WO2004101785A1

WO2004101785A1 - 目的遺伝子の抽出方法およびプローブｄｎａ結合粒子

Info

Publication number: WO2004101785A1
Application number: PCT/JP2004/006108
Authority: WO
Inventors: Kejun Fan; Taira Enomoto
Original assignee: Jsr Corporation
Priority date: 2003-05-13
Filing date: 2004-04-27
Publication date: 2004-11-25

Abstract

　目的遺伝子の形状、サイズに影響されることなく、迅速、正確、かつ効率良く目的遺伝子を抽出分離することができ、従来の２週間程度のスクリニングを約２４時間で完了することができる、極めて簡便な目的遺伝子の抽出方法を提供する。　本発明の目的遺伝子の抽出方法は、プローブＤＮＡが表面に結合されたプローブＤＮＡ結合粒子と、一方に前記プローブＤＮＡと相補的な配列を有し、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと、抽出すべき目的遺伝子とを含む試料を混合し、前記プローブＤＮＡと前記一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせること、を含む。

Description

明細書目的遺伝子の抽出方法およぴプ口ープ D N A結合粒子 [技術分野]

本発明は、目的遺伝子おょぴプローブ D N Aの双方とハイブリダィズされる一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドを使用する、特定の塩基配列を有する目的遺伝子の抽出方法、ならびに前記方法に用いられるプローブ D N A結合粒子を提供する。本発明は主に、遺伝子クローニング、 c D NAライブラリーからの目的遺伝子の抽出、分離精製、検出等の用途に適している。

[背景技術]

固相粒子に結合されるプローブ D N Aと目的遺伝子のハイブリダィゼーションを利用して特定の遺伝子を分離検出する方法が以前から考案されてきた。多くの場合、目的遺伝子と相補的な配列を有するプローブ D NAを固相粒子表面に結合させ、目的遺伝子とハイブリダィゼーシヨンを行って目的遺伝子を固相化し、分離、検出する。この方法においては、特異的な配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドの末端のみを効率的に固相粒子表面に固定する必要がある。このため、プローブとなるオリゴヌクレオチドの末端にビォチンを導入し、固相粒子表面にアビジンを共有結合で固相化させ、アビジンとビォチンとの反応を利用してプローブ D NAの固相化を図る方法が用いられてきた（例えば、特開昭 6 0 - 9 3 3 5 5号公報参照）。しかしながら、この方法では、固相粒子表面に結合したプローブ D N Aと目的遺伝子とを直接ハイプリダィズさせるため、固相粒子のサイズによって捕獲効率が異なるという欠点がある。特にサイズの大き!/、遺伝子の分離精製には、固相粒子のサイズぉょぴ目的遺伝子の実効サイズに比べて、固相粒子表面に結合したプローブ D N Aのサイズが無視できなくなるほど小さくなり、抽出効率の低下が免れない。

上述した、固相粒子表面に結合したプローブ D N Aと目的遺伝子とを直接ハイブリダイズさせる方法の欠点を改良するため、ピオチン化したプローブ D NAと目的遺伝子とのハイブリダィゼーションをまず行ってハイプリッド体を作製し、次いでこのハイブリツト体を、アビジンを固相化させた固相粒子に結合させ、抽出する方法が開示されている (例えば、「バイオマグネティック 'テクニクス 'イン ·モレキュラー · ノヽィォロン一 (Biomagnetic Techniques in Molecular Biology; 」，ダイナノレ (Dyn al) 社， 1 9 9 5年参照）。し力し、この方法も、プローブ D NAの固相化にアビジン 'ビォチン反応を利用するので、ピオチン化したプローブ D NAおよび目的遺伝子のハイプリッド体のサイズが大きい場合、目的遺伝子の抽出効率が著しく低下する問題が依然解決されない。特に標的遺伝子が 2本鎖 D NA、環状 D NAの場合、抽出できないことがある。

上述したアビジン ·ビォチン反応を用いてプローブ DMAの固相化を行なう場合、ピオチン標識体のサイズ依存性を排除できない問題がある。また、蛋白質であるアビジンを固相化させた固相粒子の取り扱いも注意を要する。さらに、アビジン ·ビォチンの反応条件とハイプリッド体の形成条件とが必ずしも一致しないときには抽出効率が低下したり、ハイプリッド体の崩壌等の問題が生じる場合がある。特に標的遺伝子が 2本鎖 D NA、環状 D NAの場合、抽出できないことがある。加えて、アビジン蛋白質や、オリゴヌクレオチドのピオチン化がコスト高であることも問題である。

[発明の開示]

本発明は、プローブ D NAが表面に結合されたプローブ D NA結合粒子と、一方に前記プローブ D NA結合粒子と相補的な配列を有し、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する一本鎖ブリッジォリゴヌクレオチドと、抽出すべき目的遺伝子とを含む試料を混合し、前記プローブ D N Aと前記一本鎖ブリッジォリゴヌクレオチドと前記目的遺伝子とをハイブリダィズさせること、を含む目的遺伝子の抽出方法を提供する。

また、本発明は、デォキシシトシン酸（d C ) およびデォキシグァニン酸（d G) の少なくとも一方が 5塩基以上連続した配列を含む 5〜 8 0塩基の配列からなる 1 本鎖オリゴヌクレオチドが表面に結合され、かつ粒子径が 0 . 1〜 1 5 μ mであるプローブ D N A結合粒子を提供する。

[図面の簡単な説明]

図 1は、ァクチン遺伝子の P C R増幅反応結果を示すバンドの写真であり、左側のパンドおょぴ右側のパンドはそれぞれ、ァクチン一ポリ C (Actin-PolyC) 一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドを添カ卩した系おょぴ添カ卩しない系での結果を示している。

[発明を実施するための最良の形態]

以下本発明を詳細に説明する。

本発明は、遺伝子配列の特異性から目的遺伝子を抽出する方法、および前記方法に用いられるプローブ D NA固定粒子である。本発明においては、目的遺伝子はその由来、形状、サイズ、配列等の制限を受けることなく、迅速、正確、力効率良く分離精製が可能である。本発明は特に目的遺伝子が 2本鎖 D NA、環状 D NAの場合にその効果が顕著である。

固相粒子表面に固相化されるプローブ D N Aと一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドとの結合を強固にするために、本発明に使用する固相化プローブ D N A結合粒子は、少なくともデォキシシトシン酸（d. C ) およぴデォキシグァニン酸（d G) の少なくとも一方が 5塩基以上連続する配列を含む 5〜 8 0塩基配列を含む 1本鎖オリゴヌクレオチドが表面に結合されていることが好ましい。ここで、 1本鎖オリゴヌクレオチドは、 d Cおよび d Gの少なくとも一方が 1 0塩基以上連続する配列を含むことがより好ましい。 d Cおよび d Gの少なくとも一方が連続する配列が 5個未満になると、プローブ D N Aと一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドとの間に強固な結合が形成されにくいので、好ましくない。また、プローブ D NAの全塩基配列が 5〜8 0塩基からなることが好ましく、 1 0〜5 0塩基であることがより好ましい。プローブ D NA の全塩基配列が 8 0塩基を超えると、プローブ D NAの合成効率が低くなり、機能する部分の比率が低くなるので好ましくない。本発明において、目的遺伝子を効率よく分離するために、共有結合によって固相粒子に結合されたプローブ DNAと一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドとの間に 2本鎖が形成されるときの融点（Tml) と、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと目的遺伝子との間に 2本鎖が形成されるときの融点（Tm2) の間に、 Tml≥Tm2の関係が成立することが好ましい。 Tmlが Tm2より低くなると、目的遺伝子と一本鎖ブリッジォリゴヌクレオチドとの間にハイプリッド条件の制限があり、目的遺伝子を認識度の低い条件にせざるをえないこともある。この場合、目的遺伝子以外の配列を拾ってしまうおそれがあるので、好ましくない。

具体的には、本発明において固相化されるプローブ DNAの塩基配列は、例えば d Cまたは dGが連続 5以上、好ましくは 10個続く配列が挙げられる。これらの塩基配列の末端部を特異的に粒子表面に固定するために、固定すべき末端に必要な官能基を修飾してもよい。また、固定ィ匕反応の種類にもよるが、必要に応じて塩基中の官能基活性をブロックしてもよい。

本発明のプローブ DNA結合粒子に用いられるプローブ D.NAは、通常の DNA合成機で調製することができる。必要に応じて固定すべき末端に共有結合用官能基を導入することができる。例えば、固相粒子表面にカルボキシル基が導入されている場合、プローブ DNAの末端にアミノ基を導入すればよい。逆の場合もありうる。また、必要に応じて S H基等を導入してもよい。

本発明のプローブ DN A結合粒子は、 1本鎖オリゴヌクレオチドが固相粒子に共有結合されて得られ、かつ粒子径が 0. 1〜1 5 Atmであることが好ましく、 0. 5〜 10 /zmであるのがより好ましい。粒子径が 0. 1 μηι未満になると、固液分離に時間がかかるので、好ましくない。一方、粒子径が 1 5 μιηを超えると、一定の固相粒子量を使用したときの固相粒子の表面積が少なくなり、同じプローブ量を導入するためにプローブの密度を上げる必要があり、結果的には高密度プローブに由来する立体障害を引き起こす恐れがあるので好ましくない。これにより、粒子のブラウン運動が小さくなり、かつ粒子自重による自然沈降が速くなるので好ましくない。

本発明において使用する固相粒子は、表面の少なくとも一部が合成高分子で被覆されることが好ましい。これは、特にプローブ D NAの化学結合に選択性を増やすために必要であるとともに、目的遺伝子以外の D N A非特異吸着を防ぐに好適である。プロープ D N Aの固定反応の種類に応じて、固相粒子表面に必要な官能基を重合する際、あるいは後修飾で導入することができる。さらに、必要に応じて固相粒子の内部に少なくとも磁気応答性磁性体、蛍光体、染料、顔料等を 1種類以上含芯させてもよい。磁性体を導入すれば、磁気分離が可能であり、作業工程を自動機に代替させることができ、特に大量な作業に好適である。また、蛍光体を固相粒子内に導入できれば、固相粒子自体が標識体となるので、検出するに好適である。また、固相粒子を着色すれば、プローブ D N Aの種類によって、固相粒子の色分けができる。

本発明の固相粒子（免疫凝集反応用粒子）を構成する有機高分子粒子は、芳香族ビニル化合物、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステルよりなる群から選ばれる一種のモノマーの重合体であり、必要に応じて a， ]3—不飽和カルボン酸モノマーを共重合することにより、有機高分子粒子の表面にカルボン酸基を導入することができる。

本発明に使用する一本鎖ブリッジォリゴヌクレオチドの塩基配列サイズは特に限定されるものではないが、通常 1 0〜5 0 0塩基であることが好ましい。 1 0塩基未満になるとハイブリッド体が形成されにくいので、好ましくない。また、 5 0 0塩基を超えると、一本鎖プリッジオリゴヌクレオチド本来の機能を満たすためには必要以上に長くなる結果、ハイプリッド反応において立体障害を引き起こす恐れがあるので、好ましくない。この塩基配列は化学合成で調製してもよいが、人工的に酵素反応を利用して調製してもよい。または、天然核酸の少なくとも一部を利用して、人工修飾を加えたものでもよい。なお、相補的な塩基配列を、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド内部に形成することを可能な限り避けることは、高効率での抽出を行なうのに有効であることは自明である。

本発明に使用する一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドは、固相粒子に結合されるプローブと相補的な配列を一方に有し、目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列をもう一方に有する。これらの相補的な配列は必ずしも末端に位置する必要はないが、ハイプリッド体形成時の立体障害を最小限にするために、末端近傍に配置されることが好ましい。また、それぞれのハイプリダイゼーシヨン用塩基配列の長さは、プローブ DNAの塩基配列、および目的遺伝子の標的部位によって自ずと決定される。具体的には、固相プローブ DNAの 5' 末端側に dGが連続して 5以上配列する部分を含有する場合、一本鎖ブリッジォリゴヌクレオチドの 3，末端側に d Cが連続して 5以上配列することは明らかである。本発明の一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドは通常の化学合成で調製することができる。ハイプリダイズ対象核酸配列の相補鎖を適切な位置に導入することができる。 .

本発明において、抽出すべき目的遺伝子がその形状、サイズ、存在状況等に関して特に制限されるものではない。抽出すべき目的遺伝子が 1本鎖 DNAであってもよいし、プラスミドのような 2本鎖 DNA、環状 DNA、またはスーパーコイル状 DNA であってもよい。

1本鎖 DN Aの具体例としては、動物細胞、またはその培養細胞から得られるゲノム DNA、またはその断片等について 1本化処理を施したもの、 cDNA, c DNA ライブラリーを含む試科、 mRNA等が挙げられる。また、 2本鎖 DNAの具体例としては、プラスミド、環状 DNA、スーパーコイル状 DNA、特に c DNAライブラリ一が組み込まれたプラスミド DN Aが挙げられる。

これらの標的 DN Aを含む試料は、通常の核酸抽出方法、例えばフヱノールクロ口ホルム抽出方法より調整することができる。通常、抽出すべき目的遺伝子が 2本鎖 D NAである場合は、 1本鎖 DN Aより高い温度にて一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドどハイブリダィズさせることが必要である。例えば、抽出すべき目的遺伝子が 2本鎖プラスミドである場合、本発明の抽出方法によれば、 2本鎖プラスミドの形で抽出することができる。したがって、本発明の抽出方法で回収した DNAがそのまま使用酵素反応、大腸菌等へのインフエクション等の用途に利用できる。

本発明において、プローブ DNA、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチド、およぴ抽出すべき目的遺伝子のハイプリッド反応の順序は特に制限されるものではなく、目的遺伝子に応じて調整すればょレ、。つまり、一本鎖ブリッジオリゴヌクレオチドと目的遺伝子とのハイブリッド体をまず形成して力ら、固相プローブ D N Aとこのハイプリッド体とのハイブリッド複合体を形成させてもよいし、固相プローブ D N Aと一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドとのハイプリッド体をまず形成させてから、目的遺伝子とこのハイプリッド体とのハイプリッド複合体を形成させてもよい。または、三者を同時に混合して、ハイプリッド複合体を形成させてもよい。これらの具体的な作業順番は、選択された一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドおよび抽出すべき目的遺伝子に応じて選択すればよい。

本発明において、ハイプリッド複合体（複合ハイブリッド）を形成することにより、目的遺伝子が固相粒子（プローブ D NA結合）に固相化され、液体試科から固液分離され、抽出される。簡単な加熱急冷処理により、抽出された目的遺伝子を液相に無傷で再度遊離させることができる。

抽出された目的遺伝子の確認方法が複数ある力 s、例えば、目的遺伝子が一本鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダィズさせる以外の位置と相補させ、かつ、蛍光等で標識される検出用プローブとハイブリダィズさせ、固相液相分離による洗浄を行ってから、蛍光強度を測定する方法がある。より高感度、確実な方法として、例えば、抽出した目的遺伝子を含むプラスミドを再び大腸菌内に感染させ、大腸菌を培養してから、コロニー P C Rによって目的遺伝子の種類、サイズ等を検証することができる。本発明の抽出方法を用いることにより、従来数日から数週間かかるこのような一連操作を、わずか約 2 4時間で完了できる。

以下、本発明の具体的な実施例について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

1 . 実施例 1

1 . 1 . 固相粒子

本発明に使用する固相粒子はすべて J S R社の製品を用いた。粒子径は光動的散乱装置 PhotalLPA3100 (大塚電子社）、または光回折装置 S O L D 2 0 0 0 (島津製作所）を用いて測定した。また、表面に導入されたカルボキシル基（官能基）の量は、酸アルカリ滴定による伝導度測定（Potentiograph E⁵³⁶ Metrohm, Herisan社）を使用した。表 1に、使用した固相粒子（粒子;！〜 4) の物性を示す。

(表 1)

1. 2. プローブ DN Aの調製

次いで、 dCが 30個続く配列を通常のアミタイド合成法より調整した。 3' 末端側にアミノ基を導入できるように c 7カラムを使用した。合成方法はメーカーマニュアル（パーキンエルマ一（PERKIN E1UMER) 社）に従って実施した。合成したオリゴヌクレオチドを O PCカラムで精製した。このように合成したオリゴヌクレオチドを dC30_Nとした。

(dC30-N)

5， - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC C- NH ₂ - 3，同様な方法で 3' 末端にアミノ基を導入しない dG 30の塩基配列、および 5' 末端に蛍光色素 FAMを導入した dG30の塩基配列を合成した。それぞれ dG30、 dG30 _Fとした。

続いて dC30 - N， dG30をそれぞれ lOnmol/ΙΟΟμ 1となるように濃度を調製し、それぞれ 100 μ 1を取り、 0.8m 1 TE/1.5MNaCl溶液の入ったチューブに入れ、 100°Cに加熱して力ら、室温までゆっくり冷やして、 dGの 3' 末端にァミノ基が導入された d G， d C 2本鎖 DNA10nmol/mlを調製した。これを dC30- Pとした。 260nm吸光度測定から、 2本鎖形成されることを確認した。

1. 3. プローブ DN Aの固相ィ匕

実施例 1で調製した、カルボキシル基が導入された各粒子の 1重量％分散液 1 m 1 をそれぞれ遠心分離処理し、固形物に 5mMMES緩衝溶液（pH=5. 5) を添加して遠心分離処理する操作を 3回繰り返すことにより、粒子の洗浄処理を行った。その後、粒子分散液に 1ーェチルー 3—ジメチルァミノプロピルカルボジィミド塩酸塩（同仁化学社製） 5 m gを溶解した 5遍 ES溶液 0. lm 1を添カ卩し、 40°Cで 2時間回転攪拌し、さらに前記調製した 30_?溶液10^1101/1111を100 1添カ卩し、室温で 10時間回転攪拌した。続いて、蒸留水で粒子分散液を 3回洗浄してから、粒子分散液 lmlを 100°C に加熱し、次いで 0°C氷水で冷やして、直ちに遠心、固液分離を行なうことにより、熱変性で遊離された d G配列を除去した。この操作を 3回繰り返し、遠心分離上澄の吸光度測定から、 dGが除去されたことを確認し、 d Cが 30塩基固定されたプロ一ブ D N A固定粒子の 1重量％分散液を得た。

上記プローブ D N A固定粒子の 1重量％分散液 100 μ 1と 200pmol d G30 - F 溶液 10 0 1を混合させ、それに 2顧 aCl溶液 200 1を加え、 50°Cで 1 5分インキュベートして力ゝら、遠心で上澄を回収した。上澄の蛍光強度を測定し、粒子分散液に加える前の 200 pmol d G30-F 溶液の蛍光強度との比率から、プローブ粒子にハイブリダイズされた dG成分、つまり有効に固定化された dC成分を求めた。

また、同様な方法で dG30を固相した粒子を調製した。各プローブ固相粒子のプロープ結合量（pmo 1/mg) を表 2に示す。

(表 2)

2. 実施例 2 ァクチン遺伝子の抽出

2. 1. 一本鎖ブリッジォリゴヌクレオチドの調整

プローブ D N Aと同様な方法で、下記の一本鎖プリッジォリゴヌクレオチド用配列 (ァクチン一ポリ C (Actin-polyC) ) を調製した。

(ァクチン一ポリ C (Actin-polyC) ：配列表の配列番号 1に相当）

GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG G— 3' 2. 2. ァクチン遺伝子の抽出

上記実施例 2で調製した一本鎖ブリッジォリゴヌクレオチド溶液 10 pmol/10ulと、実施例 1で調製したプローブ D N A結合粒子 1、 20 μ 1とを 70°Cで加熱してから、氷冷し、 5MnaClを 10 / 1加え、 45°Cで 1時間ィンキュベートした。 12000rpmで 3分遠心し、 0. IMNaClで 2回洗浄した。続いて、予め 95°Cで 10分加熱し氷冷した c D N A ライブラリーを組み込んだプラスミツド（タカラバイオ） 1 5 £/20 1を全量加えた。 55°Cで 1時間ィンキュベートし、 0. lm aClで 3回洗浄した。ペレットに 25μ 1蒸留水を加え、 70°Cで 10分間加熱し、氷冷した。遠心して上澄を回収した。

プローブ D N A結合粒子 1〜 4、それぞれ dG30および dC30を固定した粒子を用いて同様な実験を行った。

2. 3. 抽出されたァクチン遺伝子の検証

上記分離精製されたァクチン遺伝子 10 1を、 600nmで吸光度が 0.05の大腸菌溶液 100μ 1に加え、 20分氷冷した後、 42°Cで 50秒加熱し、さらに 2分氷冷した。上記大腸菌を S O C培地で 37°Cで 2時間培養し、 A r p (+)寒天培地で 16時間培養した。続いてコロニー P CRを実施した。 PCRは、 94°C,で 3分、 94°Cで 30秒、 56°C で 30秒、 72°Cで 30秒で 30周期行なった。また、ァクチン遺伝子の抽出成績を表 3に示す。所要時間は 24時間であつた。

(ァクチンプライマー 1 (Actin primer 1) ：配列表の配列番号 2に相当）

5，一 TAGGAGCCAGAGCAGTAATC - 3'

(ァクチンプライマー 2 (Actin primer 2) ：配列表の配列番号 3に相当）

5' - GCTGTGCTATGTTGCTCTAG- 3'

(表 3)

粒子種類プローブ得られたコロニー目的遺伝子を持つコロニー数収率（％)

(total)

粒子 1 dC30 26 18 69

粒子 2 dC30 24 18 75

粒子 3 dC30 27 19 70

粒子 4 dC30 26 17 65

粒子 1 dG30 29 18 62

粒子 2 dG30 20 15 75

粒子 3 dG30 26 17 65

粒子 4 dG30 27 18 67 また、 cDNAプラスミドライブラリーから、ァクチン一ポリ C (Actin - PolyC) ブリッジオリゴヌクレオチドを加えた系（A) 、または加えなかった系（B) において、粒子 1 (dG30固定）を用いて、ァクチン cDNAプラスミドを抽出した。抽出した DN Aを大腸菌に導入せず、直接上記同様なァクチンプライマーを用い、同様に PCRした結果を図 1に示す。他の粒子 2〜4からも同様な結果を得た。

図 1において、サンプル A (図 1の左側のバンド）は、ァクチン一ポリ C (Actin - polyC) ブリッジオリゴヌクレオチド存在下で抽出したもの、サンプル Bは、ァクチン一ポリ C (Actin-polyC) ブリッジォリゴヌクレオチド非存在下で抽出した結果である。

3. 実施例 3 HP RT遺伝子の抽出

上記ァクチン遺伝子抽出と同様な方法で、ブリッジォリゴヌクレオチドとして、了クチン一ポリ Cの代わりに HP RT—ポリ C (HPRT-polyC) を使用した。プローブ粒子 1、 dG30固定、ブリッジオリゴヌクレオチドの使用量、使用方法は、ァクチン遺伝子抽出時と同様にした。また、 PCR検出時のプライマーは、下記のものを使用した以外、実施例 2と同様な方法を用いた。 H P RT遺伝子の抽出成績結果を表 4に示す。所要時間は 24時間であつた。

一本鎖ブリッジォリゴヌクレオチド：

(H P R T—ポリ C (HPRT-polyC) ：配列表の配列番号 4に相当） CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC C-3'

(H P R Tプライマー 1 (HPRT primer 1) ：配列表の配列番号 5に相当）

5，一 GAGAGCTTCAGACTCGTCTA - 3'

(表 4) ノノ港れっ n一一 ΗΧ·罕、 /oy

(total)

粒子 1 dC30 20 14 70

粒子 2 dC30 24 17 71

粒子 3 dC30 21 14 67

粒子 4 dC30 22 15 68

粒子 1 dG30 24 15 63

粒子 2 dG30 22 15 68

粒子 3 dG30 23 15 65

粒子 4 dG30 20 14 70

4. 比較例 1

本試験法の代わりに以下の方法で、コロニーハイブリダィゼーション法を用いてそれぞれァクチン、 HP RT遺伝子の抽出を行った。

1) CDNAライブラリプラスミド（library plasimid) を、相補（competent) E. C oli cells (大月昜菌）にトランスフエクシヨン（transf ection)した。

2) このトランスフエタトさせた E.Coli cells (大腸菌）を、アンピシリンを含む寒天培地プレートに、 1枚当り 2000から 50000個なるように撒いた。同じようにして約 1 0〜20枚のプレートを準備した。

3) これらプレートについて、 1 6〜24時間後に菌が十分増殖していることを確認した後、ハイプリダイゼーシヨン（hybridization) に使用した。

4) ハイブリダィゼーシヨンでは、まずプレートの形に合わせて切ったニトロセル口ースからなるフィルタ膜を、 1プレート当り 2〜 3枚分作製した。したがって、全部で 20〜60枚のフィルタ膜を作製した。

5) ニトロセルロースからなるフィルタ膜をプレートの菌面に合わせ、ニトロセル口ースからなるフィルタ膜に菌を移動（transfer) させることで、レプリカを各プレートに付き 2〜 3枚作成した。

6) その後、レプリカ膜上の菌を溶解させ、 DNAの変性処理等を行って、コロユーノヽイブジダイゼーシヨン (Colony hybridization) に用いた。

7) 次いで、ラジオアイソトープでラベルした目的遺伝子の DNA断片をプローブとして、全部のプレートについて、ハイプリダイゼーシヨンを 1昼夜行った。

8) その後、非特異的結合（non- specific binding) を除くためよく洗浄し、乾燥させてから、 X線フィルムに 2〜5日ほど感光させた。 9) 感光シグナルの部分に相当するレプリカプレート上の菌を採り、 1) から 8) までの手順で再度ハイブリダイゼーションを繰り返し、シングルポジテイブコロニー（s ingle positive colony) を得た。その結果を表 5に示す。所要時間は 14日であつた。

(表 5)

コロニ一ハイブリダイゼーシヨン法を用いたときの結果得られたコロニー（total) 目的遺伝子を持つコロニー数収率

Actin ¾伝子 50000個 20個 0.04% HPRT遺伝子 00000個 1個 0.001%

5. 効果

プローブ DN A固定粒子および一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドを用いた本発明の目的遺伝子の抽出方法によれば、プローブ D N Aが表面に結合されたプローブ D NA結合粒子と、一方に前記プローブ DNAと相補的な配列を有し、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドと、抽出すべき目的遺伝子とを含む試料を混合し、

前記プローブ D N Aと前記一本鎖プリッジォリゴヌクレオチドと前記目的遺伝子とをハイブリダィズさせること、を含むことにより、目的遺伝子の形状、サイズに影響されることなく、迅速、正確、かつ効率良く目的遺伝子を抽出分離することができる。具体的には、従来の 2週間程度のスクリニングを約 24時間で完了することができるため、極めて簡便な方法として実施することができる。

Claims

請求の範囲

1. プローブ DNAが表面に結合されたプローブ DNA結合粒子と、一方に前記プロープ DNAと相補的な配列を有し、もう一方に目的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する一本鎖プリッジオリゴヌクレオチドと、抽出すべき目的遺伝子とを含む試料を混合し、

前記プローブ D N A結合粒子と前記一本鎖プリッジォリゴヌクレオチドと前記目的遺伝子とをハイブリダィズさせること、を含む、目,的遺伝子の抽出方法。

2. デォキシシトシン酸（dC) およびデォキシグァニン酸（dG) の少なくとも一方が 5塩基以上連続した配列を含む 5〜 80塩基の配列からなる 1本鎖ォリゴヌクレオチドが表面に結合され、かつ粒子径が 0. 1〜15 111である、プローブ DNA 結合粒子。