CN113215223B - 一种snp分型检测方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了SNP分型检测方法，包括：(I)使待测DNA与基因芯片杂交，基因芯片上固定有磷酸化的芯片探针，芯片探针朝外的5’端最后一个碱基为U碱基，芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，SNP位点与U碱基的位置相对应；(II)加入随机引物或特异性引物、dNTP和DNA聚合酶，合成与待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列；(III)加入能够催化U碱基切割的酶和能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶，在U碱基的位置处产生核苷酸缺口；(IV)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；(V)针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定SNP位点的基因型。
Description
技术领域
本公开提供了一种SNP分型检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即DNA序列中单个碱基的差别。在自然界中，SNP广泛存在，对于SNP的检测分析在药物研制、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。
目前的SNP检测方法大致可以分为两大类：一大类是基于凝胶电泳的传统经典的SNP检测方法，以单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶切扩增多态性序列、等位基因特异性PCR等为代表；另一大类是高通量、自动化程度较高的SNP检测方法，以直接测序、基因芯片、变性高效液相色谱、质谱检测技术、高分辨率溶解曲线等为代表。
基因芯片技术是半导体工业技术里的微细加工技术和分子生物学的结合，在一个基片表面集成了大量密集排列的基因探针。利用基因芯片的SNP检测方法根据已知的SNP位点设计两种或者多种探针，将设计好的探针固定在特殊的载体上，基于杂交、引物延伸、连接等不同的方式实现对SNP位点的分型检测。该方法实现了快速、高效、并行的多态信息分析，是常用的一种高通量SNP分析方法。
发明内容
本公开可以提供一种SNP分型检测方法，所述方法包括以下步骤：
(I)使待测DNA与基因芯片杂交，所述基因芯片上固定有磷酸化的芯片探针，所述芯片探针朝外的5’端最后一个碱基为U碱基，所述芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，所述SNP位点与U碱基的位置相对应；
(II)加入随机引物或特异性引物、dNTP和DNA聚合酶，合成与所述待测DNA中紧邻所述SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列；
(III)加入能够催化U碱基切割的酶和能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶，在所述U碱基的位置处产生核苷酸缺口；
(IV)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；
(V)针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。
本公开还可以提供包含5’端最后一个碱基为U碱基的芯片探针的基因芯片用于SNP分型检测的用途，其中所述芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，所述SNP位点与U碱基的位置相对应。
附图说明
图1示出了：现有技术中通过经典连接法对A/C、A/G、T/C或T/G型的SNP进行分型的原理图，其中显色探针覆盖SNP位点，捕获探针未覆盖SNP位点，还单独示出了所使用的四种显色探针。
图2示出了：现有技术中通过经典连接法对A/T或C/G型的SNP进行分型的原理图，其中捕获探针覆盖SNP位点，显色探针未覆盖SNP位点。
图3示出了：根据本公开的SNP分型检测方法的原理图。
图4示出了：在本公开的一种实施方式中，基因芯片的荧光扫描结果。
图5示出了：在本公开的另一种实施方式中，基因芯片的荧光扫描结果。
具体实施方式
原位合成基因芯片是基因芯片的一种，具有密集程度高、可合成任意序列的寡核苷酸等优点，特别适用于SNP分析等。在原位合成基因芯片上，连接法是检测SNP位点的经典方法。该方法通过两种探针实现对SNP位点的检测，第一种探针是固定在基因芯片上的捕获探针，其作用是把DNA片段固定到基因芯片表面；第二种探针是显色探针，其负责对基因芯片进行显色。
对于A/C、A/G、T/C或T/G型的SNP，显色探针分成四组，针对SNP位点分别为A、C、G、T设计探针，其3’末端的第一个碱基是特异的，其中A和T用一种标记物标记，C和G用显示出不同颜色的另一种标记物标记；从第二个碱基到最后一个碱基都是简并的。捕获探针被设计为正好到SNP位点旁边的一个碱基，但并未覆盖SNP位点。在待测DNA与芯片杂交后，加入显色探针，利用连接酶的高保真性，与SNP位点互补配对的显色探针会被连接至捕获探针上。连接反应完成之后，去除游离的显色探针，进行染色和扫描，基于荧光的不同颜色来判定SNP位点的基因型。此类SNP分型方法的原理图可见图1。
对于A/T或C/G型的SNP，捕获探针分为两组，其被设计为覆盖SNP位点；显色探针未覆盖SNP位点，仅有一种，呈现一种颜色。待测DNA与芯片杂交后，如果捕获探针与待测DNA完美匹配，那么加入显色探针后，再经过连接反应，显色探针会被连接至捕获探针上；如果捕获探针与待测DNA在SNP位点并不匹配，那么加入显色探针后，由于连接酶的高保真性，显色探针不会被连接至捕获探针上，从而在接下来的洗脱过程中会被洗掉。因此，进行染色和扫描后，可以基于荧光的有无来判定SNP位点的基因型。此种SNP分型方法的原理图可见图2。
然而，在该方法中，原位合成基因芯片由于合成效率问题，存在探针质量落后和碱基不同步的问题，即从3’端向5’端合成的过程中，随着碱基数目增加，越靠近5’端，有效探针数量越少。对于A/C、A/G、T/C或T/G型的SNP，由于捕获探针检测的显色环节是通过具有特异碱基的简并探针连接实现，所以合成的不同步问题会造成5’端缺损的探针也参与显色反应，从而大幅增加检测的背景信号。同时，捕获探针中间不同步的碱基，在较低的杂交温度下也会产生非特异信号。此外，捕获探针的设计较为复杂，并且显色探针的成本较高。
本发明的发明人创造性地设计了一种新的SNP分型检测方法，所述方法包括：使待测DNA与基因芯片杂交，基因芯片上固定有磷酸化的芯片探针，芯片探针朝外的5’端最后一个碱基为U碱基，芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，SNP位点与U碱基的位置相对应；随后利用随机引物或特异性引物、dNTP以及合适的DNA聚合酶进行延伸反应，合成与待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列，从引物延伸至与U碱基紧邻(没有缺口)；接着利用能够催化U碱基切割的酶和能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶，在U碱基的位置处产生核苷酸缺口；之后利用高保真聚合酶填入荧光标记的dNTP或dUTP；最后针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定SNP位点的基因型。上述根据本公开的SNP分型检测方法的原理图可见图3。
通过该方法，无需设计多种捕获探针和显色探针，但实现了特别有益的技术效果：不仅灵敏度高、精准高效，而且操作方便、简单快捷、成本较低。
除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。
在本文中使用时，“待测DNA”指的是待检测其中SNP位点的DNA样本。
在本文中使用时，“基因芯片”指的是通过在固相支持物上原位合成寡核苷酸探针或者直接将大量预先制备的探针固化于支持物表面而得到的芯片。通过将基因芯片与样品杂交，然后经过一系列的处理，最后利用芯片扫描仪和计算机对信号进行检测和分析，能够获得样品的遗传信息。
在本文中使用时，“芯片探针”指的是通过原位合成或直接将大量预先制备的探针固化等方式而被固定在固相支持物即基因芯片上的探针。
在本文中使用时，“U碱基”指的是尿嘧啶(uracil)碱基。
在本文中使用时，“反向互补”指的是两条方向相反、相互平行的多核苷酸链上的嘌呤嘧啶碱基，围绕着螺旋轴，通过形成氢键，按照碱基互补原则互相搭配成对。即一条长链上的腺嘌呤A，与另一条长链上的胸腺嘧啶T或尿嘧啶U形成氢键；而鸟嘌呤G与胞嘧啶C形成氢键。
在本文中使用时，“特异性引物”指的是针对特定序列而设计的、与该特定序列特异性结合的引物。
在本文中使用时，“随机引物”指的是含有若干个碱基的随机序列引物，包括但不限于随机六聚体引物、随机九聚体引物等。例如，pd(N)6随机六聚体引物是含有6个碱基的随机序列：5’-P-d(NNNNNN)-3’，其中N＝G、A、T或C。此外，可以对随机引物中的碱基进行修饰，例如硫代修饰，以防止引物被扩增酶消化。
在本文中使用时，“DNA聚合酶”能够催化将单个核苷酸加到已有的DNA片段的3’末端，形成磷酸二酯键。可用于本公开中的DNA聚合酶是本领域技术人员已知的能够实现上述功能的任何DNA聚合酶，包括但不限于T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、DNA聚合酶I。
dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP可用作DNA聚合酶的底物，其中“dATP”指的是脱氧腺苷三磷酸，“dTTP”指的是脱氧胸苷三磷酸，“dCTP”指的是脱氧胞苷三磷酸，“dGTP”指的是脱氧鸟苷三磷酸，“dUTP”指的是脱氧尿苷三磷酸。dATP、dTTP、dCTP、dGTP统称为dNTP。
可以在dNTP、dUTP上添加生物标记物，以便于基因芯片上的反应结果被仪器检测到。生物标记物是本领域技术人员公知的，包括但不限于Cy3、Cy5、Cy7、biotin(生物素)、DIG(地高辛)、链霉亲和素、HRP(辣根过氧化物酶)、ICG(吲哚菁绿)、TRITC(罗丹明)、荧光染料。荧光染料的实例包括但不限于：标准荧光素及其衍生物，如FITC(异硫氰酸荧光素)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等；罗丹明类染料；菁染料；其它荧光染料，如二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。
在本文中使用时，“DNA连接酶”能够催化在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将两末端连接起来。可用于本公开中的DNA连接酶是本领域技术人员已知的能够实现上述连接功能的任何DNA连接酶，包括但不限于E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶。
在本文中使用时，“能够催化U碱基切割的酶”指的是能够催化U碱基的切割、形成空碱基或无碱基(AP)位点的任何酶，其实例包括但不限于尿嘧啶DNA糖基化酶等。
在本文中使用时，“能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶”指的是能够在AP位点3’和5’端切开磷酸二酯键、释放AP位点的磷酸糖(sugar phophate)部分、从而产生核苷酸缺口的任何酶，例如AP内切酶(或称AP核酸内切酶或AP裂解酶)，包括但不限于核酸内切酶VIII(Endo VIII)等。
在本文中使用时，“具有3’磷酸酯酶活性的酶”指的是能够催化3’端磷酸基团的水解去除的任何酶，包括但不限于多聚核苷酸激酶(PNK)等。
本公开可以提供一种SNP分型检测方法，所述方法包括以下步骤：
(I)使待测DNA与基因芯片杂交，所述基因芯片上固定有磷酸化的芯片探针，所述芯片探针朝外的5’端最后一个碱基为U碱基，所述芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，所述SNP位点与U碱基的位置相对应；
(II)加入随机引物或特异性引物、dNTP和DNA聚合酶，合成与所述待测DNA中紧邻所述SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列；
(III)加入能够催化U碱基切割的酶和能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶，在所述U碱基的位置处产生核苷酸缺口；
(IV)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；
(V)针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。
在一些实施方式中，在步骤(II)中，另外加入DNA连接酶；并且在步骤(III)之后、并且在步骤(IV)之前，加入具有3’磷酸酯酶活性的酶。
因此，本公开可以提供一种SNP分型检测方法，所述方法包括以下步骤：
(I’)使待测DNA与基因芯片杂交，所述基因芯片上固定有磷酸化的芯片探针，所述芯片探针朝外的5’端最后一个碱基为U碱基，所述芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，所述SNP位点与U碱基的位置相对应；
(II’)加入随机引物或特异性引物、dNTP和DNA聚合酶，合成与所述待测DNA中紧邻所述SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列，并加入DNA连接酶；
(III’-1)加入能够催化U碱基切割的酶和能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶，在所述U碱基的位置处产生核苷酸缺口；
(III’-2)加入具有3’磷酸酯酶活性的酶，去除3’端磷酸基团；
(IV’)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；
(V’)针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。
在一些实施方式中，基因芯片可以是原位合成基因芯片。
在一些实施方式中，磷酸化的芯片探针可以通过利用具有多聚核苷酸5’羟基激酶活性的酶(例如但不限于PNK)对芯片探针进行5’磷酸化来实现。
在一些实施方式中，可以加入随机引物，也可以加入特异性引物，只要所述引物使得能够实现与待测DNA中紧邻SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列的合成即可。
在一些实施方式中，DNA聚合酶可以是本领域技术人员常规使用的那些，包括但不限于T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、DNA聚合酶I。在一些实施方式中，DNA聚合酶可以是T4 DNA聚合酶。
在一些实施方式中，DNA连接酶可以是本领域技术人员常规使用的那些，包括但不限于E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶。在一些实施方式中，DNA连接酶可以是E.coli DNA连接酶。
在一些实施方式中，“能够催化U碱基切割的酶”可以是尿嘧啶DNA糖基化酶。
在一些实施方式中，“能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶”可以是AP内切酶。在一些实施方式中，“能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶”可以是Endo VIII。
在一些实施方式中，在步骤(III)或(III’-1)中，可以分别加入“能够催化U碱基切割的酶”和“能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶”。在一些实施方式中，在步骤(III)或(III’-1)中，“能够催化U碱基切割的酶”和“能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶”可以以混合物形式加入。混合物形式的“能够催化U碱基切割的酶”和“能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶”可以是商业化的酶制剂，例如USER酶、尿嘧啶切刻酶，其是尿嘧啶DNA糖基化酶和Endo VIII的混合物。
在一些实施方式中，在步骤(III’-2)中，具有3’磷酸酯酶活性的酶可以是PNK，例如T4 PNK。
在步骤(IV)或(IV’)中加入的dUTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP和生物标记物的种类和数量取决于对待测SNP的认知程度和预期结果。
在一些实施方式中，如果希望判读待测DNA中的SNP位点是否为A碱基，在步骤(IV)或(IV’)中，可以加入带有生物标记物的dUTP或dTTP。在这种情况下，如果最终的扫描结果显示有信号，则表示该SNP位点是A碱基；如果最终的扫描结果显示没有信号，则表示该SNP位点不是A碱基。因此，如果希望判读待测DNA中的SNP位点是否为某一特定碱基，可以加入与其配对的脱氧核苷三磷酸，即可根据最终的扫描结果判定。
在一些实施方式中，如果已知待测SNP位点为二等位多态性，例如A/C或A/T，那么可以加入与其配对的两种带有不同颜色荧光标记的脱氧核苷三磷酸，并根据最终扫描结果中的颜色来判定SNP位点的基因型。同理，在一些实施方式中，如果已知待测SNP位点为三等位多态性，那么可以加入与其配对的三种带有不同颜色荧光标记的脱氧核苷三磷酸，并根据最终扫描结果中的颜色来判定SNP位点的基因型。在一些实施方式中，如果希望判读待测DNA中的SNP位点究竟是A、T、C、G四种碱基中的哪一种或哪几种，在步骤(IV)或(IV’)中，可以加入用四种颜色荧光标记的dNTP，并根据最终扫描结果中的颜色来进行判定。在一些实施方式中，在步骤(IV)或(IV’)中，可以加入dUTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP中的任何一种、两种、三种或更多种。在一些实施方式中，在步骤(IV)或(IV’)中，可以加入dUTP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP中的任一种。在一些实施方式中，在步骤(IV)或(IV’)中，可以加入dNTP。
在步骤(IV)或(IV’)之后、并且在步骤(V)或(V’)之前，可以用碱溶液进行洗涤(洗脱)。碱溶液可以是本领域技术人员公知的那些，包括但不限于NaOH溶液、KOH溶液等。
在步骤(V)或(V’)中，“针对所述生物标记物对基因芯片进行检测”是指使用仪器读取基因芯片上生物标记物的信号，根据信号的有无或者颜色来判定SNP位点的基因型。
上文针对本公开方法的各个步骤以及其中使用的各种酶、引物等所述的各种实施方式和优选项可以相互组合(只要它们彼此之间不是内在矛盾的)，由此组合而形成的各种实施方式都视为本申请公开的一部分。
本公开还可以提供包含5’端最后一个碱基为U碱基的芯片探针的基因芯片用于SNP分型检测的用途，其中所述芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，所述SNP位点与U碱基的位置相对应。
下面将结合附图和实施例以例证的方式更清楚、明确地阐述本公开的技术方案。应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不旨在限制本公开的保护范围。本公开的保护范围仅通过权利要求来限定。
实施例
实验材料
除非另有说明，否则以下实施例中所采用的基因芯片获自生捷科技(杭州)有限公司，引物获自上海捷瑞生物工程有限公司。分子生物学中的常规操作流程可见例如《分子克隆实验指南》。实施例中所使用的探针、引物或待测DNA的序列信息如下表1中所示。表1中所示探针或DNA片段的序列信息仅为以示例的方式描述或展示本公开的设计和构思，而非为了限制任何具体的序列。本领域技术人员在了解本公开内容和本发明的主旨后，能够根据本发明的构思，针对不同目标序列的具体序列信息设计相应的芯片探针并实现本发明的技术效果。
表1：相关序列信息
预处理：芯片磷酸化
将芯片加入40μL反应液中，在37℃下反应1小时，之后用ddH2O冲洗并晾干。反应液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 10× T4 ligase buffer | Takara | 4 |
| T4 PNK | Vazyme | 34 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 2 |
实施例1
1.1杂交反应
将经预处理的芯片加入50μL杂交液中，在95℃下加热变性5min，然后降温至50℃杂交1小时，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。杂交液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 20×SSC | Thermo Fish | 10 |
| 待测DNA | 人唾液提取基因组 | 5 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 35 |
1.2延伸反应&连接反应
将1.1中获得的芯片加入100μL反应液中，在37℃下反应30min，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。反应液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 10×E.coli DNA ligase buffer | NEB | 10 |
| 0.1％BSA | NEB | 1 |
| 1mM dNTP | 生工 | 1 |
| T4 DNA Polymerase | Takara | 1 |
| E.coli DNA ligase | NEB | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 86 |
1.3切割反应
将1.2中获得的芯片加入40μL反应液中，在37℃下反应30min，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。反应液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 10×CutSmart buffer | NEB | 4 |
| USER Enzyme | NEB | 2 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 34 |
1.4 3’端去磷酸反应
将1.3中获得的芯片加入40μL反应液中，在37℃下反应30min，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。反应液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 10× T4 PNK buffer | Vazyme | 4 |
| T4 PNK | Vazyme | 34 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 2 |
1.5dUTP掺入反应
将1.4中获得的芯片加入100μL反应液中，在37℃下反应30min，之后在75℃下加热20min。反应液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 10×E.coli DNA ligase buffer | NEB | 10 |
| 0.1％BSA | NEB | 1 |
| 1mM dUTP-11-Biotin | Thermo Fish | 1 |
| T4 DNA Polymerase | Takara | 1 |
| E.coli DNA ligase | NEB | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 86 |
1.6碱洗
将1.5中获得的芯片用0.2M NaOH洗涤2min，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。
1.7扫描检测
将1.6中获得的芯片置于50μL SAPE(链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白)溶液中避光染色30min。用1mL的4×SSC漂洗一次后，使用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)来检测荧光强度。
荧光扫描结果如图4所示。结果显示：背景比较干净，荧光强度非常高，从而能够判定SNP位点为A碱基。
实施例2
2.1杂交反应
将经预处理的芯片加入50μL杂交液中，在95℃下加热变性5min，然后降温至50℃杂交1小时，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。杂交液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 20×SSC | Thermo Fish | 10 |
| 待测DNA | 人唾液提取基因组 | 5 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 35 |
2.2延伸反应
将2.1中获得的芯片加入100μL反应液中，在37℃下反应30min，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。反应液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 0.1％BSA | NEB | 1 |
| 1mM dNTP | 生工 | 1 |
| T4 DNA Polymerase | Takara | 1 |
| 10×T4 DNA Polymerase buffer | Takara | 10 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 87 |
2.3切割反应
将2.2中获得的芯片加入40μL反应液中，在37℃下反应30min，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。反应液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 10×CutSmart buffer | NEB | 4 |
| USER Enzyme | NEB | 2 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 34 |
2.4dUTP掺入反应
将2.3中获得的芯片加入100μL反应液中，在37℃下反应30min，之后在75℃下加热20min。反应液体系如下：
| 成分 | 来源 | 用量(μL) |
| 10×E.coli DNA ligase buffer | NEB | 10 |
| 0.1％BSA | NEB | 1 |
| 1mM dUTP-11-Biotin | Thermo Fish | 1 |
| T4 DNA Polymerase | Takara | 1 |
| E.coli DNA ligase | NEB | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | Thermo Fish | 86 |
2.5碱洗
将2.4中获得的芯片用0.2M NaOH洗涤2min，之后用1ml 4×SSC洗涤5min，并用滤纸吸干多余液体。
2.6扫描检测
将2.5中获得的芯片置于50μL SAPE(链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白)溶液中避光染色30min。用1mL的4×SSC漂洗一次后，使用SUMMIT芯片扫描仪(购自生捷科技(杭州)有限公司)来检测荧光强度。
荧光扫描结果如图5所示。结果显示：背景干净，荧光强度高，从而能够判定SNP位点为A碱基。
虽然已经阐明并描述了本公开的特定实施方式，但并不意味着这些实施方式阐明了并描述了本公开的所有可能形式。更确切地，用在本说明书中的文字仅仅是描述性的文字并非限制性的。对于本领域技术人员明显的是，在不脱离本公开的一般范围的情况下，可以进行各种其它改变和修改。因此，在所附权利要求中，旨在包括在本公开范围内的所有这些改变和修改。
序列表
<110> 生捷科技（杭州）有限公司；生捷科技（嘉兴）有限公司
<120> 一种SNP分型检测方法
<130> D-CF210158
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
cattagattc aaatgtagca aatcagaagc cctttgagag tggaagtgac aaa 53
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
utgctacatt tgaatctaat gcactcactc a 31
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttgtcactt ccactc 16
Claims (10)
1.一种SNP分型检测方法，所述方法包括以下步骤：
(I)使待测DNA与基因芯片杂交，所述基因芯片上固定有磷酸化的芯片探针，所述芯片探针朝外的5’端最后一个碱基为U碱基，所述芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与所述待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，所述SNP位点与U碱基的位置相对应；
(II)加入随机引物或特异性引物、dNTP和DNA聚合酶，合成与所述待测DNA中紧邻所述SNP位点下游3’方向的序列反向互补的序列；
(III)加入能够催化U碱基切割的酶和能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶，在所述U碱基的位置处产生核苷酸缺口；
(IV)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，以及带有生物标记物的dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP中的一种或多种；
(V)针对所述生物标记物对基因芯片进行检测，以确定所述SNP位点的基因型。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(III)中所述的能够催化U碱基切割的酶是尿嘧啶DNA糖基化酶。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(III)中所述的能够催化AP位点的3’和5’端磷酸二酯键断裂的酶是AP内切酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤(II)中，另外加入DNA连接酶；并且在步骤(III)之后、并且在步骤(IV)之前，加入具有3’磷酸酯酶活性的酶。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述具有3’磷酸酯酶活性的酶是多聚核苷酸激酶。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(II)和步骤(IV)中所述的DNA聚合酶是T4 DNA聚合酶。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(IV)中所述的DNA连接酶是E.coliDNA连接酶。
8.如权利要求4所述的方法，其中步骤(II)中所述的DNA连接酶是E.coli DNA连接酶。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤(IV)之后、并且在步骤(V)之前，用碱溶液进行洗涤。
10.包含5’端最后一个碱基为U碱基的芯片探针的基因芯片用于SNP分型检测的用途，其中所述芯片探针中紧邻U碱基下游3’方向的序列与待测DNA中紧邻SNP位点上游5’方向的序列反向互补，所述SNP位点与U碱基的位置相对应。
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