CN111808928B - 一种snp分型检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行SNP分型检测的方法。

Description

一种SNP分型检测方法
技术领域
本发明提供了一种SNP分型检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即DNA序列中单个碱基的差别。在自然界中，SNP广泛存在，对于SNP的检测分析在药物研制、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。
目前的SNP检测方法大致可以分为两大类：一大类是基于凝胶电泳的传统经典的SNP检测方法，以单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶切扩增多态性序列、等位基因特异性PCR等为代表；另一大类是高通量、自动化程度较高的SNP检测方法，以直接测序、基因芯片、变性高效液相色谱、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线等为代表。
基因芯片技术是半导体工业技术里的微细加工技术和分子生物学的结合，在一个基片表面集成了大量密集排列的基因探针。现有技术中绝大多数基因芯片上的探针均为5’端朝外；少量基因芯片上的探针3’端朝外，但这种芯片只能达到中等探针密度，而且制作成本较高。利用基因芯片的SNP检测方法根据已知的SNP位点设计两种或者多种探针，将设计好的探针固定在特殊的载体上，基于杂交、引物延伸、连接等不同的方式实现对SNP位点的分型检测。该方法实现了快速、高效、并行的多态信息分析，是常用的一种高通量SNP分析方法。
经典的连接法检测SNP涉及将DNA样本在扩增后与基因芯片上5’端朝外的探针杂交，通过碱基配对和DNA连接酶的特异性实现对待测碱基的检测，但该方法的不足之处在于检测灵敏度有限。
滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。在RCA中，一个DNA环、一个短的DNA引物(与该环的一部分互补)和酶催化剂将dNTPs转化为一个由数千个该环的标准重复拷贝组成的单链共链DNA分子。这种方法不仅可以直接扩增DNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。与其他扩增程序不同，RCA产生一个单独的扩增产物，它仍然与DNA引物相连。因此，RCA非常适合于固相格式，例如在特定芯片位置生成局部信号的基因芯片。此外，RCA的这一独特特性允许在不受干扰的情况下同时(多次)进行许多分析，因此赋予了基因芯片上的SNP检测以高特异性。
与经典的连接法检测SNP相比，利用RCA技术在基因芯片上进行SNP检测可以通过信号扩大的方式提高SNP分型检测的灵敏度。目前，利用RCA技术进行SNP检测的方法中大多需要用到锁式探针，即首先通过连接反应环化与模板链杂交的探针，再扩增已环化的探针，然后检测扩增信号。虽然利用RCA技术进行SNP检测能够克服经典的连接法检测SNP中检测灵敏度有限的缺陷，但其自身仍然存在一定的不足。一是锁式探针的设计复杂，由于该方法需要使用特殊的锁式探针，而每个SNP位点都需要设计特定的锁式探针，因此整个过程繁琐且耗时。二是锁式探针的成本问题，由于锁式探针目前主要的获得方式是直接合成，而其通常具有接近100bp的长度，因此合成费用较高。三是信号检测时的背景问题，RCA过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA可能产生一些背景信号。
Nallur,G.(2001).Signal amplification by rolling circle amplificationon DNA microarrays. Nucleic Acids Research,29(23),118e–118.doi:10.1093/nar/29.23.e118公开了一种新的结合 RCA技术的连接法检测SNP，其中虽然避免了锁式探针的使用，但需要使用多种P2探针和多种环状模板；此外，由于P2探针是特殊合成的两端都是3’的探针，合成成本极高。
因此，本发明所要解决的技术问题是提供一种新的SNP检测方法，其能够实现高通量、高灵敏度、高特异性，同时简化检测程序，降低所使用的探针的成本。
发明内容
本发明的发明人对现有技术中已知的SNP检测方法和基因芯片进行了大量理论分析和实验研究，创造性地想到了对基因芯片表面的探针进行特殊设计，巧妙构思了一种新的SNP检测方法。本发明的方法使用具有朝外3’端的交联倒置探针的基因芯片，利用 RCA技术来进行信号放大，避免使用成本高昂的锁式探针和特殊合成的两端都是3’的探针。本发明的具有交联倒置探针的基因芯片具有更高的探针密度，能够实现更高通量的检测。另外，本发明的方法只需合成特异性的合成探针与连接探针，二者均为普通的单链核苷酸探针；使用的RCA环状模板是通用模板而非特异性RCA环状模板，从而实现了高通量、高灵敏度、高特异性，同时简化了检测程序，降低了检测成本，提高了检测效率。
本发明提供了一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行SNP分型检测的方法，所述基因芯片上固定有交联倒置探针，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补；
所述方法包括以下步骤：
(I)目标DNA与合成探针杂交，其中所述合成探针的3’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点下游3’方向的序列反向互补，并且所述合成探针的3’端最后一个核苷酸与所述目标DNA中的SNP位点互补配对；
(II)连接探针与目标DNA杂交，其中所述连接探针的5’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点上游5’方向的序列反向互补；
(III)加入连接酶，连接所述合成探针的3’端终点与所述连接探针的5’端终点；
(IV)任选地，用碱性溶液进行洗涤；
(V)加入环状模板，其中所述环状模板的一部分与所述连接探针的3’端反向互补，以进行RCA反应；
(VI)对RCA反应结果进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。
本发明方法中使用的基因芯片可通过以下步骤制备：
a)在芯片探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，
b)任选地，进行洗涤，
c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，
d)任选地，进行洗涤，
e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，
f)任选地，进行洗涤，
g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，
h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，
从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。
本发明还涉及带有交联倒置探针的基因芯片用于SNP分型检测的用途，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补。
附图说明
图1示出了利用交联芯片和RCA技术来进行SNP分型检测的一种实施方式，其中图A表示进行目标DNA与合成探针和连接探针的杂交；图B表示合成探针与连接探针进行连接反应；图C表示连接探针与环状模板的杂交；图D表示RCA反应的结果。
图2示出了利用aoNao交联制备3’端朝外芯片的原理。其中，在芯片探针5’端合成U碱基，使合成探针与其杂交，该合成探针的组成包括与芯片探针反向互补序列——U碱基——突出序列，而芯片探针和合成探针的U碱基刚好形成U碱基对。使用UDG酶切除U碱基产生空碱基对，然后加入交联剂aoNao使空碱基对交联，洗涤除去未交联上的合成探针，得到3’端朝外的探针芯片。
图3示出了反应顺序对交联效率的影响。左上图、右上图、左下图、右下图分别采用以下组合顺序：杂交切U后洗涤交联；切U杂交后洗涤交联；杂交后洗涤再切U洗涤后交联；切U后边杂交边交联。
图4示出了AP对的ICL反应。
图5示出了aoNao的结构式以及利用aoNao交联DNA的反应机理。
具体实施方式
除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。
在本文中使用时，“基因芯片”指的是通过在固相支持物上原位合成寡核苷酸探针或者直接将大量预先制备的探针固化于支持物表面而得到的芯片。通过将基因芯片与样品杂交，然后利用芯片扫描仪和计算机对杂交信号进行检测和分析，能够获得样品的遗传信息。
在本文中使用时，“芯片探针”是指通过原位合成或直接将大量预先制备的探针固化等方式而被固定在固相支持物即芯片上的探针。本领域技术人员应当理解，芯片探针的序列设计仅为了提供交联倒置探针的目的，其具体序列与SNP的检测并无相关性。可以预期，能够通过跨链交叉连接将合成探针以3’端向上的方式间接固定在芯片基质上的任何芯片探针都适用于本发明。
在本文中使用时，“U-芯片探针”指的是在基因芯片上的探针的5’端的最后一个碱基之后加上U碱基而获得的探针。
在本文中使用时，“合成探针”指的是从5’端到3’端依次包含至少与U-芯片探针上紧邻U碱基下游3’方向的序列反向互补的序列、U碱基和突出序列的探针，其中U碱基恰好与U-芯片探针中的U碱基形成U碱基对。
在本文中使用时，“突出序列”指的是位于合成探针中的U碱基的下游3’端的序列。在本文中使用时，合成探针突出序列的3’端与目标DNA中紧邻待测SNP位点下游3’方向的序列反向互补，并且合成探针突出序列的3’端最后一个核苷酸与目标DNA中的SNP 位点互补配对。
在本文中使用时，“交联倒置探针”指的是位于基因芯片上的3’端朝外的探针，其由U-芯片探针与合成探针通过跨链交叉连接形成。
在本文中使用时，“U碱基”指的是尿嘧啶(uracil)碱基。
在本文中使用时，“跨链交叉连接”指的是两条互补DNA链之间的空碱基对或无碱基对(AP对)的共价连接，在体外通常借助于交联剂来实现。图4示出了AP对的ICL 反应，其中“U”指的是脱氧尿苷。“跨链交叉连接”、“链间交联”和“交联”在本文中具有相同的含义，可互换使用。两条互补DNA链之间相互共价连接的的空碱基对或无碱基对(AP对)位点称作“跨链交叉连接点”。
在本文中使用时，“带有交联倒置探针的基因芯片”是指这样的基因芯片，其中直接固定在基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向的序列反向互补。“带有交联倒置探针的基因芯片”与“交联芯片”在本文中具有相同的含义，可互换使用。U-芯片探针与合成探针通过上述跨链交叉连接反应产生的探针总体称作“交联倒置探针”。
在本文中使用时，UDG(uracil DNA glycosylase)指的是尿嘧啶DNA糖基化酶，其能够选择性断裂单链和双链DNA中脱氧尿苷的糖苷键，释放尿嘧啶，从而产生空碱基或无碱基位点。
在本文中使用时，“交联剂”指的是用于实现AP对的共价连接的物质，包括但不限于双官能烷化剂、铂化合物、补骨脂素和不饱和醛类，例如二胺类、N,N'-(萘-1,5-二基)双[2-(氨基氧基)乙酰胺](aoNao)、苯衍生物、其他包含双(氨基氧基)基团的物质等。更优选的交联剂诸如乙二胺、己二胺、癸二胺、aoNao等。本领域常用交联剂的实例参见，例如，Kohei Ichikawa等人,Interstrand cross-link of DNA by covalently linking a pairof abasic sites,Chem.Commun.,2012,48,2143-2145；Zhiyu Yang等人，Interstrandcross-links arising from strand breaks at true abasic sites in duplex DNA,Nucleic Acids Research,2017,Vol.45,No.11 6275–6283；Yu Hirano等人,Synthesisand application of interstrand cross-linked duplexes by covalently linking apair of abasic sites.Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry e63,Volume75；Todor Angelov等人,Generation of DNA Interstrand Cross-Links by Post-Synthetic Reductive Amination.Organic Letters 2009,11(3),661-664中，这些参考文献的全部内容通过引用整体并入本文。图5示出了aoNao的结构式以及利用aoNao交联DNA的反应机理。
在本文中使用时，“待测DNA”或“待测DNA样本”指的是待检测其中SNP位点的DNA样本。
在本文中使用时，“目标DNA”或“目标DNA样品”指的是待测DNA的PCR产物、PCR单链化产物或全基因组扩增产物，优选PCR产物和PCR单链化产物，以及阳性模板。PCR单链化产物的制备是本领域技术人员公知的，如例如实施例3.3中所述，但不限于此。
本领域技术人员应当理解，使用待测DNA的全基因组扩增产物亦能实现本发明的目的，但通过特异性的PCR获得目标DNA会更进一步富集目标DNA，从而获得特异性更好、准确度更高并且检测限更低的反应。
在本文中使用时，“全基因组扩增”是指使用非特定的引物序列，对待测DNA的整个基因组进行扩增反应，以用于随后的芯片测序反应中。
在本文中使用时，“PCR”是指聚合酶链式反应，其能够放大扩增特定的DNA片段并获得目标DNA。
在本文中使用时，“连接探针”指的是这样的探针，其5’端与目标DNA中紧邻待测SNP位点上游5’方向的序列反向互补，且其5’端第一个核苷酸与目标DNA中紧邻待测 SNP位点上游5’的第一个核苷酸互补配对。同时，考虑到合成探针的3’端最后一个核苷酸与目标DNA中的SNP位点互补配对，当连接探针和合成探针均与目标DNA杂交时，连接探针5’端终点与合成探针3’端终点之间待连接的DNA缺口对应于SNP位点的5’方向。
在对SNP进行分型检测时，只有当目标DNA的SNP位点上表现多态性的特定核苷酸与合成探针3’末端最后一个核苷酸互补配对时，目标DNA才能与合成探针稳定杂交，连接探针杂交到目标DNA上并与合成探针相邻，此时，连接酶才能发挥作用，将合成探针3’末端与连接探针5’末端连接起来，从而发生后续的RCA反应，产生放大的、可检测的信号。例如，针对SNP位点有C←→T两种等位多态性的目标DNA，可设计相对应的两种连接探针，其中与SNP位点相对的3’末端最后一个核苷酸分别为G和A，来分别检测这两种等位多态性；也可以只针对感兴趣的某一种SNP位点核苷酸多态性如A，设计单一种类的连接探针(如3’末端最后一个核苷酸为T)，从而只针对具有这一种等位多态性的目标DNA产生最后的RCA反应和信号。本发明与核苷酸SNP位点的等位多态性数量无关，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，均适用于本发明的技术方案。
在本文中使用时，“连接酶”指的是DNA连接酶，其催化在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将两末端连接起来。在本发明中，如果目标DNA中的SNP位点与合成探针对应位置处的核苷酸并非互补配对，则所使用的DNA连接酶不能将合成探针与连接探针连在一起。可用于本发明中的连接酶是本领域技术人员已知的能够实现上述连接功能的DNA连接酶，包括但不限于AMP连接酶、HiFi Taq DNA连接酶、E coli连接酶，其中AMP连接酶是最优选的。
在本文中使用时，“环状模板”指的是RCA反应中使用的模板，该模板的一部分与连接探针的3’端反向互补，使得在合适的反应条件下能够合成由数千个该环状模板的标准重复拷贝组成的单链共链DNA分子，从而放大信号。成环模板和环状探针通过T4连接酶的作用形成环状模板。
在本文中使用时，“阳性模板”指的是SNP位点为阳性(发生突变)，且其它核苷酸与SNP位点未突变的基因组DNA中的相应核苷酸相同的DNA序列。
在本文中使用时，“反向互补”是指两条方向相反、相互平行的多核苷酸链上的嘌呤嘧啶碱基，围绕着螺旋轴，通过形成氢键，按照碱基互补原则互相搭配成对。即一条长链上的腺嘌呤A，与另一条长链上的胸腺嘧啶T形成氢键；而鸟嘌呤G与胞嘧啶C形成氢键。
本发明提供了一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行SNP分型检测的方法，所述基因芯片上固定有交联倒置探针，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补；
所述方法包括以下步骤：
(I)目标DNA与合成探针杂交，其中所述合成探针的3’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点下游3’方向的序列反向互补，并且所述合成探针的3’端最后一个核苷酸与所述目标DNA中的SNP位点互补配对；
(II)连接探针与目标DNA杂交，其中所述连接探针的5’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点上游5’方向的序列反向互补；
(III)加入连接酶，连接所述合成探针3’终点与所述连接探针的5’终点；
(IV)任选地，用碱性溶液进行洗涤；
(V)加入环状模板，其中所述环状模板的一部分与所述连接探针的3’端反向互补，以进行RCA反应；
(VI)对RCA反应结果进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。
应该理解的是，步骤(I)和步骤(II)的顺序可互换或者可同时进行。例如，可在步骤(I)之前、之后或与此同时进行步骤(II)。在本发明的一些实施方式中，步骤(I) 在步骤(II)之后进行。在本发明的一些实施方式中，步骤(I)和步骤(II)同时进行。在本发明的一些特别优选的实施方式中，步骤(I)在步骤(II)之前进行。
在本发明的实施方式中，步骤(I)中使用的目标DNA的浓度可以低至0.05pM。在本发明的实施方式中，步骤(I)中使用的目标DNA的浓度≥0.05pM。在本发明的更优选实施方式中，步骤(I)中使用的目标DNA的浓度≥0.1pM。在本发明的进一步优选实施方式中，步骤(I)中使用的目标DNA的浓度≥0.5pM。在本发明的进一步优选实施方式中，步骤(I)中使用的目标DNA的浓度≥1pM。在本发明的进一步优选实施方式中，步骤(I)中使用的目标DNA的浓度≥5pM。
在本发明的实施方式中，步骤(III)中使用的连接酶可以是本领域技术人员已知的能够用于连接DNA片段的DNA连接酶。在本发明的优选实施方式中，步骤(III)中使用的连接酶是AMP连接酶、HiFi Taq DNA连接酶、E coli连接酶。在本发明的特别优选的实施方式中，步骤(III)中使用的连接酶是AMP连接酶。
在本发明的优选实施方式中，芯片探针与合成探针之间的反向互补序列的长度为5- 30个碱基、10-25个碱基或15-25个碱基。在本发明的优选实施方式中，合成探针与目标DNA之间的反向互补序列的长度为20个碱基或更多个碱基，25个碱基或更多个碱基，或者30个碱基或更多个碱基。在本发明的优选实施方式中，连接探针与目标DNA之间的反向互补序列的长度为9个碱基或更多个碱基，11个碱基或更多个碱基，或者13个碱基或更多个碱基。在本发明的优选实施方式中，连接探针与环状模板之间的反向互补序列的长度为15个碱基或更多个碱基，18个碱基或更多个碱基，或者21个碱基或更多个碱基。
在本发明的优选实施方式中，目标DNA是待测DNA的PCR产物、PCR单链化产物或基因组扩增产物，优选PCR扩增产物和PCR单链化产物，更优选PCR单链化产物。
在本发明的一些实施方式中，不进行步骤(IV)，即，在连接反应后不使用碱性溶液进行洗涤。在本发明的优选实施方式中，进行步骤(IV)，即，在连接反应后使用碱性溶液进行洗涤，以清除因碱基不配对而未连接上的连接探针以及目标DNA，减少背景信号的产生。碱性溶液是本领域技术人员已知的，包括但不限于NaOH溶液、KOH溶液、氨水等。
在本发明的实施方式中，在步骤(VI)中，使用本领域技术人员已知的检测手段来确定是否存在RCA反应产物。在本发明的优选实施方式中，在步骤(VI)中，使用缀合生物标记物的检测探针来确定是否存在RCA反应产物，其中检测探针的序列与环状模板的部分序列相同，生物标记物是本领域技术人员公知的，包括但不限于Cy3、Cy5、Cy7、 biotin(生物素)、DIG(地高辛)、链霉亲和素、HRP(辣根过氧化物酶)、ICG(吲哚菁绿)、TRITC(罗丹明)、FITC(异硫氰酸荧光素)。在本发明的更优选实施方式中，在步骤(VI)中，使用缀合Cy3或biotin的检测探针来确定是否存在RCA反应产物，其中检测探针的序列与环状模板的部分序列相同。在本发明的最优选实施方式中，在步骤 (VI)中，通过抗体级联放大来进一步放大检测信号，即利用现有的抗荧光素、抗第二抗体或抗半抗原(生物素、地高辛等)抗体等对信号进行放大。例如间接法免疫荧光染色后，可用抗FITC标记荧光素与FITC结合，也可用抗FITC标记AKP使其改变颜色，还可以用抗标记有荧光素的二抗与间接法上二抗结合，使信号进一步放大。
在本发明的一些实施方式中，本发明方法中使用的基因芯片可通过以下步骤制备：
a)在芯片探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，
b)任选地，进行洗涤，
c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，
d)任选地，进行洗涤，
e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，
f)任选地，进行洗涤，
g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，
h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，
从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。
应该理解的是，步骤c)、步骤e)和步骤g)的顺序可互换或者可同时进行。例如，可在步骤c)之前或之后进行步骤e)。例如，可在步骤e)之后进行步骤c)，并在步骤 c)之后进行步骤g)或者同时进行步骤c)和步骤g)。
在本发明的一些实施方式中，步骤c)在步骤e)之前进行。
在本发明的一些实施方式中，步骤c)在步骤e)之后进行。
在本发明的一些实施方式中，步骤c)和步骤g)同时进行。
在根据本发明方法的一种实施方式中，所使用的基因芯片可通过具有以下顺序的步骤制备：
1)在芯片探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，
2)任选地，进行洗涤，
3)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，
4)任选地，进行洗涤，
5)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，
6)任选地，进行洗涤，
7)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，
8)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，
从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。
在根据本发明方法的另一种实施方式中，所使用的基因芯片可通过具有以下顺序的步骤制备：
1)在芯片探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，
2)任选地，进行洗涤，
3)向所述U-芯片探针和合成探针中加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，
4)任选地，进行洗涤，
5)使所述合成探针与所述U-芯片探针杂交，
6)任选地，进行洗涤，
7)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，
8)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，
从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。
在根据本发明方法的另一种实施方式中，所使用的基因芯片可通过具有以下顺序的步骤制备：
1)在芯片探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，
2)任选地，进行洗涤，
3)向所述U-芯片探针和合成探针中加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，
4)任选地，进行洗涤，
5)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，同时使所述合成探针与所述U-芯片探针杂交，
6)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，
从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。
在本发明的实施方式中，在交联步骤中所使用的交联剂可以是本领域技术人员已知的能够用于链间交联的交联剂。在本发明的优选的实施方式中，所使用的交联剂是二胺类、aoNao、苯衍生物或其他包含双(氨基氧基)基团的物质。在本发明的更优选的实施方式中，所使用的交联剂是乙二胺、己二胺、癸二胺、aoNao。在本发明的最优选的实施方式中，所使用的交联剂是aoNao。
在本发明的一些实施方式中，交联在0℃-37℃下进行。在本发明的一些实施方式中，交联在4℃-37℃下进行。在本发明的一些实施方式中，交联在4℃-25℃下进行。在本发明的一些实施方式中，交联在室温(即，25℃)下进行。在本发明的一些实施方式中，交联在37℃下进行。
在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行4小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行6小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行8小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行10小时至过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5 小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至4小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5 小时至2小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时至1小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至4小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时至2小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时至6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时至4小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行4小时至 8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行4小时至6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行6小时至8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行过夜。在本发明的一些实施方式中，交联进行10小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行8小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行6小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行 4小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行2小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行1小时。在本发明的一些实施方式中，交联进行0.5小时。
上文针对本发明方法的各个步骤/步骤所述的各种实施方式和优选项可以相互组合 (只要它们彼此之间不是内在矛盾的)，由此组合而形成的各种实施方式都视为本申请公开的一部分。
本发明还涉及带有交联倒置探针的基因芯片用于SNP分型检测的用途，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补。
此外，本发明还包括以下方面所述的实施方案。
第一方面：一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行SNP分型检测的方法，所述基因芯片上固定有交联倒置探针，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补；
所述方法包括以下步骤：
(I)目标DNA与合成探针杂交，其中所述合成探针的3’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点下游3’方向的序列反向互补，并且所述合成探针的3’端最后一个核苷酸与所述目标DNA中的SNP位点互补配对；
(II)连接探针与目标DNA杂交，其中所述连接探针的5’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点上游5’方向的序列反向互补；
(III)加入连接酶，连接所述合成探针的3’端终点与所述连接探针的5’端终点；
(IV)任选地，用碱性溶液进行洗涤；
(V)加入环状模板，其中所述环状模板的一部分与所述连接探针的3’端反向互补，以进行RCA反应；
(VI)对RCA反应结果进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。
第二方面：如第一方面所述的方法，其中所述步骤(I)在所述步骤(II)之前或之后进行，或二者同时进行。
第三方面：如在前任一方面所述的方法，其中所述步骤(III)中的连接酶是AMP连接酶、HiFi Taq DNA连接酶或E coli连接酶。
第四方面：如在前任一方面所述的方法，其中所述芯片探针与所述合成探针之间的反向互补序列的长度为5-30个碱基、10-25个碱基或15-25个碱基。
第五方面：如在前任一方面所述的方法，其中所述合成探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为20个碱基或更多个碱基，25个碱基或更多个碱基，或者30个碱基或更多个碱基。
第六方面：如在前任一方面所述的方法，其中所述连接探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为9个碱基或更多个碱基，11个碱基或更多个碱基，或者13个碱基或更多个碱基。
第七方面：如在前任一方面所述的方法，其中所述连接探针与所述环状模板之间的反向互补序列的长度为15个碱基或更多个碱基，18个碱基或更多个碱基，或者21个碱基或更多个碱基。
第八方面：如在前任一方面所述的方法，其中所述目标DNA是待测DNA的PCR产物、PCR单链化产物或基因组扩增产物，优选PCR扩增产物和PCR单链化产物。
第九方面：如在前任一方面所述的方法，其中所述基因芯片通过如下步骤制备：
a)在所述芯片探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，
b)任选地，进行洗涤，
c)使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，
d)任选地，进行洗涤，
e)加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，
f)任选地，进行洗涤，
g)加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，
h)任选地，进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，
从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。
第十方面：如第九方面所述的方法，其中所述用于跨链交叉连接的交联剂选自aoNao、二胺类。
第十一方面：如第九方面或第十方面所述的方法，其中所述步骤c)在所述步骤e)之前或之后进行。
第十二方面：如第九方面至第十一方面之任一所述的方法，其中所述步骤g)在室温或37℃下进行。
第十三方面：如第九方面至第十二方面之任一所述的方法，其中所述步骤g)进行2小时至过夜、4小时至过夜、6小时至过夜、8小时至过夜、6小时、8小时或过夜。
第十四方面：带有交联倒置探针的基因芯片用于SNP分型检测的用途，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述基因芯片上的芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述基因芯片上的芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补。
下面将结合附图和实施例以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不旨在限制本发明的保护范围。本发明的保护范围仅通过权利要求来限定。
实施例
除非另有说明，否则以下实施例中所采用的探针购买自上海捷瑞生物工程有限公司，酶及其buffer购买自New England Biolabs(NEB)公司。实施例中使用的芯片均是获自生捷科技(杭州)有限公司的Banff芯片，其是一种利用原位合成法合成的具有5’端朝外探针的基因芯片，但本领域技术人员应当理解，任何具有5’端朝外探针的基因芯片都适用于本发明。分子生物学中的常规操作流程可见例如《分子克隆实验指南》。实施例中所使用的探针或DNA片段的序列信息如下表1中所示。表1中所示探针或DNA片段的序列信息仅为以示例的方式描述或展示本发明的设计和构思，而非为了限制任何具体的序列。本领域技术人员结合图1应当理解，实施例中所列芯片探针、连接探针、环状探针、环状模板与包含待测SNP的目标DNA具体序列之间的互补、对应等关系，适用于任何包含待测SNP的目标DNA，即不受限于任何具体的序列。
表1：所用探针或DNA片段的序列信息
实施例1：交联芯片的制备
1.1用二胺作为交联剂
1.1.1确定二胺种类对交联效率的影响
在位于Banff芯片上的芯片探针的5’末端添加U碱基的方法以及合成含有U碱基且与芯片探针的5’端互补杂交的合成探针的方法均是本领域公知的。使添加U碱基后的Banff芯片与合成探针杂交，用1μL UDG酶(M0280S，购自NEB)在37℃下进行酶切1h，然后转移至50μL pH＝6.0的磷酸缓冲液中，加入3μL 5mM二胺、3μL 0.5M NaCNBH3，室温交联过夜。对于对照，只进行芯片探针与合成探针的杂交步骤但不进行交联步骤，其它反应条件与使用二实验组相同。在表2中所述的洗涤条件下进行洗涤，其中对于使用二胺的实验组，在1mL的0.2M NaOH中洗涤5min(强碱洗涤)；对于对照，在1mL 的4×SSC中洗涤5min(温和洗涤，不会破坏芯片探针与合成探针的杂交)。然后将芯片放入装有1μL 1μM的AMT-P和50μL 4×SSC的PCR管中，50℃杂交30min。将杂交后的芯片用1mL的4×SSC漂洗一次后置于50μL SAPE(链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白) 溶液中避光染色30min。用1mL的4×SSC漂洗一次后，使用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)来检测荧光强度，以确定交联效率。结果显示：使用不同二胺时得到的荧光强度相似，其中乙二胺最优，可达到40％左右的交联效率。
表2：二胺种类对交联效率的影响
1.1.2确定乙二胺浓度对交联效率的影响
用乙二胺作为交联剂，根据1.1.1中所述的流程和条件进行交联。乙二胺的浓度和相应的荧光强度如表3中所示。结果显示：使用不同浓度的乙二胺时得到的荧光强度相似，其中50mM乙二胺最优，可达到70％左右的交联效率。
表3：乙二胺浓度对交联效率的影响
乙二胺浓度 荧光强度
0.5mM 4000
5mM 4800
50mM 5600
500mM 4500
1.1.3确定交联时间对交联效率的影响
用乙二胺作为交联剂，根据1.1.1中所述的流程和条件进行交联，其中使用如表4中所列出的浓度和交联时间。结果显示：提高乙二胺浓度对荧光强度影响不大，而延长交联时间对荧光强度影响很大。其中，37℃下的荧光强度较低，推测原因可能是杂交探针脱落造成的。
表4：交联时间对交联效率的影响
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1.2用aoNao作为交联剂进行交联
1.2.1确定交联温度和交联时间对交联效率的影响
根据1.1.1中所述的流程和条件进行交联，其中使用aoNao作为交联剂，使用如表5中所列出的aoNao终浓度、温度和交联时间。结果显示：在37℃下的荧光强度略高于在 25℃下的荧光强度，而在4℃下的荧光强度很低；交联2小时时荧光强度很低，交联在6 小时时大致达到饱和。
表5：交联温度和交联时间对交联效率的影响
aoNao终浓度 温度 反应时间 荧光强度
0.22mM 4℃ 8h 800
0.22mM 25℃ 8h 7000
0.22mM 37℃ 8h 7600
0.22mM 25℃ 2h 3000
0.22mM 25℃ 4h 6400
0.22mM 25℃ 6h 8200
0.22mM 25℃ 8h 8100
1.2.2确定反应顺序对交联效率的影响
在其他条件均相同的情况下，调整芯片探针与合成探针杂交(杂交)、利用UDG酶切除U碱基(切U)、洗涤以及芯片探针与合成探针交联(交联)的组合顺序，以确定反应顺序对交联效率的影响。分别采用以下组合顺序：①杂交切U后洗涤交联；②切U 杂交后洗涤交联；③杂交后洗涤再切U洗涤后交联；④切U后边杂交边交联。结果如表6和图3中所示，其中采用反应顺序③时获得的实验背景最干净，在以下实施例中将采用该反应顺序。
表6：反应顺序对交联效率的影响
1.3其上的AM1’、AM3’探针已分别与AM1、AM3链内交联的芯片的制备
在200μL PCR管中加入48μL 4×SSC、1μL合成探针AM1、1μL合成探针AM3，并加入U-Banff芯片。置于50℃烘箱30min。将芯片取出并在1mL的4×SSC中漂洗一次，然后在200μLPCR管中加入44μL ddH2O、5μL UDG缓冲液、1μL UDG酶，将芯片放入后置于37℃烘箱1h。在200μL PCR管中加入41μL pH＝6的PBS缓冲液、6.5μL 2M aoNao，将芯片放入后置于室温下交联过夜。将芯片置于1mL的0.2M NaOH中清洗3min，并用 1mL的4×SSC漂洗一次。
实施例2：RCA反应环状模板的制备
将2uL 10μM的成环模板和1uL 10μM的环状探针加入1μL 10×T4 ligase buffer(购自NEB)和5μL水中，在50℃下杂交30min；在37℃下加入1μL T4连接酶(购自NEB) 进行连接30min。
实施例3：目标DNA样品的制备
3.1获得待测DNA样本
使用gDNA抽提试剂盒sbeadexTM livestock kit(购自LGC)从正常人的唾液中提取获得待测DNA样本，浓度50ng/μL。
3.2PCR产物的制备
将1μL 1μM的PCR引物-F、1μL 1μM的PCR引物-R和2μL在3.1中制得的待测 DNA样本加入6μL ddH2O中，再加入10μL 2*Taq Master Mix for PAGE(购自novoprotein)，混合均匀后放入PCR仪(GeneAmp PCR system 2700)中，并设置如下PCR循环。
3.3PCR单链化产物的制备
在PCR反应之前，将1μL T4 PNK(购自Vazyme)与1μL 10μM的PCR引物-R混合，加入到1μL T4 PNK buffer(购自Vazyme)和7μL水中，在37℃下反应30min，使 PCR引物-R的5'端磷酸化。然后，将1μL 1μM的PCR引物-F、1μL 1μM的已磷酸化的 PCR引物-R和2μL在3.1中制得的待测DNA样本加入6μL ddH2O中，再加入10μL 2× Taq Master Mix for PAGE(购自novoprotein)，混合均匀后放入PCR仪(GeneAmp PCR system 2700)中，并设置如下PCR循环。
上述PCR循环结束后，向39μL水中加入5μL的PCR产物、1μL的lambda exo(购自NEB)和5μL的10×lambda exo buffer(购自NEB)，在37℃下反应30min，然后在 75℃下失活10min，以切除磷酸化的链，从而制备PCR单链化产物。
3.4全基因组扩增产物的制备
使用3.1中制得的待测DNA样本作为起始模板，利用全基因组扩增试剂盒(Discover- sc WGA Kit，购自Vazyme)根据制造商的说明制备全基因组扩增产物。
3.5阳性模板的制备
阳性模板由上海捷瑞生物工程有限公司提供合成服务。
实施例4在交联芯片上进行SNP分型检测
4.1通用实验流程
(1)在200μL PCR管中加入48μL ddH2O，再加入1μL如实施例3中所述制备的目标DNA样品和1μL 1μM的连接探针以及如实施例1中所述制备的交联芯片，在95℃下持续5min，然后在50℃下杂交1h。
(2)将交联芯片取出，用1mL 4×SSC洗涤3min。在200μL PCR管中加入44.5μLddH2O，然后加入0.5μL连接酶和5μL相应的连接酶缓冲液，并放入交联芯片，在37℃下静置30min。
(3)将交联芯片取出，用1mL 0.2M NaOH溶液洗涤3min，再用1mL 4×SSC洗涤3min。在200μL PCR管中加入49.5μL 4×SSC，然后加入0.5μL 20nM如实施例2中所述制备的环状模板，并放入交联芯片，在48℃下杂交30min。
(4)将交联芯片取出，用1mL 4×SSC洗涤3min。在200μL PCR管中加入41.3μLddH2O，然后加入5μL 10×phi 29pol buffer(购自MCLAB)、2μL 25mM dNTP(购自生工生物)、0.5μL 20mg/mL BSA(购自NEB)和4μL 10U/μL phi 29pol(购自MCLAB)，并放入交联芯片，在30℃下反应2h，然后在65℃下变性10min。
(5)将交联芯片取出，用1mL 0.2M NaOH溶液洗涤3min，再用1mL 4×SSC洗涤3min。在200μL PCR管中加入49μL 4×SSC，然后加入1μL 1μM检测探针，并放入交联芯片，在48℃下杂交30min。
(6)将交联芯片取出，用1mL 4×SSC洗涤3min，然后如下所述来检测荧光强度。
利用“检测探针2”进行检测是指，在使用检测探针2的情况下，杂交后直接使用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)来检测荧光强度。
利用“SAPE染色”进行检测是指，在使用检测探针1的情况下，将交联芯片置于 50μL SAPE(链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白)溶液中避光染色30min。用1mL 4×SSC洗涤3min后，使用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)来检测荧光强度。
利用“抗体级联放大”进行检测是指利用检测探针1进行抗体染色，其中一抗为Streptavidin,DyLightTM 650Conjugated(购自Thermo SCIENTIFIC)和Anti-FITC,eBioscienceTM(购自invitrogen)；二抗为Goat Anti-Streptavidin,Biotinyiated(购自Vector Labs)和Goat Anti-Mouse IgG(H+L),Fluorescein(FITC)Conjugate,highlycross-adsorbed(购自invitrogen)。在40μL 4*SSC中加入0.7μL Streptavidin,DyLightTM650Conjugated(购自Thermo SCIENTIFIC)和1.75μL Anti-FITC,eBioscienceTM(购自invitrogen)配制成一抗混合液，在40μL 4×SSC中加入1.4μL Goat Anti-Streptavidin,Biotinyiated(购自Vector Labs)和0.23μL Goat Anti-Mouse IgG(H+L),Fluorescein(FITC)Conjugate,highly cross- adsorbed(购自invitrogen)配制成二抗混合液，使用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)来检测荧光强度。
4.2不同连接酶对特异性和信号强度的影响
表7
遵循4.1中所述的流程来检测荧光强度，其中步骤(1)中使用的目标DNA样品为阳性模板，浓度为20nM；步骤(2)中使用的连接酶如上表7中所示；步骤(5)中使用的检测探针为检测探针1；步骤(6)中使用的检测方式是SAPE染色。
根据上表7中所示的针对AM1和AM3的荧光强度结果，综合考虑连接的特异性和信号强度，可见AMP连接酶性能最佳。
4.3检测极限的确定
表8
遵循4.1中所述的流程来检测荧光强度，其中步骤(1)中使用的目标DNA样品为阳性模板，浓度如上表8中所示；步骤(2)中使用的连接酶为AMP ligase(购自Lucigen)；步骤(5)中使用的检测探针为检测探针1；步骤(6)中使用的检测方式是SAPE染色。
根据上表8中所示的结果可知，当使用检测探针1，通过SAPE染色进行检测时，目标DNA样品的最低可分辨浓度在0.05pM附近。
4.4不同检测方式的比较
表9
遵循4.1中所述的流程来检测荧光强度，其中步骤(1)中使用的目标DNA样品为阳性模板，浓度如上表9中所示；步骤(2)中使用的连接酶为AMP ligase(购自Lucigen)；步骤(6)中使用的检测方式如上表9中所示。
根据上表9中所示的结果可知，通过抗体级联放大来进行检测时，实现了信号放大效果，荧光强度最高。
4.5使用不同目标DNA样品进行验证
表10
遵循4.1中所述的流程来检测荧光强度，其中步骤(1)中使用的目标DNA样品如上表10中所示，浓度为20nM；步骤(2)中使用的连接酶为AMP ligase(购自Lucigen)；步骤(5)中使用的检测探针为检测探针1；步骤(6)中使用的检测方式是抗体级联放大。
如上表10中所示，分别使用阳性模板和待测DNA样本的产物对本发明的SNP检测方法进行验证。使用待测DNA样本的PCR产物和PCR单链化产物时都能得到优异的结果，检测信号强度高且对比度大；使用待测DNA样本的全基因组扩增产物时，检测信号虽然没那么高但对比明显，也能够正确判读。由此可知，本发明的SNP检测方法能够准确、有效、快速地实现对待测DNA样本的SNP检测。
虽然已经阐明并描述了本发明的特定实施方式，但并不意味着这些实施方式阐明了并描述了本发明的所有可能形式。更确切地，用在本说明书中的文字仅仅是描述性的文字并非限制性的。对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本公开的一般范围的情况下，可以进行各种其他改变和修改。因此，在所附权利要求中，旨在包括在本发明范围内的所有这些改变和修改。
序列表
<110> 生捷科技（杭州）有限公司
<120> 一种SNP分型检测方法
<130> D-CF200046
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 501
<212> DNA
<213> 人类()
<400> 1
ggaacacaag gcacgggagg tggccacggg ggcgaggagg ttctggcctc tactcccctg 60
ggagggcgtc tgaatgatgc agctctgatc ctcactcccc gaagaggggt tcaagggggt 120
aacgcagctc cgggctccca gcagaggctg gaaccgcatc atcgtggaga agcccttcgg 180
gagggacctg cagagctctg accggctgtc caaccacatc tcctccctgt tccgtgagga 240
ccagatctac ygcatcgacc actacctggg caaggagatg gtgcagaacc tcatggtgct 300
gaggtggggc caagcctggg ccgggggacc agggtggggg tggtactcag gagcctcacc 360
tggcccactg cctccccgag gacgaattcc tccagaactc agacaagggt gacccctcac 420
atgtggcccc tgcaccacag aggcccaagg tcagttcctc caccttgccc ctccctgcag 480
atttgccaac aggatcttcg g 501
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tggtcgatgc agtagatctg g 21
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tacgattcag ccgatacagc cactcactca 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
actacataac aacacgcttc cactcactca 30
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gctgtatcgg ctgaatcgta uaaaaaacct gttccgtgag gaccagatct act 53
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gaagcgtgtt gttatgtagt uaaaaaacct gttccgtgag gaccagatct acc 53
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gcatcgacca ctacctgggc aaggagatga aacatgttgt tacacagctg aggatagga 59
<210> 8
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
ctcagctgtg taacaacatg aagattgtag gtcagaactc acctgttaga aactgtgaag 60
atcgcttatt atgtcctatc 80
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
cacagctgag gataggacat a 21
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gcttattatg tcctatcctc agctg 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gcttattatg tcctatcctc agctg 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gctgtccaac cacatctcct c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ggtcaccctt gtctgagttc t 21

Claims (28)

1.一种利用基因芯片锚定RCA技术来进行非诊断目的的SNP分型检测的方法，所述基因芯片上固定有交联倒置探针，其中直接固定在所述基因芯片上的芯片探针与并未直接固定在所述基因芯片上的合成探针在一对碱基位点处具有跨链交叉连接点，所述跨链交叉连接点是所述芯片探针的5’方向终点，所述合成探针中位于所述跨链交叉连接点的上游5’方向的序列与所述芯片探针中紧邻所述跨链交叉连接点的下游3’方向序列反向互补；
所述方法包括以下步骤：
（I）目标DNA与合成探针杂交，其中所述合成探针的3’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点下游3’方向的序列反向互补，并且所述合成探针的3’端最后一个核苷酸与所述目标DNA中的SNP位点互补配对；
（II）连接探针与目标DNA杂交，其中所述连接探针的5’端与所述目标DNA中紧邻待测SNP位点上游5’方向的序列反向互补；
（III）加入连接酶，连接所述合成探针的3’端终点与所述连接探针的5’端终点；
（V）加入环状模板，其中所述环状模板的一部分与所述连接探针的3’端反向互补，以进行RCA反应；
（VI）对RCA反应结果进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。
2.如权利要求1所述的方法，在步骤（III）和步骤（V）之间还包括步骤：（IV）用碱性溶液进行洗涤。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤（I）在所述步骤（II）之前或之后进行，或二者同时进行。
4.如前述权利要求1所述的方法，其中所述步骤（III）中的连接酶是AMP连接酶、HiFiTaq DNA连接酶或E coli连接酶。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述芯片探针与所述合成探针之间的反向互补序列的长度为5-30个碱基。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述芯片探针与所述合成探针之间的反向互补序列的长度为10-25个碱基。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述芯片探针与所述合成探针之间的反向互补序列的长度为15-25个碱基。
8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述合成探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为20个碱基或更多个碱基。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述合成探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为25个碱基或更多个碱基。
10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述合成探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为30个碱基或更多个碱基。
11.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述连接探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为9个碱基或更多个碱基。
12.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述连接探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为11个碱基或更多个碱基。
13.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述连接探针与所述目标DNA之间的反向互补序列的长度为13个碱基或更多个碱基。
14.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述连接探针与所述环状模板之间的反向互补序列的长度为15个碱基或更多个碱基。
15.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述连接探针与所述环状模板之间的反向互补序列的长度为18个碱基或更多个碱基。
16.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述连接探针与所述环状模板之间的反向互补序列的长度为21个碱基或更多个碱基。
17.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述目标DNA是待测DNA的PCR产物、PCR单链化产物或基因组扩增产物。
18.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述目标DNA是待测DNA的PCR扩增产物和PCR单链化产物。
19.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述基因芯片通过如下步骤制备：
a）在所述芯片探针的5’端最后一个碱基之后合成U碱基，得到U-芯片探针，
c）使合成探针与所述U-芯片探针杂交，所述合成探针从5’端到3’端依次包含至少与所述U-芯片探针上的U碱基下游的邻接序列反向互补的序列、U碱基和突出序列，其中所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基恰好形成U碱基对，
e）加入UDG酶，以切除所述U-芯片探针和所述合成探针中的U碱基，从而产生空碱基对，
g）加入用于跨链交叉连接的交联剂，以使所述空碱基对交联，
h）进行洗涤，以除去未与所述U-芯片探针交联在一起的合成探针，从而在所述基因芯片上形成所述交联倒置探针。
20.如权利要求19所述的方法，所述方法包括以下至少之一：
在步骤a）和步骤c）之间包括步骤b）：进行洗涤；
在步骤c）和步骤e）之间包括步骤d）：进行洗涤；
在步骤e）和步骤g）之间包括步骤f）：进行洗涤。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述用于跨链交叉连接的交联剂选自aoNao、二胺类。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述步骤c）在所述步骤e）之前或之后进行。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述步骤g）在室温或37℃下进行。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述步骤g）进行2小时至过夜。
25.如权利要求19所述的方法，其中所述步骤g）进行4小时至过夜。
26.如权利要求19所述的方法，其中所述步骤g）进行6小时至过夜。
27.如权利要求19所述的方法，其中所述步骤g）进行8小时至过夜。
28.如权利要求19所述的方法，其中所述步骤g）进行6小时、8小时或过夜。
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