CN114350773A - 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 - Google Patents
一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114350773A CN114350773A CN202210084194.2A CN202210084194A CN114350773A CN 114350773 A CN114350773 A CN 114350773A CN 202210084194 A CN202210084194 A CN 202210084194A CN 114350773 A CN114350773 A CN 114350773A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- solid phase
- amplification
- phase carrier
- dna molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 title abstract description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 40
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 15
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 10
- -1 2-succinimidyl-1, 1,3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate Chemical compound 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 6
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000008941 Albumin Reagent Methods 0.000 claims description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 abstract description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000001723 curing Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000013007 heat curing Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于固相载体的DNA分子信号扩增及核酸测序的方法。所述方法包括：通过羧基与氨基的缩合反应，将羧基化的DNA引物固定于表面氨基化的固相载体上，向所述固相载体上加入环状DNA文库和扩增试剂，进行滚环扩增，所述DNA引物与所述环状DNA文库通过碱基互补的方式结合。本发明将DNA引物固定于固相载体上，利用滚环扩增将DNA扩增成线性的螺旋结构，避免了由于桥式PCR扩增成cluster引起的错误累积，提高测序准确性，亦降低因桥式PCR引起的较高duplicate比率，节约测序成本，同时，进行等温DNA扩增，对设备要求低，可减少操作人员负担，实现自动化制备。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基于固相载体的DNA分子信号扩增及核酸测序的方法。
背景技术
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序的步骤包括样品准备，文库构建，测序反应和数据分析，高通量测序的文库构建阶段，可以通过PCR将文库模版扩增数千倍，从而达到上机的文库量，以便完成后续对基因组DNA序列的测定；在测序阶段，单个DNA分子的信号难以检测，需要通过扩增使单个DNA分子形成一簇(即cluster)或成球(DNB)，获得足够强度的信号，测序才能够检测到，对于核酸模板而言，有的二级结构复杂，有的热稳定性不好，这些因素都会影响PCR扩增效率。
目前市场在测序阶段进行DNA分子信号扩增的方式有通过扩增使单个DNA分子形成一簇，即cluster。桥式PCR扩增形成cluster这一过程的错误累积会降低DNA序列复制的保真性，影响低深度测序变异和低频突变检测的精准度和敏感度。由于建库和测序的PCR扩增，会带来较高的duplicate比率，造成DNA数据量浪费，从而增加测序成本。进行RNA测序时，因为难以区分是PCR duplicates还是RNA高表达形成的相同的模板，则无法去除duplicates，这将会影响转录组表达量的准确性，尤其是小、中等表达量的转录本的准确性。
另一种在测序阶段获得足够强度的信号的方式是通过扩增使单个DNA分子形成DNA纳米球，如CN113774120A公开一种DNB双末端测序方法，其过程是先在PCR仪中进行扩增，对DNA纳米球进行定量，最后将DNA纳米球载入芯片中并通过一定方式将DNB固定在芯片中，该过程工艺繁琐，需要额外增加PCR仪和DNA纳米球定量设备，制备时间长，自动化程度低。
综上所述，如何提供一种高效扩增DNA分子信号的方法，有效避免错误积累及降低成本，是基因测序领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种基于固相载体的DNA分子信号扩增及核酸测序的方法，能够高效、低成本地对测序过程中DNA分子信号进行扩增，同时提高测序准确性。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，所述方法包括：
通过羧基与氨基的缩合反应，将羧基化的DNA引物固定于表面氨基化的固相载体上，加入环状DNA文库和扩增试剂，进行滚环扩增，所述DNA引物与所述环状DNA文库通过碱基互补的方式结合。
本发明中，通过羧基与氨基的缩合反应将含有羧基的DNA引物固定于表面含有氨基的固相载体上，能够得到高效负载DNA引物的固相载体，随后环化的文库与DNA引物通过碱基互补的方式结合并固定在固相载体上，文库在酶和试剂的作用下进行滚环扩增，扩增成线性的螺旋结构，可避免桥式PCR错误累积，同时对设备要求低，不过度依赖PCR仪等设备，易于操作，可实现自动化制备，对于基因高通量测序领域具有重要意义。
优选地，所述固相载体的材质包括玻璃、硅胶、陶瓷、塑料或金属中的任意一种。
优选地，所述羧基化的DNA引物包括5’端羧基化的DNA引物。
优选地，所述扩增试剂包括DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。
优选地，所述DNA聚合酶包括phi29 DNA聚合酶。
本发明中，phi29 DNA聚合酶具有DNA链置换活性和DNA连续合成能力，可以合成超过70kb长度的DNA，且能够在体外进行不依赖于热循环的等温DNA扩增。
优选地，所述缩合反应使用的缩合剂包括2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和二异丙基乙基胺。
优选地，所述缩合剂中2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)和二异丙基乙基胺(DIEA)的摩尔浓度比为1:(1～4)，包括但不限于1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.5、1:2.8、1:3、1:3.5或1:3.8，优选为1:2。
本发明中，使用2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯促进DNA引物中羧基和固相载体上氨基发生缩合反应，显著提高固相载体的DNA引物负载率，二异丙基乙基胺能够与负载引物的固相载体与TSTU反应生成的副产物进行反应，从而消耗所述副产物而促进反应往正方向进行，进一步提高固相载体的DNA引物负载率，此外，通过控制2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和二异丙基乙基胺的摩尔浓度比为1:2，能够进一步提高固相载体的DNA引物负载率。
优选地，所述滚环扩增后还包括封闭的步骤。
优选地，所述封闭包括将封闭试剂加入固相载体上进行封闭。
优选地，所述封闭试剂包括牛血清白蛋白试剂。
本发明中，对完成扩增反应后固相载体进行封闭，有利于扩增的DNA和phi29酶能更稳固的固定在载体上。
优选地，所述基于固相载体的DNA分子信号扩增方法包括以下步骤：
(1)对固相载体进行氨基化处理；
(2)向氨基化的固相载体上加入羧基化的DNA引物和缩合剂，得到负载DNA引物的固相载体；
(3)向所述负载DNA引物的固相载体上加入环状DNA文库和扩增试剂，进行滚环扩增，扩增后加入封闭试剂进行封闭。
优选地，所述氨基化处理的试剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷。
第二方面，本发明提供一种基于固相载体的核酸测序的方法，所述基于固相载体的核酸测序的方法包括：
利用第一方面所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法扩增待测DNA，根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序，得核酸序列信息。
优选地，所述核酸测序包括将所述扩增产物与测序引物混合进行测序反应。
本发明中利用第一方面所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法对待测DNA进行扩增，使DNA扩增成线性的螺旋结构，所有的扩增模板都是最初的插入片段，PCR产生的错误不会累积，同时不严格依赖PCR仪器进行反应，DNA分子信号在芯片内自动扩增，可减少操作人员负担，实现自动化制备。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中将DNA引物固定于固相载体上，所述DNA引物与环状DNA文库结合，利用滚环扩增(Rolling circle replication，RCA)将DNA扩增成线性的螺旋结构，使得所有的扩增模板都是最初的插入片段，避免了由于桥式PCR扩增成cluster这一过程的错误累积，亦降低因桥式PCR带来较高的duplicate比率，从而减少DNA数据量浪费，节约测序成本；
(2)本发明提供的在固相载体芯片内进行DNA分子信号扩增的制备方法，不严格依赖PCR仪器进行反应和DNA纳米球质控的操作，可将DNA分子自动载入芯片，且DNA分子信号在芯片内自动扩增，可减少操作人员负担，实现自动化制备。
附图说明
图1为玻璃表面羟基结构图；
图2为APTES修饰二氧化硅表面示意图，a表示物理吸附，b表示缩合，c表示加热固化后的主要结构；
图3为固相载体表面氨基与带羧基的引物进行缩合反应示意图；
图4为待测序的样品在固相载体内进行DNA扩增和固定示意图；
图5为荧光显微镜下观测的DNA扩增产物图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例以玻璃基板为固相载体并对其进行氨基化处理。
利用浸泡法将氨基连接在玻璃基板上，玻璃(二氧化硅)表面羟基主要为孤立羟基、双羟基和氢键键结合羟基(图1)，利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在无水条件下在二氧化硅表面的吸附并进行反应，并于55℃加热固化，反应示意图如图2所示，得到表面修饰有氨基的玻璃固相载体。
实施例2
本实施例将5’端羧基化的DNA引物固定于实施例1制备的玻璃固相载体上。
将5’端羧基化的DNA引物(序列为：5'-GCCGTATCATTCAAGCAGAAGACG-3')和2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和二异丙基乙基胺加入实施例1制备的玻璃固相载体上，2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和二异丙基乙基胺摩尔浓度比是1:2，于30℃反应30min，反应原理图如图3所示，反应完成后用无水乙醇冲洗，将未进行反应的试剂冲洗干净，得到负载DNA引物的玻璃固相载体。
实施例3
本实施例利用实施例2制备的负载DNA引物的玻璃固相载体进行DNA分子信号扩增。
使用TE buffer作为环状DNA文库的溶剂，取120fmol的文库溶于TE buffer中终体积80μL，注入实施例2制备的负载DNA引物的玻璃固相载体中，文库与载体中的引物通过碱基互补原则形成双链，室温放置30min分钟后，加入扩增反应试剂进行滚环扩增(扩增示意图如图4所示)，滚环扩增反应体系如表1所示，滚环扩增反应条件为：30℃，45min，扩增结束后，使用1％的BSA试剂进行封闭。
表1
| 试剂名称 | 始浓度 | 终浓度 | 体积(μL) |
| phi29核苷酸聚合酶 | 10U/μL | 1U/μL | 8 |
| 10Xphi29聚合酶缓冲液 | 10× | 1× | 8 |
| 25mMdNTP混合液 | 25mM | 0.5mM | 1.6 |
| 分子级水 | 62.4 | ||
| 总量 | 80 |
试验例1
本试验例对实施例3的扩增产物进行测序分析。
取实施例3封闭完后扩增产物，加入测序引物即可进行二代测序，加入带单色荧光的测序引物的荧光图片如图5所示。
可见，通过本发明的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法在固体载体上进行滚环扩增，扩增后加入测序引物，通过边合成边测序SBS可将位于基因组内的基因进行测序，即可测单端测序(测SE)，也可进行双端测序(测PE)。
综上所述，本发明将DNA引物固定于固相载体上，所述DNA引物与环状DNA文库结合，利用滚环扩增将DNA扩增成线性的螺旋结构，使得所有的扩增模板都是最初的插入片段，避免了由于桥式PCR扩增成cluster这一过程的错误累积，提高测序准确性，亦降低因桥式PCR带来较高的duplicate比率，从而减少DNA数据量浪费，节约测序成本，同时，不严格依赖PCR仪器进行反应和DNA纳米球质控的操作，可将DNA分子自动载入芯片，且DNA分子信号在芯片内自动扩增，可减少操作人员负担，实现自动化制备。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，其特征在于，所述方法包括：
通过羧基与氨基的缩合反应，将羧基化的DNA引物固定于表面氨基化的固相载体上，加入环状DNA文库和扩增试剂，进行滚环扩增；
所述DNA引物与所述环状DNA文库通过碱基互补的方式结合。
2.根据权利要求1所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，其特征在于，所述固相载体的材质包括玻璃、硅胶、陶瓷、塑料或金属中的任意一种；
优选地，所述羧基化的DNA引物包括5’端羧基化的DNA引物。
3.根据权利要求1或2所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，其特征在于，所述扩增试剂包括DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液；
优选地，所述DNA聚合酶包括phi29 DNA聚合酶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，其特征在于，所述缩合反应使用的缩合剂包括2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和二异丙基乙基胺；
优选地，所述缩合剂中2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和二异丙基乙基胺的摩尔浓度比为1:(1～4)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，其特征在于，所述滚环扩增后还包括封闭的步骤。
6.根据权利要求5所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，其特征在于，所述封闭包括将封闭试剂加入固相载体上进行封闭；
优选地，所述封闭试剂包括牛血清白蛋白试剂。
7.根据权利要求1-6任一项所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对固相载体进行氨基化处理；
(2)向氨基化的固相载体上加入羧基化的DNA引物和缩合剂，得到负载DNA引物的固相载体；
(3)向所述负载DNA引物的固相载体上加入环状DNA文库和扩增试剂，进行滚环扩增，扩增完成后加入封闭试剂进行封闭。
8.根据权利要求7所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法，其特征在于，所述氨基化处理的试剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷。
9.一种基于固相载体的核酸测序的方法，其特征在于，所述基于固相载体的核酸测序的方法包括：
利用权利要求1-8任一项所述的基于固相载体的DNA分子信号扩增方法扩增待测DNA，根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序，得核酸序列信息。
10.根据权利要求9所述的基于固相载体的核酸测序的方法，其特征在于，所述核酸测序包括将所述扩增产物与测序引物混合进行测序反应。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210084194.2A CN114350773A (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 |
| PCT/CN2022/133646 WO2023138206A1 (zh) | 2022-01-21 | 2022-11-23 | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210084194.2A CN114350773A (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114350773A true CN114350773A (zh) | 2022-04-15 |
Family
ID=81093334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210084194.2A Pending CN114350773A (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114350773A (zh) |
| WO (1) | WO2023138206A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023138206A1 (zh) * | 2022-01-21 | 2023-07-27 | 深圳太古语科技有限公司 | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0665293A2 (en) * | 1994-01-26 | 1995-08-02 | Hamamatsu Photonics K.K. | Method of determining base sequence of nucleic acid |
| CN1995369A (zh) * | 2006-12-14 | 2007-07-11 | 东南大学 | 一种固相制备核酸分子克隆的方法 |
| CN102604934A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-07-25 | 盛司潼 | 一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法 |
| CN102766688A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-11-07 | 盛司潼 | 一种检测基因序列的方法 |
| CN103505739A (zh) * | 2013-09-24 | 2014-01-15 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法 |
| CN113943788A (zh) * | 2018-11-14 | 2022-01-18 | 元素生物科学公司 | 用于改进的固相dna杂交和扩增的低结合载体 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0514909D0 (en) * | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods of nucleic acid amplification and sequencing |
| CN104357549A (zh) * | 2014-09-25 | 2015-02-18 | 徐州医学院 | 一种基于dna芯片的数字化定量检测核酸的方法 |
| CN104830985A (zh) * | 2015-05-06 | 2015-08-12 | 东南大学 | 基于固相滚环扩增和颗粒团聚的多重核酸可视化检测方法及试剂盒 |
| CN114350773A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-04-15 | 深圳太古语科技有限公司 | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 |
-
2022
- 2022-01-21 CN CN202210084194.2A patent/CN114350773A/zh active Pending
- 2022-11-23 WO PCT/CN2022/133646 patent/WO2023138206A1/zh unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0665293A2 (en) * | 1994-01-26 | 1995-08-02 | Hamamatsu Photonics K.K. | Method of determining base sequence of nucleic acid |
| CN1995369A (zh) * | 2006-12-14 | 2007-07-11 | 东南大学 | 一种固相制备核酸分子克隆的方法 |
| CN102604934A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-07-25 | 盛司潼 | 一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法 |
| CN102766688A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-11-07 | 盛司潼 | 一种检测基因序列的方法 |
| CN103505739A (zh) * | 2013-09-24 | 2014-01-15 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法 |
| CN113943788A (zh) * | 2018-11-14 | 2022-01-18 | 元素生物科学公司 | 用于改进的固相dna杂交和扩增的低结合载体 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MICHAEL G MOHSEN 等: ""The Discovery of Rolling Circle Amplification and Rolling Circle Transcription"", 《ACC CHEM RES》, vol. 49, no. 11, 24 October 2016 (2016-10-24), pages 2540 - 2550, XP093100761, DOI: 10.1021/acs.accounts.6b00417 * |
| 刘青杰;陈德清;: "滚环DNA扩增技术及其应用", 辐射研究与辐射工艺学报, no. 01, 28 February 2007 (2007-02-28), pages 5 - 9 * |
| 卢圣栋: "《现代分子生物学实验技术》", vol. 1, 31 December 1999, 中国协和医科大学出版社, pages: 502 * |
| 张靓等: "《绿色萃取技术原理、进展与应用》", vol. 1, 30 November 2021, 中国轻工业出版社, pages: 443 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023138206A1 (zh) * | 2022-01-21 | 2023-07-27 | 深圳太古语科技有限公司 | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023138206A1 (zh) | 2023-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0357336B1 (en) | Method for detection of specific nucleic acid sequences | |
| JP4528885B1 (ja) | 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット | |
| JP5565781B2 (ja) | 核酸クロマトグラフ法を利用した肺炎原因菌の検出方法 | |
| CN112326637B (zh) | 一种检测5-羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器及其检测方法和应用 | |
| CN111808928B (zh) | 一种snp分型检测方法 | |
| WO2023138206A1 (zh) | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 | |
| CN113881806A (zh) | 基于CRISPR/Cas12a技术检测新冠病毒和69/70突变株的方法及试剂盒 | |
| US20050287533A1 (en) | Target-specific compomers and methods of use | |
| CN116445594A (zh) | 适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用 | |
| CN116121352A (zh) | 一种提高双端测序质量的方法、芯片及其应用 | |
| US20230295696A1 (en) | Method for loading nucleic acid molecule on solid support | |
| US10665327B2 (en) | High-throughput hybridization and reading method for biochips and system thereof | |
| CN112063690A (zh) | 单分子探针多重靶向捕获文库的构建方法及应用 | |
| JP2011004733A (ja) | 複数検体中の標的核酸を検出するマイクロアレイ | |
| CN114438185B (zh) | 一种芯片表面双端扩增测序的方法 | |
| CN110643682A (zh) | 一种用于dna检测的信号放大系统、试剂盒和方法 | |
| CN114085895B (zh) | 快速检测msi的检测引物及其试剂盒 | |
| CN109593839A (zh) | 一种dna突变及甲基化状况检测方法 | |
| CN117757895A (zh) | 一种单链dna文库构建试剂盒及其应用 | |
| CN117467740A (zh) | 具有独特分子标签的多样本多位点dna甲基化检测方法和试剂盒 | |
| CN117925796A (zh) | 病原体耐药基因检测方法、试剂盒及装置 | |
| CN115948585A (zh) | 一种大肠杆菌基因组dna的定量检测方法及试剂盒 | |
| CN114350791A (zh) | 一种检测叶酸代谢相关基因多态性的引物探针组合及其应用 | |
| CN117025836A (zh) | 一种新型冠状病毒引物探针组合、检测试剂盒及应用 | |
| CN113249446A (zh) | 一种基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |