Fällen können die Ziel- (oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle (oder - Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, die von etwa 2 bis etwa 100 Kopien einer sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50, mindestens 55, mindestens 60, mindestens 65, mindestens 70, mindestens 75, mindestens 80, mindestens 85, mindestens 90, mindestens 95 und mindestens 100 betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit höchstens 100, höchstens 95, höchstens 90, höchstens 85, höchstens 80, höchstens 75, höchstens 70, höchstens 65, höchstens 60, höchstens 55, höchstens 50, höchstens 45, höchstens 40, höchstens 35, höchstens 30, höchstens 25, höchstens 20, höchstens 15, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3 oder höchstens 2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit beispielsweise im Bereich von etwa 4 bis etwa 60 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 17, annehmen kann. Somit kann die Oberflächendichte von hybridisierten Zielsequenzen in Bezug auf die Anzahl der Kopien einer Zielsequenz pro Flächeneinheit der Trägeroberfläche in einigen Fällen die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern selbst dann überschreiten, wenn die Hybridisierungseffizienz unter 100 % liegt.
  • Nukleinsäureoberflächenamplifikation (NASA): Im vorliegenden Zusammenhang wird der Ausdruck „Nukleinsäureoberflächenamplifikation“ (Nucleic Acid Surface Amplification - NASA) synonym mit dem Ausdruck „Festphasen-Nukleinsäureamplifikation“ (oder einfach „Festphasen-Amplifikation“) verwendet. In einigen Aspekten der vorliegenden Offenbarung sind Nukleinsäureamplifikationsformulierungen beschrieben, die in Kombination mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung verbesserte Amplifikationsraten, eine verbesserte Amplifikationsspezifität und Amplifikationseffizienz ermöglichen. Im vorliegenden Zusammenhang ist mit spezifischer Amplifikation die Amplifikation von Matrizen-Oligonukleotidsträngen, die als Bibliotheken dienen und entweder kovalent oder nichtkovalent an den festen Träger angebunden wurden, gemeint. Im vorliegenden Zusammenhang ist mit unspezifischer Amplifikation die Amplifikation von Primer-Dimeren oder anderen Nukleinsäuren, die keine Matrizen sind, gemeint. Im vorliegenden Zusammenhang ist die Amplifikationseffizienz ein Maß für den Anteil der angebundenen Oligonukleotide auf der Trägeroberfläche, die während eines jeweiligen Amplifikationszyklus oder einer jeweiligen Amplifikationsreaktion erfolgreich amplifiziert werden. Mit einer Nukleinsäureamplifikation, die an vorliegend offenbarten Oberflächen vorgenommen wird, können Amplifikationseffizienzen von 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder über 95 %, etwa 98 % oder 99 % erlangt werden.
  • Im Zusammenhang mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung kann ein jedes von einer Vielfalt an Schemata der Nukleinsäureamplifikation mit thermischen Zyklen oder der isothermen Nukleinsäureamplifikation verwendet werden. Beispiele für Verfahren der Nukleinsäureamplifikation, die im Zusammenhang mit den offenbarten Trägern mit geringer Bindung genutzt werden können, sind u. a. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Multi-Displacement-Amplifikation (MDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA), auf Nukleinsäuresequenzen basierende Amplifikation (NASBA), Strangverdrängungsamplifikation (SDA), Echtzeit-SDA, Brückenamplifikation, isotherme Brückenamplifikation, Rolling-Circle-Amplifikation, Circle-to-Circle-Amplifikation, Amplifikation mittels Helikase, Amplifikation mittels Rekombinase oder Amplifikation mittels Einzelstrang-bindender (SSB-)Proteine.
  • Verbesserungen im Hinblick auf die Amplifikationsrate, Amplifikationsspezifität und Amplifikationseffizienz lassen sich oftmals mithilfe der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit Formulierungen der Amplifikationsreaktionskomponenten erzielen. Zusätzlich zur Einbeziehung von Nukleotiden, einer oder mehrerer Polymerasen Helikasen, Einzelstrang-bindenden Proteinen usw. (oder einer Kombination daraus) kann das Amplifikationsreaktionsgemisch in vielfältiger Weise angepasst werden, um eine verbesserte Leistung zu erzielen, darunter die Wahl der Pufferart, des pH-Werts des Puffers, organischer Lösungsmittelgemische, der Pufferviskosität, von Detergenzien und zwitterionischen Komponenten, der Ionenstärke (einschließlich der Anpassung von Konzentrationen sowohl monovalenter als auch divalenter Ionen), von Antioxidanzien und Reduktionsmitteln, Kohlenhydraten, BSA, Polyethylenglycol, Dextransulfat, Betain, anderen Zusatzstoffen und dergleichen.
  • Die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen kann im Vergleich zu jenen, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erlangt werden, gesteigerte Amplifikationsraten ergeben. In einigen Fällen können die relativen Amplifikationsraten, die erreicht werden können, mindestens 2x, mindestens 3x, mindestens 4x, mindestens 5x, mindestens 6x, mindestens 7x, mindestens 8x, mindestens 9x, mindestens 10x, mindestens 12x, mindestens 14x, mindestens 16x, mindestens 18x oder mindestens 20x so hoch wie jene im Falle der Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle bei beliebigen der vorbeschriebenen Amplifikationsverfahren sein.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung entweder für sich oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen Gesamtamplifikationsreaktionszeiten (d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % des vollständigen Abschlusses der Amplifikationsreaktion zu erreichen) von unter 180 Minuten, 120 Minuten, 90 Minuten, 60 Minuten, 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten, 15 Minuten, 10 Minuten, 5 Minuten oder 3 Minuten, 1 Minute, 50 s, 40 s, 30 s, 20 s oder 10 s in Bezug auf eine jede dieser Abschlusskennzahlen ergeben.
  • Einige vorliegend offenbarte Trägeroberflächen mit geringer Bindung weisen ein Verhältnis von spezifischer Bindung zu unspezifischer Bindung eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 50:1, 75:1, 100:1 oder über 100:1 oder einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs auf. Einige vorliegend offenbarte Oberflächen weisen ein Verhältnis von spezifischem zu unspezifischem Fluoreszenzsignal im Falle eines Fluorophors wie Cy3 von mindestens 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 50:1, 75:1, 100:1 oder über 100:1 oder einen beliebigen Wert innerhalb dieses Bereichs auf.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung entweder für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationspufferformulierungen kürzere Amplifikationsreaktionszeiten (d. h. die Zeiten, die erforderlich sind, um 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % des vollständigen Abschlusses der Amplifikationsreaktion zu erreichen) von unter 60 Minuten, unter 50 Minuten, 40 Minuten, 30 Minuten, 20 Minuten oder 10 Minuten ermöglichen. Dem ähnlich kann es die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung entweder für sich oder in Kombination mit optimierten Pufferformulierungen ermöglichen, die Amplifikationsreaktionen in einigen Fällen in nicht mehr als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 oder nicht mehr als 30 Zyklen vollständig abzuschließen.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen im Vergleich zu jener, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erlangt werden, eine gesteigerte spezifische Amplifikation und/oder eine verringerte unspezifische Amplifikation ergeben. In einigen Fällen beträgt das Verhältnis von spezifischer Amplifikation zu unspezifischer Amplifikation, das erreicht werden kann, mindestens 4:1 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1 oder 1.000:1.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen im Vergleich zu jener, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erlangt wird, eine gesteigerte Amplifikationseffizienz ergeben. In einigen Fällen ist die Amplifikationseffizienz, die erreicht werden kann, besser als 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % oder 99 % in beliebigen der Amplifikationsreaktionszeiten, die vorstehend angegeben sind.
  • In einigen Fällen kann die Länge der klonal amplifizierten Ziel-(oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle (oder -Nukleinsäuremoleküle), die an die Oligonukleotidadaptor- oder - primermoleküle hybridisiert sind, welche an die Trägeroberfläche mit geringer Bindung angelagert sind, im Bereich von etwa 0,02 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb oder von etwa 0,1 Kilobasen (kb) bis etwa 20 kb liegen. In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Zieloligonukleotidmoleküle mindestens 0,001 kb, mindestens 0,005 kb, mindestens 0,01 kb, mindestens 0,02 kb, mindestens 0,05 kb, mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang oder mindestens 20 kb lang sein oder eine Länge mit einem beliebigen Zwischenwert innerhalb des hier beschriebenen Bereichs annehmen, bspw. mindestens 0,85 kb lang sein.
  • In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Ziel-(oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle (oder -Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige, multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, ferner umfassend Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit. In einigen Fällen können die klonal amplifizierten einzelsträngigen oder doppelsträngigen, multimeren Nukleinsäuremoleküle mindestens 0,1 kb lang, mindestens 0,2 kb lang, mindestens 0,3 kb lang, mindestens 0,4 kb lang, mindestens 0,5 kb lang, mindestens 1 kb lang, mindestens 2 kb lang, mindestens 3 kb lang, mindestens 4 kb lang, mindestens 5 kb lang, mindestens 6 kb lang, mindestens 7 kb lang, mindestens 8 kb lang, mindestens 9 kb lang, mindestens 10 kb lang, mindestens 15 kb lang oder mindestens 20 kb lang sein oder eine Länge mit einem beliebigen Zwischenwert innerhalb des hier beschriebenen Bereichs annehmen, bspw. etwa 2,45 kb lang sein.
  • In einigen Fällen können die klonal amplifizierten Ziel-(oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle (oder -Nukleinsäuremoleküle) einzelsträngige oder doppelsträngige multimere Nukleinsäuremoleküle umfassen, die von etwa 2 bis etwa 100 Kopien einer sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit umfassen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50, mindestens 55, mindestens 60, mindestens 65, mindestens 70, mindestens 75, mindestens 80, mindestens 85, mindestens 90, mindestens 95 und mindestens 100 betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit höchstens 100, höchstens 95, höchstens 90, höchstens 85, höchstens 80, höchstens 75, höchstens 70, höchstens 65, höchstens 60, höchstens 55, höchstens 50, höchstens 45, höchstens 40, höchstens 35, höchstens 30, höchstens 25, höchstens 20, höchstens 15, höchstens 10, höchstens 5, höchstens 4, höchstens 3 oder höchstens 2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit beispielsweise im Bereich von etwa 4 bis etwa 60 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Anzahl der Kopien der sich regelmäßig wiederholenden Monomereinheit einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 12, annehmen kann. Somit kann die Oberflächendichte von klonal amplifizierten Zielsequenzen in Bezug auf die Anzahl der Kopien einer Zielsequenz pro Flächeneinheit der Trägeroberfläche in einigen Fällen die Oberflächendichte von Oligonukleotidprimern selbst dann überschreiten, wenn die Hybridisierungs- und/oder Amplifikationseffizienz unter 100 % liegt.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen im Vergleich zu jener, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erlangt werden, eine gesteigerte Anzahl der klonalen Kopien ergeben. In einigen Fällen, in denen die klonal amplifizierten Ziel-(oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle bspw. verkettete, multimere Wiederholungen einer monomeren Zielsequenz umfassen, kann die Anzahl der klonalen Kopien im Wesentlichen geringer als jene sein, die unter Verwendung herkömmlicher Träger und Amplifikationsprotokolle erlangt wird. Daher kann die Anzahl der klonalen Kopien in einigen Fällen im Bereich von etwa 1 Molekül bis etwa 100.000 Molekülen (z. B. Zielsequenzmolekülen) pro amplifizierter Kolonie liegen. In einigen Fällen kann die Anzahl der klonalen Kopien mindestens 1, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 50, mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 2.000, mindestens 3.000, mindestens 4.000, mindestens 5.000, mindestens 6.000, mindestens 7.000, mindestens 8.000, mindestens 9.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000 oder mindestens 100.000 Moleküle pro amplifizierter Kolonie betragen. In einigen Fällen kann die Anzahl der klonalen Kopien höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 9.000, höchstens 8.000, höchstens 7.000, höchstens 6.000, höchstens 5.000, höchstens 4.000, höchstens 3.000, höchstens 2.000, höchstens 1.000, höchstens 500, höchstens 100, höchstens 50, höchstens 10, höchstens 5 oder höchstens 1 Molekül(e) pro amplifizierter Kolonie betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Anzahl der klonalen Kopien beispielsweise im Bereich von etwa 2.000 Molekülen bis etwa 9.000 Molekülen liegen. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Anzahl der klonalen Kopien einen jeden Wert in diesem Bereich annehmen kann, in einigen Fällen z. B. etwa 2.220 Moleküle oder in anderen Fällen etwa 2 Moleküle.
  • Wie vorstehend genannt, können die amplifizierten Ziel-(oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle (oder -Nukleinsäuremoleküle) in einigen Fällen verkettete, multimere Wiederholungen einer monomeren Zielsequenz umfassen. In einigen Fällen können die amplifizierten Ziel-(oder Proben-)Oligonukleotidmoleküle (oder -Nukleinsäuremoleküle) eine Vielzahl von Molekülen umfassen, von denen jedes eine einzelne monomere Zielsequenz umfasst. Somit kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen eine Oberflächendichte der Zielsequenzkopien ergeben, die im Bereich von etwa 100 Zielsequenzkopien pro mm2 bis etwa 1 × 1012 Zielsequenzkopien pro mm2 liegt. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der Zielsequenzkopien mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 klonal amplifizierte Zielsequenzmoleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der Zielsequenzkopien höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Zielsequenzkopien pro mm2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; so kann die Oberflächendichte der Zielsequenzkopien in einigen Fällen zum Beispiel im Bereich von etwa 1.000 Zielsequenzkopien pro mm2 bis etwa 65,000 Zielsequenzkopien pro mm2 liegen. Fachleute werden erkennen, dass die Oberflächendichte der Zielsequenzkopien einen jeden Wert in diesem Bereich annehmen kann, z. B. etwa 49.600 Zielsequenzkopien pro mm2.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationspufferformulierungen eine Oberflächendichte der klonal amplifizierten Ziel-(oder Probe-)Oligonukleotidmoleküle (oder -Cluster) im Bereich von etwa 100 Molekülen pro mm2 bis etwa 1 × 1012 Kolonien pro mm2 ergeben. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Moleküle mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Moleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Moleküle höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Moleküle pro mm2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Moleküle zum Beispiel im Bereich von etwa 5.000 Molekülen pro mm2 bis etwa 50.000 Molekülen pro mm2 liegen. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Kolonien einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 48.800 Moleküle pro mm2, annehmen kann.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationspufferformulierungen eine Oberflächendichte der klonal amplifizierten Ziel-(oder Probe-)Oligonukleotidmoleküle (oder -Cluster) im Bereich von etwa 100 Molekülen pro mm2 bis etwa 1 × 1012 Kolonien pro mm2 ergeben. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Moleküle mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Moleküle pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Moleküle höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Moleküle pro mm2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Moleküle zum Beispiel im Bereich von etwa 5.000 Molekülen pro mm2 bis etwa 50.000 Molekülen pro mm2 liegen. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Kolonien einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 48.800 Moleküle pro mm2, annehmen kann.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationspufferformulierungen eine Oberflächendichte der klonal amplifizierten Ziel-(oder Probe-)Oligonukleotidkolonien (oder -Cluster) im Bereich von etwa 100 Kolonien pro mm2 bis etwa 1 × 1012 Kolonien pro mm2 ergeben. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Kolonien mindestens 100, mindestens 500, mindestens 1.000, mindestens 5.000, mindestens 10.000, mindestens 15.000, mindestens 20.000, mindestens 25.000, mindestens 30.000, mindestens 35.000, mindestens 40.000, mindestens 45.000, mindestens 50.000, mindestens 55.000, mindestens 60.000, mindestens 65.000, mindestens 70.000, mindestens 75.000, mindestens 80.000, mindestens 85.000, mindestens 90.000, mindestens 95.000, mindestens 100.000, mindestens 150.000, mindestens 200.000, mindestens 250.000, mindestens 300.000, mindestens 350.000, mindestens 400.000, mindestens 450.000, mindestens 500.000, mindestens 550.000, mindestens 600.000, mindestens 650.000, mindestens 700.000, mindestens 750.000, mindestens 800.000, mindestens 850.000, mindestens 900.000, mindestens 950.000, mindestens 1.000.000, mindestens 5.000.000, 1 × 107, mindestens 5 × 107, mindestens 1 × 108, mindestens 5 × 108, mindestens 1 × 109, mindestens 5 × 109, mindestens 1 × 1010, mindestens 5 × 1010, mindestens 1 × 1011, mindestens 5 × 1011 oder mindestens 1 × 1012 Kolonien pro mm2 betragen. In einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Kolonien höchstens 1 × 1012, höchstens 5 × 1011, höchstens 1 × 1011, höchstens 5 × 1010, höchstens 1 × 1010, höchstens 5 × 109, höchstens 1 × 109, höchstens 5 × 108, höchstens 1 × 108, höchstens 5 × 107, höchstens 1 × 107, höchstens 5.000.000, höchstens 1.000.000, höchstens 950.000, höchstens 900.000, höchstens 850.000, höchstens 800.000, höchstens 750.000, höchstens 700.000, höchstens 650.000, höchstens 600.000, höchstens 550.000, höchstens 500.000, höchstens 450.000, höchstens 400.000, höchstens 350.000, höchstens 300.000, höchstens 250.000, höchstens 200.000, höchstens 150.000, höchstens 100.000, höchstens 95.000, höchstens 90.000, höchstens 85.000, höchstens 80.000, höchstens 75.000, höchstens 70.000, höchstens 65.000, höchstens 60.000, höchstens 55.000, höchstens 50.000, höchstens 45.000, höchstens 40.000, höchstens 35.000, höchstens 30.000, höchstens 25.000, höchstens 20.000, höchstens 15.000, höchstens 10.000, höchstens 5.000, höchstens 1.000, höchstens 500 oder höchstens 100 Kolonien pro mm2 betragen. Ein jeder der unteren und oberen Werte, die in diesem Absatz aufgeführt werden, kann kombiniert werden, um einen Bereich zu bilden, der in der vorliegenden Offenbarung beinhaltet ist; in einigen Fällen kann die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Kolonien zum Beispiel im Bereich von etwa 5.000 Kolonien pro mm2 bis etwa 50.000 Kolonien pro mm2 liegen. Für Fachleute ergibt es sich, dass die Oberflächendichte der klonal amplifizierten Kolonien einen jeden Wert in diesem Bereich, z. B. etwa 48.800 Kolonien pro mm2, annehmen kann.
  • In einigen Fällen kann die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung für sich oder in Kombination mit optimierten Amplifikationsreaktionsformulierungen ein Signal aus den amplifizierten und markierten Nukleinsäurepopulationen (z. B. ein Fluoreszenzsignal) ergeben, das einen Abweichungskoeffizienten von nicht mehr als 50 % aufweist, etwa von 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % oder unter 5 %.
  • In einigen Fällen ermöglichen die wie vorliegend offenbarten Trägeroberflächen und Verfahren eine Amplifikation bei erhöhten Verlängerungstemperaturen wie bspw. bei 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C, 40 °C oder mehr oder beispielsweise bei etwa 21 °C oder 23 °C.
  • In einigen Fällen ermöglicht die Verwendung der wie vorliegend offenbarten Trägeroberflächen und Verfahren vereinfachte Amplifikationsreaktionen. Beispielsweise werden Amplifikationsreaktionen in einigen Fällen unter Verwendung von nicht mehr als 1, 2, 3, 4 oder 5 separaten Reagenzien vorgenommen.
  • In einigen Fällen ermöglicht die Verwendung der wie vorliegend offenbarten Trägeroberflächen und Verfahren die Verwendung vereinfachter Temperaturprofile während der Amplifikation, sodass Reaktionen bei Temperaturen im Bereich von einer niedrigen Temperatur von 15 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C oder 40 °C bis zu einer hohen Temperatur von 40 °C, 45 °C, 50 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C oder über 80 °C, wie bspw. in einem Bereich von 20 °C bis 65 °C, durchgeführt werden.
  • Amplifikationsreaktionen werden auch derart verbessert, dass geringere Matrizenmengen (z. B. an Ziel- oder Probenmolekülen) ausreichen, um erkennbare Signale auf einer Oberfläche zu ergeben, wie bspw. 1 pM, 2 pM, 5 pM, 10 pM, 15 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM, 900 pM, 1.000 pM, 2.000 pM, 3.000 pM, 4.000 pM, 5.000 pM, 6.000 pM, 7.000 pM, 8.000 pM, 9.000 pM, 10.000 pM oder über 10.000 pM einer Probe, wie bspw. 500 nM. In Ausführungsbeispielen sind Einsätze von etwa 100 pM ausreichend, um Signale für eine zuverlässige Signalbestimmung zu generieren.
  • Fluoreszenzbildgebung von Trägeroberflächen: Die offenbarten Formulierungen für Festphasen-Nukleinsäureamplifikationsreaktionen und Träger mit geringer Bindung können in einer beliebigen von einer Vielfalt an Anwendungen der Nukleinsäureanalyse verwendet werden, bspw., Nukleinsäurebasenunterscheidungs-, Nukleinsäurebasenklassifizierungs-, Nukleinsäurebasenzuordnungs-, Nukleinsäurenachweisanwendungen, Nukleinsäuresequenzierungsanwendungen und Diagnoseanwendungen, die auf Nukleinsäure (genetisch und genomisch) beruhen. In vielen dieser Anwendungen können Techniken der Fluoreszenzbildgebung verwendet werden, um Hybridisierungs-, Amplifikations- und/oder Sequenzierungsreaktionen zu überwachen, die an den Trägern mit geringer Bindung vorgenommen werden.
  • Die Fluoreszenzbildgebung kann unter Verwendung eines beliebigen von einer Vielfalt an Fluorophoren, Fluoreszenzbildgebungstechniken und Fluoreszenzbildgebungsinstrumenten, die Fachleuten bekannt sind, vorgenommen werden. Beispiele für geeignete Fluoreszenzfarbstoffe, die verwendet werden können (z. B. durch Konjugation an Nukleotide, Oligonukleotide oder Proteine) sind u. a. Fluorescein, Rhodamin, Coumarin, Cyanin und Derivate davon, einschließlich der Cyaninderivate Cyaninfarbstoff-3 (Cy3), Cyaninfarbstoff-5 (Cy5), Cyaninfarbstoff-7 (Cy7) usw. Beispiele für Fluoreszenzbildgebungstechniken, die verwendet werden können, sind u. a. die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie, die konfokale Fluoreszenzbildgebung, die Zwei-Photonen-Fluoreszenz und dergleichen. Zu Beispielen für Fluoreszenzbildgebungsinstrumente, die verwendet werden können, zählen u. a. Fluoreszenzmikroskope, die mit einem Bildsensor oder einer Kamera ausgestattet sind, Konfokalfluoreszenzmikroskope, Zwei-Photonen-FluoreszenzMikroskope oder spezielle Instrumente, die eine geeignete Auswahl an Lichtquellen, Linsen, Spiegeln, Prismen, dichroitischen Reflektoren, Blenden und Bildsensoren oder Kameras usw. umfassen. Ein nicht einschränkendes Beispiel für ein Fluoreszenzmikroskop, das zum Erfassen von Aufnahmen der offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung und klonal amplifizierten Kolonien (oder Clustern) von daran hybridisierten Zielnukleinsäuresequenzen ausgestattet ist, ist das umgekehrte Fluoreszenzmikroskop Olympus IX83, ausgestattet mit 20x, 0,75 NA, einer Lichtquelle mit 532 nm, einem Set aus Bandpassfilter und dichroitischem Spiegel, optimiert für eine Langpassanregung bei 532 nm und Cy3-Fluoreszenzemissionsfilter, einem dichroitischen Reflektor, Semrock, 532 nm, und einer Kamera (Andor sCMOS, Zyla 4.2), wobei die Anregungslichtstärke angepasst wird, um eine Signalsättigung zu verhüten. Oftmals kann die Trägeroberfläche in einen Puffer (z. B. 25 mM ACES-Puffer, pH-Wert 7,4) getaucht werden, während die Aufnahme erfasst wird.
  • In einigen Fällen kann die Leistung der Nukleinsäurehybridisierungs- und/oder Amplifikationsreaktionen unter Verwendung der offenbarten Reaktionsformulierungen und Träger mit geringer Bindung anhand von Fluoreszenzbildgebungstechniken bewertet werden, in denen das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) der Aufnahmen eine Schlüsselkennzahl beim Bewerten der Amplifikationsspezifität und unspezifischen Bindung an den Träger bereitstellt. Das CNR ist gemeinhin wie folgt definiert: CNR = (Signal - Hintergrund) / Rauschen. Der Ausdruck Hintergrund wird gemeinhin als das Signal aufgefasst, das für die interstitialen Regionen gemessen wird, die ein jeweiliges Merkmal (beugungsbegrenzter Lichtfleck, DLD) in einer bestimmten interessierenden Region (ROI) umgeben. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) wird zwar oft als Richtwert für die Signalqualität insgesamt betrachtet, doch lässt sich aufzeigen, dass ein verbessertes CNR einen signifikanten Vorteil gegenüber dem SNR als Richtwert für die Signalqualität in Anwendungen verschaffen kann, in denen eine schnelle Bilderfassung erforderlich ist (z. B. Sequenzierungsanwendungen, bei denen die Zykluszeiten minimiert werden müssen), wie im nachstehenden Beispiel gezeigt. Wie in 6A und 6B dargestellt, kann die Bildgebungszeit, die erforderlich ist, um eine exakte Unterscheidung (und damit eine exakte Basenzuordnung im Falle von Sequenzierungsanwendungen) zu erreichen, selbst mit moderaten Verbesserungen des CNR drastisch reduziert werden. 6A und 6B stellen Simulationsdaten bzgl. Signal- und Hintergrundintensitäten (durchgezogene Linien) und integrierte Durchschnittswerte (gestrichelte Linien) dar, die in Abhängigkeit vom CNR (CNR = 1,25 in 6A und 12,49 in 6B) und der Integrationszeit (SNR = 2 in beiden Figuren) ermittelt wurden und die verbesserte Unterscheidung darstellen, die anhand des CNR als Kennzahl für die Signalqualität erreicht werden kann.7 stellt Beispiele für die Auswirkung eines verbesserten CNR in Bilddaten auf die Bildgebungsintegrationszeit dar, die erforderlich ist, um Merkmale wie bspw. klonal amplifizierte Nukleinsäurekolonien auf der Trägeroberfläche exakt nachzuweisen.
  • In den meisten Herangehensweisen der Sequenzierung, die auf einem Ensemble beruhen, wird der Ausdruck des Hintergrunds typischerweise als das Signal gemessen, das mit „interstitialen“ Regionen assoziiert ist (siehe 8). Zusätzlich zum „interstitialen“ Hintergrund (Binter) besteht innerhalb der Region, die von einer amplifizierten DNA-Kolonie eingenommen wird, ein „intrastitialer“ Hintergrund (Bintra). Die Kombination aus diesen zwei Hintergrundsignalen gibt das erreichbare CNR vor und wirkt sich somit direkt auf die Anforderungen bzgl. Optikinstrumenten, die Kosten für Aufbauten, für Reagenzien, die Durchlaufzeiten, Kosten/Genom und letztlich auf die Exaktheit und Datenqualität für Sequenzierungsanwendungen, die auf einer zyklischen Anordnung beruhen, aus. Das Binter-Hintergrundsignal entsteht aus einer Vielfalt an Quellen; einige Beispiele sind die Autofluoreszenz von aufbrauchbaren Durchflusszellen, die unspezifische Adsorption von Nachweismolekülen, die unechte Fluoreszenzsignale ergeben, welche das Signal aus der ROI überdecken können, das Vorhandensein unspezifischer DNA-Amplifikationsprodukte (z. B. jene, die aus Primer-Dimeren entstehen). In typischen Anwendungen der Sequenzierung der neuen Generation (NGS) wird das Hintergrundsignal im jeweils aktuellen Sichtfeld (FOV) zeitgemittelt und subtrahiert. Das Signal, das aus einzelnen DNA-Kolonien entsteht (d. h. (S) - Binter im FOV) ergibt ein erkennbares Merkmal, das klassifiziert werden kann. In einigen Fällen kann der intrastitiale Hintergrund (Bintra) ein störendes Fluoreszenzsignal beitragen, das nicht für das interessierende Ziel spezifisch ist, aber in derselben ROI vorliegt und das Mitteln und Subtrahieren damit um Einiges schwieriger macht.
  • Wie in den Beispielen weiter unten aufgezeigt, kann die Umsetzung einer Nukleinsäureamplifikation auf die Substrate mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung das Hintergrundsignal Binter durch Verringern der unspezifischen Bindung reduzieren, Verbesserungen der spezifischen Nukleinsäureamplifikation ergeben und eine Verringerung der unspezifischen Amplifikation ergeben, was sich auf das Hintergrundsignal auswirken kann, das sowohl aus der interstitialen als auch intrastitialen Region entsteht. In einigen Fällen können die offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung, die optional in Kombination mit den offenbarten Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsreaktionsformulierungen verwendet werden, Verbesserungen des CNR um einen Faktor von einem 2-, 5-, 10-, 100- oder 1000-Fachen gegenüber jenem ergeben, das unter Verwendung herkömmlicher Träger und Hybridisierungs-, Amplifikations- und/oder Sequenzierungsprotokolle erreicht wird. Obwohl sie hier im Kontext des Verwendens der Fluoreszenzbildgebung als Auslese- oder Nachweismodus beschrieben werden, gelten die gleichen Prinzipien für die Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung und Nukleinsäurehybridisierungs- und Amplifikationsformulierungen auch für andere Nachweismodi, einschließlich sowohl optischer als auch nicht optischer Nachweismodi.
  • Die offenbarten Träger mit geringer Bindung, die optional in Kombination mit den offenbarten Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsprotokollen verwendet werden, ergeben Festphasenreaktionen, die aufweisen: (i) eine unerhebliche unspezifische Bindung von Protein und anderen Reaktionskomponenten (weshalb sie den Substrathintergrund minimieren), (ii) unerhebliches unspezifisches Nukleinsäureamplifikationsprodukt und (iii) die abstimmbare Nukleinsäureamplifikationsreaktionen bereitstellen. Wenngleich sie vorliegend primär im Zusammenhang mit Nukleinsäurehybridisierungs-, -amplifikations- und -sequenzierungsassays beschrieben werden, ergibt es sich für Fachleute, dass die offenbarten Träger mit geringer Bindung in einem jeden von einer Vielfalt an anderen Bioassayformaten verwendet werden können, darunter Sandwich-Immunassays, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) usw.
  • System: In der vorliegenden Schrift sind Systeme zum Vornehmen von Basenunterscheidungs- oder Basenklassifikationsreaktionen unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Oberfläche bereitgestellt. Zudem ist ein System zum Vornehmen eines oder mehrerer Schritte eines beliebigen vorliegend offenbarten Sequenzierungsverfahrens bereitgestellt. Optional beinhaltet das System Komponenten und Reagenzien, die zum Koppeln der Oligonukleotidmoleküle, Hybridisieren von Probe- oder Zielnukleinsäuren an die angelagerten Oligonukleotidmoleküle und Nachweisen oder Abbilden des Signals auf der Oberfläche notwendig sind.
  • Zudem ist ein System zum Vornehmen eines oder mehrerer Schritte eines beliebigen vorliegend offenbarten Sequenzierungsverfahrens bereitgestellt. Optional beinhaltet das System Komponenten und Reagenzien, die zum Analysieren der Sequenz der Nukleinsäuren in derartigen Sequenzierungstechniken erforderlich sind, welche auf dem Nachweises von fluoreszierenden Nukleotiden oder Oligonukleotiden beruhen. Die Nachweisinstrumente, die zum Ablesen der Fluoreszenzsignale in derartigen Anordnungen verwendet werden, können entweder auf Epifluoreszenzmikroskopie oder interner Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie beruhen. Ein Nachweisinstrument ist vorgeschlagen worden, das ein optischen Lesegerät der Sequenzierung per Synthese verwendet. Das Lesegerät kann einen Laser aufweisen, der eine Fluoreszenz von einer Probe in Wasserkanälen einer Durchflusszelle induziert. Die Fluoreszenz wird durch optische Bildgebungselemente emittiert und eingefangen, die eine oder mehrere Objektivlinsen und Tubuslinsen umfassen. Zu den optischen Bildgebungsvorrichtungen gehören u. a. eine Lichtquelle zum Beleuchten einer Probe in der interessierenden Region, ein oder mehrere Detektoren und optische Komponenten zum Lenken von Licht von der interessierenden Region auf den bzw. die Detektor(en). Zu den optischen Bildgebungsvorrichtungen kann auch ein Fokusmechanismus gehören, der den Fokus der optischen Komponenten auf die interessierende Region hält, damit auf den Detektoren einfallendes Licht scharf eingefangen wird.
  • Verfahren zur Basenpaarklassifizierung: Vorliegend sind Verfahren zum Vornehmen von Nukleinsäurebasenpaarunterscheidungen oder zur Basenpaarklassifizierung bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Oberfläche; wobei die Oberfläche umfasst: i) ein Substrat; ii) mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht; iii) eine Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen, die an mindestens einer hydrophilen Polymerüberzugsschicht angelagert sind; und ivv) mindestens eine separate Region der Oberfläche, die eine Vielzahl von klonal amplifizierten Probenukleinsäuremolekülen, welche an die Vielzahl von angelagerten Oligonukleotidmolekülen annealt sind, umfasst, wobei die Vielzahl annealter klonal amplifizierter Probenukleinsäuremoleküle in einer Oberflächendichte von mindestens 10.000 Molekülen/mm2 vorliegen, b) Vornehmen einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion an Probenukleinsäuremolekülen, bevor oder nachdem sie an die Vielzahl von Oligonukleotidmolekülen annealt werden; und c) Vornehmen einer zyklischen Reihe einzelner Nukleotidbindungs- oder -einbaureaktionen, wobei die Nukleotide mit einem nachweisbaren Marker versehen werden.
  • Vorliegend ist zudem ein Verfahren zum Vornehmen einer Nukleinsäuresequenzierung unter Verwendung der Oberflächen oder des Systems, die vorliegend beschrieben werden, vorgesehen. In einigen Ausführungsformen ist der nachweisbare Marker ein Fluorophor. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei dem nachweisbaren Marker um Cyaninfarbstoff-3 (Cy3), und wobei eine Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche, erfasst unter Verwendung eines umgekehrten Fluoreszenzmikroskops, Olympus IX83, ausgestattet mit 20x, 0,75 NA, einer 532-nm-Lichtquelle, einem Set aus Bandpassfilter und dichroitischem Spiegel, optimiert für eine Langpassanregung von 532 nm, und einem Cy3-Fluoreszenzemissionsfilter, einem dichroitischen Reflektor, Semrock, 532 nm, und einer Kamera (Andor sCMOS, Zyla 4.2), unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einem Puffer eingetaucht ist, was nach Bindung oder Einbau eines ersten mit Cy3 markierten Nukleotids erfolgt, ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) von mindestens 20 aufweist.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäureamplifikationsreaktion eine Brückenamplifikationsreaktion. In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäureamplifikationsreaktion eine Reaktion einer isothermen Brückenamplifikation. In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäureamplifikationsreaktion eine Reaktion einer Rolling-Circle-Amplifikation (RCA). In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäureamplifikationsreaktion eine Amplifikationsreaktion mittels Helikase. In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäureamplifikationsreaktion eine Amplifikationsreaktion mittels Rekombinase. In einigen Ausführungsformen weist die mindestens eine hydrophile Polymerüberzugsschicht einen Wasserkontaktwinkel von unter 50 Grad auf.
  • BEISPIELE
  • Diese Beispiele sind allein zur Veranschaulichung bereitgestellt und schränken den Umfang der vorliegend bereitgestellten Ansprüche nicht ein.
  • Beispiel 1 - Hydrophile Substrate
  • Die Studien wurden durchgeführt, um Trägeroberflächen mit geringer unspezifischer Bindung unter Verwendung von Poly(ethylenglycol)(PEG)-Molekülen mit unterschiedlicher Molekülmasse und unterschiedlichen funktionellen Endgruppen zu präparieren. Eine oder mehrere PEG-Schichten wurden mittels Silankupplung an die funktionellen Endgruppen an eine Glasoberfläche gebunden. Beispiele für funktionelle Gruppen, die verwendet werden können, sind u. a. Biotin, Methoxyether, Carboxylat, Amin, NHS-Ester, Maleimid und bis-Silan. Oligonukleotidprimer mit verschiedenen Basensequenzen und Basenmodifikationen wurden mit unterschiedlichen Dichten an die Oberflächenschicht angebunden. Sowohl die Dichte der funktionellen Gruppen auf der Oberfläche als auch die Oligonukleotidkonzentration wurden variiert, um bestimmte Bereich der Primerdichte zu erzielen. Des Weiteren kann die Primerdichte durch Verdünnen eines Oligonukleotids mit anderen Molekülen, welche die gleiche funktionelle Gruppe tragen, kontrolliert werden. So kann zum Beispiel ein mit Amin markiertes Oligonukleotid mit aminmarkiertem Polyethylenglycol verdünnt werden; dies erfolgt in einer Reaktion mit einer mit NHS-Ester überzogenen Oberfläche, um die finale Primerdichte zu reduzieren. Primer, die unterschiedliche Längen eines Verbindungsstücks umfassen, das zwischen der Hybridisierungsregion und der funktionellen Oberflächenanlagerungsgruppe positioniert ist, können ebenfalls angewendet werden, um die Dichte zu kontrollieren. Zu beispielhaften Linkern zählen Poly-T- und Poly-A-Stränge (einer Länge von 0 bis 20 Basen) am 5'-Ende des Primers, PEG-Linker (3 bis 20 Einheiten lang) und Kohlenwasserstoffketten-Linker unterschiedlicher Längen (z. B. C6, C12, C18 usw.). Zum Messen der Primerdichte wurden mittels Fluoreszenz markierte Primer an die Oberfläche immobilisiert, und die Fluoreszenzablesung wurde mit jener einer Farbstofflösung bekannter Konzentration verglichen.
  • Substratoberflächen mit geringer unspezifischer Bindung (vorliegend auch als „passivierte“ Substratoberflächen bezeichnet) sind wünschenswert, damit Biomoleküle wie bspw. Protein und Nukleinsäuren, nicht an den Oberflächen „ankleben“. Beispiele für Oberflächen mit geringer unspezifischer Bindung (Oberflächen mit geringer NSB), die unter Verwendung standardmäßiger Monoschicht-Oberflächen-Zubereitungen und verschiedener Glasoberflächenbehandlungen präpariert wurden, sind nachstehend bereitgestellt. Das erfolgreiche Vornehmen einer Nukleinsäureamplifikation auf passivierten Oberflächen stellt eine besondere Herausforderung dar. Da passivierte, hydrophile Oberflächen eine ultrageringe NSB von Proteinen und Nukleinsäuren aufweisen, müssen neuartige Bedingungen genutzt werden, um eine hohe Passivierung, verbesserte Reaktionseffizienzen für die Primer-Ablagerung, Hybridisierungsbedingungen zu erreichen und eine effektive Nukleinsäureamplifikation zu induzieren. Für Prozesse der Festphasen-Nukleinsäurehybridisierung und -amplifikation ist die Anlagerung einer Nukleinsäurematrize an die Oberfläche mit geringer Bindung oder passivierte Oberfläche und eine darauffolgende Proteinabgabe und -bindung an die Oberfläche erforderlich. Eine Kombination aus einer neuen Formulierung zur Primeroberflächenkonjugation (mittels Cy3-Oligonukleotidtransplantationstitrierung identifiziert) und dem daraus resultierenden ultrageringen unspezifischen Hintergrund (unter Verwendung von Funktionstestergebnissen zur NSB für roten und grünen Farbstoff bewertet) demonstriert die Brauchbarkeit dieser Herangehensweisen.
  • Um die Primerdichte zu skalieren und hydrophilen oder amphoteren Oberflächen eine zusätzliche Dimensionalität zu verleihen, wurden mehrschichtige Überzüge unter Verwendung von PEG und anderen hydrophilen Polymeren angewendet und getestet. Durch das Verwenden von Herangehensweisen der Schichtenbildung von hydrophilen und amphoteren Oberflächen, die u. a. die hier beschriebenen Polymer/Copolymermaterialien beinhalten, ist es möglich, die Primerbeladung auf der Trägeroberfläche beträchtlich zu erhöhen. Von herkömmlichen Trägern mit PEG-Überzug, für die ein Prozess der monoschichtigen Primerablagerung verwendet wird, wurde im Falle von Anwendungen der Einzelmolekülsequenzierung berichtet; sie ergeben allerdings keine hohen Kopienanzahlen zur Nukleinsäureamplifikation. Vorliegend offenbaren wir, dass eine „Schichtenbildung“ mithilfe traditioneller Vernetzungsherangehensweisen und von chemiekompatiblen Monomer- und Polymeruntereinheiten bewerkstelligt werden kann, sodass eine oder mehrere stark vernetzte Schichten sequenziell gebildet werden können. Zu nicht einschränkenden Beispielen für Polymere, die zur Verwendung geeignet sind, zählen u. a. Streptavidin, Polyacrilamid, Polyester, Dextram, Polylysin, Polyethylenglycol und Polylysincopolymere, Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglycol)methylethermethacrylat (POEGMA), Polyester, Dextran, Polylysin, Polyethylenglycol (PEG), Polyacrylsäure (PAA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylimidazol) und Polylysincopolymere. Die verschiedenen Schichten können mithilfe einer beliebigen von einer Vielfalt an kovalenten oder nichtkovalenten Reaktionen aneinandergefügt werden, darunter Biotin-Streptavidin-Bindung, Azid-Alkin-Click-Reaktionen, Amin-NHS-Ester-Reaktionen, Thiol-Maleimid-Reaktionen und ionische Wechselwirkungen zwischen positiv geladenen Polymeren und negativen geladenen Polymeren. Es ist auch denkbar, dass diese Materialien mit hoher Primerdichte in einer Lösung gebildet und anschließend in mehreren Schritten auf die Oberfläche geschichtet werden können. Mit dieser Herangehensweise ist es möglich, Substratoberflächen mit geringer NSB/geringem Hintergrund (9-13) zum Vornehmen chemischer Reaktionen der Festphasen-Nukleinsäureamplifikation und -sequenzierung zu erzeugen, die eine signifikant verbesserte Nukleinsäureamplifikation bereitstellen, sodass die Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse abgestimmt werden können, um die Notwendigkeiten einer jeweiligen Sequenzierungsanwendung zu erfüllen (14 und 15).9 stellt ein Beispiel für Bilddaten bereit, die aus einer Studie zum Bestimmen der relativen Grade der unspezifischen Bindung eines grün fluoreszierenden Farbstoffs an Glassubstratoberflächen stammen, welche gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden. 10 stellt ein Beispiel für Bilddaten bereit, die aus einer Studie zum Bestimmen der relativen Grade der unspezifischen Bindung eines rot fluoreszierenden Farbstoffs an Glassubstratoberflächen, die gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden, stammen. 11 stellt ein Beispiel für Daten aus einer Oligonukleotidprimer-Transplantation im Falle von Substratoberflächen bereit, die gemäß verschiedenen Protokollen zur Oberflächenmodifikation behandelt wurden.
  • Verfahren zum Präparieren einer 2-schichtigen PEG-Oberfläche mit Thiol-Maleimid-Chemie: Ein Objektträger wurde mittels 30-minütiger Behandlung mit 2 M KOH bei Raumtemperatur gereinigt, gewaschen, woraufhin Oberflächen-Silanolgruppen mit Sauerstoffplasma aktiviert wurden. Silan-PEG5K-Thiol (Creative PEGWorks, Inc., Durham, NC, USA) wurde bei einer Konzentration von 0,1 % in Ethanol angewendet. Nach einer 2-stündigen Überzugsreaktion wurde der Objektträger gründlich mit Ethanol und Wasser gewaschen und anschließend 30 Minuten lang mit 2,5 mM Maleimid-PEG-Succinimidyl-Valerat (Molekülmasse = 20 K) in Dimethylformamid (DMF) umgesetzt. Die so entstandene Oberfläche wurde gewaschen und sofort 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Oligonukleotidprimer, markiert mit 5'-Amin, in Reaktion gebracht. Überschüssige Succinimidylester auf der Oberfläche wurden deaktiviert durch Umsetzen mit 100 mM Glycin bei einem pH-Wert von 9, gefolgt von der Primer-Immobilisierung.
  • Verfahren zum Präparieren einer mehrschichtigen PEG-Oberfläche mit NHS-Ester-Amin-Chemie: Ein Objektträger wird durch 30-minütige Behandlung mit 2 M KOH bei Raumtemperatur gereinigt, gewaschen, woraufhin Oberflächen-Silanolgruppen mit Sauerstoffplasma aktiviert werden. Silan-PEG2K-Amin (Nanocs, Inc., New York, NY, USA) wird bei einer Konzentration von 0,5 % in einer Ethanollösung angewendet. Nach einer 2-stündigen Überzugsreaktion wurde der Objektträger gründlich mit Ethanol und Wasser gewaschen. 100 µM von 8-Arm-PEG-NHS (Molekülmasse = 10 K, Creative PEGWorks, Inc., Durham, NC, USA) wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Lösungsmittelzusammensetzung eingebracht, die 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Prozent organisches Lösungsmittel und 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Prozent Puffer mit geringer Ionenstärke beinhalten kann. Die so entstandene Oberfläche wurde gewaschen und 2 Stunden mit 20 µM Mehrarm-PEG-Amin (Molekülmasse = 10 K, Creative PEGWorks, Inc., Durham, NC, USA) umgesetzt. Die entstandene Amin-PEG-Oberfläche wurde daraufhin mit einem Gemisch aus Mehrarm-PEG-NHS und mit Amin markiertem Oligonukleotidprimer bei variierenden Konzentrationen in Reaktion gebracht. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um zusätzliche PEG-Schichten auf der Oberfläche zu bilden.
  • Isotherme Festphasen-Amplifikation: Im Hinblick auf verschiedene isotherme Amplifikationsverfahren lässt sich zeigen, dass jedes isotherme Amplifikationsverfahren einen eigenen optimalen Bereich für die Primerdichte hat, wofür abstimmbare Oberflächenüberzüge erforderlich sind, um die Amplifikationseffizienz zu maximieren. In einigen Fällen besteht ein Zusammenhang zwischen einer höheren Primeroberflächendichte und höheren Anzahlen an Matrizenkopien (15). In einigen Fällen können höhere Oberflächendichten an Primern im Falle mancher Amplifikationsherangehensweisen zwar höhere Vordergrundsignale (d. h. sequenzspezifische Signale) ergeben, im Falle anderer Amplifikationsherangehensweisen jedoch zu hohen Hintergrundsignalen führen und sich damit als nachteilig erweisen. Oben in 16 sind Konzentrationen der Primerablagerung gezeigt; in den Aufnahmen, die von der entstandenen Oberfläche infolge der isothermen Amplifikationsreaktion erfasst wurden, sind dagegen die verschiedenen getesteten Helikase-Formulierungen für die isotherme Amplifikation angegeben. Es wurde davon ausgegangen, dass die Aufnahme jeder Oberfläche rot erscheint, wenn eine spezifische Amplifikation erfolgt war. Wie sich bei Formulierung „58“ in der Aufnahmereihe in 16 erkennen lässt, änderte sich die Farbe bei steigender Primerdichte von Rot zu Grün, was auf eine Verringerung der spezifischen Amplifikation hinweist. Des Weiteren lässt sich erkennen, dass sich durch Zusetzen von Betain (einem gebräuchlichen Pufferzusatzstoff) zur Amplifikationsreaktionsformulierung der Grad der unspezifischen Amplifikationsreaktion zugunsten einer spezifischen Amplifikationsreaktion verringert, was hellere Signale und ein verbessertes CNR ergibt. Die Kombination aus geschichteten Trägeroberflächen mit geringer Bindung, abstimmbaren Oberflächendichten an Primern, Verbesserungen von Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsreaktionsformulierungen (einschließlich Anpassungen von Pufferbestandteilen und -zusatzstoffen (z. B. Wahl des Puffers, pH-Werts, Lösungsmittels, der Ionenstärke, von Detergenzien, Formamid, Betain, Agenzien zur Massebildung und anderen Zusatzstoffen usw.)) und dadurch entstehende Verbesserungen der Amplifikationsraten und - spezifität sollte völlig neue Verbesserungen in der Sequenzierung der nächsten Generation von Nukleinsäuren ergeben.
  • Die vorliegende Offenbarung begegnet den Herausforderungen, die sich durch das Erreichen einer stark monoklonalen Amplifikation von Nukleinsäuresträngen, die als Bibliothek dienen, auf hydrophilen Substraten für eine Vielfalt an Anwendungen stellen, für welche eine Signalverstärkung erforderlich ist, etwa Nukleinsäurenachweis, -sequenzierung und Diagnoseanwendungen. Herkömmliche isotherme Verfahren der Nukleinsäureamplifikation zum Erzeugen monoklonaler Cluster eines als Bibliothek dienenden Nukleinsäurestrangs gehen mit Beschränkungen und Schwachstellen einher. Beispiele für ihre Leistungsbeschränkungen sind u. a. lange Clusterbildungszeiten (z. B. 2+ Stunden), die Notwendigkeit hoher Temperaturen (z. B. 60 °C oder mehr), die Unfähigkeit der effizienten Amplifikation/Clusterbildung auf bestimmten Oberflächen, hohe Kosten, Probleme aufgrund der Polyklonalität, aufgrund der Stabilität von Reagenzien usw. Trotz der Fülle an isothermen Amplifikationsverfahren, die in der Fachliteratur beschrieben werden, gibt es nur ein oder zwei Verfahren, die erfolgreich auf gewerbliche Sequenzierungsanwendungen angewendet werden konnten. Hier schlagen wir isotherme Amplifikationsstrategien vor, anhand derer sich erfolgreich Cluster monoklonaler Kopien eines Fragments von als Bibliothek dienender DNA (oder einer anderen Nukleinsäure) für Anwendungen wie bspw. die DNA-Sequenzierung erzeugen und die vorgenannten Probleme beheben oder eingrenzen lassen.
  • Die Gestaltungskriterien zum Entwickeln allgemeiner Änderungen von Zusammensetzungen für die DNA-Amplifikation/DNA-Sequenzierung zum Verringern von Hintergrundsignalen (Binter und Bintra) und Fördern einer kontrollierten DNA-Amplifikation auf Substraten mit geringer Bindung beinhalteten: (i) verringerte unspezifische DNA-Amplifikation (bspw. aufgrund der Amplifikation von Primer-Dimeren) in interstitialen Regionen (Binter) im Vergleich zu traditionellen Herangehensweisen/Herangehensweisen im Stand der Technik, (ii) verringerte Mengen an unspezifischem DNA-Amplifikationsprodukt (z. B. Primer-Dimeren) in spezifischen DNA-Kolonien (Bintra) im Vergleich zu traditionellen Herangehensweisen/Herangehensweisen im Stand der Technik, (iii) erhöhte Kontrolle der spezifischen DNA-Amplifikation (z. B. Reaktionszeiten, Zykluszeiten, Primeroberflächendichtetitrierung, Primeroberflächendichte, Primersequenz usw.) auf Substraten mit geringer Bindung, sodass das Signal-zu-Hintergrund(S/B)-Verhältnis selbst ohne Verbesserungen von Hybridisierungs- und Amplifikationsformulierungen reduziert wird.
  • Beispiel 2 - Amplifikation mittels Helikase auf Oberflächen mit geringer Bindung mit verbesserter Spezifität
  • Es ist allgemein bekannt, dass die Amplifikation mittels Helikase stark für unspezifische Amplifikation, etwa Primer-Dimer-Bildung, anfällig ist. Wir können diese unspezifische Amplifikation auf der Oberfläche durch eine beliebige Kombination der folgenden Verfahren reduzieren: (i) Gestalten von Oligonukleotidprimern, das weniger Primer-Dimer hervorbringt, (ii) Anpassen der Primeroberflächendichte auf der mehrschichtigen Trägeroberfläche, (iii) Vornehmen der Reaktion bei höheren Temperaturen unter Verwendung von thermophilen Enzymen, (iv) Verwenden von Amplifikationspufferzusatzstoffen wie den weiter oben genannten in Kombination mit Primersequenzen ohne Selbst-Priming und (v) Hinzuziehen eines oder mehrerer Schritte der vollständigen Nukleinsäuredenaturierung und Primerhybridisierung.
  • Spezifische Amplifikation mittels Helikase auf Oberflächen mit geringer NSB ohne SSB-Protein: Eine Amplifikation mittels Helikase von linearen Matrizensträngen kann mit reduzierter unspezifischer Amplifikation und hoch effizienter klonaler Amplifikation auf Oberflächen mit geringer Bindung erreicht werden. Ein Vorwärtsprimer auf der Oberfläche wird unter Verwendung eines Polymerase und Helikase enthaltenden Amplifikationsreaktionsgemischs an einem einzelsträngigen als Bibliothek dienenden Matrizenstrang verlängert. Anschließend wird der Matrizenstrang optional denaturiert und weggewaschen. Alternativ kann durch die Aktivität der Helikase ein Doppelstrang entspiralisiert werden. Jedes der Verfahren ergibt eine Verlängerung des Vorwärtsstrangs von dem an die Oberfläche konjugierten Primer, teilweise oder ganz in einzelsträngiger Form. Daraufhin hybridisiert ein oberflächengebundener Rückwärtsprimer an diesen Vorwärtsstrang und wird ebenfalls verlängert, wodurch eine doppelsträngige Brückenstruktur geschaffen wird. Die in dem Reaktionsgemisch vorliegende Helikase entspiralisiert die zwischenliegenden doppelsträngigen Ampliconstränge, die dann zum erneuten Hybridisieren an andere freie oberflächengebundene Primer für nachfolgende Amplifikationsrunden verfügbar sind. Der Grad der Entspiralisierung muss dafür nicht groß sein - nur ausreichend, um Primerhybridisierungsregionen in einzelsträngige Komponenten (Ausfransen der Enden) umzuwandeln, um die Hybridisierung nachfolgender oberflächenkonjugierter Primer zu ermöglichen. Die in dieser Reaktion verwendete Helikase sollte in der Lage sein, eine Entspiralisierung ab den Enden der Brückenstruktur einzuleiten; sie kann entweder eine 3'-zu-5'-Helikase oder eine 5'-zu-3'-Helikase sein. In einigen Fällen kann die Helikase eine der Superfamilie 1, 2, 3 4, 5 oder 6 sein. In einigen Fällen kann sie eine hoch prozessive Helikase sein (d. h., sie ist in der Lage, viele aufeinanderfolgende Basenpaare zu entspiralisieren, ohne die einzelsträngige oder doppelsträngige Struktur zu lösen), oder eine Helikase mit begrenzter Prozessivität. In diesem Amplifikationsschema können bestimmte Mutanten der Helikasen der Superfamilie 1, die eine höhere Prozessivität aufweisen, bspw. der Mutant UvrD303 der Helikase UvrD, verwendet werden.
  • Um die Entspiralisierung durch 5'-zu-3'-Helikasen zu fördern, kann einer oder können beide oberflächengebundene Primer in ihrer Gesamtheit oder teilweise Modifikationen aufweisen, um spezifische Aufbringungsstellen für die 5'-zu-3'-Helikase zu schaffen. An einer Matrizennukleinsäure, die von einem solchen Primer ausgehend verlängert wird, würde die Modifikationsstelle als Polymerasestopppunkt dienen, wodurch der Abschnitt der Primersequenz zwischen dem Oberflächenkonjugationspunkt und der Modifikationsstelle stets in einzelsträngiger Form zurückgelassen wird. Dieser Abschnitt würde als Aufbringungsstelle für Helikasen dienen, die von 5' zu-3' ausgerichtet sind, da viele Helikasen eine viel bessere Bindungsaffinität für einzelsträngige Nukleinsäure besitzen, wodurch die Entspiralisierungsaktivität der 5'-zu-3'-Helikase an die Stellen gelenkt und dort verstärkt wird, an denen sie für die Amplifikation mittels Helikase auf der Trägeroberfläche benötigt wird. Zu Beispielen für Primermodifikationen, die verwendet werden können, zählen u. a. ein Einschub einer PEG-Kette in die Hauptkette des Primers zwischen zwei Nukleotiden zum 5'-Ende hin, ein Einschub eines abasischen Nukleotids (d. h. eines Nukleotids, das weder eine Purin- noch Pyrimidinbase besitzt) oder eine Läsionsstelle, die von der Helikase umgangen werden kann.
  • Viele Helikasen besitzen Cofaktor-Proteine und spezifische Konformationen, welche die Helikaseaktivität aktivieren oder verstärken. Zu Beispielen zählen u. a. das RepD-Protein im Falle der PcrA-Helikase von Bst, das Phi-X-Gen-Protein A im Falle der E.-coli-Rep-Helikase und das MutL-Protein im Falle der UvrD-Helikase. Der Zusatz dieser akzessorischen Proteine kann die gewünschte Entspiralisierungsaktivität effektiver aktivieren und damit die isotherme Amplifikation mittels Helikase weiter fördern. Manche dieser Cofaktoren besitzen spezifische Bindesequenzen oder Molekülteile, welche an die Primer angefügt werden können, um die Entspiralisierungsaktivität anzuleiten.
  • Formulierungen für die Amplifikation mittels Helikase zeigten eine verringerte unspezifische Amplifikation bei Verwendung einer mesophilen Helikase und einer Strangverdrängungspolymeraseformulierung, die kein einzelsträngiges Bindungs(SSB)-Protein aufwies (z. B. Formulierung Nr. 58 in dieser Schrift). Anders als bei den meisten Herangehensweisen der Amplifikation mittels Helikase der Fall, wurde beobachtet, dass der Ausschluss von einzelsträngigem Bindungsprotein (typischerweise verwendet, um die vorübergehende unspezifische Hybridisierung zu stören) aus der Formulierung die unspezifische Amplifikation reduziert. Bei einer Vielfalt von Formulierungsänderungen wurde gezeigt, dass sie den Anstieg der unspezifischen Hybridisierung auf Oberflächen mit geringer Bindung abschwächen.
  • Änderung der Zusammensetzung von Formulierungen für verbesserte Amplifikation mittels Helikase: Zusatzstoffe wie Betain verringern, wie allgemein bekannt, die unspezifische Amplifikation im Falle isothermer Amplifikationsreaktionen, die in einer Lösung vorgenommen werden. Die Kriterien werden restriktiver, da hohe Primeroberflächendichten erforderlich sind, um eine abstimmbare Amplifikation und eine hohe Kopienanzahl in Kolonien von Matrizennukleinsäure zu unterstützen. Bei einer hohen Primerdichte beginnt die unspezifische Amplifikation, die Vorteile einer hohen Matrizenkopienanzahl in den entstehenden Kolonien zu fördern (16). Infolgedessen wurden zusätzliche Zusatzstoffformulierungen entdeckt, welche die unspezifische Amplifikation in einer Matrizennukleinsäurekolonie begünstigen. In dem in 16 gezeigten Beispiel lässt sich eindeutig erkennen, dass der Zusatz von Betain zu Formulierung Nr. 58 für eine spezifischere Amplifikation (worauf die rote Farbe hinweist) auf Oberflächen mit höherer Primerdichte sorgt. Zusätzlich zu Betain ist es möglich, viele verschiedene Komponenten von Reaktionsformulierungen zu kombinieren, um eine höhere Amplifikationsspezifität in einer Lösung und auf einer Oberfläche mit geringer Bindung zu erreichen (17 und 18).
  • Organische Lösungsmittel wie Acetonitril, DMSO, DMF, Ethanol, Methanol und ähnliche Verbindungen verändern die Struktur einzelsträngiger und doppelsträngiger Nukleinsäuren über einen Prozess der Oligonukleotiddehydrierung. Verbindungen wie 2-Pyrrolidon und Formamid verringern bekanntermaßen die Schmelztemperatur von Nukleinsäuren und reduzieren die Sekundärstruktur von Oligonukleotiden mit hohem GC-Gehalt. Von Agenzien zur Massebildung ist ebenfalls bekannt, dass sie die Struktur von Nukleinsäure stabilisieren. Puffer mit niedrigem pH-Wert begünstigen die Hybridisierung und Wasserstoffbrückenbildung bei der Basenpaarung. Wenn man die verschiedenen Eigenschaften jeder dieser jeweiligen Formulierungen kombiniert, ist es möglich, das spezifische Annealing von Oligonukleotidsequenzen im Vergleich zu traditionellen Herangehensweisen um mehr als 2 Größenordnungen zu steigern. Indem diese Verbindungen kombiniert und den unten beschriebenen Amplifikationsformulierungen zugesetzt werden, wird die unspezifische Amplifikation, die bspw. durch Primer-Dimere entsteht, drastisch verringert, und gute Ausbeuten von spezifischem Amplifikationsprodukt werden nach wie vor in einer Lösung (17) und auf den offenbarten Oberflächen mit geringer NSB (18) beobachtet.
  • Beispiel 3 - Modifizierte Rolling-Circle-Multiple-Displacement-Amplifikation (modifizierte RCA-MDA)
  • Fragmente einer Nukleinsäurebibliothek werden an Adaptorsequenzen (die Vorwärts-, Rückwärts- und Sequenzierungsprimer und beliebige Identifizierungs-/Barcodesequenzen enthalten) ligiert und entweder in der Lösung oder auf der Oberfläche mit geringer Bindung zirkularisiert.
  • Zirkularisierte ssDNA wird anschließend entweder in einer Lösung oder auf der Oberfläche durch einen Oberflächenvorwärtsprimer eingefangen oder daran hybridisiert und durch eine Strangverdrängungspolymerase, die einzelsträngige konkatemere Kopien der als Bibliothek dienenden Nukleinsäure und Adaptorsequenzen anfertigt, in einer RCA-Reaktion verlängert. Rückwärtsprimer hybridisieren an mehreren Stellen an diese konkatemere Vorwärtsmatrize und werden mithilfe des RCA-Reaktionsgemischs verlängert, wodurch konkatemere Umkehrkopien angefertigt werden. Während dieses Vorgangs werden Umkehrstränge voneinander verdrängt. Eine strangaufwärtige Umkehrstrangverlängerung würde die strangabwärtige Verlängerung verdrängen, wodurch einzelsträngige konkatemere Umkehrstränge gebildet werden. Der Zusatz von Helikasen kann die Erzeugung einzelsträngiger Nukleinsäureregionen bewirken, die lange genug Bestand haben, um die Hybridisierung neuzustarten und Verdrängungskaskaden auszulösen, was die Anzahl der Amplifikationskopien auf relativ kontrollierte Art und Weise erhöhen kann. Alternativ kann der Zusatz von Rekombinasen und akzessorischen Proteinen eine Hybridisierung von Primern in die homologen Regionen als Doppelstrang vorliegender DNA bewirken, was in einem als Stranginvasion bezeichneten Vorgang erfolgt. Dies wird die Verdrängung und Hybridisierungskaskaden neustarten und die Kopienanzahl in der Kolonie erhöhen.
  • Die Kopienanzahl in den RCA-MDA-Kolonien wird anhand der Primeroberflächendichte bestimmt, die vorgibt, wie oft und erfolgreich die anfänglichen Konkatemere oder verdrängten Konkatemere mit den Vorwärts- und den Rückwärtsprimern hybridisiert sind. Wie sich gezeigt hat, bringt eine erhöhte Primerdichte auf Oberflächen mit geringer Bindung höhere Amplifikationskopienzahlen in diesen Clustern hervor (15). Zusammengefasst ist es möglich, unter Verwendung eines der folgenden Verfahren oder einer Kombination daraus die Kopienanzahl oder spezifische Amplifikation zu erhöhen und die unspezifische Amplifikation auf Oberflächen mit geringer Bindung zu verringern: (i) die spezifische Kopienanzahl kann durch Erhöhen der Effizienz von Primermatrizenhybridisierungen durch Formulierungsänderungen erhöht werden (16), (ii) die spezifische Kopienanzahl kann durch Erhöhen der Primerdichte auf Substraten mit geringer Bindung erhöht werden (14 und 15), (iii) die unspezifische Amplifikation von Primer-Dimeren oder die Bildung chimärer DNA kann durch Verwenden der vorbeschriebenen Zusatzstoffe verringert werden, (iv) Amplifikationsinkubationstemperaturen können unter Verwendung thermostabiler Enzyme in Kombination mit Formulierungsänderungen, wie weiter oben beschrieben, erhöht werden, um die unspezifische Amplifikation zu reduzieren, (v) Primerzusammensetzungen, die Primersequenzen ohne Selbsthybridisierung umfassen, können in Kombination mit Zusatzstoffen und/oder erhöhten Amplifikationsinkubationstemperaturen verwendet werden, um die unspezifische Primer-Dimer-Amplifikation zu verringern.
  • Beispiel 4 - Durch Einzelstrang-DNA-bindende (SSB-)Proteine vermittelte isotherme Amplifikation
  • SSB-Proteine, die Sekundärstrukturen in Nukleinsäuresträngen lösen können, stabilisieren die einzelsträngige DNA nach der Entspiralisierung, verhindern oder stören die nicht extensive Hybridisierung von zwei Nukleinsäuresträngen (ein Vorläufer der Primer-Dimer-Amplifikation), fördern die spezifische Hybridisierung kurzer Oligonukleotide an die korrekten komplementären Regionen in einem Zieloligonukleotid und interagieren mit Enzymen und leiten diese zu den gegabelten Verbindungsstellen einzelsträngiger und doppelsträngiger Nukleinsäuren. C-terminale Trunkierungsmutationen in SSB heben, wie berichtet wurde, die kooperative Bindung an ssDNA auf, wohingegen seine Monomere eine stärkere Bindung an ssDNA aufweisen und die Schmelztemperatur von dsDNA reduzieren. Beispielsweise ergibt eine C-terminale Trunkierungsmutation eines Phagen-SSB-Proteins, T4 gp32, ein Protein (gp32ΔC), das die Schmelztemperatur von dsDNA im Vergleich zur Leistung des Wildtypproteins um mehrere zehn Grad reduziert.
  • In diesem Amplifikationsschema verwenden wir diese Proteine in einer Formulierung, die sowohl trunkierte als auch Wildtyp-SSB-Proteine (und Strangverdrängungspolymerase) umfasst, um die Enden der Brückenzwischenelemente von doppelsträngiger Nukleinsäure aufzuschmelzen und eine Oberflächenprimerhybridisierung und Primerverlängerung zuzulassen. Wenngleich SSB die Nukleinsäurehybridisierung verlangsamt, fördert es, wie bekannt ist, die spezifische Hybridisierung im Allgemeinen. Daher könnte die Verwendung von trunkierten SSB-Proteinen wie bspw. T4 gp32ΔC eine effizientere Hybridisierung der 3'-Enden in den verbrückten Nukleinsäurestrukturen an andere freie oberflächengebundene Primer ermöglichen. Dies würde zwar auch die neu gebildeten Primermatrizenkomplexe aufbrechen, doch sollte eine optimierte Formulierung eine Verlängerung derartiger Komplexe durch eine Strangverdrängungspolymerase ermöglichen. SSB-Proteine finden sich in einer Vielfalt von Phagen (zum Beispiel T4 gp32), Bakterien, Archaea, Pilzen und eukaryotischen Organismen. Einige sind thermostabile SSB-Proteine, deren C-terminale trunkierte Formen eine effizientere Aufschmelzung von Nukleinsäureenden bei optimierten höheren Temperaturen ermöglichen könnten, was eine SSBabhängige thermophile Amplifikation ermöglichen würde, während die geringere unspezifische Amplifikation bei höherer Temperatur genutzt werden könnte.
  • Mittels Zusatzstoffen wie den weiter oben genannten, Gestaltung von Primersequenzen und Formulierungen für eine spezifische Hybridisierung und/oder Amplifikation sowie optimierter Temperaturen für die Verwendung mit geeigneten thermisch und chemisch resistenten Enzymen und Proteinen kann dieses Amplifikationsverfahren derart zugeschnitten werden, dass es eine hochspezifische Amplifikation fördert und zugleich die unspezifische Amplifikation ausschließt.
  • Dieses Schema kann zum Amplifizieren sowohl ringförmiger als auch linearer DNA verwendet werden, wobei jede Einleitung einer Verlängerung durch eine Strangverdrängungspolymerase mehrere nachfolgende Ereignisse der Multi-Displacement-Amplifikation hervorrufen kann, durch die konkatemere Kopien der ringförmigen DNA-Matrize entstehen (siehe Abschnitt zur modifizierten RCA-MDA oben).
  • Wir haben festgestellt, dass die durch SSB vermittelte Amplifikation (beispielsweise unter Verwendung von phi29 SSB) von ringförmiger als Bibliothek dienender DNA um Einiges schneller als die traditionelle RCA ist (bspw. sind Amplifikationszeiten von nur 30 Minuten bis 1 Stunde erforderlich, im Gegensatz zu 2 bis 3 Stunden im Falle der traditionellen RCA). Die Produkte der durch SSB vermittelten Amplifikation, vorgenommen in einer Lösung, liefen auf Gelen als getrennte konkatemere Leitern.
  • Beispiel 5 - Brückenamplifikation mit thermischen Zyklen bei niedriger Temperatur auf Oberflächen mit geringer Bindung
  • Mithilfe von Kombinationen aus Zusatzstoffen für verbesserte Hybridisierungs- und/oder Amplifikationsformulierungen, thermostabilen SSB-Proteinen und/oder trunkierten SSB-Proteinen wurden PCR-Formulierungen entwickelt, die bei niedrigeren Temperaturen als in den traditionellen Verfahren, dargelegt in der ursprünglichen Offenbarung der PCR von Mullis, thermischen Zyklen unterzogen werden können. In diesem Schema ist es möglich, Zusatzstoffe zu verwenden, um die Temperaturen für die Nukleinsäurehybridisierung und -dehybridisierung unter deren traditionelle Werte zu bringen. Beispielsweise wird Formamid gemeinhin verwendet, um die Schmelztemperatur (Tm) von DNA zu reduzieren, und eine nachfolgende DNA-Dehybridisierung kann bei einer Temperatur von etwa 60 Grad vorgenommen werden. Andererseits sind für Reannealingtemperaturen auch stufenweise Temperaturänderungen von höheren Temperaturen (95 Grad C) auf nahe Raumtemperatur erforderlich. Es ist möglich, Formulierungen derart zu erzeugen, dass die mit der Reannealingtemperatur verbundenen Stringenzen drastisch verringert werden können. Die Verwendung einer derartigen Formulierung würde insofern eine erhebliche Verbesserung gegenüber traditionellen Verfahren der Brückenamplifikation darstellen, als stufenweise Temperaturänderungen zwischen 20 und 60 Grad vorgenommen werden können. Die Verringerungen der Anforderungen bezüglich der stufenweisen Temperaturänderungen und die verbesserte Hybridisierungsstringenz bei Substraten mit geringer Bindung könnten folgende Vorteile gegenüber der traditionellen Brückenamplifikation verschaffen: (i) reduzierte Amplifikationszeiten; (ii) vereinfachte Gestaltung von Instrumenten, (iii) verringerter Gebrauch von Reagenzien durch schnellere und spezifischere Hybridisierung, was effizientere Amplifikationsraten ergibt, und (iv) reduzierte Kosten für Reagenzien. Es ist auch möglich aufzuzeigen, dass die Stringenz der verbesserten Hybridisierung die Anzahl der Amplifikationszyklen verringern würde, die zur Amplifikation auf der Trägeroberfläche erforderlich sind.
  • 19A-B stellen Beispiele für Daten dar, welche die Verbesserungen hinsichtlich der Hybridisierungseffizienz veranschaulichen, die mithilfe der Träger mit geringer unspezifischer Bindung und der verbesserten Hybridisierungsformulierungen der vorliegenden Offenbarung erlangt werden können (19A), im Vergleich zu jenen im Falle einer herkömmlichen Hybridisierungsformulierung (19B).
  • 20 stellt einen Arbeitsablauf zur Nukleinsäuresequenzierung unter Verwendung der offenbarten Träger mit geringer Bindung und Hybridisierungs-/Amplifikationsreaktionsformulierungen der vorliegenden Offenbarung und nicht einschränkende Beispiele für die Verarbeitungszeiten, die dadurch erreicht werden können, dar.
  • Beispiel 6 - Präparation einer 2-schichtigen PEG-Oberfläche mit Thiol-Maleimid-Chemie
  • Ein Objektträger wird chemisch behandelt, um organische Substanzen zu entfernen und Hydroxylgruppen zur Silankupplung zu aktivieren (verschiedene Verfahren sind u. a. Plasmabehandlung, Piranha-Ätze, basisches Waschen, basische Bäder, Glastempern bei hohen Temperaturen und eine jede Kombination daraus. Silan-PEG5K-Thiol (Creative PEGWorks, Inc) wird bei einer Konzentration von 0,1 % in einer Ethanollösung angewendet. Nach einer 2-stündigen Überzugsreaktion wurde der Objektträger gründlich mit Ethanol und Wasser gewaschen und anschließend 30 Minuten mit 2,5 mM Maleimid-PEG-Succinimidyl-Valerat (Molekülmasse: 20 K) in DMF in Reaktion gebracht. Die so entstandene Oberfläche wird gewaschen und sofort 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Oligonukleotidprimer, markiert mit 5'-Amin, in Reaktion gebracht. Die überschüssigen Succinimidylester auf der Oberfläche werden nach der Primerimmobilisierung mit 100 mM Glycin bei einem pH-Wert von 9 deaktiviert. Diese Herangehensweise verschafft feste Trägeroberflächen mit unwesentlicher, geringer Bindung und eine effiziente iterative Primer- und Polymerkupplung, die traditionelle Methodiken um eine Größenordnung von nahezu 2 übertrifft.
  • Beispiel 7 - Präparation einer mehrschichtigen PEG-Oberfläche mit NHS-Ester-Amin-Chemie
  • Ein Objektträger wird chemisch behandelt, um organische Substanzen zu entfernen und Hydroxylgruppen zur Silankupplung zu aktivieren (verschiedene Verfahren sind u. a. Plasmabehandlung, Piranha-Ätze, basisches Waschen, basische Bäder, Glastempern bei hohen Temperaturen und eine jede Kombination daraus. Silan-PEG-Amin (Nanocs, Inc) wird in einer Konzentration von 0,1 %-2 % in sauberer Ethanollösung angewendet. Nach einer 2-stündigen Überzugsreaktion wurde der Objektträger gründlich mit Ethanol und Wasser gewaschen. Mehrarm-PEG-NHS wird 5-30 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Lösungsmittelzusammensetzung eingebracht, die 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Prozent organisches Lösungsmittel und 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 oder 90 Prozent Puffer mit geringer Ionenstärke beinhalten kann. Die entstandene Oberfläche wird gewaschen und mit Mehrarm-PEG-Amin (Molekülmasse 10 k, Creative PEGWorks, Inc) umgesetzt. Die entstandene Amin-PEG-Oberfläche wird anschließend mit einem Gemisch aus Mehrarm-PEG-NHS und mit Amin markiertem Oligonukleotidprimer bei variierenden Konzentrationen umgesetzt. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um zusätzliche PEG-Schichten auf der Oberfläche zu bilden. Diese Herangehensweise verschafft feste Trägeroberflächen mit unwesentlicher, geringer Bindung und eine effiziente iterative Primer- und Polymerkupplung, die traditionelle Methodiken um eine Größenordnung von nahezu 2 übertrifft.
  • Beispiel 8 - Berechnung des CNR an Clusterdaten
  • Wenn ein Fluoreszenznachweis für Festphasenassays verwendet wird, werden Signale typischerweise durch Anbinden und/oder Amplifizieren von Molekülen generiert, gekoppelt mit oder gefolgt von einer Anlagerung von Reporterfarbstoffmolekülen. Dieser Vorgang bringt sowohl spezifische als auch unspezifische Signale hervor. Die unspezifischen Komponenten werden üblicherweise als unspezifisches Rauschen oder unspezifischer Hintergrund bezeichnet (entstehend entweder aus inter- oder intrastitialen Beiträgen), das bzw. der die Messung des spezifischen Signals stört und das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) verringert.
  • Ein unspezifischer Hintergrund kann entweder durch Farbstoffmoleküle, die unspezifisch an die Trägeroberfläche adsorbiert werden, oder durch unspezifische Amplifikation beispielsweise von Primer-Dimer-Paarungen auf der Oberfläche entstehen. Beide Mechanismen erzeugen einen erheblichen Fluoreszenzhintergrund, wenn fluoreszierende Reporter zum Markieren der spezifischen interessierenden Moleküle verwendet werden.
  • Die offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung und damit verbundene Verfahren zu deren Verwendung demonstrieren eine erhebliche Verbesserung beim Minimieren des unspezifischen Hintergrunds. Wie in den unten beschriebenen Beispielen gezeigt, liegt der geschätzte unspezifische Hintergrund bei Verwendung des angegebenen Amplifikationsverfahrens und der angegebenen Trägeroberfläche weit unter 10 % am Signal insgesamt. Dagegen bringen herkömmliche Amplifikationsverfahren und Trägeroberflächen oftmals Hintergrundsignale hervor, die 30 % bis 50 % am Signal insgesamt ausmachen.
  • Zu beachten sei, dass der unspezifische Hintergrund oder das unspezifische Rauschen im vorliegenden Zusammenhang nur einen Bestandteil des Gesamtsystemrauschens darstellt, das auch andere Beiträge aus dem Nachweissystem beinhalten kann, wie bspw. Schrotrauschen aufgrund von Photonen, Autofluoreszenzhintergrund, Bildsensorrauschen, Beleuchtungsrauschen (das z. B. durch Schwankungen der Beleuchtungsstärke entsteht) usw. In dieser Hinsicht kann es möglich sein, die offenbarten Herangehensweisen auf eine Verbesserung des CNR durch neuartige Trägeroberflächen und damit verbundene Hybridisierungs- und Amplifikationsverfahren auszuweiten, um noch größere Verbesserungen für das NGS und andere Bioassay-Technologien zu erreichen, beispielsweise durch Korrigieren von Signalverunreinigungen, die durch die traditionelle Sequenzierung per Synthese, etwa durch die Verwendung von Prä-Phasing und Phasing, entstehen können, und auch durch Korrigieren von Fehlern, die durch den Verlust von DNA-Strängen und/oder durch DNA-Beschädigungen wegen stringenter Waschbedingungen oder Entblockieren (Entfernung reversibler Terminatoren) über mehrere Assayreaktionszyklen hinweg auftreten.
  • Der Assay zum Messen des CNR für einen Festphasen-Bioassay beinhaltet im Allgemeinen die folgenden Schritte:
    • (1) Präparieren der offenbarten Substrate mit geringer Bindung, damit sie mit Rezeptor-, Ziel- und/oder Fangoligonukleotiden, die von Interesse sind, funktionalisiert werden.
    • (2) Einfangen der Rezeptor-, Ziel- und/oder Fangoligonukleotide, die direkt markiert oder ein Vorläufer für eine nachfolgende Markierungsreaktion sein können. Ist keine Amplifikation oder kein zusätzlicher Sondenmarkierungsschritt erforderlich, geht man zu Schritt 5 über. Falls ein Sondenmarkierungsschritt erforderlich ist, um einen Reporter zu erzeugen, geht man zu Schritt 4 über. Andernfalls geht man zu Schritt 3 über.
    • (3) Vornehmen einer Amplifikation des Rezeptor-, Ziel- und/oder Fangoligonukleotids durch traditionelle Immunassaysignalamplifikation, Oligonukleotidreplikationsamplifikation (bspw. unter Verwendung von Strategien der Brückenamplifikation, isothermen Amplifikation, RCA-, HDA- oder RCA-MDA-Amplifikation).
    • (4) Sondieren des amplifizierten Ziels mit einer Reportermarkierung (durch Verwendung einer fluoreszierenden Spezies oder einer anderen Reporterart). Dieser Schritt ist auf einen jeden oberflächenbasierten Bioassay anwendbar, darunter Genotypisierung, Nukleinsäuresequenzierung oder oberflächenbasierte Ziel-/Rezeptoridentifizierung.
    • (5) Durchführen einer geeigneten Nachweismethodik. Zur auf Fluoreszenz beruhenden Bildgebung kann die Nachweismethodik unterschiedlich ausgelegt werden. Traditionelle Lichtmikroskopieverfahren würden zum Beispiel eine der folgenden Komponenten oder eine Teilgruppe davon beinhalten: Beleuchtungs- oder Anregungslichtquelle, Objektiv, Probe, andere optische Komponenten (wie bspw. Tubuslinse, optische Filter, dichroitische Reflektoren usw.) und eine Nachweismodalität (z. B. Verwenden einer EMCCD-Kamera, CCD-Kamera, von sCMOS, CMOS, PMT, APD oder anderen traditionellen Verfahren zum Messen von Lichtstärken). Für einen Nachweis, der nicht auf Licht basiert, können elektrische Signale mithilfe unterschiedlicher Mittel gemessen werden, darunter Feldeffekttransistor(FET)-Nachweis, auf Elektroden basierende Messung elektrischer Signale (Gleich- oder Wechselstrom), Tunnelströme, Messung magnetischer Signale usw.
  • Die Verwendung einer Bildgebung und Signalverarbeitung aus einem bestimmten Sichtfeld (FOV) zum Berechnen des CNR ist in 8 dargestellt, wobei CNR = (Signal - Hintergrund)/(Rauschen) und wobei Hintergrund = (Bintrastitial + Binterstitial), wie in der Figur dargestellt.
  • Für die folgenden Beispiele zur Berechnung des CNR für klonal amplifizierte Cluster von Nukleinsäuresequenzen auf den Trägern mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung wurde ein Bildanalyseprogramm verwendet, um repräsentative helle Vordergrundlichtflecken („Cluster“) zu finden. Lichtflecken sind typischerweise als kleine verbundene Region von Bildpunkten definiert, die eine Lichtintensität über einem bestimmten Intensitätsschwellenwert aufweisen. Nur verbundene Regionen, die eine Gesamtanzahl von Bildpunkten umfassen, welche in einen bestimmten Bereich fällt, werden als Lichtflecken oder Cluster gezählt. Regionen, die in Bezug auf die Anzahl der Bildpunkte zu groß oder zu klein sind, werden nicht in Erwägung gezogen.
  • Sobald eine Anzahl der Lichtflecken oder Cluster identifiziert worden ist, werden die durchschnittliche Lichtfleck- oder Vordergrundintensität und andere statistische Signalwerte berechnet; beispielsweise können die maximale, durchschnittliche und/oder interpolierte maximale Intensität berechnet werden. Der Median- oder Durchschnittswert aller Lichtfleckintensitäten wird verwendet, um die Lichtfleckvordergrundintensität zu repräsentieren.
  • Eine repräsentative Schätzung der Hintergrundregionintensität kann anhand eines von vielen verschiedenen Verfahren bestimmt werden. Ein Verfahren besteht im Aufteilen von Bildern in mehrere kleine „Kacheln“, die bspw. 25x25 Bildpunkte beinhalten. In jeder Kachelregion wird ein bestimmter Anteil der hellsten Bildpunkte (z. B. 25 %) außer Acht gelassen, und die statistischen Intensitätswerte werden für die übrigen Bildpunkte berechnet. Ein anderes Verfahren zum Bestimmen der Hintergrundintensität besteht im Auswählen einer Region von mindestens 500 Bildpunkten oder mehr, die frei von jeglichen „Lichtflecken“ (wie im Schritt davor definiert) im Vordergrund ist, und im anschließenden Berechnen der statistischen Intensitätswerte. Für jedes dieser Verfahren werden anschließend eine repräsentative Hintergrundintensität (Median- oder Durchschnittswert) und die Standardabweichung berechnet. Die Standardabweichung der Intensität in den ausgewählten Regionen wird als repräsentative Hintergrundvariation verwendet.
  • Das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis (CNR) wird dann als (Vordergrundintensität - Hintergrundintensität) / (Hintergrund-Standardabweichung) berechnet.
  • 21-23 stellen Beispiele für Histogramme mit Bildrohdaten und Intensitätsdaten dar, die zum Berechnen des CNR für Differenzkombinationen der Nukleinsäureamplifikationsmethodik und der Träger mit geringer Bindung, die vorliegend beschrieben sind, verwendet werden. In jedem dieser Beispiele sind das obere Histogramm das Histogramm zur Hintergrundbildpunktintensität und das untere Histogramm das Histogramm zur Vordergrundlichtfleckintensität; ein Teil der Originalaufnahme ist ebenfalls enthalten. Es sei darauf hingewiesen, dass die Intensitätsskala für die Aufnahmen nicht gleich ist; die visuelle Wahrnehmung der Helligkeit gibt demnach nicht die tatsächliche Intensität an.
  • Für diese Beispiele wurden feste Träger mit geringer Bindung mithilfe der zuvor erläuterten Verfahren erzeugt. Oligonukleotidprimer (eine oder zwei Primersequenzen, je nach verwendetem Amplifikationsschema) wurden unter Verwendung der offenbarten Verfahren bei variierenden Dichten transplantiert. Die Oberflächendichten für jeden dieser Versuche wurde als etwa 100 K Primer/µm2 geschätzt. Die Primeroberflächendichte wurde mithilfe der folgenden Methodik geschätzt: (i) eine Fluoreszenztitrierungskurve wurde erstellt unter Verwendung eines GE Typhoon (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA, USA) und einer kapillaren Durchflusszelle mit bekannter Fläche (40 mm2), Höhe (0,5 mm) und bekanntem Volumen (200 µl), die bekannte Konzentrationen von Cy3-dCTP enthielt, (ii) die auf den Träger mit geringer Bindung transplantierten Primer wurden an mit Cy3 markierte komplementäre Oligonukleotide hybridisiert, wofür ein herkömmliches Hybridisierungsprotokoll verwendet wurde (3x Salzlösung-Natriumcitrat (SSC) bei 37 Grad C oder bei Raumtemperatur (RT); die Hybridisierungsbedingungen sollten im Hinblick auf die Vervollständigung charakterisiert werden), die Fluoreszenzintensität für das entstandene Signal auf der Oberfläche wurde anhand desselben GE-Typhoon-Instruments gemessen, das zum Erstellen der Kalibrierungskurven verwendet wurde, (iii) und die Anzahl der angebundenen Primermoleküle pro Flächeneinheit der Oberfläche wurde auf der Grundlage eines Vergleichs des gemessenen Oberflächensignals mit der Kalibrierungskurve berechnet.
  • Daraufhin wurden DNA-Bibliothekssequenzen an die angebundenen Primer hybridisiert. Die Hybridisierungsprotokolle, die für den Schritt der Bibliothekshybridisierung verwendet wurden, können je nach Oberflächeneigenschaften variieren; kontrollierte Bibliothekseinträge sind jedoch erforderlich, um auflösbare amplifizierte DNA-Kolonien zu schaffen.
  • Die DNA-Amplifikation wurde für dieses Beispiel unter Verwendung der folgenden Protokolle vorgenommen: (i) Brückenamplifikation ä 28 Zyklen mit einer Primerdichte von etwa 1 K Primer/µm2, (ii) Brückenamplifikation ä 28 Zyklen mit höherer Primerdichte > 5 K Primer/µm2, und (iii) Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) für 90 Minuten mit einer Primerdichte von etwa 2-4 K Primer/µm2.
  • Nach der Amplifikation wurde die amplifizierte DNA mit einem komplementären „Sequenzierungs-‟Primer hybridisiert, und ein Sequenzierungsreaktionsgemisch, das ein mit Cy3 markiertes dNTP umfasste, wurde zugesetzt (Assay „der ersten Base“), um das CNR der ersten Base für jede der jeweiligen Methodiken zu bestimmen. Das Sequenzierungsreaktionsgemisch, das für den „Assay der ersten Base“ verwendet wird, kann eine jede Kombination aus markierten Nukleotiden, sodass 4 Basen unterschieden werden können, ein Enzym, welches das modifizierte Nukleotidtriphosphat (dNTP) einbaut, und einen passenden Einbaupuffer, Metallkationen und Cofaktoren usw. beinhalten.
  • Nach dem Einbau der ersten Base wurde das Sequenzierungsreaktionsgemisch mit Puffer ausgetauscht, eine Bildgebung wurde unter Verwendung desselben GE-Typhoon-Instruments vorgenommen und das CNR an den daraus resultierenden Aufnahmen berechnet.
  • 21 stellt ein Beispiel für eine Fluoreszenzaufnahme und Fluoreszenzintensitätsdaten bezüglich eines Trägers mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, an dem eine Festphasen-Nukleinsäureamplifikation mithilfe einer Brückenamplifikation ä 28 Zyklen mit einer Primerdichte von etwa 2 K Primer/µm2 vorgenommen wurde, um klonal amplifizierte Cluster einer als Matrize dienenden Oligonukleotidsequenz zu schaffen. In diesem Beispiel betrug die Hintergrundintensität 592 Zählungen (mit einer Standardabweichung von 66,5 Zählungen), die Vordergrundintensität lag bei 1047,3 Zählungen und das berechnete CNR = (1047,3-592)/66,5 = 455,3/66,5 = 6,8. Das geschätzte unspezifische Rauschen = (592-100)/(1047-100) = 52 %.
  • 22 stellt ein Beispiel für eine zweite Fluoreszenzaufnahme und Fluoreszenzintensitätsdaten bezüglich eines Trägers mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, an dem eine Festphasen-Nukleinsäureamplifikation mithilfe einer Brückenamplifikation ä 28 Zyklen mit einer höheren Primerdichte von > 5 K Primer/µm2 vorgenommen wurde, um klonal amplifizierte Cluster einer als Matrize dienenden Oligonukleotidsequenz zu schaffen. In diesem Beispiel betrug die Hintergrundintensität 680 Zählungen (mit einer Standardabweichung von 118,2 Zählungen), die Vordergrundintensität lag bei 1773 Zählungen und das berechnete CNR = (1773-680)/118,2 = 1093/118,2 = 9,2. Das geschätzte unspezifische Rauschen = (680-100)/(1773-100) = 35 %.
  • 23 stellt ein Beispiel für eine Fluoreszenzaufnahme und Fluoreszenzintensitätsdaten bezüglich eines Trägers mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, an dem eine Festphasen-Nukleinsäureamplifikation mithilfe einer Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) für 90 Minuten mit einer Primerdichte von etwa 100 K Primer/µm2 vorgenommen wurde, um klonal amplifizierte Cluster einer als Matrize dienenden Oligonukleotidsequenz zu schaffen. In diesen Beispielen betrug die Hintergrundintensität 254 Zählungen (mit einer Standardabweichung von 22,7 Zählungen), die Vordergrundintensität lag bei 6161 Zählungen und das berechnete CNR = (6161-254)/22,7 = 5907/22,7 = 260. Es sei auf die erhebliche Verbesserung des CNR hingewiesen, die durch Verwendung dieser Kombination aus Oberfläche mit geringer Bindung und Amplifikationsprotokoll erreicht wurde. Das geschätzte unspezifische Rauschen = (254-100)/(6161-100) = 3 %.
  • Beispiel 9 - Modifikation von Polymerträgeroberflächen
  • Eine Modifikation einer Oberfläche für die vorliegend offenbarten Zwecke schließt ein, dass die Oberflächen gegen viele chemische Gruppen (-R), darunter Amine, reaktionsfähig gemacht werden. Wenn sie an einem geeigneten Substrat präpariert werden, können diese reaktionsfähigen Oberflächen langfristig bei Raumtemperatur gelagert werden, beispielsweise mindestens 3 Monate oder mehr. Derartige Oberflächen können ferner mit R-PEG und R-Primeroligomer für eine Amplifikation von Nukleinsäuren auf der Oberfläche, wie an anderer Stelle in dieser Schrift beschrieben, transplantiert werden. Oberflächen aus Kunststoff, etwa Cycloolefinpolymer (COP), können mithilfe eines jeden von zahlreichen fachbekannten Verfahren modifiziert werden. Beispielsweise können sie mit Ti:Sapphir-Laserablation, UV-vermitteltem Photografting mit Ethylenglycolmethacrylat, Plasmabehandlung oder mechanischer Einwirkung (z. B. Sandstrahlen oder Polieren usw.) behandelt werden, um hydrophile Oberflächen zu erzeugen, die über Monate hinweg gegenüber vielen chemischen Gruppen wie bspw. Aminen reaktionsfähig bleiben können. Diese Gruppen können dann die Konjugation von Passivierungspolymeren wie PEG oder Biomolekülen wie DNA oder Proteinen ohne Einbuße der biochemischen Aktivität ermöglichen. So ermöglicht die Anlagerung von DNA-Primeroligomeren zum Beispiel eine DNA-Amplifikation auf einer passivierten Kunststoffoberfläche bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Adsorption von Proteinen, Fluorophormolekülen oder anderen hydrophoben Molekülen.
  • Des Weiteren kann die Oberflächenmodifikation bspw. mit Laserdruck oder UV-Maskierung kombiniert werden, um gemusterte Oberflächen zu erzeugen. Dies ermöglicht eine musterbasierte Anlagerung von DNA-Oligomeren, Proteinen oder anderen Molekülteilen, was eine oberflächenbasierte enzymatische Aktivität, Bindung, Nachweis oder Verarbeitung ermöglicht. Beispielsweise können DNA-Oligomere zum Amplifizieren von DNA nur in gemusterten Merkmalen oder zum Einfangen amplifizierter langer DNA-Konkatemere in musterbasierter Weise verwendet werden. In einigen Ausführungsformen können Enzyminseln in den gemusterten Bereichen geschaffen werden, die in der Lage sind, mit lösungsbasierten Substraten zu reagieren. Da sich Kunststoffoberflächen für diese Verarbeitungsarten besonders gut eignen, können Kunststoffoberflächen in einigen wie in dieser Schrift vorgesehenen Ausführungsformen als besonders vorteilhaft betrachtet werden.
  • Außerdem kann Kunststoff spritzgegossen, gestanzt oder per 3D-Druck angefertigt werden, um eine beliebige Gestalt auszubilden, darunter mikrofluidische Vorrichtungen, was viel einfacher als bei Glassubstraten ist; deswegen können sie zum Erzeugen von Oberflächen für die Bindung und Analyse biologischer Proben in mehreren Auslegungen verwendet werden, z. B. mikrofluidische Chips im von der Probe zum Ergebnis führenden Format zum Biomarkernachweis oder zur DNA-Sequenzierung.
  • Es wurde eine spezifische lokalisierte DNA-Amplifikation auf modifizierten Kunststoffoberflächen erreicht, die Lichtflecke mit einem ultrahohen Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis und einem sehr geringen Hintergrund bei Sondierung mit fluoreszierenden Markierungen erzeugte.
  • Wir haben eine repräsentative hydrophilisierte und aminreaktive Cycloolefinpolymeroberfläche mit Amin-Primer und Amin-PEG transplantiert und festgestellt, dass sie die Rolling-Circle-Amplifikation unterstützt. Daraufhin haben wir entdeckt, dass bei Sondierung mit Fluorophormarkierten Primern, oder bei Anfügen markierter dNTPs an die hybridisierten Primer durch eine Polymerase helle Lichtflecke von DNA-Amplicons zu beobachten waren, die Signal-zu-Rausch-Verhältnisse von über 100 mit äußerst geringen Hintergründen aufwiesen, was auf eine hochspezifische Amplifikation hinweist, zusätzlich zu ultrageringen Maßen der Bindung von Protein und hydrophobem Fluorophor, die Kennzeichen für Nachweissysteme mit hoher Exaktheit wie fluoreszenzbasierte DNA-Sequenzierungsautomaten sind.
  • Hier wird eine Kunststoffdurchflusszelle getestet, die mit angebundenen DNA-Clustern besiedelt und im Hinblick auf die 1. Base der Bibliothekssequenz sondiert wird. Für die Besiedlung der Oberfläche mit DNA wurde eine Oberfläche aus Kunststoff, Cycloolefinpolymer (COP), mit 25-mer Amin-Primer 1, Amin-Primer 2 und Amin-5K-PEG wie im Falle mit PEG-NHS überzogener Glasoberflächen transplantiert, wie zuvor in den Beispielen 1 und 7 und an anderer Stelle in dieser Schrift beschrieben. 5 pM einer zirkularisierten DNA-Bibliothek, welche die Primer-2-Sequenz, eine Sequenzierungsprimersequenz und mit Primer 1 komplementäre Sequenz zusätzlich zu dem Bibliothekseinschub enthält, wurde daraufhin 15 Minuten lang an die Oberfläche hybridisiert. Dann wurde wie zuvor in den Beispielen 2 bis 5 und an anderer Stelle in dieser Schrift beschrieben eine Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) vorgenommen, um DNA-Spiralen mit konkatemerer Sequenz einer Länge von bis zu 0,5-1 Mb zu erzeugen. Der Sequenzierungsprimer wurde hybridisiert, und die 1. Base wurde unter Verwendung eines mit Fluorophor markierten dNTP-Satzes mit einer Polymerase eingebaut, um Cluster mit 3 verschiedenen Farben zu markieren, wie in 25A gezeigt.
  • Ein parallel ablaufender Versuch unter Verwendung identischer Parameter, beginnend mit einer Glasoberfläche anstelle einer COP-Oberfläche (mit einer wie in Beispiel 7 beschriebenen Oberflächenpräparation) wurde durchgeführt, um einen Vergleich zwischen passivierten Glasoberflächen und passivierten COP-Oberflächen bereitzustellen. Wie in 25A-B gezeigt, ist das Signal, das durch den Einbau der ersten fluoreszierend markierten Base auf COP-Oberflächen erzeugt wurde, mit jenem vergleichbar, welches auf ähnlich behandelten Glasoberflächen erhalten wurde, und zwar sowohl im Hinblick auf die Intensität als auch die Auflösung der beobachteten Lichtflecken. Dies deutet daraufhin, dass die vorliegend offenbarten Verfahren ein allgemeines Verfahren für die Präparation von Oberflächen zur Immobilisierung, Amplifikation und zum Nachweis von Nukleinsäuren bereitstellen.
  • Die Intensität und das CNR werden sowohl für Glas als auch Kunststoff bestimmt. Aus 26A geht hervor, dass sowohl Glas als auch Kunststoff unter Nachweisbedingungen eine Signalintensität aufweisen, die im Wesentlichen über dem Hintergrund liegt. Sowohl für Glas als auch Kunststoff sind die Signalintensität links und der Hintergrund rechts abgebildet. In 26B ist zu erkennen, dass das CNR sowohl für Glas als auch Kunststoff unter den getesteten Bedingungen bei über 50 liegt.
  • Beispiel 10 - Oberflächenherstellung
  • Eine Oberfläche, die eine nur unwesentliche unspezifische Bindung an organische Farbstoffe und Proteine aufweist, aufweisend eine Stabilität bei mindestens bis zu 95 °C, eine chemische Stabilität gegenüber hohen pH-Werten (0,1 M NaOH), niedrigen pH-Werten (> 5,0); organischen Lösungsmitteln (Methanol, Ethanol, Acetonitril, Formamid, Oxidanzien, Phosphine), Stabilität bei langfristiger Lagerung, geringer Anforderungen bzgl. Bibliothekseinträgen und eine skalierbare Primerbeladung, wird wie folgt hergestellt. Der Prozess umfasst ein Reinigen und Silanisieren oder Passivieren der Oberfläche.
  • Die Oberfläche wird mittels einer KOH-Lösung, 2 M, in Kombination mit einem Alconox-/Hellmanex-Detergens gewaschen und mit Ethanol gespült. Daraufhin wird die Oberfläche auf 56 °C erhitzt, um OH-Gruppen zu exponieren. Die Oberflächen werden abwechselnd oder kombiniert einer Plasmabehandlung unterzogen.
  • Die Oberflächen werden mit 5 mg/ml Silan-5k-PEG-NHS (99,9 % Ethanol/0,01 % Essigsäure) silanisiert, auf 65C erhitzt und unter Verwendung einer gereinigten Oberfläche, KOH/Detergens/Hitze, getestet. Die Oberflächen wurden abwechselnd oder kombiniert mit 10 mg/ml Silan-5k-PEG-NHS (90 % DMF/10 % 100 mM MES, pH 5,5), auf 25 °C erhitzt und unter Verwendung einer gereinigten Oberfläche, KOH/Detergens/Hitze, oder mit einer plasmabehandelten Oberfläche getestet.
  • Mit diesen Oberflächen sind einige Farbstoffe kompatibel, etwa Cy3-C, R11-U, Cy3.5C, 647N-A, Cy5-G, 660-U, Cy5.5-C (Hinweis: Nur Farbstoff bei 200 nM). Ein beispielhaftes Farbstoffgemisch umfasst Cy3-A, Cy3.5-C, Cy5-U, AHO690-G.
  • Derartige Oberflächen werden abstimmbar mit Primern beladen, was bei niedrigen Konzentrationen (5,0×104 Primer/µm2), bei hohen Konzentrationen (1,0×107 Primer/µm2) und bei Konzentrationen mit Werten in einem Bereich erfolgt, der durch diese Endpunkte definiert ist oder außerhalb dieses Bereichs liegen.
  • Die Konzentration wird optional wie folgt gemessen. Herstellen einer Cy3-dCTP-Lösung verschiedener Konzentrationen, Messen der FL-Intensität mithilfe eines GE Typhoon (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA, USA) oder einem anderen geeigneten Instrument in einer Kapillare mit feststehenden Maßen (0,5 mm x 5 mm oder einer anderen Fläche). Dies ergibt die Primerbeladung, wenn die Fläche bekannt ist und die Anzahl der Moleküle bekannt ist.
  • Die Konzentrationen, in Primer/µm2, von 80.000, 160.000, 320.000, 640.000, 1.300.000, 2.600.000 und 5.100.000 wurden mithilfe dieser Herangehensweise gemessen, und andere Konzentrationen mit Werten in einem Bereich, der durch diese Endpunkte definiert ist oder außerhalb dieses Bereichs können ohne Weiteres erreicht werden. Das Vorhandensein von mehrschichtigem PEG oder anderen Oberflächen, wie vorliegend offenbart, fördert diese Dichten.
  • Über den Verlauf von einer Woche der Lagerung zeigten die Oberflächen keinen signifikanten Stabilitätsrückgang.
  • Die Dichten wurden für einige Oberflächenvarianten gemessen, und die Ergebnisse waren wie unten aufgeführt. 3-schichtiges mehrarmiges PEG (8,16,8) auf PEG-Amin-APTES, das zwei Schichten einer Primervorbeladung ä 7 µM ausgesetzt worden war, wies eine Konzentration von 2.000.000 bis 10.000.000 auf der Oberfläche auf. Ähnliche Konzentrationen wurden im Falle von 3-schichtigem mehrarmigem PEG (8,16,8) und (8,64,8) an PEG-Amin-APTES, 8 µM Primer ausgesetzt, und 3-schichtigem mehrarmigem PEG (8,8,8) unter Verwendung eines sternförmigen PEG-Amins zum Ersetzen des hantelförmigen 16mer und 64mer beobachtet.
  • Mithilfe dieser Herangehensweisen wurde beobachtet, dass erhöhe Primerdichten höhere Vordergrundintensitäten, höhere Koloniedichten und ein höheres CNR ergaben. Beispielsweise ergab ein Einsatz von 10 pM ein CNR von 10 auf einer Oberfläche mit einer Primerdichte von < 1,0×104 Primer/µm2, wohingegen ein ähnlicher Einsatz ein CNR von 40-60 bei einer Primerdichte von > 1,0×106 Primer/µm2 ergab.
  • Beispiel 11 - Oberflächen mit hohem CNR ergeben qualitativ hochwertige Daten.
  • Oberflächen nach dem Stand der Technik und Oberflächen mit geringem und hohem CNR wie bspw. die vorliegend offenbarten wurden im Hinblick auf ihre Fluoreszenz getestet, die in einem ersten Kanal und einem zweiten Kanal, welche einem ersten und einem zweiten Farbstoff entsprachen, nachgewiesen wurde.
  • Es ließ sich beobachten, dass mit steigendem CNR die Auflösung einzelner Nachweisereignisse klarer wurde. Diese Nachweisereignisse reihen sich auf klar erkennbaren Achsen auf, die Farbstoffemissionsspektren entsprechen, und sammeln sich nicht in „Wolken“ mit einer höheren Fehlerrate, wie in den drei oberen Dateien in 27 zu erkennen. Auf die unteren drei Dateien von 27 Bezug nehmend, verdeutlicht sich diese exaktere Datenerhebung als schmalere, höhere Peaks bei bestimmten erwarteten Wellenlängen und weniger Datenpunkten auf Zwischenpositionen. Dieser klarer aufgelöste Datensatz führt zu exakteren fluoreszenzbasierten Basenzuordnungen, die aus Assays entstehen, welche auf Oberflächen mit hohem CNR durchgeführt werden.
  • Beispiel 12 - Klonal amplifizierte, multimere Zieloligonukleotidmoleküle
  • 28 stellt eine schematische Darstellung einer klonal amplifizierten, multimeren Zieloligonukleotidsequenz bereit, hybridisiert an eine Oberfläche, die eine hohe Oberflächendichte an Oligonukleotidadaptor- oder -primermolekülen wie bspw. von 4.000 oder mehr Molekülen pro µm2 (links) aufweisen, und an eine Oberfläche, welche eine geringere Oberflächendichte wie bspw. von unter 500 Molekülen pro µm2 an Oligonukleotidadaptor- oder -primermolekülen umfasst (rechts), und stellt die resultierende Verbesserung des CNR dar, die erreicht werden kann. Mehrere Oberflächen wurden derart präpariert, dass sie eine Oligonukleotiddichte aufwiesen, die über den 2000 Molekülen/µM2 liegt, und die Fluoreszenzaufnahme der Oberflächen weist ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis von über 20 auf.
  • Beispiel 13 - Verringerung der Anforderung bzgl. des Nukleinsäureeinsatzes
  • 29 stellt einen Vergleich der Versuchsergebnisse bzgl. des Vornehmens einer traditionellen Hybridisierungsreaktion auf einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung und bzgl. des Vornehmens einer optimierten Hybridisierungsreaktion auf der Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit. In traditionellen Herangehensweisen der Hybridisierung werden ein SSC-Puffer und eine Erhitzung auf 95 Grad mit anschließender langsamer Abkühlung von 2 Stunden verwendet. Nach dem Anlagern von Oligonukleotidprimern an die Trägeroberfläche mit geringer Bindung kann es vorkommen, dass die effiziente Hybridisierung von Zielnukleinsäuren an die Oligonukleotidprimer durch geminderte Stoßfrequenzen auf der Oberfläche mit geringer Bindung beeinträchtigt ist. Zumindest teilweise aufgrund der verringerten Kupplung von Fangoligonukleotiden an Oberflächen nach dem Stand der Technik sind bei traditionellen Hybridisierungsverfahren zum Anfügen von Ziel-DNA an oberflächengebundene Primer DNA-Eingangskonzentrationen von bis zu 10 nM erforderlich (siehe 29, links, wo die Bindung eines markierten Zieloligonukleotids an bindende Trägeroberflächen gezeigt ist). Selbst bei diesen hohen Konzentrationen ist die Kupplung von Zieloligonukleotiden begrenzt. Im Vergleich dazu wurde ein nicht komplementäres Oligonukleotid mit den gleichen jeweiligen Konzentrationen als Negativkontrolle verwendet (untere Reihe in 29). Zum Vergleich wurden unter Verwendung neuer Hybridisierungsreaktionsbedingungen, die entwickelt worden sind und die ein Gemisch, umfassend PEG, ein Lösungsmittel mit verringerter Polarität in Bezug auf Wasser, etwa Ethanol, Methanol, Isopropanol, Acetonitril, Butanol oder dergleichen, Formamid und einen Puffer mit niedrigem pH-Wert (< 7) beinhalten, Zielnukleinsäuresequenzen bei Eingangskonzentrationen der Zielnukleinsäure von nur 50 pM an oberflächenangelagerte Oligonukleotide hybridisiert. Der Rückgang der Eingangskonzentration von Zielnukleinsäure weist auf einen etwa 200-fachen Anstieg der Hybridisierungseffizienz hin (siehe 29, rechts, wo die Bindung eines markierten Zieloligonukleotids an die offenbarten Oberflächen mit geringer Bindung gezeigt ist), was die offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung mit einem signifikanten Vorteil für die Verwendung in Sequenzierungstechnologien bereitstellt, in denen die Einsatzmenge als Bibliothek dienender DNA eventuell knapp ist. Der effiziente Prozess der Primerkupplung und die effizienten Hybridisierungsbedingungen können die Präparation einer Oberfläche ermöglichen, die eine geringe unspezifische Bindung und eine hohe Oberflächendichte an Oligonukleotidprimern aufweist, welche mithilfe traditioneller Chemien zur Primerkupplung oder von Hybridisierungsbedingungen, die in der Technik beschrieben worden sind, nicht erreicht werden könnten. Zum Vergleich wurde ein nicht komplementäres Oligonukleotid mit den gleichen jeweiligen Konzentrationen als Negativkontrolle verwendet (untere Reihe in 29, rechts). Der nachweisbare Marker bei jeder der Aufnahmen ist Cyaninfarbstoff-3 (Cy3), und wobei eine Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche erlangt wurde mit 20x, 0,75 NA, einer 532-nm-Lichtquelle, einem Set aus Bandpassfilter und dichroitischem Spiegel, optimiert für eine Langpassanregung von 532 nm, und einem Cy3-Fluoreszenzemissionsfilter, einem dichroitischen Reflektor, Semrock, 532 nm, und einer Kamera (z. B. einer Andor sCMOS, Zyla 4.2)
  • Es wurden traditionelle oder standardmäßige Bedingungen mit einer Hybridisierungsreportersonde (komplementäre Oligonukleotidsequenzen, markiert mit einem Cy™3-Fluorophor am 5'-Ende) in 2x-5x Salzlösung-Natriumcitrat(SSC)-Puffer (Standard) bei Konzentrationen, die bei 90 Grad verzeichnet wurden, mit einem langsamen Abkühlungsprozess (2 Stunden) bis zum Erreichen von 37 Grad getestet. Die für beide Testbedingungen verwendeten Oberflächen waren Oberflächen mit ultrageringer unspezifischer Bindung, die ein Maß an unspezifischer Cy3-Farbstoff-Absorption von unter 0,25 Molekülen/µm2 aufwiesen. Näpfchen wurden mit 50 mM Tris, pH-Wert 8,0; 50 mM NaCl gewaschen. Die Aufnahmen wurden erfasst unter Verwendung eines inversen Mikroskops (Olympus IX83), ausgestattet mit einem 100 x TIRF-Objektiv, NA = 1,4 (Olympus), einem dichroitischen Spiegel, optimiert für Licht mit 532 nm (Semrock, Di03-R532-t1-25×36), einem Bandpassfilter, optimiert für die Cy3-Emission (Semrock, FF01-562/40-25) und einer Kamera (sCMOS, Andor Zyla) unter Bedingungen ohne Signalsättigung, für 1 s (Laser Quantum, Gern 532, < 1 W/cm2 bei der Probe), während die Probe in einem Puffer (25 mM ACES-Puffer, pH 7,4) eingetaucht war. Bedingungen, die in 50 % ACN + MES mit einer Oligonukleotidtransplantationskonzentration von 1 µm und 25 % ACN + MES + 20 % PEG + 10 % Formaldehyd mit einer Oligonukleotidtransplantationskonzentration von 5,1 µM bestanden, wurden gewählt, um die Brauchbarkeit dieser Bedingungen zum Verbessern bestehender Standardprotokolle für die Oberflächenhybridisierung auf einem Substrat mit geringer Bindung zu testen. Die Oligonukleotidsonde wurde in den angegebenen Konzentrationen zugegeben und eine 2-minütige Hybridisierung bei 50 Grad C durchgeführt, die Aufnahmen wurden wie vorbeschrieben erfasst, und die Ergebnisse sind in der Figur gezeigt.
  • Beispiel 14 - Vergleich traditioneller Chemien zur Oligo-Primer-Kupplung, Hybridisierungsreaktionsbedingungen und Amplifikationstechniken auf Trägeroberflächen mit geringer Bindung
  • 30-32 stellen Vergleiche von Versuchsergebnissen bzgl. des Vornehmens traditioneller Hybridisierungsreaktionen oder verbesserter Hybridisierungsreaktionen mithilfe der in der Beschreibung von 29 dargelegten Methodiken an den Trägern mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung bereit, wobei die Oligo-Primer mithilfe einer herkömmlichen Kupplungschemie angelagert wurden, die im Falle von NHS-NH2-Kupplungsreaktionen typischerweise in Natriumbicarbonatpuffer bei pH = 8,3 vorgenommen werden, oder mithilfe einer verbesserten Kupplungschemie, die ein Ändern der Polarität des Kupplungspuffers (Lösungsmittel auf organischer Basis) mit Zusatz einer Pufferkomponente von pH > 8,0 beinhaltet, und wobei auf die Hybridisierungsreaktionen das Vornehmen entweder einer RCA- oder Brückenamplifikation folgte. Die Amplifikation von Ziel-DNA auf Trägern mit geringer Bindung, die eine Oligonukleotidprimer-Oberflächendichte von unter einem ganz bestimmten Schwellenwert für die Oberflächendichte aufweisen, entweder per PCR-basierter Amplifikation („Brückenamplifikation“) oder Rolling-Circle-Amplifikation ergibt längliche oder ausgebreitete Zielmoleküle, womit zwei Herausforderungen einhergehen: 1) verringerte Packungsdichten und 2) gemindertes Signal. Infolgedessen wird die Skalierung eines Systems für Anwendungen der Hochdurchsatzsequenzierung, die auf einer solchen Oberfläche basieren, stark beeinträchtigt. 30 zeigt die Ergebnisse sowohl der PCR-Amplifikation („Brückenamplifikation“, rechts) als auch der Rolling-Circle-Amplifikation (links) auf Oberflächen mit geringer Bindung mithilfe traditioneller Chemien der Oligonukleotidkupplung, sodass die Oligonukleotiddichte < 1000 Oligonukleotide/µm2 beträgt. Aus diesen Aufnahmen geht hervor, dass markierte amplifizierte Ziel-DNA ausgedehnte Konformationen annimmt, die für die Bildgebung in Sequenzierungsanwendungen ernstliche Schwierigkeiten darstellen würden. Im Vergleich dazu zeigt 31 die Ergebnisse einer PCR-/„Brücken-‟Amplifikation, und 32 zeigt die Ergebnisse einer Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) auf Oberflächen mit Oligonukleotidprimerdichten von mindestens 1.000 Molekülen pro µm2. Diese Oberflächen unterstützen das Verdichten der amplifizierten Ziel-DNA in stark lokalisierte Regionen, die hohe Fluoreszenzintensitäten ausgehend von angelagerten Markierungen ergeben, und kleine Bildpunktbereiche bei der Bildgebung. Die hohen Fluoreszenzintensitäten führen insbesondere zu einem verstärkten Signal beim Berechnen von Lichtfleckintensitäten im Falle von Sequenzierungsanwendungen. Zu betonen ist, dass das gesteigerte Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis, das durch die Verwendung der vorliegend offenbarten Oberflächen mit geringer Bindung entsteht, sowohl von dem sehr hohen Signal, welches eben durch diese Verdichtung der amplifizierten Ziel-DNA entsteht, als auch dem sehr geringen Hintergrund, welchen die hydrophilen überzogenen Oberflächen verschaffen, abhängt. Jede dieser Aufnahmen weist ein markiertes Nukleotid mit einzelnen Markierungen auf, sodass jedes Nukleotid eine andere Emissionsmarkierung besitzt. Beispielsweise können die Markierungen aus Cy3, Cy3.5, Cy5 bzw. Cy5.5 bestehen und dann an einem Olympus-IX83-Mikroskop dargestellt werden, das mit einem 20x, 0,75 NA, einer Lichtquelle von 532 nm, einem Set aus Bandpassfilter und dichroitischem Spiegel, optimiert für eine Langpassanregung bei 532 nm, und Cy3-Fluoreszenzemissionsfilter, einem dichroitischen Reflektor, Semrock, 532 nm, und einer Kamera (Andor sCMOS, Zyla 4.2) mit einer Expositionszeit von mindestens 0,5 s ausgestattet ist.
  • Beispiel 15 - Vergleich von Amplifikationsreaktionen auf Trägeroberflächen mit geringer Bindung
  • 33 stellt nicht einschränkende Beispiele für Fluoreszenzaufnahmen einer traditionellen Trägeroberfläche und einer Trägeroberfläche mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung, an die Zieloligonukleotide hybridisiert und amplifiziert worden sind, bereit. Um die Sequenzierungsexaktheit zu fördern, muss jede amplifizierte Zielnukleinsäure auf Aufnahmen der Trägeroberfläche klar von anderen Zielnukleinsäuren zu unterscheiden sein. Jede Zielnukleinsäure muss während des Sequenzierungszyklus zudem ein Signal (wie bspw. ein Fluoreszenzsignal) zeigen, das mit der Identifizierung jedes Nukleotids in der Sequenz in Zusammenhang steht (als „Basenzuordnung“ bezeichneter Vorgang). Dieses Basenzuordnungssignal, bei dem es sich in vielen Fällen schlichtweg um die Fluoreszenzintensität handelt, welche durch eine an die Zielnukleinsäuremoleküle angelagerte Markierung bereitgestellt wird, muss klar und exakt auflösbar sein, und zwar sowohl über dem Rauschen (Signalvariation in einem Lichtfleck oder Ziel) als auch Hintergrund (unechtes Signal, unspezifisch aufgrund von Charakteristika des Materials erzeugt, aus dem das Versuchsmilieu besteht). Das Verhältnis zwischen Kontrast und Rauschen („CNR“) definiert das Vermögen, exakt zu bestimmen, welche Basis an jeder Position in einer Zielnukleinsäuresequenz vorliegt, wie auch die Ablesungslänge, Reproduzierbarkeit und den Durchsatz eines Sequenzierungssystems. Die vorliegend offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung ermöglichen eine reduzierte unspezifische Bindung von Protein und Farbstoff, wodurch ein geringeres Hintergrundsignal und ein kompakteres, helleres Vordergrundsignal entstehen, was ein gesteigertes CNR ergibt und bessere Basenzuordnungsergebnisse in Sequenzierungsanwendungen ermöglicht. 32 zeigt einen Vergleich zwischen einer mit PEG überzogenen Oberfläche, die allgemein gemäß herkömmlichen Verfahren präpariert und nach Bedarf auf die Bindung klonal amplifizierter Ziel-DNA angepasst wurde (oben, „Traditionell“), und den Trägeroberflächen mit geringer Bindung der vorliegenden Offenbarung (oben, „Aktuelles Element“). Aus den Aufnahmen geht eindeutig hervor, dass die vorliegend offenbarten Oberflächen deutlich schärfer abgegrenzte, intensivere Lichtflecken zur Messung klonal amplifizierter DNA als die herkömmliche Oberfläche zeigen. Eine quantitative Messung sowohl der Lichtfleckintensität (Fluoreszenz, die auf klonal amplifizierte Ziel-DNA zurückzuführen ist, äquivalent zum Sequenzierungssignal) als auch der Hintergrundintensität zeigt, dass das CNR für die offenbarten Trägeroberflächen mit geringer Bindung (unten „Aktuelles Element, Bestwert“) jenes bei Weitem übertrifft, das mithilfe der herkömmlichen Oberfläche erreicht werden kann (unten, „Traditionell“), was selbst für ideale Bildgebungsbedingungen gilt, bspw. für die Verwendung verbesserter Hybridisierungsbedingungen für die Bindung von Ziel-DNA (unten, „Traditionelle Verbesserung“). Der CNR-Anstieg ist größer, als man es in vernünftiger Weise bei Verwendung einer herkömmlichen Trägeroberfläche erwarten könnte, und stellt sowohl eine qualitative als auch quantitative Verbesserung gegenüber Oberflächen im Stand der Technik dar. Diese Verbesserungen werden durch Erzeugen einer Trägeroberfläche erreicht, die mehrere Kriterien erfüllt, z. B. eine reduzierte Protein- und Farbstoffbindung, eine Anlagerung der korrekten Dichte von Oligonukleotiden an die Oberfläche und eine Hybridisierung/Bindung einer klonal amplifizierten Zielnukleinsäure an die Oberfläche, um Aufnahmen mit einem sehr hohen CNR zu ergeben, die eine verbesserte Basenzuordnung in Sequenzierungsanwendungen ermöglichen.
  • Beispiel 16 - Prognosebeispiel zur Präparation von Trägern mit geringer Bindung unter Verwendung anderer Polymere
  • Ein Objektträger wird physikalisch oder chemisch behandelt (bspw. mithilfe einer Plasmabehandlung, eines Piranha-Reinigungsschritts, von saurem Waschen, basischem Waschen, Glastempern bei hohen Temperaturen oder einer jeden Kombination daraus), um organische Verunreinigungen zu beseitigen und Oberflächenhydroxylgruppen zur Silankupplung zu aktivieren. Die präparierte Glasoberfläche wird anschließend mit einem Silan in Reaktion gebracht, um eine erste Schicht funktioneller Gruppen (z. B. von Primäraminen) und/oder eine hydrophile Polymerschicht kovalent anzulagern. In einigen Fällen wird beispielsweise ein Silan wie z. B. (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS) oder (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) 3 (3-Acrylopropyl)trimethoxysilan unter Verwendung von Standardprotokollen mit der Oberfläche in Reaktion gebracht, um funktionelle Primäramingruppen kovalent an die Oberfläche anzulagern. In anderen Fällen kann ein mit Silan modifiziertes Polymer, z. B. ein hydrophiles, heterobifunktionelles Polymer, das eine Silylgruppe an einem Ende und eine zweite funktionelle Gruppe (z. B. ein Primäramin, eine Carboxylgruppe usw.) am anderen Ende umfasst, direkt mit der Oberfläche in Reaktion gebracht werden (bspw. durch Inkontaktbringen der sauberen Glasoberfläche mit dem Silan-modifizierten Polymer bei einer Konzentration von 0,1 %-2 % in Ethanol für etwa 1 bis 2 Stunden, gefolgt von Spülen mit Ethanol und Wasser). Beispiele für geeignete mit Silan modifizierte Polymere sind u. a. Silan-PEG-NH2 (mit einer Polyethylenglycol(PEG)-Molekülmasse von beispielsweise 1000, 2000, 3400, 5000 oder 10 Kilodalton), Silan-PEG-COOH (mit einer PEG-Molekülmasse von beispielsweise 1000, 2000, 3400, 5000 oder 10 Kilodalton), Silan-PEG-Maleimid (mit einer PEG-Molekülmasse von beispielsweise 1000, 2000, 3400, 5000 oder 10 Kilo-Dalton), Silan-PEG-Biotin (mit einer PEG-Molekülmasse von beispielsweise 1000, 2000, 3400, 5000 Dalton oder 10 Kilodalton), Silan-PEG-Acrylat (mit einer PEG-Molekülmasse von beispielsweise 1000, 2000, 3400, 5000 Dalton oder 10 Kilodalton), Silan-PEG-Silan (mit einer PEG-Molekülmasse von beispielsweise 1000, 2000, 3400, 5000 Dalton oder 10 Kilodalton), mit Silan modifizierte Polypropylenglycole (PPGs) mit unterschiedlicher Molekülmasse, die eine zusätzliche funktionelle Gruppe umfassen, mit Silan modifizierte Poly(vinylalkohole) (PVAs) mit unterschiedlicher Molekülmasse, die eine zusätzliche reaktive funktionelle Gruppe umfassen, mit Silan modifiziertes Polyethylenimin (PEIs) mit unterschiedlicher Molekülmasse, die eine zusätzliche reaktive funktionelle Gruppe umfassen, mit Silan modifiziertes Poly(lysin) mit unterschiedlicher Molekülmasse, die eine zusätzliche reaktive funktionelle Gruppe umfassen, und dergleichen oder eine beliebige Kombination daraus.
  • In einigen Fällen wird nach der anfänglichen Reaktion der Oberfläche mit einem Silan oder mit Silan modifiziertem Polymer wenigstens eine zusätzliche Schicht einer hydrophilen Polymerschicht an die Glasoberfläche gekuppelt oder darauf abgelagert. Ein jedes von vielen hydrophilen Polymeren, die Fachleuten bekannt sind, darunter Polyethylenglycol (PEG), Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(vinylpyridin), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(acrylsäure) (PAA), Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM), Poly(methylmethacrylat) (PMA), Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(oligo(ethylenglycol)methylethermethacrylat) (POEGMA), Polyglutaminsäure (PGA), Polylysin, Polyglucosid, Streptavidin, Dextran oder eine jede Kombination daraus kann verwendet werden, wobei im Falle einer kovalenten Kupplung Polymer(e), welche die passenden monofunktionellen, homobifunktionellen und/oder heterobifunktionellen reaktiven Gruppen umfassen, im Hinblick auf ihr Kompatibilität mit der gewählten Konjugationschemie ausgewählt werden. In einigen Fällen wird ein derivatisiertes Polymer verwendet, etwa ein PEG-Amin, ein PEG-NHS oder ein PEG-Acrylat. In einigen Fällen wird ein bifunktionelles PEG-Derivat verwendet, bspw. ein Acrylat-PEG-NHS. In einigen Fällen können diese zusätzlichen hydrophilen Polymerschichten an die vorherige Schicht gekuppelt oder darauf abgelagert werden, indem die Oberfläche etwa 5 Minuten bis etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem 0,1 %-2 % Polymer in Ethanol oder einer Lösung aus Ethanol/wässrigem Puffer in Kontakt gebracht wird, gefolgt von Spülen mit Ethanol oder einem Ethanol/wässrigen Puffer.
  • In einigen Fällen können eine zweite, dritte, vierte, fünfte oder mehr zusätzliche Schichten eines hydrophilen Polymers an die anfängliche Schicht der Trägeroberfläche gekuppelt oder darauf abgelagert werden. In einigen Fällen können die Polymermoleküle in einer Schicht mithilfe geeigneter homofunktioneller oder heterofunktioneller Vernetzungsreagenzien miteinander vernetzt werden. In einigen Fällen können die Polymermoleküle in verschiedenen Schichten miteinander vernetzt werden. In einigen Fällen können eine oder mehrere der hydrophilen Polymerschichten ein verzweigtes Polymer umfassen, bspw. verzweigtes PEG, verzweigten Poly(vinylalkohol) (verzweigten PVA), verzweigtes Poly(vinylpyridin), verzweigtes Poly(vinylpyrrolidon) (verzweigtes PVP), verzweigte Poly(acrylsäure) (verzweigte PAA), verzweigtes Polyacrylamid, verzweigtes Poly(N-isopropylacrylamid) (verzweigtes PNIPAM), verzweigtes Poly(methylmethacrylat) (verzweigtes PMA), verzweigtes Poly(2-hydroxylethylmethacrylat) (verzweigtes PHEMA), verzweigtes Poly(oligo(ethylenglycol)methylethermethacrylat) (verzweigtes POEGMA), verzweigte Polyglutaminsäure (verzweigte PGA), verzweigtes Polylysin, verzweigtes Polyglucosid, verzweigtes Dextran oder eine beliebige Kombination daraus.
  • Eine oder mehrere der hydrophilen Polymerschichten können eine Vielzahl kovalent angelagerter Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle umfassen, wobei die Oligonukleotidmoleküle unter Verwendung einer beliebigen von einer Vielfalt an geeigneten Konjugationschemien, die Fachleuten bekannt sind, kovalent an das Polymer gekuppelt werden. In einigen Fällen werden die Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle kovalent an das Polymer in der Lösung gekuppelt, d. h. vor dem Kuppeln oder Ablagern des Polymers an bzw. auf die Oberfläche. In einigen Fällen werden die Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle kovalent an das Polymer gekuppelt, nachdem es an die Oberfläche gekuppelt oder darauf abgelagert worden ist. In einigen Fällen umfasst die mindestens eine hydrophile Polymerschicht eine Vielzahl von kovalent angelagerten Oligonukleotidadaptor- oder -primermolekülen. In einigen Fällen umfassen wenigstens zwei, wenigstens drei, wenigstens vier oder wenigstens fünf Schichten aus hydrophilem Polymer eine Vielzahl von kovalent angelagerten Adaptor- oder Primermolekülen.
  • Die Wahl des verwendeten Polymers oder der verwendeten Polymere, die Anzahl der Schichten, der Grad der Vernetzung innerhalb von und zwischen Schichten, die Anzahl der Schichten, die kovalent angelagerte Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle umfassen, und die lokale Konzentration oder Oberflächendichte der Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle können einzeln oder insgesamt angepasst werden, um die Eigenschaften der Oberfläche „abzustimmen“, um eine gewünschte Oberflächenbenetzbarkeit (wie angegeben; beispielsweise mithilfe eines Wasserkontaktwinkels von unter 50 Grad), eine gewünschte Oberflächenstabilität unter längerer Exposition gegenüber Reagenzien zur Sequenzierung/Genotypisierung und wiederholten Temperaturzyklen, für die oftmals stufenweise Temperaturänderungen bei einer Spitzentemperatur von mindestens 95 Grad C und ein Halten für mindestens 5 Minuten und ein mehrfaches Unterziehen von mindestens 30 Zyklen erforderlich ist, und eine gewünschte Oberflächendichte der Oligonukleotidadaptor- oder -primermoleküle (z. B. mindestens 1.000 Adaptor- oder Primermoleküle pro µm2) zu erreichen, die wiederum Folgendes verschaffen: eine äußerst geringe unspezifische Bindung von Farbstoffmolekülen oder anderen markierten Reagenzien zur Sequenzierung/Genotypisierung, eine verbesserte Hybridisierungseffizienz, eine verbesserte Amplifikationseffizienz und -spezifität, optimale Dichten von klonal amplifizierten Zielsequenzen (in Bezug auf die Anzahl der klonalen Kolonien pro Flächeneinheit, die Anzahl der Kopien der Zielsequenz pro Flächeneinheit oder die Anzahl der amplifizierten Zielmoleküle pro Flächeneinheit), höhere Kontrast-zu-Rausch-Verhältnisse (CNRs) in Aufnahmen (z. B. Fluoreszenzaufnahmen) der Trägeroberfläche (z. B. CNR > 20) und schließlich eine verbesserte Nachweisexaktheit oder Exaktheit der Basenzuordnung in Anwendungen der Genotypisierung und Sequenzierung.
  • Beispiel 17 - Acrylat-gekuppelte Oberflächen
  • Mit Plasma behandelte, mit KOH behandelte oder mit Plasma/KOH behandelte Glasoberflächen oder Siliziumscheiben oder mit Plasma behandelte COP-Oberflächen wurden mit (3-Acrylopropyl)trimethoxysilan behandelt, gefolgt von einer Inkubation mit bifunktionellem Acrylat-PEG-NHS mit durchschnittlichen PEG-Molekülmassen, die von 1 K bis 6 K variierten, einschließlich insbesondere PEG-3,4 K. Molekülmassen von 500-10 K wurden in Erwägung gezogen, mit der Einschränkung, dass das PEG bei 42 °C wasserlöslich, bei 37 °C wasserlöslich, bei Raumtemperatur wasserlöslich, bei 42 °C in einem flüssigen Zustand, bei 37 °C in einem flüssigen Zustand oder bei Raumtemperatur in einem flüssigen Zustand vorliegen musste. Die Einbringung von PEG wurde optional durch den Zusatz von bis zu 0,5 % (w/w) 2-Hydroxy-2-methylpropiophenon begleitet, gefolgt von einer UV-Behandlung (10 Minuten bei 3,0 mW/cm2). Acrylat-PEG-NHS wurde bei Konzentrationen von 3 mM und 6 mM verwendet, wobei mit 6 mM Acrylat-PEG-NHS bessere Ergebnisse erzielt wurden. Nach dem Waschen zum Entfernen von ungebundenem Polymer wurden die Oberflächen ausreichend lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Autolyse der NHS-Gruppen zuzulassen, wonach freie terminale Carboxylatgruppen an den gebundenen PEG-Molekülen zurückblieben. Diese Oberflächen wurden anschließend durch Behandlung mit EDAC-HCl aktiviert, und 5'-Amino-Oligonukleotide wurden angefügt, um die Oligonukleotid-konjugierte Oberfläche zu erlangen. Eine Kombination aus SP6-Oligonukleotid (25NT) und SP5P-Oligonukleotid (ein 25NT mit einer Phosphatkappe an 3') wurden in einem Verhältnis von 1:1 oder einem Verhältnis von 1:2, 1:5 oder 1:10 zugesetzt (SP6-Oligonukleotid ist ein Primer für die Rolling-Circle-Amplifikation mit Oberflächenwachstum, wohingegen SP5P das Verhindern zufälliger Priming-Ereignisse oder einer unspezifischen Kondensation/Bindung von amplifizierten RCA-Produkten unterstützt). Nach dem Waschen mit 90 % EtOH in MES bei einem pH-Wert von 9 zum Entfernen ungebundener Oligonukleotide wurde ein Puffer zur Lagerung zugesetzt, der ACES/KCl/EDTA/Tween20 umfasste. Die Oberflächen können unter dieser Pufferbedingung mindestens 7 Tage lang gelagert werden.
  • Angelagerte Primer umfassende Oberflächen wurden anschließend zur auf der Oberfläche erfolgenden Rolling-Circle-Amplifikation von Zielnukleinsäuren verwendet, was kondensierte Nukleinsäuremoleküle ergab, wie an anderer Stelle in der vorliegenden Schrift gezeigt. Vorpräparierte RCA-Produkte wurden ebenfalls an die Oberfläche gebunden, was ähnlich kompakte Nukleinsäurestrukturen ergab.
  • In der vorliegenden Erfindung wurden zwar bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gezeigt und beschrieben, doch ist es für Fachleute offensichtlich, dass derartige Ausführungsformen lediglich beispielhalber bereitgestellt sind. Für Fachleute ergeben sich zahlreiche Variationen, Änderungen und Substitutionen ohne Abweichung von der Erfindung. Es versteht sich, dass bei der praktischen Umsetzung der Erfindung verschiedene Alternativen zu den vorliegend beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung in beliebiger Kombination verwendet werden können. Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Ansprüche den Umfang der Erfindung definieren und dass Verfahren und Strukturen innerhalb des Umfangs dieser Ansprüche und ihrer Äquivalente dadurch abgedeckt sind.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
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Claims (30)

  1. System zum Verarbeiten eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend: eine Oberfläche, an die mindestens eine hydrophile Polymerschicht gekoppelt ist, die ein Polymer umfasst, das an ein erstes Nukleinsäuremolekül gekoppelt ist; ein zweites Nukleinsäuremolekül, das an das erste Nukleinsäuremolekül gekoppelt ist, wobei eine Fluoreszenzaufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis von größer oder gleich etwa 5 aufweist, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül oder ein Derivat davon mit einem Cyaninfarbstoff-3-Fluorophor markiert ist und wenn die Fluoreszenzaufnahme unter Verwendung eines inversen Fluoreszenzmikroskops, das ein Objektiv mit 20-facher Vergrößerung, 0,75 NA, eine Lichtquelle mit 532 nm, ein Set aus Bandpassfilter und dichroitischem Spiegel, optimiert für eine Langpassanregung bei 532 nm, und einen Cyaninfarbstoff-3-Fluoreszenzemissionsfilter, einen dichroitischen Reflektor für 532 nm und eine Kamera aufweist, unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einen Puffer eingetaucht ist, wobei eine Bildgebungszeit mindestens 0,5 s beträgt und es sich bei dem Puffer um 50 mM N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure mit einem pH-Wert von 7,4 handelt, erfasst wird.
  2. System, umfassend: einen oder mehrere Computerprozessoren, die jeweils oder alle zum Implementieren eines Verfahrens programmiert sind, das umfasst: Inkontaktbringen eines ersten Nukleinsäuremoleküls mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül, sodass das zweite Nukleinsäuremolekül an das erste Nukleinsäuremolekül gekoppelt wird, wobei das erste Nukleinsäuremolekül an ein Polymer mindestens einer hydrophilen Polymerschicht, die an eine Oberfläche gekoppelt ist, gekoppelt wird, wobei eine Aufnahme der Oberfläche nach dem Inkontaktbringen ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis von größer oder gleich etwa 5 aufweist, wenn die Aufnahme unter Verwendung eines inversen Fluoreszenzmikroskops, das ein Objektiv mit 20-facher Vergrößerung, 0,75 NA, eine Lichtquelle mit 532 nm, ein Set aus Bandpassfilter und dichroitischem Spiegel, optimiert für eine Langpassanregung bei 532 nm, und einen Cyaninfarbstoff-3-Fluoreszenzemissionsfilter, einen dichroitischen Reflektor für 532 nm und eine Kamera aufweist, unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einen Puffer eingetaucht ist, wobei eine Bildgebungszeit mindestens 0,5 s beträgt und es sich bei dem Puffer um 50 mM N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure mit einem pH-Wert von 7,4 handelt, erhalten wird.
  3. System nach Anspruch 1 oder 2, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül in einer Oberflächendichte von größer oder gleich etwa 10.000 Molekülen pro mm2 an der Oberfläche vorliegt.
  4. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis von größer oder gleich etwa 10 aufweist, wenn die Aufnahme erhalten wird.
  5. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis von größer oder gleich etwa 20 aufweist, wenn die Aufnahme erhalten wird.
  6. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis von größer oder gleich etwa 40 aufweist, wenn die Aufnahme erhalten wird.
  7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aufnahme der Oberfläche ein Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis von größer oder gleich etwa 60 aufweist, wenn die Aufnahme erhalten wird.
  8. System nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Oberfläche ein Substrat umfasst, das aus der aus Glas, Quarzglas und Kunststoff bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  9. System nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die mindestens eine hydrophile Polymerschicht einen Wasserkontaktwinkel von kleiner oder gleich etwa 50 Grad aufweist.
  10. System nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die mindestens eine hydrophile Polymerschicht eine zweite hydrophile Polymerschicht umfasst.
  11. System nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Polymer eine Molekülmasse von mindestens 1.000 Dalton aufweist.
  12. System nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Polymer ein verzweigtes Polymer mit mindestens 4 Verzweigungen ist.
  13. System nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei das Inkontaktbringen des ersten Nukleinsäuremoleküls mit dem zweiten Nukleinsäuremolekül ein Kontaktieren der Oberfläche mit einer Lösung umfasst, welche das zweite Nukleinsäuremolekül umfasst, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül in einer Konzentration von kleiner oder gleich etwa 1 Nanomol in der Lösung vorliegt.
  14. System nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei das Inkontaktbringen des ersten Nukleinsäuremoleküls mit dem zweiten Nukleinsäuremolekül ein Kontaktieren der Oberfläche mit einer Lösung umfasst, welche das zweite Nukleinsäuremolekül umfasst, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül in einer Konzentration von kleiner oder gleich etwa 500 Pikomol in der Lösung vorliegt.
  15. System nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei das Inkontaktbringen des ersten Nukleinsäuremoleküls mit dem zweiten Nukleinsäuremolekül ein Kontaktieren der Oberfläche mit einer Lösung umfasst, welche das zweite Nukleinsäuremolekül umfasst, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül in einer Konzentration von kleiner oder gleich etwa 20 Pikomol in der Lösung vorliegt.
  16. System nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül ein multimeres Nukleinsäuremolekül mit Wiederholungen einer regelmäßig auftretenden Monomereinheit umfasst.
  17. System nach Anspruch 16, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül eine Länge von größer oder gleich etwa 10 Kilobasen aufweist.
  18. System nach Anspruch 16, wobei das multimere Nukleinsäuremolekül doppelsträngig ist.
  19. System nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei eine Aufnahme der Oberfläche ein Verhältnis von Vordergrundfluoreszenzintensität und unspezifischer Farbstoffadsorptionshintergrund(Binter)-Fluoreszenzintensität von mindestens 3:1 aufweist, wenn das zweite Nukleinsäuremolekül oder ein Derivat davon amplifiziert und mit einem Cyaninfarbstoff-3 markiert ist und die Aufnahme unter Verwendung eines inversen Mikroskops und einer Kamera unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einen Puffer eingetaucht ist, erhalten wird.
  20. System nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei eine Aufnahme der Oberfläche ein Verhältnis von Vordergrundfluoreszenzintensität und unspezifischer Farbstoffadsorptionshintergrund(Binter)-Fluoreszenzintensität von mindestens 5:1 aufweist, wenn das zweite Nukleinsäuremolekül oder ein Derivat davon amplifiziert und mit einem Cyaninfarbstoff-3 markiert ist und die Aufnahme unter Verwendung eines inversen Mikroskops und einer Kamera unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einen Puffer eingetaucht ist, erhalten wird.
  21. System nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei eine Aufnahme der Oberfläche ein Verhältnis von Vordergrundfluoreszenzintensität und einer Kombination aus unspezifischer Farbstoffadsorptionshintergrund- und unspezifischer Amplifikationshintergrund (Binter + Bintra) - Fluoreszenzintensität von mindestens 3:1 aufweist, wenn das zweite Nukleinsäuremolekül oder ein Derivat davon amplifiziert und mit einem Cyaninfarbstoff-3 markiert ist und die Aufnahme unter Verwendung eines inversen Mikroskops und einer Kamera unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einen Puffer eingetaucht ist, erhalten wird.
  22. System nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei eine Aufnahme der Oberfläche ein Verhältnis von Vordergrundfluoreszenzintensität und einer Kombination aus unspezifischer Farbstoffadsorptionshintergrund- und unspezifischer Amplifikationshintergrund (Binter + Bintra) - Fluoreszenzintensität von mindestens 5:1 aufweist, wenn das zweite Nukleinsäuremolekül oder ein Derivat davon amplifiziert und mit einem Cyaninfarbstoff-3 markiert ist und die Aufnahme unter Verwendung eines inversen Mikroskops und einer Kamera unter Bedingungen ohne Signalsättigung, während die Oberfläche in einen Puffer eingetaucht ist, erhalten wird.
  23. System nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Verfahren weiterhin ein Amplifizieren des zweiten Nukleinsäuremoleküls oder eines Derivats im Anschluss an (b) umfasst.
  24. System nach Anspruch 23, wobei das Verfahren weiterhin ein Bestimmen einer Sequenz des zweiten Nukleinsäuremoleküls oder eines Derivats davon im Anschluss an das Amplifizieren umfasst.
  25. System nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei das erste Nukleinsäuremolekül eine Sequenz umfasst, die einen Polymerasestopppunkt aufweist.
  26. System nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei das erste Nukleinsäuremolekül in einer Oberflächendichte von größer oder gleich etwa 4.000 Molekülen pro µm2 an der Oberfläche vorliegt.
  27. System nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei das erste Nukleinsäuremolekül in einer Oberflächendichte von größer oder gleich etwa 10.000 Molekülen pro µm2 an der Oberfläche vorliegt.
  28. System nach einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei das erste Nukleinsäuremolekül in einer Oberflächendichte von größer oder gleich etwa 40.000 Molekülen pro mm2 an der Oberfläche vorliegt.
  29. System nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül ringförmig ist.
  30. System nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei die Oberfläche ein Maß an unspezifischer Cy3-Farbstoffadsorption von unter etwa 0,25 Molekülen/µm2 aufweist.
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