JP2002539849A

JP2002539849A - ユニバーサルアレイ

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Publication number: JP2002539849A
Application number: JP2000608794A
Authority: JP
Inventors: ファン，チアン−ビン; ヒルシュホーン，ジョエル，エヌ．; フアン，シアオフア; カプラン，ポール; ランダー，エリック，エス．; ロッカート，デービッド，ジェイ．; ライダー，トーマス; スクラー，パメラ
Original assignee: ホワイトヘッドインスチチュートフォアーバイオメディカルリサーチ; アフィメトリックスインコーポレイテッド
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-27
Publication date: 2002-11-26
Also published as: WO2000058516A3; WO2000058516A2; CA2366459A1; US20050074787A1; EP1165839A2

Abstract

(57)【要約】複数の目的に使用されうる、固相基板上のオリゴヌクレオチドのアレイが開示される。試料中の遺伝子の対立遺伝子形態の同一性または制限（ration）を決定するための遺伝子型タイピングを実施するための方法および試薬が提供される。単一塩基伸長プライマーが配列同一性コードに連結される。プライマー伸長反応の際に、試料中に存在する対立遺伝子形態を同定する特有の標識が取り込まれる。これにより、複数の同時解析が容易かつ効率的に行われうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景数千の多型マーカーに関する遺伝子型情報を非常に平行した様式で得ることは
、疾患の遺伝子座をマッピングする際に、量的形質遺伝子座を同定する際に、ヘ
テロ接合性の腫瘍喪失を診断する際に、そして連鎖分析を行う際にますます重要
な課題になりつつある。非常に多くの多型マーカー遺伝子型を同時に得るために
現在用いられる方法は、高密度のオリゴヌクレオチドアレイにおける対立遺伝子
特異的プローブに対するハイブリダイゼーションを含む。この方法を実施するた
めに、ハイブリダイゼーションプローブの重複したセット、典型的には、２０以
上のセットが、それぞれのマーカーを評価するために使用されている。しかしな
がら、大きな重複度が、ノイズを減らし、かつ満足できるレベルの正確さを達成
するためには必要である。このレベルの重複性でさえ、多くの場合には、ヘテロ
接合体を疑いなく評価するために、あるいは集団における対立遺伝子の頻度を定
量的に決定するためには不十分である、従って、この分野では、多型マーカーに
おける遺伝子型を同定するための、信頼性がより大きく、より良好な定量的方法
が求められている。

【０００２】発明の要旨固相基板に結合させられたオリゴヌクレオチド標識のアレイが、遺伝子座特異
的タグ化オリゴヌクレオチドとともに開示される。本発明のアレイおよび遺伝子
座特異的タグ化オリゴヌクレオチドは、一塩基伸長反応を使用する遺伝子型タイ
ピング（genotyping）において特に有用である。アレイおよび遺伝子座特異的タ
グ化（locus-specific tagged ）オリゴヌクレオチドは、それらが一緒に使用さ
れた場合、遺伝子型タイピングにおいて使用される「ユニバーサルチップ」シス
テムとして役立つ。この場合、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドの種々
のセットを使用することによって、システムを任意の所望する遺伝子型タイピン
グ適用に合わせることができる。例えば、多型遺伝子座における対立遺伝子の比
を決定することを補助する方法を提供することは本発明の目的である。多型遺伝
子座（polymorphic locus ）に存在するヌクレオチドの比を決定する際に使用さ
れるプライマーのセットを提供することは本発明の別の目的である。

【０００３】従って、１つの態様において、本発明は、固相基板に固定化された１つまたは
それ以上のオリゴヌクレオチドタグを含むアレイに関する。この場合、それぞれ
のオリゴヌクレオチドタグは、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイゼーションするのに充分な長さの独特（unique）の既知の任意のヌクレ
オチド配列を含み、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドは、その第１の末
端に、オリゴヌクレオチドタグの前記任意の配列にハイブリダイゼーションする
、例えば、オリゴヌクレオチドタグの前記任意の配列に対して相補的なヌクレオ
チド配列を有し、そして遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドは、第２の末
端にサンプル中の標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列
を有する。

【０００４】１つの態様において、本発明は、固相基板に固定化された１つまたはそれ以上
のオリゴヌクレオチド標識を含むアレイと、１つまたはそれ以上の遺伝子座特異
的タグ化オリゴヌクレオチドとを含むキットに関する。この場合、それぞれのオ
リゴヌクレオチド標識は、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドにハイブリ
ダイゼーションするのに充分な長さの独特の既知の任意のヌクレオチド配列を含
み、そしてそれぞれの遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドは、その第１の
（５’）末端に、アレイ上の対応するオリゴヌクレオチド標識の任意の配列にハ
イブリダイゼーションする、例えば、アレイ上の対応するオリゴヌクレオチド標
識の任意の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有し、かつその第２の（３
’）末端にサンプル中の標的ポリヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチ
ド配列を有する。

【０００５】本発明はさらに、１つまたはそれ以上の遺伝子座において核酸サンプルを遺伝
子型タイピングする方法に関する。この方法は下記の工程を含む：試験対象の核
酸サンプルを得る工程；核酸サンプルを１つまたはそれ以上の遺伝子座特異的タ
グ化オリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせるために好適な条件のも
とで、核酸サンプルを１つまたはそれ以上の遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレ
オチドと組み合わせる工程であって、それぞれの遺伝子座特異的タグ化オリゴヌ
クレオチドは、オリゴヌクレオチドタグにおける相補的な配列にハイブリダイズ
し得るヌクレオチド配列と、サンプル中の目的とするヌクレオチドの５’ヌクレ
オチド配列に相補的なヌクレオチド配列とを含み、それによって、増幅産物−遺
伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチド複合体が得られる工程；複合体を一塩基
伸長反応に供する工程であって、反応により、標識されたｄｄＮＴＰが遺伝子座
特異的タグ化オリゴヌクレオチドに付加され、そして各タイプのｄｄＮＴＰが、
それ以外の３タイプのｄｄＮＴＰのタグとは区別され得るタグを有する工程；複
合体を、固相基板に固定された１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド標識を
含むオリゴヌクレオチドアレイと、好適なハイブリダイゼーション条件のもとで
接触させる工程であって、それぞれのオリゴヌクレオチド標識が、遺伝子座特異
的タグ化オリゴヌクレオチドにおける相補的な配列に対して相補的で、ハイブリ
ダイズするのに充分な長さの独特の任意の配列を含み、それにより、複合体がア
レイ上の特定のオリゴヌクレオチドタグにハイブリダイズする工程；および１つ
またはそれ以上のオリゴヌクレオチドタグにハイブリダイズした複合体に存在す
る標識されたｄｄＮＴＰを決定するためにアレイを評価し、それによってサンプ
ル中の目的のヌクレオチドの遺伝子型を決定する工程。１つの態様において、試
験対象の核酸サンプルは増幅される。

【０００６】１つの態様において、サンプル中の多型遺伝子座における対立遺伝子の比を決
定することを助けるための方法が提供される。１対のプライマーが、サンプル中
の核酸の領域を増幅するために使用される。１つの態様において、領域は多型遺
伝子座を含み、そしてその多型遺伝子座を含む増幅された核酸産物が形成される
。増幅された核酸産物は、伸長プライマーとの一塩基伸長反応におけるテンプレ
ートとして使用され、標識された伸長プライマーが形成される。伸長プライマー
（これはまた、本明細書中では遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドと呼ば
れる）は３’部分および５’部分を含む。３’部分は、増幅された核酸産物に相
補的であり、多型遺伝子座の５’の１ヌクレオチドで終結する。５’部分は、増
幅された核酸産物に対して相補的ではない。多型遺伝子座に対して相補的な標識
されたジデオキシヌクレオチドが、伸長プライマーの３’末端に結合される。反
応物中に存在する各タイプのジデオキシヌクレオチドは異なる標識を有する。伸
長プライマーの５’部分は、固相支持体上の既知の位置に固定化された１つまた
はそれ以上のプローブ（これはまた、本明細書中ではオリゴヌクレオチドタグと
呼ばれる）にハイブリダイズさせられる。プローブは、伸長プライマーの５’部
分に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。

【０００７】本発明により、多型遺伝子座に存在するヌクレオチドの比（ratio ）を決定す
るために使用されるプライマーセットもまた提供される。このプライマーセット
は、１対の増幅プライマーおよび伸長プライマーを含む。プライマー対は、多型
遺伝子座を含む二本鎖核酸の領域の合成を開始する。伸長プライマーは、二本鎖
核酸の前記領域に対して相補的な３’部分と、二本鎖核酸の前記領域に対して相
補的でない５’部分とを含む。伸長プライマーは、多型遺伝子座の５’の１ヌク
レオチドで終結する。本発明によるプライマーの例を表１に示す。

【０００８】本発明の別の態様は、サンプル中の多型遺伝子座における対立遺伝子の比を決
定することを補助する方法を提供する。１つまたはそれ以上の多型遺伝子座を含
む任意の核酸分子（ゲノムＤＮＡを含む）は、伸長プライマーとの一塩基伸長反
応におけるテンプレートとして使用され、標識された伸長プライマーが形成され
る。伸長プライマーは３’部分および５’部分を含む。３’部分は、核酸分子に
相補的であり、多型遺伝子座の５’の１ヌクレオチドで終結する。５’部分は、
核酸産物に対して相補的ではない。多型遺伝子座に対して相補的な標識されたジ
デオキシヌクレオチドが、伸長プライマーの３’末端に結合される。反応物中に
存在する各タイプのジデオキシヌクレオチドは異なる標識を有する。伸長プライ
マーの５’部分は、固相支持体上の既知の位置に固定化された１つまたはそれ以
上のプローブにハイブリダイズさせられる。

【０００９】下記においてより詳しく記載される本発明のこれらの態様および他の態様は、
個体の遺伝子型タイピングおよび集団における対立遺伝子頻度を迅速かつ容易に
決定するための方法およびツールを当該分野に提供する。

【００１０】発明の詳細な記載本発明は、固相基板（図１）に付着しているオリゴヌクレオチドタグから成る
、一般的あるいはユニバーサルな遺伝子型アレイを特徴としている。そのアレイ
中の各アドレス（例えば、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、その他）はそれに関連する
オリゴヌクレオチドタグを有する。所定のアドレスのオリゴヌクレオチドは固相
基板に付着させ、また独特の任意のヌクレオチド配列を含む。すなわち、「タグ
Ａ」のためのヌクレオチド配列はアレイ中のその他の全てのタグのためのヌクレ
オチドとは異なっている。各標識のためのヌクレオチド配列は、それがそのアレ
イ中の他のあらゆるタグのためのヌクレオチドとは異なっているのであれば、い
かなる配列であってもよいという点で任意のものである。好適には、そのオリゴ
ヌクレオチドタグは約２０〜約５０個のヌクレオチドタグの長さである。例えば
、標的核酸分子（増幅産物）との望ましくない相互作用を促進しないといった、
オリゴヌクレオチドタグのヌクレオチド配列を設計することもまた望ましいこと
であり得る。

【００１１】オリゴヌクレオチドアレイは、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドと組
み合わせて使用される。アレイ中の各オリゴヌクレオチドタグは、遺伝子座特異
的タグ化オリゴヌクレオチドに対応する。遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオ
チドの１つの末端（５’末端）は、それに対応するオリゴヌクレオチドタグ（図
２）の独特の任意の配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。好適に
は、この配列は約２０〜約３０ヌクレオチドの長さである。遺伝子座特異的タグ
化オリゴヌクレオチドのもう一方の末端（３’末端）は、目的のヌクレオチド、
例えば、多型ヌクレオチドを含む標的核酸分子に対して相補的である。好適には
、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドの３’末端は、標的核酸分子にハイ
ブリダイズされるときに、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドが目的のヌ
クレオチドの５’の１ヌクレオチドで終結するように合成される。標的核酸分子
にハイブリダイズする遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドの部分は好適に
は、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さのものである。例えば、遺伝子座特異的
タグ化オリゴヌクレオチド「Ａ」の５’末端は、アレイ中のアドレス「Ａ」に結
合されるオリゴヌクレオチドタグ「Ａ」の末端にある独特の任意の配列に相補的
である。遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチド「Ａ」の３’末端は、標的「
Ａ」中の目的のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列５’に対して相補的である
と考えられる。

【００１２】遺伝子座「Ａ」の個体から得た核酸サンプルを遺伝子型タイピングするために
、遺伝子座「Ａ」を含む領域に特異的な増幅プライマーが、サンプル中の核酸分
子を増幅するために使用される。遺伝子座「Ａ」のヌクレオチド配列５’に相補
的である遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションに
適した条件下で増幅産物と組み合わされる（図３）。ハイブリダイゼーション複
合体は単一塩基伸長に供される。反応混合物中のｄｄＮＴＰの４つのタイプが異
なる標識を有する（例えば、４つの異なる蛍光タグで、例えば、ｄｄＡＴＰが第
１波長で蛍光発光した付着蛍光団を有するであろうもの、ｄｄＣＴＰが第２波長
で蛍光発光した付着蛍光団（fluorophore ）を有し、ｄｄＧＴＰが第３波長で蛍
光発光した付着蛍光団を有し、ｄｄＴＴＰ第４波長で蛍光発光した付着蛍光団を
有する）。単一塩基伸長反応時に、単一ｄｄＮＴＰが付着し（図４）、標識化ｄ
ｄＮＴＰと増幅産物とにより伸長された遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチ
ドからなる複合体を形成するという結果になる。

【００１３】単一塩基伸長反応の後、標識化（伸長）遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオ
チドと増幅産物との複合体は、アレイにハイブリダイズされる（図５）。アドレ
ス「Ａ」にあるオリゴヌクレオチドタグ「Ａ」は選択的にそれに対応する遺伝子
座特異的タグ化オリゴヌクレオチド（この時点では、標識化ｄｄＮＴＰにより伸
長されている）にハイブリダイズされ、アドレス「Ｂ」にあるオリゴヌクレオチ
ドタグ「Ｂ」は選択的にそれに対応する遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチ
ド（この時点では標識化ｄｄＮＴＰにより伸長されている）にハイブリダイズさ
れる、などである。アレイは、どの標識（単数または複数）がアレイ上のどのア
ドレスに存在しているのかを決定するために分析される。例えば、アドレス「Ａ
」がｄｄＡＴＰ上の標識と同じ波長で蛍光発光した場合、増幅産物は明確に、目
的のヌクレオチドにおける「Ｔ」を含んでいた（なぜなら単一塩基伸長反応によ
り目的のヌクレオチドに対して相補的であるｄｄＮＴＰを付着させる）。ｄｄＣ
ＴＰ標識と同じである波長での蛍光は、遺伝子型が「Ｇ」であったことを示す等
である。発光した波長内の２つのピークを検出することにより、異なるヌクレオ
チドがサンプル中の目的の位置に存在し、例えば、その個体がその遺伝子座では
ヘテロ接合であったことを示す。

【００１４】本明細書に記載されているアレイと方法の長所は、多くのアドレスが同時にア
ッセイされ、多くの異なる遺伝子座、例えば、ＳＮＰに関する遺伝子型タイピン
グデータを産生することができることである。遺伝子座特異的タグ化オリゴヌク
レオチドの事前に定義されたセットを使用することにより、例えば、遺伝病の１
つのセットをアッセイするのに特異的な１つのセットを使用することにより、単
一アレイが、特定の目的のために使用することができ、また、そのアレイ上の同
じタグに対応する遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドの異なるセットを使
用することにより、同じアレイを異なる目的のために利用することができる。ユ
ニバーサルチップは、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチド（標識化、遺伝
子型タイピングされたＳＮＰと一緒に）が計画され、所定のやり方でハイブリダ
イズするアドレスのセットの貯蔵所（repository）として役に立つ。そのアレイ
と遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドのセット（複数）はしたがって、配
列決定および遺伝子型タイピングの目的のためにキット中の構成要素として使用
することができる。遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドのセットはしたが
って、本明細書に記載されているようなアレイと組み合わせて、法医学、個体の
同定、そして疾患の診断／予後予測の用途で使用することができる。

【００１５】本発明は多型遺伝子座にある個体の遺伝子型あるいは１つの集団中の対立遺伝
子頻度を測定するのに都合の良い、また正確な方法を提供する。本方法の１つの
態様には、３つの工程が含まれる。すなわち、（１）多型遺伝子座の増幅、（２
）多型遺伝子座における異なるポリヌクレオチドについての別個の標識による配
列タグ化プライマーのプライマー伸長、および（３）タグアレイへのハイブリダ
イゼーションである。各別個の標識の量はそのタグアレイの公知の位置で測定す
ることができる。各タグは、別個の多型遺伝子座を表わしており、また各別個の
標識は多型遺伝子座における別個の対立遺伝子形態を表わしている。本方法は１
つの集団の中での対立遺伝子の頻度の測定だけではなく、複数の遺伝子座におけ
る遺伝子型の同時測定をも可能にする。もうひとつの態様は工程２と３だけを用
いる。

【００１６】開示されている本方法の長所には、１つの一般的なタグアレイだけを使用して
任意の遺伝子マーカーを遺伝子型タイピングでき、すなわち、特異的にカスタマ
イズされた遺伝子型タイピングチップは必要ないことが含まれる。さらに、タグ
チップ上で合成された事前選択プローブ配列が、そのプローブとそのタグの間で
の良好なハイブリダイゼーション結果を保証している。さらに、このアッセイに
おいて使用されている２色あるいは複数色アプローチにより、テストを受けたサ
ンプルにおける対立遺伝子の頻度の正確な測定を提供する。これは、非常に信頼
できる遺伝子型タイピングの結果が、個体のサンプルに関してだけでなく、プー
ルされたサンプルに関しても得ることができることを意味している。

【００１７】一対のプライマーあるいは単一プライマーは、サンプル中の核酸の１つの領域
を増幅するのに使用することができる。そのサンプルは単一の個体あるいは個体
の集団から得ることが可能である。増幅される領域には多型遺伝子座が含まれる
。増幅の工程は特定の対立遺伝子に特異的なものではない。しかし、その増幅は
、多型遺伝子座を含む二本鎖あるいは一本鎖核酸の領域を特異的に増幅するよう
に設計されている。

【００１８】その増幅工程は当業者には公知のいずれかの技術を使用して実施することが可
能である。１つの好適な技術は、ＤＮＡが対数的に増幅されるポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）である。当業者には公知のものであるように、一対の増幅プライ
マーの各プライマーが、対立遺伝子の反対鎖にハイブリダイズされ、また好適に
はその対立遺伝子の反対側の鎖に相補的である。そのプライマーは、２ｋｂ以上
離れていない位置にある二本鎖核酸にハイブリダイズされるのが好適であり、ま
た、さらに互いにずっと近い方が好適である。１ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２
ｋｂ、０．１ｋｂ、０．０１ｋｂ、あるいは０．００１ｋｂ以上離
れていないといった位置が好適である。適当なＤＮＡポリメラーゼは、当業者に
は公知であるように使用することができる。熱安定ポリメラーゼが特に、プライ
マーハイブリダイゼーション、重合、融解のラウンドの熱サイクルには好都合で
ある。一本鎖核酸の増幅もまた用いることができる。

【００１９】増幅後は、いかなる過剰なプライマーとヌクレオチドを取り除くおよび／また
は分解することが望ましい。これは、例えば、エンドヌクレアーゼＩおよびアル
カリ性ホスファターゼなどといった酵素を使用して洗浄および／または酵素によ
る分解により行うことができる。その除去を達成することに関する当業者には公
知のものである、クロマトグラフィ、磁気ビーズ、およびアビジン−あるいはス
トレプトアビジン結合ビーズなどの他の技術もまた使用することができる。増幅
ＤＮＡ産物の二本の鎖のうち一本を除去あるいは破壊する必要はない。

【００２０】本方法のプライマー伸長工程は、本方法に対して対立遺伝子特異性を提供する
ものの１つである。このプライマーは１つのヌクレオチド５’を終結して多型遺
伝子座にするように設計されている。このプライマーは変性増幅二本鎖ＤＮＡに
ハイブリダイズされる。このプライマーがジデオキシヌクレオチドとＤＮＡポリ
メラーゼを使用して単一塩基により伸長されるとき、多型遺伝子座にあるヌクレ
オチドに対して相補的であるそのジデオキシヌクレオチドが加えられる。再び、
いずれかのＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼを使用することができる。こうし
たものには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩの
Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ
．ａｑｕａｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されな
い。この反応は好適には、産生形態を促進するためにその鋳型によりプライマー
のＴ_Mにおいて行われる。

【００２１】プライマー伸長工程を実施するための１つの形態は、増幅二本鎖ＤＮＡの反対
側の鎖にそれぞれハイブリダイズされる２つの異なるプライマーを利用するもの
である。各プライマーは１つのヌクレオチド５’を終結して、多型遺伝子座にす
る。このプライマー伸長反応は、鋳型として一本鎖によるもののほうが、もう一
方によるものよりも頑丈である。さらに、第２鎖から得られる情報により、第１
鎖から得られる情報を確認すべきである。

【００２２】プライマー伸長の１つの代替的な方法には、逆転写酵素と、３’を多型遺伝子
座にハイブリダイズする１つのプライマーあるいは２つのプライマーの使用が含
まれる。この方法は、「フォワード」方向プライマー伸長が望まれるものよりも
頑丈ではない場合には、望ましいものになるであろう。

【００２３】単一塩基伸長反応に存在するそれぞれ異なるジデオキシヌクレオチドは、ユニ
ークに標識化される。そのユニークな標識は検出することができ、またその量は
サンプル中にある対応するデオキシヌクレオチドを含む特定の対立遺伝子の量に
比例するであろう。サンプルが単一の個体から得られたものであれば、多型遺伝
子座に存在するそのヌクレオチド塩基は測定することができる。そのサンプルが
個体の集団から得られたものであれば、その集団における対立遺伝子の頻度を測
定することができる。

【００２４】数多くの異なる多型遺伝子座について同時に、多重的なやり方で本発明の方法
を実施することができるのは、その５’末端にある伸長プライマー上に存在する
配列タグに拠る。その配列タグは、多重的な増幅の産物と１つのアレイ上の異な
る位置への多重的なプライマー塩基伸長を本方法のオペレーターが最終的に分類
することを可能にしている。伸長プライマー上の各配列タグは、単一多型遺伝子
座に対してのみ使用される。このように、プライマー伸長反応の産物が１つのア
レイ上の別個の既知の位置にハイブリダイズすることができるため、プライマー
伸長反応の産物は個別に解析することができる。

【００２５】配列タグは典型的には、解析される多型対立遺伝子の配列にはまったく無関係
である。配列タグはそれらの好ましいハイブリダイゼーション特性により選択さ
れる。タグが他のタグ配列に対して同様のハイブリダイゼーション特性および最
少交差ハイブリダイゼーションを有しているようにタグは典型的に選択される。
各配列タグは特定の遺伝子あるいは遺伝子マーカーに付着させられ、その後、そ
の特定の遺伝子あるいは遺伝子マーカーに対する標識として役に立つ。事前に選
択された標的配列に対応する一般的な標識アレイが作製され、また、テストサン
プル中の特定対立遺伝子形態の有無あるいは割合を検出するのに使用される。本
出願に参考文献として引用される、１９９６年４月４日に出願された米国出願第
０８／６２６，２８５号およびＥＰ出願第９７３０２３１３．８号を参照のこと
。

【００２６】使用される標識は、当業者には知られているいずれかのものでありうる。これ
らには、放射標識、蛍光標識、酵素標識、エピトープ標識、および高アフィニテ
ィー結合パートナー標識が含まれる。実施例には、同位体で標識されたヌクレオ
チド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、ジゴキシン標識ヌク
レオチドが含まれる。異なる標識が、単一塩基伸長反応における各塩基ジデオキ
シヌクレオチドに割り当てられる。２つ、３つあるいは４つの異なる標識が、こ
の反応に使用することができる。異なる標識はすべて同じタイプ、例えば、酵素
標識であっても、混合タイプであってもよい。

【００２７】固相支持体上の公知の位置に固定化される１つあるいはそれ以上のプローブへ
の伸長プライマーの５’部分（標識配列）のハイブリダイゼーションもまた意図
されている。ハイブリダイゼーションは、高度な特異性をもって強いシグナルを
得るために、当該分野で既知の標準的な条件下で実施することができる。標準的
な洗浄条件もまた用いることができる。伸長プライマーのハイブリダイゼーショ
ンの検出は、使用される標識のタイプにより、標準的な手段を使用して行うこと
ができる。例えば、蛍光は光学検出手段を使用して検出され、また定量化されう
る。放射標識は、オートラジオグラフィーあるいはシンチレーションカウンティ
ングを使用して検出することができる。酵素標識は、酵素反応および酵素反応の
最終的な産物に対する分析を用いて検出することができる。抗原性標識は免疫学
的検出手段を使用することができる。ストレプトアビジンあるいはアビジンおよ
びビオチンなどの親和性結合パートナーもまた標識として使用することができる
。

【００２８】本発明の反応は、単一あるいは多重化様式で実施することができる。例えば、
増幅工程では、対応する数の多型マーカーを増幅するために、２０、３０、４０
、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０あるいは３００の異なるプライ
マー対を使用して実施することができる。これらは、所望される場合は、単一塩
基伸長反応のために、プールされうる。数千のハイブリダイゼーションを同時に
行うことができるように、ハイブリダイゼーション工程のためにプールすること
が好ましい。

【００２９】１つの代替的な態様では、増幅工程は省略することができる。したがって、充
分なＤＮＡが入手可能である場合は、単一塩基伸長反応はゲノムＤＮＡ上に直接
実施することができる。もう１つの特定の態様では、ゲノム全体の増幅がランダ
ムプライマーを使用して実施することができる。

【００３０】本発明によるプライマーのセットは、増幅対および伸長プライマーを含む。多
型遺伝子座に存在するヌクレオチドの比を測定するための方法において、これら
は一緒に使用される。これは、単一の容器、好適には、分割容器あるいはパッケ
ージのなかにパッケージングされうる。プライマー対は多型遺伝子座を含む二本
鎖ＤＮＡの領域を増幅する。伸長プライマーは、多型遺伝子座を含有している二
本鎖ＤＮＡの領域の一部に対して相補的である３’部分と、二本鎖ＤＮＡの領域
に相補的ではない５’部分の２つの部分を有している。５’領域は単一塩基伸長
反応の産物を識別また分析するのに使用される標識アレイに対して相補的である
標識配列である。単一塩基伸長プライマーの３’末端は、多型遺伝子座の５’の
１ヌクレオチドで終結する。

【００３１】本発明によるキットには、上述のような１つあるいはそれ以上のプライマーの
セットが含まれ得る。本キットにはまた、固相支持体に付着させる少なくとも１
つのプローブを含む固相支持体が含まれ得る。１つあるいはそれ以上のプローブ
は、伸長プライマーの５’部分に相補的であり、すなわち、タグ配列に対して相
補的である。本発明による固相支持体には、ビーズ、マイクロタイタープレート
、およびアレイが含まれる。

【００３２】核酸を対立遺伝子特異的プローブのアレイにハイブリダイズさせる「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基対により２つの異なる核酸の２
分子複合体の形成を意味する。相補的な塩基対は非共有結合により起こり、通常
は、二本鎖ＤＮＡにおける相補的塩基の結合におけるように、他の塩基を特異的
に認識する塩基の水素結合により起こる。本発明では、ハイブリダイゼーション
は、対立遺伝子特異的増幅により核酸サンプルから調製される標的核酸と、アレ
イを形成するために基板上に固定化された少なくとも２つのプローブとの間で実
施される。

【００３３】当業者であれば、膨大な数のアレイデザインが、本発明の実施には適すること
を理解するであろう。アレイには典型的には、目的の配列（タグ）に特異的にハ
イブリダイズされる数多くのプローブが含まれる。さらに、アレイには１つある
いはそれ以上のコントロールプローブが含まれることが望ましい。１つの態様で
は、アレイは高密度アレイである。高密度アレイは、多くの対立遺伝子マーカー
の存在を検出するために、標的核酸サンプルとハイブリダイズさせるのに使用さ
れるアレイであり、好適には１０以上の対立遺伝子マーカー、さらに好適には１
００以上の対立遺伝子マーカー、最も好適には１０００の対立遺伝子マーカーで
ある。

【００３４】高密度アレイは、不均一な核酸の大きな集団の存在下で対立遺伝子マーカーの
頻度における小さな変異を定量化するために適する。こうした高密度アレイは、
基板上でのｄｅｎｏｖｏ合成によるか、あるいは基板の特定の位置に核酸配列
をスポット（spot）するかあるいは輸送することによるかのいずれかで作製され
る。これらの方法は両方とも、特定の位置にあるアレイ上に固定化される核酸を
産生する。核酸は、目的の配列のクローン化セグメントを含む細菌プラスミドな
どの生物学的材料から精製および／または分離されうる。適切な核酸はまた、鋳
型の増幅により、あるいは合成により産生することもできる。非限定的な説明と
して、ポリメラーゼ連鎖反応および／またはｉｎｖｉｔｒｏでの転写は、適切
な核酸増幅方法である。

【００３５】「標的核酸」という用語は、そのプローブが特異的にハイブリダイズするよう
に設計されている核酸（合成かあるいは生物学的サンプルあるいは核酸サンプル
から誘導されたもの）を意味する。本発明では、こうした標的核酸は配列タグと
同じである。検出される標的核酸が存在するかあるいは存在しないかが検出され
るか、あるいは標的核酸の量が定量化される。標的核酸はその標的に指向される
対応するプローブの核酸配列に対して相補的である配列を有する。「標的核酸」
という用語は、その存在を検出することが望まれるより大きな核酸のプローブが
指向される特定部分配列、あるいは全体配列（例えば、遺伝子あるいはｍＲＮＡ
）のことをいう。使用の違いは、文脈から明らかである

【００３６】本明細書で使用される「プローブ」は、１つあるいはそれ以上のタイプの化学
結合、通常は相補的塩基対、通常は水素結合形成により相補配列の標的核酸に結
合することが可能な核酸と定義される。本出願で使用されているように、プロー
ブには天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、ＣあるいはＴ）あるいは修飾塩基（例えば
、７−デアザグアノシン、イノシン、その他）が含まれうる。プローブにはまた
オリゴヌクレオチドが含まれうる。オリゴヌクレオチドは２〜ｎ塩基の一本鎖核
酸であり、ここでｎは１０００より小さい任意の整数である。核酸は当該分野で
既知のいずれかの技術を使用してクローン化あるいは合成されうる。それらには
また、ハイブリダイゼーションを改善するために修飾されるもの、またペプチド
核酸などの非天然発生ヌクレオチドアナログを含めることができる。さらに、プ
ローブの中の塩基は、それがハイブリダイゼーションに干渉しないかぎり、ホス
ホジエステル結合以外の結合により連結されることも可能である。したがって、
プローブは、構成成分である塩基がホスホジエステル結合よりもむしろペプチド
連結したペプチド核酸であってもよい。

【００３７】プローブ設計アレイには、「テストプローブ」（本明細書中では「オリゴヌクレオチドタグ
」とも呼ぶ）が含まれる。テストプローブは約５〜約４５個あるいは５〜約５０
０個のヌクレオチドの範囲にあるオリゴヌクレオチドでありうるが、さらに好適
には約１０〜約４０個のヌクレオチドであり、またもっとも好適には約１５〜約
４０個のヌクレオチドの長さでありうる。他の特に好ましい態様では、プローブ
は２０〜２５個のヌクレオチドの長さである。もう１つの態様では、テストプロ
ーブは二本鎖あるいは一本鎖ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は天然資源から分離
あるいはクローン化することができ、あるいは鋳型として天然核酸を使用して天
然資源から増幅することができる。しかし、アレイ上のプローブのｉｎｓｉｔ
ｕ合成が好適である。プローブはそれら対立遺伝子マーカーが検出されるように
設計されている遺伝子の対立遺伝子マーカーの特定部分配列に相補的である配列
を有する。したがって、テストプローブは標的核酸を検出するように設計された
標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。

【００３８】「完全マッチプローブ」という用語は、特定標的配列に完全に相補的であるよ
うに設計された配列を有するプローブを意味する。プローブは典型的には、標的
配列の一部（部分配列）に完全に相補的である。完全マッチプローブは「テスト
プローブ」、「標準化（normalization ）コントロールプローブ」、発現レベル
コントロールプローブなどでありうる。しかし、完全なマッチコントロールプロ
ーブあるいは完全マッチプローブは「ミスマッチコントロールプローブ」、ある
いは「ミスマッチプローブ」あるいは「ミスマッチコントロールプローブ」から
識別される。

【００３９】目的の標的核酸（単数または複数）に結合するテストプローブに加えて、高密
度アレイにはコントロールプローブが多数含まれうる。そのコントロールプロー
ブは２つのカテゴリーに分類される。すなわち、標準化コントロールとミスマッ
チコントロールである。

【００４０】標準化コントロールは、標識化標準オリゴヌクレオチドに対して相補的である
オリゴヌクレオチドあるいはその他の核酸プローブであるか、あるいは、核酸サ
ンプルに加えられるその他の核酸配列である。ハイブリダイゼーション後の標準
化コントロールプローブから得られたシグナルは、ハイブリダイゼーション条件
における変化、標識強度、「読み出し」効率、および、完全ハイブリダイゼーシ
ョンのシグナルをアレイ間で変化させる原因となるその他の要因に対するコント
ロールを提供する。１つの好適な態様では、アレイ中のすべての他のプローブか
ら読み出されるシグナル（例えば、蛍光強度）は、そのコントロールプローブか
ら得られるそのシグナル（例えば、蛍光強度）で割り、それによって測定が標準
化される。

【００４１】実質的にいかなるプローブも標準化コントロールプローブとして役立たせるこ
とができる。しかし、ハイブリダイゼーション効率は、塩基組成とプローブの長
さにより変化することが分かっている。好適な標準化プローブはアレイ中に存在
するその他のプローブの平均の長さを反映するように選択される。しかし、それ
らは長さのある範囲をカバーするように選択することができる。標準化コントロ
ールプローブ（複数）はまた、アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反
映するように選択することもできる。しかし１つの好適な態様では、１つのみあ
るいはいくつかの標準化プローブが使用され、またそれらはそれらが良好にハイ
ブリダイゼーションされ（すなわち、２次構造なし）、いずれの標識特異的プロ
ーブにも対合しないように選択される。

【００４２】ミスマッチコントロールはまた、標的対立遺伝子に対するプローブあるいは標
準化コントロールに対しても提供することができる。「ミスマッチコントロール
」あるいは「ミスマッチプローブ」あるいは「ミスマッチコントロールプロー
ブ」という用語は、その配列が特定の標的配列に対して完全に相補的ではないよ
うに意図的に選択されるプローブを意味する。ミスマッチコントロールプローブ
は、１つあるいはそれ以上のミスマッチ塩基の存在以外はそれらに対応するテス
トあるいはコントロールプローブと同じオリゴヌクレオチドプローブあるいはそ
の他の核酸プローブである。ミスマッチ塩基は、そうでなければプローブが特異
的にハイブリダイズしうる標的配列中の対応する塩基には相補的ではないように
選択される塩基である。１つあるいはそれ以上のミスマッチは、適切なハイブリ
ダイゼーション条件下（例えば、緊縮条件）で、テストあるいはコントロールプ
ローブがその標的配列によりハイブリダイズされうると予測されるが、しかしミ
スマッチプローブはハイブリダイズされえない（あるいは著しく低い程度でハイ
ブリダイズされうる）ように選択される。好適なミスマッチプローブには中心ミ
スマッチが含まれる。したがって、例えば、１つのプローブが２０量体である場
合、対応するミスマッチプローブは、位置６〜１４（中心ミスマッチ）のいずれ
かで単一塩基ミスマッチ（例えば、Ａの代わりにＧ、ＣあるいはＴを置換する）
以外の同一配列を有することになる。

【００４３】高密度アレイ中の各ミスマッチコントロールに関しては、典型的には、同じ特
定標的配列に対して完全に相補的である対応する完全対合プローブがそこには存
在する。このミスマッチは１つあるいはそれ以上の塩基を含みうる。ミスマッチ
プローブ中のどこかにミスマッチ（複数）が位置するのが良いが、一方、末端ミ
スマッチは標的配列のハイブリダイゼーションを防ぎにくいと考えられるので、
末端ミスマッチあまり望ましくない。１つの特に好適な態様では、このミスマッ
チがテストハイブリダイゼーション条件下で標的配列により二本鎖を不安定なも
のにする可能性がもっとも高くなるように、そのミスマッチはそのプローブの中
心あるいはその近傍に位置させる。

【００４４】ミスマッチプローブは、そのプローブが方向付けられている標的ではなくて、
サンプル中の核酸に非特異的に結合する、あるいは交差ハイブリダイゼーション
のためのコントロールを提供する。ミスマッチプローブはこのように、ハイブリ
ダイゼーションが特異的かどうかを示す。例えば、標的が存在する場合、完全対
合プローブはミスマッチプローブよりも常に明るいはずである。完全対合プロー
ブとミスマッチプローブの間の強度差（Ｉ_(PM)−Ｉ_(MM)）は、ハイブリダイズさ
れた材料の濃度の良好な測定値を提供する。

【００４５】アレイにはまた、サンプル調製物／増幅コントロールプローブを含めることが
できる。これらは、測定されている特定の生物学的サンプルの核酸で正常には起
こらないので、選択されたコントロール遺伝子の部分配列に対して相補的である
プローブである。適当なサンプル作成／増幅コントロールプローブには、例えば
、関心の対象となっているサンプルが真核細胞から得られたものである細菌遺伝
子（例えば、ＢｉｏＢ）に対するプローブが含まれる。

【００４６】１つの好適な態様では、高密度アレイ中のオリゴヌクレオチドプローブは、使
用されている特定のハイブリダイゼーション条件下で最少非特異的結合あるいは
交差ハイブリダイゼーションによりそれらプローブが方向付けられている核酸標
的に対して特異的に結合するように選択される。本発明の高密度アレイには過剰
な１００，０００あるいは１，０００，０００の異なるプローブを含めることが
できるので、特定の核酸配列に結合する、それぞれ特有の長さのプローブを提供
することが可能である。

【００４７】高密度アレイを形成する高密度アレイは、対立遺伝子マーカーの存在をモニターするのに特に有用であ
る。遺伝子発現モニタリングにおける高密度アレイの作製と適用は、以前に、例
えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ９７／１０３６５号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／１０
５８８号、１９９６年１２月２３日に出願された米国特許出願第０８／７７２，
３７６号、１９９５年９月１５日に出願された米国特許出願第０８／５２９，１
１５号、１９９３年１２月１５日に出願された米国特許出願第０８／１６８，９
０４号、１９９０年１２月６日に出願された米国特許出願第０７／６２４，１１
４号、１９９０年６月７日に出願された米国特許出願第０７／３６２，９０１号
および米国特許第５，６７７，１９５号に開示されており、すべては本出願に参
考文献としてあらゆる目的のために組み込まれている。高密度アレイを使用して
いるいくつかの態様では、高密度オリゴヌクレオチドアレイが、あらゆる目的の
ために参考文献として本出願に組み込まれている米国特許第５，４４５，９３４
号に開示されている超大規模固定ポリマー合成(Very Large Scale Immobilized
Polymer Synthesis)（ＶＬＳＩＰＳ）などの諸方法を使用して、合成されている
。各オリゴヌクレオチドは、基板上の既知の位置を占める。核酸標的サンプルは
オリゴヌクレオチドの高密度アレイによりハイブリダイズされ、その後、各プロ
ーブにハイブリダイズされたアレイ中の標的核酸の量が定量化される。

【００４８】合成オリゴヌクレオチドアレイは本発明には特に好適である。オリゴヌクレオ
チドアレイは、産生効率、アレイ内およびアレイ間変動性の減少、情報量の増加
、および高信号対雑音比など、他の諸方法よりも数々の利点を有している。

【００４９】好適な高密度アレイは、約１００よりも多い、好適には約１０００よりも多い
、さらに好適には約１６，０００よりも多い、またもっとも好適には６５，００
０または２５０，０００よりも多い、約１，０００，０００の異なるオリゴヌク
レオチドプローブよりも多い場合もある、異なるオリゴヌクレオチドを、好適に
は表面面積が１ｃｍ²未満に含有する。オリゴヌクレオチドプローブは約５〜約
５０個あるいは約５００個のヌクレオチドの長さの範囲にあり、さらに好適には
約１０〜約４０個のヌクレオチドの長さの範囲にあり、またもっとも好適には約
１５〜約４０個のヌクレオチドの長さの範囲にある。

【００５０】最少限度の合成工程数のオリゴヌクレオチド、ペプチドおよびその他の重合体
配列の高密度アレイを形成する諸方法が知られている。オリゴヌクレオチド類似
体アレイは光指向性化学的結合および機械的指向性結合には限定されないが、そ
れらを含むさまざまな方法により固体基板上で合成することができる。これにつ
いては、例えば、光指向性合成技術を使用したペプチド、オリゴヌクレオチドお
よびその他の分子の巨大なアレイを形成する諸方法を開示している、Ｐｉｒｒｕ
ｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１５０７
０号も参照のこと）およびＦｏｄｏｒら、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／１００
９２号およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／０９６６８号ならびに米国特許出願
第０７／９８０，５２３号を参照のこと。また、Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
，２５１，７６７−７７（１９９１）も参照のこと。重合体アレイの合成に関す
るこうした諸手法は現在ではＶＬＳＩＰＳ（商標）法と言われている。ＶＬＳＩ
ＰＳ（商標）アプローチを使用して、重合体のある１つの不均一なアレイが、い
くつかの反応部位での同時結合により異なる不均一なアレイに変換される。米国
特許出願第０７／７９６，２４３号および第０７／９８０，５２３号を参照のこ
と。

【００５１】上記の米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ９
０／１５０７０号および第ＷＯ９２／１００９２号に記載されているように、
ＶＬＳＩＰＳ（商標）技術の開発はコンビナトリアル合成およびコンビナトリア
ルライブラリーのスクリーニングの分野では先進的な技術であると考えられてい
る。さらに最近では、１９９３年６月２５日に出願された特許出願第０８／０８
２，９３７号には、標的核酸の一部あるいは完全な配列を検査するあるいは決定
する、また特定のオリゴヌクレオチド配列を含む核酸の存在を検出するのに使用
することができるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを作製するための諸方法
が記載されている。

【００５２】手短に言うと、ガラス表面上のオリゴヌクレオチドアレイの光指向性コンビナ
トリアル合成は、自動化されたホスホルアミダイト化学およびチップマスキング
技術を使用して進められる。１つの特定の実施例(implementation)では、ガラス
表面が官能基、例えば、光不安定性(photolabile) 保護基により阻止される水酸
基あるいはアミン基を含むシラン試薬により誘導される。入ってくる５’−光保
護ヌクレオシドホスホルアミダイトと反応するようにその後に準備される官能基
を露光するためにフォトリソグラフィマスクにより光分解が選択的に使用される
。ホスホルアミダイトは、受照している部位のみと反応する（また、したがって
、光不安定性阻止基の除去により露光が行われる）。したがって、ホスホルアミ
ダイトは、その前の工程から選択的に露光していた領域にのみ加えられる。こう
した工程は固体表面上に所望される配列のアレイが合成されるまで繰り返される
。アレイ上の異なる位置にある、異なるオリゴヌクレオチド類似体のコンビナト
リアル合成は、合成時の照明のパターンおよび結合試薬の添加の順序により決定
される。

【００５３】ポリアミド主鎖を備えたオリゴヌクレオチド類似体がＶＬＳＩＰＳ（商標）法
の中で使用される場合は、そのモノマーがリン酸結合を介して互いに付着しない
ため、その合成工程を実施するために、ホスホルアミダイト化学を使用すること
は一般的には不適当である。その代わりに、ペプチド合成諸方法が代用される。
これについては、例えば、Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号
を参照のこと。

【００５４】ポリアミド主鎖と天然ヌクレオシド中に見つかった塩基を含有するペプチド核
酸は市販されており、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社（マサチューセッツ州ベッ
ドフォード市）から入手可能である。ペプチド核酸は高度な特異性をもって核酸
に結合することが可能なものであり、また、本開示の目的に関しては「オリゴヌ
クレオチド類似体」が考えられる。

【００５５】単一基板上にオリゴヌクレオチドの１つのアレイを生成するのに使用すること
ができるさらなる諸方法は、１９９２年１１月２０日に出願された米国特許同時
係属出願第０７／９８０，５２３号および１９９１年１１月２２日に出願された
第０７／７９６，２４３号と、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／０９６６８号に記
載されている。こうした出願に開示されている諸方法には、試薬が以下のいずれ
かの方法により基板に送達される。すなわち、（１）事前に規定された領域上に
規定されている溝内に注ぐ、あるいは（２）事前に規定された領域上に「スポッ
ティングする」、あるいは（３）フォトレジストを使用することにより送達され
る。しかし、スポッティングと注ぎ入れることの組み合わせだけではなく、他の
アプローチも用いることができる。各場合において、モノマー溶液がさまざまな
反応部位に送達されると基板のある活性化領域がその他の領域から機械的に分離
される。

【００５６】本発明の化合物およびライブラリーに適用される典型的な「注ぎ込み溝」法は
、一般的には以下のように説明することができる。多様な重合体配列が、それを
通って適当な試薬が注ぎ込まれ、あるいは適当な試薬が戴置される注ぎ込み溝を
基板表面上に形成することにより基板あるいは固相支持体の選択された領域で合
成される。例えば、モノマー「Ａ」が選択領域の第１群中の基板に結合されるも
のと仮定する。必要であれば、選択領域の全部あるいは一部にあるその基板の表
面の全部あるいは一部を、例えば、すべてあるいはいくつかの溝を通じて適当な
試薬を注ぎ込むことにより、あるいは適当な試薬で基板全体を洗浄することによ
り、結合のために活性化される。その基板の表面上に溝ブロックを戴置した後、
モノマーＡを有する試薬がすべてあるいはいくつかの溝を通して注がれ、あるい
はその中に戴置される。その溝により流体は第１選択領域に接触することがもた
らされ、それによって、第１選択領域に直接あるいは間接的に（スペーサを介し
て）基板上でモノマーＡと結合する。

【００５７】その後、モノマー「Ｂ」が第２選択領域に結合され、そのうちのいくつかは第
１選択領域中に含まれ得る。第２選択領域は、基板表面上の溝ブロックの並進、
回転あるいは置換により、また、選択したバルブを開閉することにより、あるい
は化学的またはフォトレジスト層を堆積させることにより、第２注ぎ込み溝（複
数）と流体接触することになる。必要である場合は、少なくとも第２領域を活性
化させるための工程が実施される。その後、モノマーＢが第２注ぎ込み溝（複数
）を通して注ぎ込まれ、あるいはその中に戴置され、モノマーＢを第２選択位置
で結合させる。この特定の実施例では、処理のこの段階で基板に結合されて結果
的に生じた配列は、例えば、Ａ、ＢおよびＡＢとなる。このプロセスは基板上の
既知の位置に所望の長さの配列の巨大なアレイを形成するよう繰り返される。

【００５８】基板が活性化された後、モノマーＡは溝のいくつかを通って注ぎ込まれ、モノ
マーＢは他の溝を通って注ぎ込まれ、モノマーＣはさらに別の溝を通って注ぎ込
まれる、などが可能である。このように、反応領域の多くあるいは全部がモノマ
ーと反応し、その後、溝ブロックを取り除かなければならず、あるいはその基板
は洗浄および／または再活性化させなければならない。利用可能な反応領域の多
くあるいは全部を同時に利用することにより、洗浄および活性化工程の数は最少
限度のものにすることができる。

【００５９】当業者であれば、溝を形成するか、あるいはそうでなければその基板の表面の
一部分を保護する代替的な諸方法があることは認識することであろう。例えば、
いくつかの態様によれば、親水性あるいは疎水性被膜（その溶媒の性質による）
などの保護被膜が、保護されるべき基板の部分上に使用され、場合によっては、
他の領域中の反応体溶液により湿潤化されることを促進する材料と組み合わせて
使用される。このように、注ぎ込まれる溶液はさらに、その指定されている注ぎ
込み経路の外側を通過しないように予防されている。

【００６０】高密度核酸アレイは、事前に合成されたあるいは所定の位置にある天然核酸を
析出することにより作製することができる。合成あるいは天然核酸は、光指向性
標的化およびオリゴヌクレオチド指向性標的化により基板の特定位置上に析出さ
れる。核酸はまた、注ぎ込み溝法と多くの点で同じやり方で特定位置に方向付け
られることもできる。例えば、核酸Ａは、適切に活性化された反応領域の第１群
に送達されて結合させることができる。その後、核酸Ｂは活性化反応領域の第２
群に送達され、また結合させることができる。核酸は選択領域で析出する。もう
１つの態様では、特定箇所で核酸を析出させるために、領域から領域へと移動す
るディスペンサーが使用される。典型的なディスペンサーには、基板に核酸を送
達するためのマイクロピペットあるいは毛管ピン、および基板に対するマイクロ
ピペットの位置をコントロールするためのロボットシステムが含まれる。他の態
様では、ディスペンサーには、さまざまな試薬を反応領域に同時に送達すること
ができるように、一連の管、マニホルド、ピペットあるいは毛管ピンの列などが
含まれる。

【００６１】ハイブリダイゼーション条件「緊縮（stringent）条件」という用語は、その条件下でプローブがその標的
部分配列にハイブリダイズされるが、他の配列への、あるいはその差異が同定さ
れるであろうような他の配列への実質的ではないハイブリダイゼーションのみと
関わる条件を意味する。緊縮条件は、配列依存性のものであり、また異なる環境
では異なるものとなる。配列が長ければ長いだけ、それだけ高い温度で特異的に
ハイブリダイズされる。一般的には、緊縮条件は、規定のイオン強度とｐＨにお
いて特定配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。

【００６２】Ｔｍは、規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下、標的配列に相補的な
プローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズされる温度である。標
的配列が一般的には過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状
態では占有される。典型的には、緊縮条件は、ｐＨ７．０〜８．３でＮａある
いはその他の塩の濃度が少なくとも約０．０１〜１．０Ｍ、また温度は短いプ
ローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃である条件で
ある。緊縮条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化薬剤の添加によっても達成
することができる。

【００６３】「特異的にハイブリダイズする」という用語は、その配列がＤＮＡあるいはＲ
ＮＡの複合体混合物（例えば、全細胞内）の中に存在するとき、緊縮条件下で特
定のヌクレオチド配列あるいは配列群に、分子が実質的に、あるいはそれのみに
結合、二本鎖化、あるいはハイブリダイズされることを意味する。一般的に、核
酸は、温度を上昇させることにより、あるいはその核酸を含有する緩衝液の塩濃
度を減少させることにより変性することが分かっている。低緊縮条件（例えば、
低温度および／または高塩濃度）下では、ハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ
：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡあるいはＲＮＡ：ＤＮＡ）が、徐冷再対合された配列
が完全に相補的ではない場合であっても、形成されることになる。したがって、
ハイブリダイゼーションの特異性は、低緊縮下では減少される。反対に、高緊縮
下では（例えば、高温度あるいは低塩濃度）ハイブリダイゼーションを成功裡に
行うにはミスマッチがなるべく少ないことが要求される。

【００６４】当業者であれば、ハイブリダイゼーション条件は任意の緊縮性の度合いをもた
らすように選択することができることは理解することであろう。１つの好適な態
様では、ハイブリダイゼーションは低緊縮下で、この場合、６ＸＳＳＰＥ−Ｔ
で３７℃にて（０．００５％トリトンＸ−１００）で実施され、ハイブリダイ
ゼーションが確実なものにされ、またその後、引き続いてミスマッチハイブリッ
ド二本鎖を取り除くために洗浄が高緊縮下で（例えば、１ＸＳＳＰＥ−Ｔで
３７℃にて）実施される。ハイブリダイゼーション特異性の所望されるレベルが
得られるまで、連続洗浄を段々と高い緊縮性（例えば、０．２５ＸＳＳＰＥ
−Ｔで３７℃〜５０℃という低条件まで下げて）で実施することができる。緊縮
性はまた、ホルムアミドなどの薬剤の添加により上昇させることができる。ハイ
ブリダイゼーション特異性は、存在しうるさまざまなコントロール（例えば、発
現レベルコントロール、標準化コントロール、ミスマッチコントロール、その他
）へのハイブリダイゼーションとのテストプローブへのハイブリダイゼーション
の比較により評価することができる。

【００６５】一般的には、ハイブリダイゼーション特異性（緊縮性）とシグナル強度の間で
の取り決め(tradeoff)がある。このように、１つの好適な態様では、一様な結果
を生じ、またバックグラウンド強度のおよそ１０％より大きなシグナル強度を提
供するもっとも高い緊縮下において洗浄が実施される。このように、１つの好適
な態様では、ハイブリダイズされたアレイは、連続的に高い緊縮性溶液で洗浄す
ることができ、また、各洗浄間で読み出すことができる。このように作成された
データセットの分析は、ハイブリダイゼーションパターンが分かるようには改変
されない、また関心の対象となっている特定のオリゴヌクレオチドプローブに関
する十分なシグナルを提供する洗浄緊縮性を明らかにする。

【００６６】ＲＮＡあるいはＤＮＡの間で形成される二本鎖の安定性は一般的には、溶液中
で、ＲＮＡ：ＲＮＡ＞ＲＮＡ：ＤＮＡ＞ＤＮＡ：ＤＮＡの順序である。標的との
より良好な二本鎖安定性を長いプローブは有するが、しかし、より短いプローブ
よりも不十分なミスマッチ識別を有する（ミスマッチ識別とは、完全対合プロー
ブと単一塩基ミスマッチプローブとの間で測定されたハイブリダイゼーションシ
グナル比のことを言う）。短いプローブ（例えば、８量体）はミスマッチを非常
に良好に識別するが、総体的な二本鎖安定性は低い。

【００６７】例えば、公知のオリゴヌクレオチド類似体を用い、標識とプローブとの間に形
成された二本鎖の熱安定性（Ｔｍ）を改変することにより、二本鎖安定性とミス
マッチ識別の最適化が可能になる。Ｔｍを改変するという１つの有用な態様につ
いて言うと、これは、Ａ−Ｔ二本鎖が塩基対あたり２つの水素結合を有し、一方
、Ｇ−Ｃ二本鎖が塩基対あたり３つの水素結合を有するという事実に部分的には
拠って、アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）二本鎖が、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）
二本鎖よりも低いＴｍを有するという事実に起因している。塩基の非均一な分布
がある不均一なオリゴヌクレオチドアレイにおいては、各オリゴヌクレオチドプ
ローブに対して同時にハイブリダイゼーションを最適化することは一般的には可
能なことではない。したがって、いくつかの態様では、Ｇ−Ｃ二本鎖を選択的に
不安定にして、および／またはＡ−Ｔ二本鎖の安定性を増大させることが望まし
い。これは、例えば、Ｇ−Ｃ二本鎖を形成するアレイのプローブのグアニン残基
をヒポキサンチンで置換することにより、あるいはＡ−Ｔ二本鎖を形成している
プローブのアデニン残基を２，６ジアミノプリンで置換することにより、あるい
は、ＮａＣｌの代わりに、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣｌ）を使用
することにより、達成することができる。

【００６８】オリゴヌクレオチド類似体プローブを使用することにより付与される改変され
た二本鎖安定性は、以下の、例えば、時間をかけた標的オリゴヌクレオチドによ
りハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド類似体アレイの蛍光シグナル強度に
より確かめることができる。そのデータにより、例えば、室温での特異的ハイブ
リダイゼーション条件の最適化が可能になる。

【００６９】改変された二本鎖安定性を確認する別の方法は、ハイブリダイズすると生じる
シグナル強度を経時的に追跡することによるものである。ＤＮＡ標的とＤＮＡチ
ップを使用した以前の実験では、時間経過とともにシグナル強度が増加し、また
、より安定している二本鎖が、より安定していない二本鎖よりも早くより高いシ
グナル強度を生成することが示されている。結合部位のすべてが占有されてくる
ために、一定時間後は、シグナルは安定水準状態あるいは「飽和」に達する。こ
れらのデータにより、特定の温度でのハイブリダイゼーションの最適化と最良条
件の決定が可能になる。

【００７０】ハイブリダイゼーション条件の最適化に関する諸方法は、当業者には周知のも
のである（例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編『生化学と分子生物学における実験
室技術』、第２４巻、核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２４；Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ）、１９９
３年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社刊、Ｎ．Ｙ．参照のこと）。

【００７１】シグナル検出ハイブリダイズされた核酸は、標的核酸に付着させた１つあるいはそれ以上の
標識を検出することにより検出することができる。その標識は、当業者には周知
の数々の手段のいずれかにより組み込むことができる。しかし、１つの好適な態
様では、その標識は標的核酸の調製に際しての増幅工程に先立ってそのプライマ
ーを標識化することにより組み込まれる。したがって、例えば、標識化プライマ
ーを用いるポリメラーゼ連鎖反応は、標識化増幅産物をもたらすことになる。

【００７２】本発明での使用に適する検出可能な標識には、分光的、光化学的、生化学的、
免疫化学的、電気的、光学的、あるいは化学的手段により検出可能な任意の組成
物が含まれる。本発明において有用な標識には、標識化ストレプトアビジン接合
体による染色のためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商
標））、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グ
リーン蛍光タンパク質など）、放射能標識（例えば、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ
または³²Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼおよびＥＬＩＳＡで通常使用されているその他のもの）ならびに金コロイ
ドあるいは色付きのガラスあるいはプラスチックのビース（例えば、ポリスチレ
ン、ポリプロピレン、ラテックス、その他）などの比色標識が含まれる。こうし
た標識の使用法を教示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、第
３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第
４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号
が含まれる。

【００７３】こうした標識を検出する手段は、当業者には周知のものである。したがって、
例えば、放射能標識は、写真フィルムあるいはシンチレーションカウンターを使
用して検出することができ、蛍光マーカーは放射光を検出するために光検出器を
使用して検出することができる。酵素標識は典型的には、基板を用いて酵素を提
供することにより検出され、その基板上の酵素の作用により産生される反応産物
を検出し、比色標識は、その着色標識を単に視覚化することにより検出される。
１つの方法では、散乱光を測定することにより検出することができる金コロイド
標識が使用されている。

【００７４】アレイのプローブにハイブリダイズされた標識化標的核酸を検出する手段は当
業者には公知のものである。したがって、例えば、比色標識が使用されている場
合、標識の簡単な視覚化で十分である。放射能標識化プローブが使用されている
場合は、放射線を検出すること（例えば、写真フィルムあるいは固体物理学的検
出器による）で十分である。

【００７５】蛍光標識（すなわち、「色タグ」）により標識化されている標的核酸の検出は
蛍光顕微鏡により達成することができる。ハイブリダイズアレイは、光源を用い
て特定の蛍光標識の励起波長で励起させることができ、その結果生じる発光波長
において蛍光が検出される。励起光源は蛍光標識の励起に適当なレーザーであり
うる。

【００７６】共焦点顕微鏡は、すべてのプローブを調べるまで、高密度アレイ全体を自動的
にスキャンする、すなわち、逐次的に個々のプローブを調べる、あるいは系統的
なやり方でプローブの隣接する群を調べるというコンピュータにより制御される
段階を備えた自動化が可能である。同様に、その顕微鏡は、アレイ上の各オリゴ
ヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションされることにより産生された蛍
光シグナルを自動的に記録するために、自動化データ取得システムに取り付けた
光変換器（例えば、光電子増倍管、固体物理学的アレイ、ＣＣＤカメラ、その他
）を装備することができる。こうした自動化システムは、米国特許第５，１４３
，８５４号、ＰＣＴ出願第２０９２／１００９２号および１９９４年２月１０
日に出願された米国特許同時係属出願第０８／１９５，８８９号に詳細に説明さ
れている。シグナル検出のための自動化共焦点顕微鏡と共にレーザー照射を使用
することにより、約１００μｍよりも良好な解像度、さらに好適には約５０μｍ
よりも良好な解像度、そして最も好適には約２５μｍよりも良好な解像度での検
出が可能となる。

【００７７】２つの異なる蛍光標識が、調べられた各マーカーで２つの対立遺伝子を識別す
るために使用することができる。こうした場合では、そのアレイは２度スキャン
することができる。第１回目のスキャン時に、励起波長と発光波長が、その２つ
の蛍光標識のうち１つを検出するのに必要な形態に設定される。第２のスキャン
に関しては、励起波長および発光波長は、第２の蛍光標識を検出するのに必要な
形態に設定される。両方のスキャンから得られた結果が比較され、その遺伝子型
同定あるいは対立遺伝子の頻度が測定されうる。

【００７８】遺伝子型の定量化と決定核酸配列またはサブ配列のハイブリダイゼーションを定量化するという文脈の
中で使用される場合には、「定量化」という用語は絶対的あるいは相対的定量化
を意味することができる。絶対的定量化は、１つあるいはそれ以上の標的核酸（
例えば、ＢｉｏＢ．などのコントロール核酸あるいは標的核酸自体の公知の量
）の公知の１つまたは複数の濃度を包含することにより、また公知の標的核酸を
用いて未知のハイブリダイゼーション強度を参照することにより（例えば、標準
曲線の作成により）、達成することができる。代替的には、相対的定量化は、２
つあるいはそれ以上の遺伝子間、あるいはハイブリダイゼーション強度における
変化、そして、当然の帰結として、対立遺伝子の頻度を定量化するために２つあ
るいはそれ以上の処理の間でのハイブリダイゼーションシグナルの比較により、
達成することができる。相対的な定量化もまた、標的核酸中に対立遺伝子が存在
するかあるいは存在しないのかを単に検出するために使用することができる。１
つの実施態様では、例えば、マーカーの２つの対立遺伝子が存在するあるいは存
在しないことが、そのアレイ中の公知の位置にある、すなわち、その２つの対立
遺伝子に関する対立遺伝子特異的プローブに対応する固形支持体上にある、第１
と第２色標識の定量を比較することにより決定することができる。

【００７９】好適な定量化方法は、共焦点顕微鏡と蛍光標識を使用することである。Ｇｅｎ
ｅＣｈｉｐ（登録商標）システム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、カリフォルニア州
サンタクララ市）は特にハイブリダイゼーションを定量化するのに好適である。
しかし、いずれかの同様のシステム、あるいはその他の効果の面で等価である検
出方法もまた使用することができることは、当業者には明らかなことであろう。

【００８０】ハイブリダイゼーションの結果を評価するための諸方法は、使用される特定の
プローブの性質ならびにコントロールにより変化する。各プローブに関する蛍光
強度の簡単な定量化が測定されうる。これは、高密度アレイ（例えば、ここでは
標識が蛍光標識であり、そのアレイ上の各位置での固定励起照射により産生され
た蛍光強度の検出）上での各位置（異なるプローブを代表する）におけるシグナ
ル強度を測定することにより簡単に達成することができる。

【００８１】しかし、当業者であれば、ハイブリダイゼーションシグナルは、強度において
は、ハイブリダイゼーションの効率、サンプル核酸上の標識量およびサンプル中
の特定核酸の量により変化することは理解されることであろう。典型的には、非
常に低レベル（例えば、＜１ｐＭ）に存在する核酸は、非常に弱いシグナルを示
すことになる。濃度の低いレベルでは、そのシグナルは実質的にはバックグラウ
ンドから識別不可能になる。そのハイブリダイゼーションデータを評価する際に
、閾値強度値は、１つのシグナルが、バックグラウンドから本質的には識別不可
能であるものとしてカウントされるレベル以下で選択することができる。

【００８２】「バックグラウンド」あるいは「バッグラウンドシグナル強度」という用語は
、非特異的結合、あるいは標識化標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイの構成成
分（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、コントロールプローブ、アレイ基板
、その他）との間のその他の相互作用から結果的に生じるハイブリダイゼーショ
ンシグナルを言う。バックグラウンドシグナルはまた、そのアレイ構成成分自体
に固有の蛍光により産生される可能性もある。単一バックグラウンドシグナルは
、アレイ全体に関して算出することができ、あるいは異なるバックグラウンドシ
グナルは各標的核酸に関して算出することができる。１つの好適な実施態様では
、バックグラウンドは、そのアレイ中のプローブのもっとも低い５％〜１０％に
ついては平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として算出され、あるいは異
なるバックグラウンドシグナルが各標的対立遺伝子に関して算出される場合は、
各対立遺伝子に関してプローブのもっとも低い５％〜１０％について算出される
。しかし、特定の対立遺伝子に対するプローブが良好にハイブリダイズされる場
合、そしてそのように標的配列に特異的に結合するようにみえる場合は、それら
は、バックグラウンドシグナル算出において使用すべきではない。代替的には、
バックグラウンドは、サンプル中に見出されるいずれかの配列に相補的ではない
プローブへのハイブリダイゼーションにより産生される平均ハイブリダイゼーシ
ョンシグナル強度として算出されるのが良い（例えば、反対のセンスの核酸に対
して方向付けられたプローブあるいは、サンプルが哺乳動物核酸である場合の細
菌遺伝子などのサンプル中に見出せない遺伝子に対して方向付けられたプローブ
）。バックグラウンドはまた、いずれのプローブもまったく欠いているアレイの
領域により産生された平均シグナル強度として算出することもできる。１つの好
適な実施態様では、バックグラウンドシグナルは、非特異的結合を減少させるハ
イブリダイゼーション時に界面活性剤（例えば、Ｃ−ＴＡＢ）あるいは阻害試薬
（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１ＤＮＡ、その他）の使用により減少させる
。１つの特に好適な実施態様では、ハイブリダイゼーションは約０．５ｍｇ／
ｍｌＤＮＡ（例えば、ニシンの精子ＤＮＡ）の存在下で実施される。ハイブリ
ダイゼーションにおける阻害薬剤の使用は、当業者であれば、周知のことである
（例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、同上掲載書中の第８章を参照のこと）。

【００８３】高密度アレイには、ミスマッチコントロールを含めることができる。１つの好
適な実施態様には、標準化コントロール以外にそのアレイ中のすべてのプローブ
についての中心ミスマッチを有するミスマッチコントロールがみられる。緊縮条
件で洗浄した後、ミスマッチではなくて、完全対合が予測されてプローブにハイ
ブリダイズされた場合には、そのミスマッチコントロールから得られるシグナル
は、非特異的結合のみ、あるいはそのミスマッチにハイブリダイズされる核酸の
サンプル中に存在するもののみを反映すべきものである。関心の対象となってい
るプローブとそれに対応するミスマッチコントロールの両方が高いシグナルを示
す場合には、あるいはそのミスマッチがその対応するテストプローブよりも高い
シグナルを示す場合には、ハイブリダイゼーションに関して問題があり、そうし
たプローブから得られるシグナルは無視される。任意のマーカーに関しては、第
一対立遺伝子に対する対立遺伝子特異的プローブ（完全対合プローブ）と第２対
立遺伝子に対するそれに対応するプローブ（あるいはその他のミスマッチコント
ロールプローブ）の間のハイブリダイゼーションシグナル強度における差異（Ｉ_allele1 −Ｉ_allele2）は、第１対立遺伝子の存在を判定するもの、あるいは濃
度の測定値である。したがって、１つの好適な実施態様では、ミスマッチプロー
ブのシグナルは、テストプローブの特異的結合によるシグナルの測定値を提供す
るその対応するテストプローブに関するシグナルから減算される。

【００８４】特定配列の濃度はその後、その遺伝子に特異的に結合するプローブのそれぞれ
のシグナル強度を測定することにより、また標準化コントロールに標準化するこ
とにより、測定することができる。そのプローブから得られるシグナルがそのミ
スマッチよりも大きい場合は、そのミスマッチが減算される。そのミスマッチ強
度がそれに対応するテストプローブと等しいかあるいは大きい場合には、そのシ
グナルは無視される（すなわち、そのシグナルは評価することはできない）。

【００８５】分析されたそれぞれのマーカーに関しては、その遺伝子型はその２つの標識、
例えば、用いられる色タグのそれぞれに関して得られるハイブリダイゼーション
パターンを比較することにより明確に判定することができる（図８）。ハイブリ
ダイゼーションが、その他の色タグ（例えば、「Ｇ」）についてのものではなく
、それに対応する対立遺伝子特異的プローブに対する１つの色タグ（例えば、「
Ａ」）について提示されている場合（図８の左にあるパターン）、その場合には
、二倍体生物体のその提示された遺伝子型は、ホモ接合Ａ／Ａである。ハイブリ
ダイゼーションがそれに対応する対立遺伝子特異的プローブ（例えば、「Ｇ」）
に対するその他の色タグについてのみ提示される場合（図８の中央にあるパター
ン）、その場合は、二倍体生物体のその提示された遺伝子型はホモ接合Ｇ／Ｇで
ある。ハイブリダイゼーションがそれらに対応する対立遺伝子特異的プローブに
対する両方の色タグについて提示される場合（図８の右側にあるパターン）、そ
の場合には、二倍体生物体のその提示された遺伝子型がヘテロ接合（Ａ／Ｇ）で
ある。

【００８６】中間陽性結果により提示されるハイブリダイゼーションの限界検出（例えば、
アレイ全体に関して得られたすべての陽性ハイブリダイゼーション結果平均の１
％未満、あるいは１〜５％、あるいは１〜１０％、あるいは２〜１０％、あるい
は５〜１０％、あるいは１〜２０％、あるいは２〜２０％、あるいは５〜２０％
、あるいは１０〜２０％）により、図８に提示されるような総体的なハイブリダ
イゼーションパターンによる交差ハイブリダイゼーションあるいは交差増幅のい
ずれかが提示される場合がある。しかし、こうしたものは、観察されたユニーク
パターンにより識別することができる。データ分析に関するさらなる手順は、す
べての目的のために前に組み込まれている米国特許出願第０８／７７２，３７６
号に開示されている。

【００８７】ＨｕＳＮＰおよびその他のマーカー特異的アレイが設計され、遺伝子研究にお
いて使用されてきた^9-10。しかし、この研究において開発されたその方法は、数
多くの異なる遺伝子適用を扱うに際していくつかの利点を提供する。すなわち、
（１）特異的なカスタマイズされた遺伝子型アレイはまったく必要とされないの
で、単一遺伝子設計に基づくアレイは遺伝子マーカーの異なるセットを遺伝子型
分類するのに使用することができる、（２）タグアレイ上で合成された事前に選
択されたプローブ配列は、良好なハイブリダイゼーションの結果を確実なものに
する手助けとなる、（３）テストサンプル中の対立遺伝子頻度の正確な定量的測
定を達成することができる。このように、信頼できる遺伝子型の結果は、個人サ
ンプルについてだけ得ることができるばかりでなく、プールされたサンプルにつ
いてもまた得ることができる。ＳＢＥ以外にも、その他のアッセイを、タグアレ
イアッセイ、例えば、オリゴヌクレオチド結合アッセイ（ＯＬＡ）^19-20、オリ
ゴヌクレオチドプローブの侵入切断アッセイ²²、対立遺伝子特異的ＰＣＲ^23-24 と結合することができる。

【００８８】われわれの現在の標識チップには、３２，０００個以上のユニーク標識プロー
ブが含まれている。遺伝子適用のほとんどに関しては、例えば、１つの特定遺伝
子における変異を検出することであり、それにはこうした高密度チップは必要な
い。そのため、チップ上にはより数の少ないタグを備えたより小さなチップに需
要がある。代替的には、１つの特定マーカーに対応する複数のタグが、正確な遺
伝子型分類を確実なものとするアッセイに対して重複性を構築するように設計す
ることができる。あるいは、ＳＮＰの１つのセットに関する複数のタグセットを
設計することができ、したがって複数サンプルを１つのチップで処理し、また分
析することができる。われわれは現在、アッセイに関しては、２色標識化機構を
使用している。しかし、４色標識／スキャニングシステムによりそのアッセイを
保障すべきであり、それは単一試験管反応で実施することができる。

【００８９】さらに広範な遺伝子適用に関しては、例えば、ある研究では、１００個から１
０００個の遺伝子マーカーの遺伝子型を必要とし、その遺伝子座を多重化ＰＣＲ
により増幅することがいまだに最良の方策である。しかし、１０００〜１０，０
００個のマーカーの遺伝子型に対して、関心の対象となっている遺伝子座の前も
っての増幅は、非常に厄介なものであり、またコスト的にも高いものになる。全
ゲノムアプローチが模索されるべきであり、例えば、全ヒトゲノムＤＮＡを直接
的に使用すること、あるいは例えば、プライマー伸長事前増幅、ＰＥＰ²⁵、ある
いは全ｃＤＮＡなどの何らかの一般的な増幅方法を使用して増幅したゲノムＤＮ
Ａ使用することを含む方策が模索されるべきである。事実、われわれは、われわ
れのタグアレイアッセイの中でＳＢＥ鋳型として全ヒトゲノムＤＮＡを直接使用
しようと試み、われわれがテストした３８種のマーカーのうち２４種は良好なシ
グナルを付与した（データは示さず）。にもかかわらず、感度（シグナル強度）
と特異性（ミスプライミング）問題の両方を、全ゲノムアプローチが実際に有用
になる前に解決するには、膨大な量の作業があることを認めないわけにはいかな
い。

【００９０】本発明はさらに、以下の限定されない実施例により説明される。本明細書に引
用されている参考文献の内容は、全体として本明細書に参考文献として組み込ま
れている。

【００９１】実施例方法サンプルからのＤＮＡの採集と分離ＤＮＡサンプルが、進行中の家族血圧計画の一部としてＧｅｎＮｅｔにより採
集された。サンプルは同意を得て、また、ミシガン州テカムセ市およびイリノイ
州ロヨラ市の「家族計画（ＦＡＭＩＬＩＥＳ）」の両方でＩＲＢ承認を得て採集
された。その地域社会の血圧分布の一番上１５番目（テカムセ市）あるいは２
０番目（ロヨラ市）百分順位にあった発端者の同定に基づいて確認が行われた。
完全な表現型に関する情報はそれぞれの個人から得た。ＤＮＡは標準的な「塩析
」法（ＧｅｎｔｒａＳｙｓｔｅｍ）を使用してそれぞれの個人から採取された
全血の５〜１０ｍｌから抽出された。

【００９２】プライマー設計各ＳＮＰに関して、１次ＰＣＲ増幅プライマーは、前に説明されているように
設計した⁹。ＳＢＥプライマーは、その３' は多形態部位前の１つの塩基を終結
させるというやり方で設計した。プライマー３．０ソフトウエアパッケージ（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／
ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）を修飾し、また６０℃（５４℃〜６４
℃の範囲）の融解温度で２０（１８〜２６の範囲）ヌクレオチドの所定の長さの
バッチ配列によりＳＢＥプライマーを選び取るのに使用した。ＳＢＥプライマー
は常に最初にフォワード方向から選び取った（すなわち、５' から多形態部位へ
）。ＳＢＥプライマーがそのフォワード方向から選び取ることができない場合は
、リバース方向を試した。

【００９３】多重化（multiplexing）ＰＣＲ１４４個のＳＮＰを含有する特異的ゲノム領域を９個の多重化ＰＣＲ反応によ
り増幅し、それぞれ総量値２５μｌとなるヒトゲノムＤＮＡ５０ｎｇ、０．１
μＭのそれぞれのプライマー、１ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴ
Ｐ）、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂およびＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）
２単位を含む。ＴｈｅｒｍｏＣｙｃｌｅｒ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社）上で
ＰＣＲを、９６℃で１０分間のＤＮＡ鋳型の初期変性とＴａｑ酵素活性化；続い
て、９４℃で３０秒間、５７℃で４０秒間、および７２℃で１分３０秒間の４０
サイクルの変性；そして７２℃で１０分間の最終伸長で実施した。

【００９４】ＳＢＥ鋳型調製１μｌのエキソヌクレアーゼＩ（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃ
ｅ社、１０Ｕ／μｌ）、および１μｌの小エビのアルカリ性ホスファターゼ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社、１Ｕ／μｌ）を２５μｌＰＣ
Ｒ産物（上記参照）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その酵素活
性を１００℃で１５分間不活性化した。その酵素的に処理したサンプルを、残存
ＰＣＲプライマーとｄＮＴＰをさらに減らし、またｄｄＨ₂Ｏでその緩衝液を置
換するため、Ｓ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に適用した。

【００９５】多重化ＳＢＥ反応ＳＢＥを６μｌの鋳型（上記参照）、それぞれのＳＢＥプライマーの１．５
ｎＭ、Ｔｈｅｒｍｏ配列（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の２．５単位、５２ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、６．５ｍＭＭｇＣｌ₂、２５μＭフルオレセイン
−Ｎ６−ｄｄＮＴＰ（ＮＥＮ社）、７．５μＭビオチン−Ｎ６−ｄｄＵＴＰある
いはビオチン−Ｎ６−ｄＣＴＰ、あるいは３．７５μＭビオチン−Ｎ６−ｄｄＡ
ＴＰおよび１０μＭのその他の低温ｄｄＮＴＰを使用して、３３μｌ反応液中で
実施した。

【００９６】伸長反応を、１サイクルの９４℃３分、次いで４５サイクルの９４℃２０秒お
よび５８℃１１秒でＴｈｅｒｍｏＣｙｃｌｅｒ（ＭＪＲｅｓｅａｓｒｃｈ）
で行なった。

【００９７】ＳＢＥ反応後、各サンプルから９個の反応物をあわせ、３０μｌの１００μｇ
／ｍｌグリコーゲン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、１８．７５
μｌの８ＭＬｉＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、および１１２５μｌのあらかじめ冷却し
た（−２０℃）エタノール（無水）と混合し、室温で１５分間最高スピードで遠
心分離（エッペンドルフ遠心機５４１５Ｃ）することにより沈澱させた。沈澱し
たサンプルを４０℃で４０分間乾燥させ、３３μｌのｄｄＨ₂Ｏに再懸濁させた
。

【００９８】タグアレイ設計およびハイブリダイゼーション各タグ配列に関して、２つのプローブをアレイ上で合成した。１つは正確に設
計されたタグ配列（完全対合プローブあるいはＰＭプローブと称される）である
。もう１つは中心位置において単一塩基差以外は同じである（ミスマッチプロー
ブあるいはＭＭプローブと称される）。ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼ
ーション特異性に関する内的コントロールとして役に立つ。３２，０００個を超
える２０−ｍｅｒタグプローブ（およびその同伴物）を選び¹¹、８ｍｍｘ８
ｍｍの寸法のアレイ上で作成した。それぞれのプローブ（特徴を有している）は
３０ミクロンｘ３０ミクロンの面積を占有している。アレイのセットをその上で
１００アレイが作成された単一グラスウエハー上で一緒に合成した。

【００９９】標識化サンプルを、９５℃〜１００℃で１０分間変性させ、２〜５分間氷上で
急激に冷却した。そのタグアレイを、６ＸＳＳＰＥ−Ｔ（０．９ＭＮａＣｌ
、６０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、６ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、０．００５
％トリトンＸ−１００）＋０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡで数分間前もってハイブリ
ダイズし、その後１２０μｌハイブリダイゼーション溶液（以下に示す）により
、４２℃で２時間４０ＲＰＭの回転攪拌子の上でハイブリダイズした。ハイブリ
ダイゼーション溶液は、総計１２０μｌ反応液の中の３ＭＴＭＡＣＬ（塩化テ
トラメチルアンモニウム）、５０ｍＭＭＥＳ（（２−［Ｎ−モルフォリノ］エ
タンスルホン酸）ナトリウム塩）（ｐＨ６．７）、０．０１％トリトンＸ−１
００、０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５０ｐＭフルオレセイン標識化コン
トロールオリゴ０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社）、および２９．４μ
ｌ標識化ＳＢＥ産物（以下を参照）から構成される。

【０１００】チップを室温で約１０秒間１ＸＳＳＰＥ−Ｔにより２回洗浄し、その後４０
ＲＰＭの回転攪拌子上で４０℃で５〜２０分間１ＸＳＳＰＥ−Ｔにより洗浄し
た。その後、そのチップを１０回、流体ステーション（ＦＳ４００、Ａｆｆｙｍ
ｅｔｒｉｘ社）上で２２℃で６ＸＳＳＰＥ−Ｔにより洗浄した。そのチップを
、４０ＲＰＭの回転攪拌子上で１５分間、１２０μｌの染色溶液（６ＸＳＳＰ
ＥＴ中の２．２μｇ／ｍｌストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）および０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ）によ
り室温で染色した。染色後、そのプローブアレイを再び、ＦＳ４００上で２２℃
で６ＸＳＳＰＥＴにより１０回洗浄した。チップを特性毎に６０〜７０ピクセ
ルの解像度で、また２つのフィルター（それぞれ、５３０−ｎｍおよび５６０−
ｎｍ）で共焦点スキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）上でスキャンした。Ｇｅ
ｎｅＣｈｉｐソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）をその画像ファイルを、
さらなるデータ分析のためにデジタル化されたファイルに変換するのに使用する
。

【０１０１】クラスター分析任意のマーカー（任意のタグプローブ位置で）に関して、２つの色（フルオレ
セインとフィコエリトリン）のそれぞれの強度を、完全対合位置（ＰＭ）での強
度マイナスミスマッチ位置（ＭＭ）における強度として算出した。負のフルオレ
セインあるいはフィコエリトリン強度値は、ゼロとして処理する。Ｐｈａｔ値は
強度の比（フルオレセイン／フルオレセイン＋フィコエリトリン）として算出し
た。Ｐｈａｔ値を分類し、２または３のクラスターという仮定が与えられたＡＡ
、ＡＢおよびＢＢ遺伝子型の範囲の最適セットとみなし、以下の規範にかけた。
すなわち、最大でも４点（アウトライアー）が遺伝子型の範囲から除外される場
合がある。２つのグループについては、合計範囲のＰｈａｔ値は少なくとも０．
３でなければならない。３つのグループについては、合計範囲Ｐｈａｔ値は少な
くとも０．５でなければならない。範囲は少なくとも０．１の間隔で区分けされ
ていなければならない。１つの範囲の幅は最大でも０．４でなければならない。
スコアはその後、スコア＝１−（範囲幅の合計／合計範囲）−（アウトライアー^* ０．１）として算出した。

【０１０２】最良スコアの範囲セットを見つけ出し、遺伝子型を判定するのに使用した。こ
のスコアは狭い範囲で増加し、一方いずれの範囲にも入らない点の数に関しては
減少している。したがって、全Ｐｈａｔ値が比較的小さな範囲内に含まれている
場合は、それが最適となる傾向がある。

【０１０３】遺伝子型を決定するためのＡＢＩ配列決定タグアレイ定量測定から判定される遺伝子型を個別に確認するために、３つの
試料（９０４９５７００００００、９０４８９６００００００および９０４８８
９００００００）を、ゲル電気泳動に基づく方法を使用して、配列決定した。試
料は、標準的なＰＣＲサイクル条件（２．５μｌの２０ｎｇ／μｌＤＮＡ、０
．３７５μｌの２０μＭプライマー（Ｘ２）、１．５μｌの１０ＸＰＣＲ緩衝
液、０．９μｌの２５ｍＭＭｇ^2-、０．１５μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、０．
２５μｌの１０Ｕ／μｌＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ社）、試験
管毎にｄｄＨ₂Ｏにより１５μｌにまで引き上げる）を使用して、Ｔ７およびＴ
３タグ化プライマーによりすべての部位に対して増幅された。いくつかの産物を
直接配列決定し、一方、多型塩基からそのプライマー末端までが近位であったた
めＭ１３入れ子法（Ｍ13 nesting strategy）を使用した。初期増幅から得ら
れた試料をｄｄＨ₂Ｏにより１：５０に希釈し、標準的ＰＣＲ条件を使用してＭ
１３Ｆ−Ｔ７（ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ
ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ；配列番号：９）とＭ１３Ｒ−Ｔ３（ＡＡＣＡＧＣＴ
ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ；配列番
号：１０）プライマーにより増幅した。全ＰＣＲ産物を、１０μｌの容量のエキ
ソヌクレアーゼＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ウエル毎に１０Ｕ／μｌを０．１５μ
ｌ）および小エビ（Shrimp）アルカリ性ホスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、
ウエル毎に１Ｕ／μｌを０．３０μｌ）で洗浄した。ＢｉｇＤｙｅｓ（Ｐｅｒ
ｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用してＡＢＩ３７７（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社
）上で、Ｍ１３Ｒプライマー（ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ；配列番号：
１１）またはＴ７プライマー（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧ
Ａ；配列番号：１２）を用いて染色ターミネーター配列決定を行い、３つすべて
の個体のそれぞれのＳＮＰに関する遺伝子型ステータスを決定した。トレースフ
ァイルをＥｄｉｔＶｉｅｗ１．０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）ソフトウ
エアにより読み出した。

【０１０４】実施例１個体からＤＮＡを単離し、１５個のあらかじめ特徴づけられている（すなわち
既知の）ＳＮＰから得たプライマーで増幅する。増幅はＨｕｄｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．
ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：１９４５−１９５４（１９９５））およびＤｉｅ
ｔｒｉｃｈら（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．Ｆ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３８０：１４９
−１５２（１９９６）；Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．Ｆ．ら，ＮａｔｕｒｅＧｅｎ
ｅｔｉｃｓ７：２２０−２４５；Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｗ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ１３１：４２３−４４７（１９９２））に記述されているように進行させる
ことができる。例えば５０μｌの反応容量で、０．５ｎｇのテンプレート核酸／
標的ポリヌクレオチドを１μＭフォワード増幅プライマー、１μＭリバース増幅
プライマー、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＡ
ＴＰ、３．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１．０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５
０ｍＭＫＣｌ、０．０２μＭ分子プローブおよび０．２５単位のポリメラー
ゼ酵素に加える。次にこの反応混合物を、Ｔｅｔｒａｄ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、マサチューセッツ州ウォータータウン）を使って、９４℃で６０秒間の変性
、次いで５３〜５６℃で１分間のアニーリング／伸長工程という条件で行われる
２工程増幅法に供することができる。この変性工程とアニーリング／伸長工程は
４０サイクル繰り返される。もう一つの選択肢として、９４℃で６０秒間、次い
で５３〜５６℃で３０秒間のアニーリング、次いで７２℃で１分間の伸長という
３工程が４０サイクル繰り返されるような３工程熱サイクル反応も使用できる。
この後に７２℃で５分間の随意の伸長工程を設けてもよい。

【０１０５】増幅が完了した後、１０個のＳＮＰに特異的な遺伝子座特異的タグ化オリゴヌ
クレオチドを加え、増幅産物をハイブリダイズすることができる。

【０１０６】次に一塩基伸長反応用の試薬類を加える。ここでは４種類のｄｄＮＴＰがそれ
ぞれ異なる蛍光団で標識される。次に、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｐｒｏｂｅｓ９：１７５−１８２（１９９５））に記述されているように
、一塩基伸長を行なう。

【０１０７】反応が完了した後、反応生成物をユニバーサルアレイと接触させるように入れ
、該反応生成物が各生成物をアレイ上の適当なオリゴヌクレオチドタグにハイブ
リダイズさせる。次にそのチップを蛍光計でアッセイし、アレイ中の各アドレス
で放射される波長を記録する。このデータから各個体のＳＮＰでの遺伝子型が決
定される。

【０１０８】実施例２テンプレートの２つの対立遺伝子を１：３０、１：１０、１：３、１：１、３
：１、１０：１および３０：１の比で混合した。これらを一塩基伸長反応によっ
て異なる色のラベルで標識し、タグアレイにハイブリダイズさせた。シグナル強
度比とテンプレート濃度比の間には９００倍ものダイナミックな範囲を超える相
関関係が観察された。図２を参照されたい。

【０１０９】実施例３タグが類似するハイブリダイゼーション特性や、他のタグ配列に対して最小限
のクロスハイブリダイゼーションを有するように一組のタグ配列を選択する。そ
れら全てのタグのオリゴヌクレオチドアレイを作製する。酵母ゲノムの機能解析
用のこのような４，０００−２０マー−タグアレイの設計およびその使用は既に
記載されている（１）。さらに最近になってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社は、１６，
０００個を超えるそのようなタグのセットを有するアレイを設計し作製した。チ
ップ上で合成されるタグ配列は２０マー、２５マーまたは他の長さでありうる。

【０１１０】実施例４マーカー特異的プライマーを使って各遺伝子マーカー（例えばＳＮＰ）を増幅
する。マルチプレックス（multiplex ）ＰＣＲストラテジーを使ってこれらのマ
ーカーを被験個体のゲノムＤＮＡから増幅する（２）。ＰＣＲ増幅後に過剰のプ
ライマーとｄＮＴＰ類を酵素的に除去する。次いで、酵素処理したこれらのＰＣ
Ｒ産物は次のＳＢＥ反応でテンプレートとして役立つ。これらのテンプレート（
ＰＣＲ産物）は、他のプロトコール（３、４）で使用されるテンプレートとは異
なり、二本鎖であることに注目されたい。例えばミニシークエンシング（Ｍｉｎ
ｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（３）や遺伝子ビット解析（ＧｅｎｅｔｉｃＢｉｔ
Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＢＡ、４）では、塩基伸長反応に先立って、二本鎖テ
ンプレートを一本鎖テンプレートに変換しなければならない。この変換に使用さ
れる方法は費用がかさみ、労力を要し、自動化が困難である。

【０１１１】実施例５下記のプロトコールでは、多型部位の１塩基前で終わるＳＢＥプライマーを各
遺伝子マーカー用に設計する。しかし他のプライマー設計スキームも使用できる
。各マーカー用のプライマーには、タグチップ上で合成される特異的プローブ配
列に相補的なユニークなタグが取り付けられる。複数のマーカーに対応するＳＢ
Ｅプライマーを一つの反応管に加え、異なる蛍光団で標識されたｄｄＮＴＰ対（
例えばＡ／Ｃバリアントの場合であればｄｄＡＴＰ−赤とＤＤＣＴＰ−緑があり
得る）の存在下で伸長させる伸長反応は、マルチプレックスなものである。

【０１１２】実施例６得られた混合物をタグアレイにハイブリダイズさせる。各タグはただ一つのマ
ーカーに対応する。色の強度の比は被験試料中の遺伝子型（または０％〜１００
％の範囲の対立遺伝子頻度）を示す。

【０１１３】実施例７ＳＢＥテンプレート調製：マーカー特異的プライマーを使って各一塩基多型（
ＳＮＰ）を増幅する。マルチプレックスＰＣＲストラテジーを使ってこれらのＳ
ＮＰを増幅する（Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：１０７７−１０８２，１９９８）。

【０１１４】マルチプレックスＰＣＲ：マルチプレックスＰＣＲ反応はＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄと２５個のプライ
マー対とを使って２５μｌの反応容量で行なう。多型部位に同じ塩基組成（すな
わちＡ／Ｇ、Ｔ／Ｃなど）を持つＳＮＰを一つにプールする。

【０１１５】ＰＣＲ試薬：１０×ＰＣＲマルチプレックス緩衝液（ＩＩ）：１００ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）５００ｍＭＫＣｌ２５ｍＭｄＮＴＰ類フォワードおよびリバースプライマー（各プライマーについて濃度は１μＭ）２０ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡ

【０１１６】マルチプレックスＰＣＲ反応（２５μｌ）プライマーミックス（各１μＭ）２．５μｌゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ／μｌ）２．５μｌ１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ２．５μｌ２５ｍＭＭｇＣｌ₂ ５μｌ２５ｍＭｄＮＴＰ類１μｌＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（５Ｕ／μｌ）０．４μｌｄｄＨ₂０２５μｌまで

【０１１７】ＰＣＲ条件９６℃ １０分４０サイクル：９４℃ ３０秒５７℃ ４０秒７２℃ １分３０秒７２℃ １０分４℃ 終夜

【０１１８】未使用のプライマーとｄＮＴＰ類をそれぞれ分解および脱リン酸化するためのＰ
ＣＲ産物の酵素処理：２５μｌのＰＣＲ産物に、１μｌのエキソヌクレアーゼＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、１０Ｕ／μｌ）と１μｌの子エビアルカリホスフ
ァターゼ（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、１Ｕ／μｌ）を加え
、３７℃で１時間インキュベートする。１００℃で１５分間で酵素活性を不活化
する。残存するＰＣＲプライマーおよびｄＮＴＰ類をさらに減少させるために、
試料をＳ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にのせ、緩衝液をｄｄＨ₂Ｏで
置き換える。この試料は次のＳＢＥ反応にそのまま使用できる。

【０１１９】単一塩基伸長（ＳＢＥ）：ＳＢＥプライマーは、多型部位の１塩基前で終結する各ＳＮＰについて設計さ
れる。それぞれのＳＮＰに関するそのプライマーには、タグチップ上の特異的プ
ローブ配列に相補的であるユニークなタグが取り付けられる。ＳＢＥ反応はまた
２５−ｐｌｅｘで多重化される。

【０１２０】反応混合物（３３μｌ）：テンプレ−ト（上記参照）６μｌＳＢＥプライマーミックス（各プライマーに対して２０ｎＭ）２．５μｌ５ＸＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液６．６μｌＢｉｏ−（ｄ）ｄＮＴＰ（Ｘｎｍｏｌ／μｌ＊、ＮＥＮ社）０．５μｌＦｌｕ−ｄｄＮＴＰ（１ｎｍｏｌ／μｌ、ＮＥＮ社）０．８μｌその他２つの低温−ｄｄＮＴＰ（１ｎｍｏｌ／μｌ、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｉａ
社）各０．３μｌＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（６．４Ｕ／μｌ）０．４μｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）ｄｄＨ₂Ｏ３３μｌまで

【０１２１】＊それがＢｉｏ−ｄｄＵＴＰもしくはｂｉｏ−ｄＣＴＰ（０．５ｍＭ）である場
合は、Ｘ＝０．５であり、またはそれがｂｉｏ−ｄｄＡＴＰ（０．２５ｍＭ）で
ある場合は、Ｘ＝０．２５である。

【０１２２】ＰＣＲプログラム：９６℃ ３分１サイクル９４℃ ２５秒５８℃ １１秒４５サイクル４℃ 永久定常

【０１２３】沈降：ＳＢＥ反応後、われわれはそれぞれの試料で９本の試験管を組み合わせ、３０
μｌの１００μｇ／ｍｌグリコーゲン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ社）を混合し、次いで、１８．７５μｌの８ＭＬｉＣｌおよび事前に冷却し
た（−２０℃）エタノール（無水）１１２５μｌにより沈降させた。よく混合し
、次いで、室温にて１５分間、一番速いスピードで遠心分離機（エッペンドルフ
遠心分離機５４１５Ｃ）にかけ、上澄みをデカントし、４０℃にて４０分間その
試料を乾燥させ、その試料を３３μｌのｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、この時点でハ
イブリダイゼーションの準備が完了する。

【０１２４】ハイブリダイゼーション：調製された試料を１００℃にて１０分間変性させ、２〜５分間氷上で素早く冷
却した。そのユニバーサルタグチップを、６ＸＳＳＰＥ−Ｔ（０．９ＭＮ
ａＣｌ，６０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、６ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、０．０
０５％トリトンＸ−１００）＋０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで前もってハイブリダ
イズし、その後、１２０μｌハイブリダイゼーション溶液（以下に示すように）
により、４２℃、２時間にて４０ＲＰＭで回転攪拌子上でハイブリダイズさせる
。

【０１２５】ハイブリダイゼーション溶液には以下のものが含まれる：５ＭＴＭＡＣＬ７２μｌ０．５ＭＭＥＳ（ｐＨ６．７）１２μｌ１％トリトンＸ−１００１．２μｌＨＳＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．２μｌＦｌｕ−ｃ２１３（５ｎＭ）１．２μｌＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）３．０μｌ＋２９．４μｌ調製試料（上記参照）。

【０１２６】ハイブリダイゼーション後の洗浄：チップを１０秒間１ＸＳＳＰＥ−Ｔにより２回リンスし、その後、１５〜２
０分間４０ＲＰＭの回転攪拌子上で４０℃にて１ＸＳＳＰＥ−Ｔにより洗浄す
る。そして、その後、１０回、６ＸＳＳＰＥＴにより流体ステーション（ＦＳ
４００、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）上で２２℃にて洗浄する。

【０１２７】染色：前記チップを４０ＲＰＭの回転攪拌子上で１５分間、１２０μｌの染色溶液（
６ＸＳＳＰＥＴ中２．２μｇ／ｍｌストレプトアビジンＲ−フィコエリトリ
ン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）、および０．５ｍｇ／ｍｌアセチル
化ＢＳＡ）により室温にて染色する。染色後、そのプローブアレイを、ＦＳ４０
０上で２２℃にて６ＸＳＳＰＥ−Ｔによりさらに１０回洗浄した。

【０１２８】スキャニング：前記チップを特性毎に６０〜７０ピクセルの解像度と、また２つのフィルター（
それぞれ、５３０−ｎｍおよび５６０−ｎｍ）を有する共焦点スキャナー（Ａｆ
ｆｙｍｅｔｒｉｘ社）上でスキャンした。ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウエア（Ａｆ
ｆｙｍｅｔｒｉｘ社）はその画像ファイルを、さらなるデータ分析のためにデジ
タル化されたファイルに変換するのに使用される。

【０１２９】実施例７高密度オリゴヌクレオチド「タグ」アレイによる遺伝子型タイピングマーカー特異的ＰＣＲ増幅と単一塩基伸長（ＳＢＥ）^1-2反応とを組み合わせ
た、３２，０００以上の事前に選択された２０マーオリゴヌクレオチドプローブ
を含む高密度「タグ」アレイの使用に基づく遺伝子型タイピング法が開発された
。われわれは、この方法を４９個の高血圧候補遺伝子³から同定された１４４個
の一塩基多型（ＳＮＰ）のコレクションを遺伝子型分類する(genotype)ために、
使用してきた。まず、マーカー特異的プライマーを、ＳＮＰを含む特定のゲノム
領域を増幅するためにマルチプレックスＰＣＲ反応において使用した。次いで、
ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物を、ＳＢＥ反応においてテンプレ−トとして使用した。そ
れぞれのＳＢＥプライマーは、３' 部分と５' 部分とから成る。３' 部分は特定
のＳＮＰ遺伝子座に対して相補的であり、また、多型部位の１塩基前で終結する
。５' 部分は「タグ」アレイ上で合成される特定のオリゴヌクレオチドプローブ
に対して相補的である、ユニークな配列から成る。単一反応試験管の中で複数の
ＳＮＰに対応するＳＢＥプライマーを用いる伸長反応は、多様なものである。そ
のプライマーは２色標識化ｄｄＮＴＰの存在下で伸長し、また、その結果得られ
る混合物はタグアレイにハイブリダイズされる。２つの色の強度比は、テストさ
れる試料の遺伝子型を演繹するのに使用された。

【０１３０】同様の融解温度と、Ｇ−Ｃ含量、そして互いの間の相同性がもっとも低い配列¹¹ を有するすべてのタグプローブが同じ長さになる、例えば、２０−ヌクレオチ
ドの長さになるというやり方で選択されたタグ配列のアレイによりタグアレイス
トラテジーを開始する。したがって、これらのタグは、同様のハイブリダイゼー
ション特性とその他のタグ配列に対する最小クロスハイブリダイゼーションを有
している可能性がある。

【０１３１】酵母サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）遺伝子¹¹の機能分析に対する４，０００タグアレイの設計および
使用と薬剤感受性研究¹²が記載されている。さらに最近では、われわれは３２，
０００以上のこうしたタグを含むアレイを設計し、作製して、それをマーカー特
異的ＰＣＲ増幅とＳＢＥ反応とに組み合わせて、遺伝子型タイピング手段として
開発した。

【０１３２】図７に示されているように、マーカー特異的プライマーを、各一塩基多型（Ｓ
ＮＰ）を増幅するために設計し、使用している。ゲノムＤＮＡ⁹からこうしたＳ
ＮＰを増幅するためにマルチプレックスＰＣＲストラテジーを使用する。一般的
には、多型部位にある同じ塩基組成を有するＳＮＰ（例えば、すべてのＡ／Ｇ
多型）は、一緒にグループ化される。ＰＣＲ増幅後、過剰なプライマーとｄＮＴ
Ｐとを、エキソヌクレアーゼＩおよび小エビアルカリ性ホスファターゼをそれぞ
れ使用して、分解し、脱リン酸化する。これらの酵素的に処理されたＰＣＲ産物
（二本鎖）はその後に、ＳＢＥ反応においてテンプレ−トとして役に立つ。多型
部位の１塩基前で終結するＳＢＥプライマーを、それぞれの遺伝子マーカーにつ
いて設計する。各プライマーには、タグアレイ上で合成される特異的プローブ配
列に相補的であるユニークなタグが取り付けられる。複数マーカー（われわれが
いままでテストしたのは５６マーカーまで）に対応するＳＢＥプライマーを単一
反応試験管に添加し、そして、異なる蛍光団により標識化されたｄｄＮＴＰ対の
存在下で伸長される伸長反応はマルチプレックスなものであり、例えば、Ａ／Ｇ
バリアントについてはビオチン標識ｄｄＡＴＰおよびフルオレセイン標識化ｄｄ
ＧＴＰが使用される。ＳＢＥ反応のその結果得られる混合物をタグアレイにハイ
ブリダイズさせる。各標識はチップ上の特定プローブ位置にハイブリダイズする
。色強度比はその遺伝子型（ホモ接合野生型あるいはホモ接合変異体あるいはヘ
テロ接合体）を表し、あるいはテストされた試料中の対立遺伝子頻度（０％〜１
００％の範囲）を表わす。

【０１３３】現行のＳＢＥ／タグアレイ定量測定法におけるテンプレ−トとして一本鎖およ
び二本鎖ＰＣＲ産物を使用した結果の比較においては、何ら有意な差は見つから
なかった（データは示さず）。しかし、ミニシークエンシング^13-15および遺伝
子ビット分析^16-18の以前に公表されたプロトコルでは、二本鎖テンプレ−トが
その塩基伸長反応に先立って一本鎖のテンプレートに変換されなければならない
。この変換のために使用される方法はコスト的に高価であり、手間がかかり、自
動化が困難であった。

【０１３４】タグアレイ定量測定法は、テストされる試料中の対立遺伝子頻度のかなり正確
な定量的測定を提供する。図２に示されるように、われわれは、２つの人工的な
ＳＢＥテンプレ−トを合成した。それらは、２１番目の位置以外は同一である：
すなわち、テンプレ−ト−ＴにおいてＴ、そしてテンプレ−ト−ＧにおいてＧが
ある。われわれはその後、その２つのテンプレ−トを１：１０、１：３、１：１
、３：１、１０：１および３０：１の割合で混合したが、これは３００倍のダイ
ナミックな範囲となるものである。同じ３' 部分（テンプレ−ト配列に相補的な
部分）を有するが異なる５' 部分（タグアレイ上の標識プローブに相補的な部分
）を有する６つのＳＢＥプライマーを設計し（図２）、異なる割合で混合され
たＳＢＥテンプレ−ト、ビオチン標識化ｄｄＡＴＰと、フルオレセイン標識化ｄ
ｄＣＴＰの存在下で伸長させた。図８に示されているように、２つの色の強度比
と、テンプレ−ト濃度比（すなわち、対立遺伝子頻度）はわれわれがテストした
３００倍のダイナミックな範囲において、かなり良好な直線的な相関関係を形成
するようである。

【０１３５】さらに、遺伝子型タイピング適用のためのタグアレイ／ＳＢＥ定量測定方法の
頑丈さと効率をテストするために、われわれは、高血圧候補遺伝子³に関する大
規模な多型スクリーニング研究からわれわれが同定したＳＮＰの一部をタイプ分
けすることに着手した。当初、われわれは５６個の高血圧候補遺伝子から１７３
個のＳＮＰを選択した。これらのＳＮＰは、そのヌクレオチド変化がアミノ酸の
変化を起こす、プロモーター領域あるいはスプライシング結合部、あるいはコー
ド領域で発生するものについて選択された。われわれは、疾患にかかりやすくし
た機能性変異体であるということに関して、これらのＳＮＰはその良好な候補で
ありうると論理的に考えている。したがって、本研究で開発した定量測定法は、
次いで、高血圧における大規模な関連研究において使用することができた。ＰＣ
Ｒプライマーを、こうした１７３個のＳＮＰについて個別に設計し、テストした
。それらのうち８個（４．６％）は増幅せず、ＳＢＥプライマーをその後に残り
の１６５個のＳＮＰについて設計した。それぞれの反応で９〜２８個のマーカー
の複雑度、そして、１６５個のマーカーに対して合計９つの反応を有する多重化
ＰＣＲ定量測定法と、多重化ＳＢＥとを開発した。そのうちの２１個（１２．７
％）が多重化ＰＣＲと多重化ＳＢＥ定量測定に失敗した。したがって、４９個の
遺伝子から得られた１４４個のマーカーがその定量測定法開発に合格したことに
なる。これらの１４４個のマーカーについての遺伝子位置、多型部位、そして設
計されたプライマーは表１に概略されている。

【０１３６】われわれは、次いで、４４個のタグアレイを使用して４４の個体を遺伝子型分
類した。良好なハイブリダイゼーションシグナルが、それら症例の９６．５％（
６１１６／６３３６（１４４ｘ４４））で得られた。ハイブリダイゼーションの
結果から得られたシグナル強度値を１４４個の各マーカーに対するクラスター分
析の際に使用した。１４４個の遺伝子座における各個体についての遺伝子型を、
いくつかマニュアル編集作業を用い、その密集している結果に基づいて自動的に
分類した。データデスク６．０（Ｄａｔａｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ社）を、（
２つの色の強度比の）密集している分析結果を手動的に表示するのに使用した。
総体的に、そのマーカーの８０〜８５％が良好なクラスター（複数のクラスター
）を形成する。

【０１３７】われわれは、４４の個体のうちの３つで、１１５遺伝子座にある遺伝子型を決
定するためにゲルに基づくＤＮＡ配列決定を実施した（方法を参照のこと）。Ａ
ＢＩ配列決定の結果とそのチップの結果とを比較すると、１１５ｘ３＝３４５個
の遺伝子型判定のうち、１４個が不一致（４％）という結果になった。１つの方
法がホモ接合体と判定した場合で、一方で、もう１つの方法がヘテロ接合体と判
定した場合には大部分の不一致が起こっていた。３つの個体すべてで、ＡＢＩ配
列決定法がＧ／Ｇと判定したが、タグアレイ／ＳＢＥ定量測定法はＡ／Ａと判定
した場合（マーカーＣＡＭ１ｅｘ６．２５４）では、われわれはこの不一致は隣
接する配列に対するＳＢＥプライマーのミスプライミングに起因すると考えてい
る。

【０１３８】われわれはまた、タグアレイ／ＳＢＥ定量測定法遺伝子型タイピング法の再現
性をテストした。われわれは、４つの個体で、多重化ＰＣＲ実験、ＳＢＥ実験お
よびチップハイブリダイゼーション実験を繰り返した。反復された実験における
（１４４のマーカーのそれぞれについての）２つの色の比はすべて正確に同じで
はないが、しかし、それらはすべて同じクラスター内に分類されている（すなわ
ち、同じ遺伝子型判定を与えている）。したがって、われわれは、複製された試
料の遺伝子型タイピング判定においては何らの不一致も見出されなかった。

【０１３９】

【表１】

【０１４０】参考文献

【０１４１】本発明はその好ましい態様に関して特に示され且つ記載されているが、添付の
特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書におい
て形態および詳細の様々な変化がなされ得ることを当業者は理解するだろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ユニバーサルアレイの図である。固相基板（例えば、ガラススライド
）が左側に示され、また異なるオリゴヌクレオチド標識（「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ
」、その他）がその固相基板に付着しているのが図示されている。各オリゴヌク
レオチドタグ（「タグＡ」、「タグＢ」、「タグＣ」）の右側末端にあるヌクレ
オチド配列は、任意の独特の配列である。すなわち、そのヌクレオチド配列は各
オリゴヌクレオチド標識に対して独特であるように設計され、また合成される。

【図２】図２は、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドを示す図である。左側末端
にあるヌクレオチド配列は、図１に示されているオリゴヌクレオチドの１つの任
意の配列に対して相補的である。その右側末端にあるヌクレオチド配列は、公知
の多型遺伝子座（例えば、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））の増幅産物に対して
相補的である。したがって、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチド「Ａ」は
、図１に示されている「標識Ａ」オリゴヌクレオチドタグの任意の配列に対して
相補的であるヌクレオチド配列を含み、またＳＮＰ「Ａ」に対して相補的である
配列を含む。

【図３】図３は、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドの増幅産物へのハイブリダ
イゼーションを示す図である。オリゴヌクレオチドの遺伝子特異的配列（右側末
端）は、遺伝子型分類されるヌクレオチドの（５’末端の）直前の１ヌクレオチ
ドで終結するように設計される（ボックスで示す）。

【図４】図４は、単一塩基伸長を介しての遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチド増
幅プライマー複合体の標識化を描いている図である。反応の間、問われているヌ
クレオチドに対して相補的である単一標識化ｄｄＮＴＰは、遺伝子座特異的タグ
化オリゴヌクレオチドの３’末端に酵素的に付け加えられる。そのヌクレオチド
はボックス内に図示されている。

【図５】図５は、その増幅産物の複合体と遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドを
アレイ上のオリゴヌクレオチドタグへとハイブリダイゼーションするところを描
いている図である。そのアレイのオリゴヌクレオチド標識が結合している固相基
板が左側に、それぞれ「Ａ」、「Ｂ」などとアドレス標識化されて示されている
。遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドがそのオリゴヌクレオチドタグにハ
イブリダイズされることが示されており、またその増幅産物は順に遺伝子座特異
的タグ化オリゴヌクレオチドに結合される。その遺伝子座特異的タグ化オリゴヌ
クレオチドは、単一塩基伸長の結果として、標識化（黒四角、●など）ヌレオチ
ドに結合される。各アドレスに単一複合体が示されているが、現実には、多くの
かかるオリゴヌクレオチドタグが各アドレスに位置しており、すなわち、アドレ
ス「Ａ」にあるその基板表面は、それに付着しているオリゴヌクレオチドタグ「
Ａ」などの多くのコピーを有している。

【図６】図６は、図５と同様、ハイブリダイゼーションを示す図であるが、アドレス「
Ｂ」にあるサンプルは、目的のヌクレオチドに対してヘテロ接合性である。

【図７】図７は、タグ化プライマーの増幅、単一塩基伸長、タグアレイに対するハイブ
リダイゼーションの組み合わせ使用を示す模式図である。

【図８】図８は、対立遺伝子の頻度の定量的測定を図示している。鋳型−Ｔ（５’−ＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＡＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧ
ＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧ−３’；配列識別番号：１）および、鋳型−Ｇ（５’−ＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧ
ＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧ−３’；配列識別番号：２）を、異なる割合で混合した（
６ｎＭ／６０ｎＭ，６ｎＭ／１８ｎＭ，６ｎＭ／６ｎＭ，１８ｎＭ／６ｎＭ，６
０ｎＭ／６ｎＭ，１８０ｎＭ／６ｎＭ）。６つのＳＢＥプライマー、（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＴＣＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡ
ＧＧＴＡＧＣＡＣＴ−３’（配列識別番号：３）；５’−ＧＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＧ
ＧＴＡＧＣＡＣＴ−３’（配列識別番号：４）；５’−ＧＡＣＴＡＣＧＡＴＧＴＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＧ
ＧＴＡＧＣＡＣＴ−３’ （配列識別番号：５）；５’−ＧＡＡＣＧＣＡＧＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＧ
ＧＴＡＧＣＡＣＴ−３’（配列識別番号：６）；５’−ＣＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＧ
ＧＴＡＧＣ−ＡＣＴ−３’（配列識別番号：７）；および５’−ＧＣＴＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＧ
ＧＴＡＧＣＡＣＴ−３’ （配列識別番号：８）が別々に、異なる比の混合鋳型
を含む６つのＳＢＥ反応に加えられた。ＳＢＥプライマーはビオチン標識化ｄｄ
ＡＴＰとフルオレセイン標識化ｄｄＣＴＰ（実施例を参照）の存在下で伸長され
、またプールされ、標識アレイにハイブリダイズされた。２つの呈色（ｙ軸）
の強度比を、混合された２つの鋳型（ｘ軸）の比に対してプロットした。

【図９】図９は、マーカーＧＭＰ−１４０．２５における４４個体のタグアレイハイブ
リダイゼーション結果のクラスター解析を図示している。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月１３日（２００１．３．１３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００７】本発明により、多型遺伝子座に存在するヌクレオチドの比（ratio ）を決定す
るために使用されるプライマーセットもまた提供される。このプライマーセット
は、１対の増幅プライマーおよび伸長プライマーを含む。プライマー対は、多型
遺伝子座を含む二本鎖核酸の領域の合成を開始する。伸長プライマーは、二本鎖
核酸の前記領域に対して相補的な３’部分と、二本鎖核酸の前記領域に対して相
補的でない５’部分とを含む。伸長プライマーは、多型遺伝子座の５’の１ヌク
レオチドで終結する。本発明によるプライマーの例を表１に示す（第１列、配列
番号１６〜１５９；第２列、配列番号１６０〜３０２；第３列、配列番号３０３
〜４４６；および第４列、配列番号４４７〜５９０）。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１３５】さらに、遺伝子型タイピング適用のためのタグアレイ／ＳＢＥ定量測定方法の
頑丈さと効率をテストするために、われわれは、高血圧候補遺伝子3 に関する大
規模な多型スクリーニング研究からわれわれが同定したＳＮＰの一部をタイプ分
けすることに着手した。当初、われわれは５６個の高血圧候補遺伝子から１７３
個のＳＮＰを選択した。これらのＳＮＰは、そのヌクレオチド変化がアミノ酸の
変化を起こす、プロモーター領域あるいはスプライシング結合部、あるいはコー
ド領域で発生するものについて選択された。われわれは、疾患にかかりやすくし
た機能性変異体であるということに関して、これらのＳＮＰはその良好な候補で
ありうると論理的に考えている。したがって、本研究で開発した定量測定法は、
次いで、高血圧における大規模な関連研究において使用することができた。ＰＣ
Ｒプライマーを、こうした１７３個のＳＮＰについて個別に設計し、テストした
。それらのうち８個（４．６％）は増幅せず、ＳＢＥプライマーをその後に残り
の１６５個のＳＮＰについて設計した。それぞれの反応で９〜２８個のマーカー
の複雑度、そして、１６５個のマーカーに対して合計９つの反応を有する多重化
ＰＣＲ定量測定法と、多重化ＳＢＥとを開発した。そのうちの２１個（１２．７
％）が多重化ＰＣＲと多重化ＳＢＥ定量測定に失敗した。したがって、４９個の
遺伝子から得られた１４４個のマーカーがその定量測定法開発に合格したことに
なる。これらの１４４個のマーカーについての遺伝子位置、多型部位、そして設
計されたプライマーは表１に概略されている（第１列、配列番号１６〜１５９；
第２列、配列番号１６０〜３０２；第３列、配列番号３０３〜４４６；および第
４列、配列番号４４７〜５９０）。

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図３】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２ＡＦ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ファン，チアン−ビンアメリカ合衆国カリフォルニア 92122 サンディエゴ，ナンバー2115，ノベルドライブ 3737 (72)発明者ヒルシュホーン，ジョエル，エヌ．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02459 ニュートン，オークモントロード 14 (72)発明者フアン，シアオフアアメリカ合衆国カリフォルニア 94043 マウンテンビュー，ジャクソンストリート 937 (72)発明者カプラン，ポールアメリカ合衆国カリフォルニア 95008 キャンベル，ビスカヤサークル 2190 (72)発明者ランダー，エリック，エス．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02139 ケンブリッジ，ビショップアランドライブ 151 (72)発明者ロッカート，デービッド，ジェイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 92014 デルマール，トレイポイントロード 510 (72)発明者ライダー，トーマスアメリカ合衆国カリフォルニア 95030 ロスガトス，スプリングストリート 100 (72)発明者スクラー，パメラアメリカ合衆国マサチューセッツ 02446 ブルックリン，フラーストリート 68 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B029 AA07 BB20 CC03 FA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QR66 QR83 QS03 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】各々が遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドにハイブリ
ダイズするのに充分な長さの独特の既知の任意のヌクレオチド配列を含有してな
る、固相基板に固定化された１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドタグを含
有してなるオリゴヌクレオチドアレイであって、遺伝子座特異的タグ化オリゴヌ
クレオチドがその第１の末端に、オリゴヌクレオチドタグの任意の配列にハイブ
リダイズする、例えば、相補的であるヌクレオチド配列を有してなる、オリゴヌ
クレオチドアレイ。
【請求項２】（ａ）各々が遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオチドにハ
イブリダイズするのに充分な長さの独特の既知の任意のヌクレオチド配列を含有
してなる、固相基板に固定化された１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドタ
グを含有してなるアレイ；および（ｂ）各々がその第１（５’）の末端に、アレイ上の対応するオリゴヌクレオ
チドタグの任意の配列にハイブリダイズする、例えば、相補的であるヌクレオチ
ド配列を有してなり、その第２（３’）の末端に試料中の標的ポリヌクレオチド
配列に相補的なヌクレオチド配列を有してなる、１つまたはそれ以上の遺伝子座
特異的タグ化オリゴヌクレオチド、を含有してなるキット。
【請求項３】（ａ）試験対象の核酸試料を得る工程；（ｂ）各々がオリゴヌクレオチドタグ中の相補的な配列にハイブリダイズしうる
ヌクレオチド配列、および試料中の目的のヌクレオチドの５’のヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列を含有してなる１つまたはそれ以上の遺伝子座特
異的タグ化オリゴヌクレオチドへの核酸試料のハイブリダイゼーションに適切な
条件下で核酸試料と１つまたはそれ以上の遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレオ
チドとを組み合わせ、それにより増幅産物−遺伝子座特異的タグ化オリゴヌクレ
オチド複合体を生成する工程；（ｃ）前記複合体を単一塩基伸長反応に供する工程、ここで該反応が、遺伝子座
特異的タグ化オリゴヌクレオチドへの標識ｄｄＮＴＰの付加を生じ、各タイプの
ｄｄＮＴＰが他の３つのタイプのｄｄＮＴＰの標識と区別されうる標識を有する
；（ｄ）適切なハイブリダイゼーション条件下で、前記複合体と、各々が遺伝子座
特異的タグ化オリゴヌクレオチド中の相補配列に相補的であり、かつハイブリダ
イズするのに充分な長さの独特の任意の配列を含有してなる１つまたはそれ以上
のオリゴヌクレオチドタグを含有するオリゴヌクレオチドアレイとを接触させ、
それにより、複合体がアレイ上の特定のオリゴヌクレオチドタグにハイブリダイ
ズし；アレイを分析して、１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドタグにハイ
ブリダイズした複合体中に存在する標識ｄｄＮＴＰを測定する工程、を含み、それにより、試料中の目的のヌクレオチドの遺伝子型を決定する、１つ
またはそれ以上の遺伝子座の核酸試料を遺伝子型タイピングする方法。
【請求項４】（ａ）プライマー対を用いて試料中の核酸の多型遺伝子座を
含む領域を増幅し、それにより増幅されたＤＮＡ産物が形成される工程；（ｂ）単一塩基伸長反応により伸長プライマーを標識し、標識伸長プライマーを
形成する工程、ここで、増幅されたＤＮＡ産物がテンプレートとして使用され、
該伸長プライマーが３’部分および５’部分を含有し、ここで３’部分が増幅Ｄ
ＮＡ産物に相補的であり、多型遺伝子座の５’の１つのヌクレオチドで終結し、
５’部分が増幅ＤＮＡ産物に相補的でなく、それにより多型遺伝子座に相補的で
ある標識ジデオキシヌクレオチドが、伸長プライマーの３’末端に結合され、こ
こで、反応物中に存在するジデオキシヌクレオチドの各々のタイプが異なる標識
を有する；および（ｃ）固相支持体に既知の位置で固定化された５’部分に相補的な１つまたはそ
れ以上のプローブに伸長プライマーの５’部分をハイブリダイズさせる工程、を含む、試料中の多型遺伝子座の対立遺伝子の比の測定を補助する方法。
【請求項５】増幅ＤＮＡ産物の２つの相補鎖が、単一塩基伸長反応物中に
存在する、請求項４記載の方法。
【請求項６】増幅ＤＮＡ産物の２つの相補鎖が標識工程においてテンプレ
ートとして使用される、請求項４記載の方法。
【請求項７】標識が蛍光標識である、請求項４記載の方法。
【請求項８】標識が放射標識である、請求項４記載の方法。
【請求項９】標識が酵素標識である、請求項４記載の方法。
【請求項１０】標識が抗原性標識である、請求項４記載の方法。
【請求項１１】標識がアフィニティー結合パートナーである、請求項４記
載の方法。
【請求項１２】（ｄ）任意に、固相支持体上の蛍光標識を検出する工程、
をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項１３】標識の工程が、異なる標識を有する少なくとも２つの異な
るジデオキシヌクレオチドを使用する、請求項４記載の方法。
【請求項１４】標識の工程が、異なる標識を有する４つの異なるジデオキ
シヌクレオチドを使用する、請求項４記載の方法。
【請求項１５】（ｄ）固相支持体上の位置の第１の標識と第２の標識との
量を比較する工程；および（ｅ）試料中の多型遺伝子座に存在するヌクレオチドの比を測定する工程、をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項１６】２つまたはそれ以上の多型遺伝子座に存在するヌクレオチ
ドの比が同時に測定される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】試料が２つまたはそれ以上の個体に由来するＤＮＡを含む
、請求項４記載の方法。
【請求項１８】２つまたはそれ以上の多型遺伝子座に存在するヌクレオチ
ドの比が同時に測定される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】固相支持体が、ビーズ、マイクロタイタープレート、およ
びオリゴヌクレオチドアレイからなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項２０】（ａ）ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、多型遺伝子座を含
有してなる二本鎖ＤＮＡの領域を増幅するプライマー対；および（ｂ）二本鎖ＤＮＡの領域の一部に相補的な３’部分および二本鎖ＤＮＡの領域
に相補的でない５’部分を含有してなる、多型遺伝子座の５’の１つのヌクレオ
チドで終結してなる伸長プライマー、を含有してなる、多型遺伝子座に存在するヌクレオチドの比の測定に使用するた
めのプライマーセット。
【請求項２１】単一の容器中に２つまたはそれ以上の請求項２０記載のプ
ライマーセットを含有してなるキット。
【請求項２２】（ａ）請求項２０記載のプライマーセット；および（ｂ）固相支持体に付着される、伸長プライマーの５’部分に相補的であるプロ
ーブを含有してなる固相支持体、を単一の容器内に含有してなるキット。
【請求項２３】固相支持体がオリゴヌクレオチドアレイである、請求項２
２記載のキット。
【請求項２４】固相支持体がビーズである、請求項２２記載のキット。
【請求項２５】固相支持体がマイクロタイタープレートである、請求項２
２記載のキット。
【請求項２６】（ａ）３’部分および５’部分を含有する伸長プライマー
を単一塩基伸長反応により標識し、ＤＮＡ分子をテンプレートとして使用して標
識伸長プライマーを形成させる工程、ここで３’部分がＤＮＡ分子に相補的であ
り、多型遺伝子座の５’の１つのヌクレオチドで終結し、５’部分がＤＮＡ分子
に相補的でなく、それにより、多型遺伝子座に相補的な標識ジデオキシヌクレオ
チドが伸長プライマーの３’末端に結合され、ここで、反応物中に存在する各タ
イプのジデオキシヌクレオチドが異なる標識を有する；ならびに（ｂ）固相支持体上の既知の部位に固定化される５’部分に相補的な１つまたは
それ以上のプローブに伸長プライマーの５’部分をハイブリダイズさせる工程、
を含む、試料中の多型遺伝子座での対立遺伝子の比の測定を補助する方法。
【請求項２７】ＤＮＡ分子の２つの相補鎖が、単一塩基伸長反応物中に存
在する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】ＤＮＡ分子の各相補鎖が伸長プライマーを標識するための
テンプレートとして使用される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】標識が蛍光標識である、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】標識が放射標識である、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】標識が酵素標識である、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】標識が抗原性標識である、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】標識がアフィニティー結合パートナーである、請求項２６
記載の方法。
【請求項３４】（ｃ）任意に、固相支持体上の蛍光標識を検出する工程、
をさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３５】（ｃ）固相支持体上の位置の第１の標識と第２の標識との
量を比較する工程；および（ｄ）試料中の多型遺伝子座に存在するヌクレオチドの比を測定する工程、をさらに含む請求項２６記載の方法。
【請求項３６】２つまたはそれ以上の多型遺伝子座に存在するヌクレオチ
ドの比が同時に測定される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】試料が２つまたはそれ以上の個体に由来するＤＮＡを含む
、請求項２６記載の方法。
【請求項３８】２つまたはそれ以上の多型遺伝子座に存在するヌクレオチ
ドの比が同時に測定される、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】標識の工程が異なる標識を有する少なくとも２つの異なる
ジデオキシヌクレオチドを使用する、請求項２６記載の方法。
【請求項４０】標識の工程が異なる標識を有する４つの異なるジデオキシ
ヌクレオチドを使用する、請求項２６記載の方法。