JPH05508764A - 遺伝病を検出するための熱安定リガーゼによるｄｎａ増幅系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝病を検出するための熱安定リガーゼによるＤＮＡ増幅系２０００以上の疾患 が、子孫に影響を生じるリスクが数学的に予測できる遺伝子の一カ所だけの欠損 として確認された。ヒトにおけるこれらの疾患には、ハンチントン舞踏病、膵膿 庖性繊維症、α１−アンチトリプシン欠乏症、筋ジストロフィー、ハンター症候 群、レッシュ・ナイハン症候群、ダウン症候群、ティ・サックス病、血友病、フ ェニルケトン尿症、サラセミア、および鎌状赤血球貧血等が含まれる。 これらの核酸塩基対の１カ所だけの変化、欠失、挿入、転位、またはその他の突 然変異を直接検出するため、３種の重要な技術が最近開発された。しかしこれら の技術のうちの２つは自動化が容易にできなかった。そのような技術の第１は、 患者の臨床試料に変異が存在し、または存在しないことを、サザン・プロットを 用いる患者のＤＮＡの制限消化の分析によって検出する方法である［ジャーナル ・オフ・モレキュラー・バイオロジー、９８巻、５０３頁（１９７５年）参照］ 。 しかしサザン・プロット手法は、例えばα、−アンチトリプシン欠乏症のように 、変異が制限部位を変化させない遺伝病には使用できない。第２の手法は、変異 部正常な遺伝子へは安定にハイブリッド形成するが、塩基対の１カ所だけのミス マツチをもつ変異遺伝子へはハイブリッド形成しない水準でハイブリダイゼーシ ョンの緊縮を起こすことによって、変異遺伝子から正常遺伝子を区別するのに使 用する〔プロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイ エンシズ・オフ・ザ・ＵＳＡ、８０巻、２７８頁（１９８３年〕参照コ。最初の 方法は、さらにオリゴヌクレオチドを固定化し、標識したＰＣＲ増幅試料でプロ ーブすることによって修飾された。この修飾では、固定化したオリゴヌクレオチ ドへ試料をハイブリッド形成し、ついで上述のようなハイブリダイゼーションの 緊縮を起こすことによってこれを洗い落とす［プロシーディングズ・オフ・ザ・ ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・オフ・ザ・ＵＳＡ、８６巻、６ ２３０頁（１９８９年）参照］。また蛍光ＰＣＲプライマーを使用して１カ所だ けの変異または対立遺伝子を特異的に増幅する別の方法が開発された［プロシー ディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・オフ・ ザ・ＵＳＡ、８６巻、９１７８頁（１９８９年）参照〕。この方法では生産物を スピンカラムまたはゲル電気泳動によって、プライマーから分離する必要があり 、したがって大規模な自動化へ移すことができない。第３の手法は、試料核酸が 正確な標的配列を含んでいる場合だけ、診断プローブが、隣接プローブへの共有 結合を実買上維持する条件下で、診断プローブおよび隣接プローブの両者の存在 を利用する方法である。さらに診断オリゴヌクレオチドプローブは、手法の効率 を増大する手段として（例えばストレプトアビジンによって）捕獲される「フッ ク」　（例えばビオチン化したオリゴヌクレオチド）を含み、隣接プローブは検 出し得る部分または標識を含み得る［サイエンス、２４１巻、１０７７頁（１９ ８８年）、および米国特許第４８８３７５０号参照］。 必ずしも常に必要とは限らないが、ＤＮＡ中の１カ所だけの塩基対変異を検出す るには、普通、ＤＮＡ試料物質量を増加（即ち、増幅）する技術が役立つ。核酸 の増幅を実施する多（の技術がある。とりわけ、（１）Ｔａｑポリメラーゼを使 用して、温度循環装置で２０〜３０反応サイクルを実施し、およそ数時間で１個 のコピーからＤＮＡを１００万倍に増幅することができるポリメラーゼ連鎖反応 ［サイエンス、２３９巻、４８７頁（１９８８年）、および米国特許第４６８３ １９５号、同第４６８３２０２号、同第４８００１５９号参照］、（２）自立的 配列複製または３ＳＲは、３７℃の等温条件下で逆転写酵素Ｔ７　ＲＮＡポリメ ラーゼおよびＲＮアーゼＨを使用して、１時間を超えない時間で、１個のコピー からＤＮＡまたはＲＮＡを１０００万倍に増幅することができる［プロシーディ ングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・オフ・ザ・ ＵＳＡ、８７巻、１８７４頁（１９９０年）］、（３）Ｑβレプリカーゼは特別 な３００ｂｐの認識配列を含んだ数千のＲＮＡ分子を３０分間で１０億倍に複製 することができる。それ以外の技術も利用でき、その一つとして、この発明でク ローン化した好熱性リガーゼによるリガーゼ連鎖反応を以下に説明する。 この発明を利用して診断し得る各種の疾患に加え、臨床試料中の原因微生物の特 異的なりＮＡ配列特性の存在によって、多くの感染疾患を診断することができる 。これらは細菌、ウィルス、および寄生虫等である。そのような方法では、感染 患者から得られる試料中に比較的少数の病原微生物が存在し得るが、これらの微 生物から抽出したＤＮＡは、試料中の全ＤＮＡのご（小部分を構成するに過ぎな い。しかし疑わしい病原菌に特異的な配列を固定化し検出する前に、ＤＮＡ試料 のハイブリダイゼーションによって特異的に増幅することは、在来の方法の感度 および特異性を著しく改善するはずである。しかもそのような分析が、本来、感 度の低い非放射性検出手法を用いて少量の試料で実施しなければならない場合、 または放射性手法を採用するが、迅速な検出が望ましい場合、増幅は特に有用で ある。 このような手法を利用し得るが、−ケ所だけの塩基対の突然変異を検出するには 他の技術の探索が続けられる。サーマス・アクアチヵスに由来する好熱性ＤＮＡ リガーゼを利用するりガーゼ検出反応（ＬＤＲ）またはりガーゼ連鎖反応（ＬＣ Ｒ）によって標的ＤＮＡ配列を検出するＤＮＡ増幅および／または検出であるこ の発明は、継続しつつある労作の一部である。 ＤＮＡ増幅のためにエシェリキア・コリまたはＴ４　ＤＮＡリガーゼを利用する 他の技術も試みられたが、これらは、この発明のりガーゼ連鎖反応では起こり得 ない条件である高水準のバックグラウンド「ノイズ」　（１ｏサイクルに達する までに）のため、許容し得ないことが判明した。 またＤＮＡ増幅および／または検出に特異的なりガーゼの利用が試みられた。 例えば７５サイクルを用い、各サイクル毎に使用したＴ４　ＤＮＡリガーゼをさ らに補給し、５０００００コピーで出発して９５時間でＤＮＡを増幅できるリガ ーゼ増幅反応が報告された［ジーン、７６巻、２４５頁（１９８９年）参照］。 しかしこの報告の技術は緩慢であり、各段階のあとでＴ４リガーゼの追加を要す るので、この両者の必要性は、報告された技術の自動化を受け入れ難（する。こ の発明のりガーゼ連鎖反応は、３０サイクルを用いて２００コピーから３時間で ＤＮＡの増幅ができ、各サイクルのあとでリガーゼの追加を必要としない。 以下のこの発明の説明を通じて、この技術分野の特別な術語を使用する。説明す る内容に関して誤解を避けるため、また説明した内容に関して明瞭な理解を提供 するため、以下の定義を用いる。 「増幅」とは、特定の核酸断片のコピー数を酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反 応、リガーゼ連鎖反応、または自立的配列複製のような）、またはその断片をク ローン化したベクターの複製の何れかによって増加することを表わす。 「平滑末端ライゲーション」とは完全に平滑である（即ち、付着末端突出部をも たない）ＤＮＡの２つの末端の共有結合的な連結法をいう。 「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」の語は互換的に用い得、そのような記 載はすべて子孫を含む。したがって「形質転換体」または「形質転換細胞」の語 は、伝達数に無関係に初代対象細胞およびそれに由来する培養を含む。またすべ ての子孫は意図的または偶発的な突然変異のためＤＮＡ含量が正確に同一ではあ り得ないことはいうまでもない。ただしもとの形質転換細胞でスクリーニングし たのと同一の機能を有するすべての変異体子孫を包含する。 「クローン」とは、共通の祖先から無性的に由来した遺伝子的に同一である分子 、細胞、または微生物群をいう。「クローニング」とはそのような同一である分 子、細胞、または微生物を増殖させる操作である。組換えＤＮＡ技術により、個 々の遺伝子をクローン化することが可能となる。これを「分子クローニング」と いう。 「共有結合的な付着」とは、２つの物質量の共有化学結合を生成することをいう 。 「サイクル」とはＤＮＡの１回の融解および冷却操作をいう。例えば９４℃のよ うな非常な高温では、実質上すべての２本鎖ＤＮＡ　（鎖長に関係なく）は巻き 戻され融解する。相補的なオリゴヌクレオチドの存在で温度を冷却すると（４５ 〜６５℃へ）、巻き戻され融解したＤＮＡのもとの正しい配列へハイブリッド形 成することができる。融解し、相補的なオリゴヌクレオチドの存在で冷却したＤ ＮＡは、次のＤＮＡリガーゼ反応の基質となる（ｒＴｍＪの項を参照）。 「診断部分」とは、存在し、または存在しないことを検出すべきヌクレオチドの 変化を含む標的配列部分をいう。「隣接部分」とは、診断に選ばれた配列部分の ヌクレオチド配列の連続部分であるＤＮＡの配列を表わす。連続はどちらの方向 をも含み得る。 その末端の一方に標的配列が存在し、または存在しないことを鑑別するヌクレオ チド（複数もあり）を含んでいなければならないことを除き、診断部分を含んだ 選ばれたオリゴヌクレオチドの正確な位置が任意であることは下記の説明から明 らかであろう。即ち、隣接部分を含むオリゴヌクレオチドは、診断部分を含んだ この任意に選ばれたオリゴヌクレオチドの配列に連続しており、したがって診断 ヌクレオチド（複数もあり）は２つのオリゴヌクレオチドの接続箇所にある。 「エンドヌクレアーゼ」とは、分子内の部位でＤＮＡを切断する酵素（例えば制 限エンドヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ）をいう。 「発現系」とは、所望の暗号配列および制御配列で形質転換した宿主が暗号化し たタンパク質を生産できるような態様で、これらの配列を実施可能な連鎖で含ん でいるＤＮＡ配列をいう。形質転換を実施するため、発現系をベクター上に含み 得、あるいはまた形質転換したベクターＤＮＡを宿主染色体へ組込み得る。 「遺伝子」とは、回収可能な生物活性を有するポリペプチドまたは前駆物質を暗 号化しているＤＮＡ配列をいう。このポリペプチドは完全鎖長の遺伝子配列で暗 号化でき、あるいは酵素活性を保有している限り、暗号配列の任意の部分で暗号 化できる。 「遺伝子ライブラリー」または「ライブラリー」とは、与えられた種の完全なゲ ノムを実質上包含する無作為にクローン化された断片のコレクションをいう。 またこの語はクローンバンクまたはショットガンコレクションを表わすのにも用 いる。 「ゲノム」とは生物の全体のＤＮＡをいう。 「フック」とは、フックを「捕捉する」ことによって、この修飾を含んでいる的 なりＮＡ配列、および他の好適な反応基によって回収できる特異的な反応性化イ ゼーション」および「結合」の語は互換的に用いられる。変性したＤＮＡへ７％ イブリッド形成し、または結合させたプローブは、ポリヌクレオチド中で相補的 な配列へ対合させ、または「凝集」させた塩基である。特定のプローブが、ポリ ヌクレオチドと対合させた塩基、または凝集させた塩基を保有しているかいない かは、相補性の度合、プローブの鎖長、および結合条件の緊縮度によって決まる 。 緊縮度が高ければ高いほど、相補性の度合は高く、そして／またはプローブは長 （なければならない。 「クレノー断片」とは、ＤＮＡポリメラーゼＩの部分的タンパク質分解消化によ って得られた７６０００ダルトンのポリペプチドをいう。この酵素は、ＤＮＡポ リメラーゼ■の５′→３゛ポリメラーゼおよび３゛→５”エキソヌクレアーゼ活 性「リガーゼ」とは、２本鎖ＤＮＡ中の１本鎖切断部位でリン酸ジエステル結合 の生成を触媒する酵素をいう。またリガーゼ酵素は２本１１ｍＤＮＡの共有結合 、即ち、平滑末端を平滑末端へ、または１つの付着末端をもう１つの付着末端へ 共有結合するのを触媒する。 ［リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）Ｊとは、オリゴヌクレオチドライゲーション生産 物の増幅を表わす。例えば１サイクルのＤＮＡ生産物が次のサイクルのＤＮＡ基 質となることができるようにオリゴヌクレオチドを設計すると、そのようなサイ クルを反復することによってＤＮＡの指数的増幅（「連鎖反応」）が起こる。 好熱性リガーゼ酵素は、多くのＤＮＡ融解および冷却サイクルの間、活性を保存 することができるから、単一の反応容器中で、オリゴヌクレオチドライゲーショ ン生産物を増幅する多くの熱反応サイクルを行なうＤＮＡ増幅を迅速に自動的に 起こすことができる。 「リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）Ｊとは、特異的な配列を検出するため、好熱性リ ガーゼの助けを借りる直線的な生産物増幅による隣接した２つのオリゴヌクレオ チドの使用を表わす。 「リガーゼＤＮＡ配列」とは、この発明の好熱性リガーゼのためのサーマス・ア クアチカスＨＢ８中のＤＮＡ配列をいう。この配列はりガーゼタンパク質のアミ ノ末端で下記の核酸配列を含む。 χ夏スＭλ刀！入℃αΩｌＩ：ｍαス雇ロ刀写Ａπにスまな）にｍＣ町コスαズ ｍ ｐＸＴＧＡｆｆ　Ｃ１℃Ｇａ１ａ　ＩＩＷ　ＧＩＤ　ｆｆ　ＡＡＧαｂ　ＧＴＡ 　ＡＡＣｃ；＜　ｒｎα℃Ｇ℃０℃Ａ！　（ｆｆ　Ｔ７１ＣＣＸ：　ＭＣ’ＩＸ ：α：ＣＴＡＣ’ＩＸ：：　ＣＴＣＣＩＧα）Ｓ　Ｇｉ’ＣＣＣＧＣＭ　ＡＴＣ ＴＣＣＧＣＣＣＣＧＡＧ　ＴＡＣＧＡＣαＤ　ＣＩＴ　ＣｒＩ’　ＡＧＧ　（、 ％　ＣＴＣＡＡＧ％　Ｃ’ＩＴ　ＧＡＧ　（％　ＣＧＣ’ＩＴＣαＴ（１０℃Ａ ＡＡＡｆｆ：σｃ　ｃ；＜　’ＫＩ：’α℃ＡＣＣｃ′ｎ”　ｃｘ　ｃｚ　ＧＧ Ｇ　ｃｗ　ｍα：’ｒ　’ｚ　ＧＡＧαＥＣＡＣＣＴ［αｎｃｃｃＯ℃αｔＣ＜ 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結合的に付着させて単一の配列を生成することをいう。標準的にはこの反応は一 方の配列の５′末端と他方の配列の３°末端との間で、リン酸ンエステル結合の 生成を触媒するりガーゼで処理することによって実施される。ただしこの発明の 説明に関連して「連結（ライゲーション）する」の用語は、そのような配列を、 例えば化学的手段によって共有結合的に付着させるその他の方法をも包含して使 用される。「共有結合的に付着させるＪおよび「連結（ライゲーション）する」 の語は互換的に用いられ得る。 「ニック閉環活性」とはＤＮＡの隣接する鎖同士の共有結合をいう。この活性は 開環状ＤＮＡ（ＯＣＤＮＡ）を共有結合的に転換して、閉環状ＤＮＡ（ＣＣＣＤ ＮＡ）へ閉環し、試料ＤＮＡが、臭化エチジウム染色したアガロースゲル上を移 動する速度を測定することによるリガーゼ活性の検定に使用される（ＯＣＤＮＡ はＣＣＣＤＮＡより一層遅く移動する）。 「オリゴヌクレオチド」とは、２種またはそれ以上、好ましくは３種以上のデオ キシリボヌクレオチドまたはりポヌクレオチドを含む分子をいう。その正確な大 きさはオリゴヌクレオチドの究極的な機能またはその使用によって左右される。 オリゴヌクレオチドは合成的に、またはクローニングによって誘導され得る。 「実施可能に連結した」とは、構成要素の正常な機能が実施できるように並べて 配置することをいう。即ち、制御配列へ「実施可能に連結した」暗号配列とは暗 号配列が制御配列の制御下に発現できる配置であることを表わす。 「過剰生産株」とは、特定の酵素または化学物質を過剰に生産するように誘導し 得る細菌またはその他の宿主細胞株をいう。 「ポリメラーゼ」とは、デオキシリボヌクレオチドをＤＮＡへ組立てる反応を触 媒する酵素をいう。 ［ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）Ｊとは、相手の鎖へノーイブリッド形成し、 標的ＤＮＡ内で、対象領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを 利用することによる特異的なりＮＡ断片の指数的増幅に関する特許方法（米国特 許第４６８３２０２号および同第４６８３１９５号）をいう。この方法は、鋳型 変性、プライマー・アニーリング、およびＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによって アニールさせたプライマーの伸長を含むサイクルを反復する一連の系からなる。 「プローブ」とは、変性した核酸内のプローブされるべき配列と十分に相補的で ある（その鎖長に関連して）ように設計され、選ばれた緊縮条件下で、これへ結 合させるオリゴヌクレオチドをいう。「隣接プローブ」とは、隣接部分と相補的 であるプローブを表わす。「診断プローブ」とは、診断部分と相補的であるプロ ーブを表わす。「標的プローブ」とは、標的配列と相補的であり、診断プローブ および隣接プローブを共有結合的に付着させる（ライゲーションする）ことによ って作られるプローブをいう。 「リポータ−基」とは、特定の部分の存在を知らせる基をいう（「標識」の項を 参照）。 「制限エンドヌクレアーゼ」とは、分子の内側にある特異的な配列を認識するこ とによってＤＮＡを切断し、その結果、認識配列の内部または外側の何れかの部 位でＤＮＡの両方の鎖をともに切断する酵素をい２゜「粘着末端ライゲーション 」とは、必ずしもそれだけに限らないが、通常、１〜５ヌクレオチドの鎖長であ る５゛または３′の１本練突出部を相補的に含んでいるＤＮＡの２つの末端の共 有結合をいう。 「緊縮」とは、２本鎖ＤＮＡが、それを構成する１本鎖へ解離を起こすように核 酸に加える条件の組合せをいう。これらは、特に極端なｐＨ，高温、塩濃度であ る。「高度緊縮」とは、標準的なサザン・ハイブリダイゼーション・プロトコー ル［ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー、９８巻、５０３頁（１９ ７５年）の報告のような］のもとにオリゴヌクレオチド・プローブ、またはそれ とご（近縁の配列を使用して非反復配列を検出するのに十分な条件、具体的には ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件をいう。 ｒＴｍＪとは、ＤＮＡの２つの相補鎖が巻き戻され、分離される温度を表わす。 これは１本鎖ＤＮＡの鎖長およびその塩基組成の関数である。短い断片では、Ｔ ｍの近似値（’Ｃ）は４　（Ｇ＋Ｃ）＋２　（Ａ＋Ｔ）に等しい。例えば５Ｇ、 ７Ｃ。 ５Ａおよび４Ｔの塩基を有するオリゴヌクレオチドでは、４　（５＋７）　＋２ 　（５十４）の温度、即ち６６℃である。 「標的配列」とは、検出を所望する配列が存在し、または存在しない核酸配列を いう。この発明の方法の好ましい適用の説明に関連して用いる場合、この語は錐 状赤血球貧血のような遺伝病に関連する遺伝子中のコード領域の一部を構成する 配列である。そのような多くの疾患では、遺伝子異常の存在は暗号配列の僅かな 変化を特徴とする。最も多いのは、正常な個体では遺伝的「欠損」を有する個体 に存在する対応する配列と１ヌクレオチドが異なる配列を有する。この発明の方 法では正常な配列、または変化した配列のどちらでも、標的配列として使用でき る。 「好熱性酵素」とは、５０〜９０℃の高温で作用する酵素をいう。これらの酵素 の幾つかは、通常の酵素では変性され、したがって不活性となる９４〜１００℃ の温度に短時間露出しても生存し得る。 「熱安定リガーゼ」とは、熱に安定であり、耐熱性であり、５０〜９０℃の高温 で、隣接するオリゴヌクレオチドのライゲーションを好適な態様で触媒（促進） し、標的核酸鎖と相補的な生産物を生成する酵素をいう。一般にこの酵素は、１ ヌクレオチドの５゛末端を活性化して、これを隣接するＤＮＡ分子の３′鎖へ結 合させる。ただしほかのメカニズムを用いて隣接するオリゴヌクレオチドを共有 結合的に付着させる熱安定酵素もあり得る。熱安定リガーゼは、５０〜９０℃の 高温で、適当な条件下に、ＤＮＡ内の「ニック」閉環、および粘着末端および平 滑末端ライゲーションのように多数の異なった核酸基質を共有結合的に連結する ことができる。 この発明の熱安定酵素は、増幅反応に有効であるという唯一の基準を満たさなけ ればならない。即ち、この酵素は、２本鎖核酸の変性を実施するのに必要な時間 、上昇温度を加えても不可逆的に変性（不活性化）されてはならない。これに関 連して用いられる「不可逆的な変性」の語は、永久的な完全な酵素活性の喪失を もたらす操作を意味する。変性に必要な加熱条件は、例えば緩衝塩濃度および変 性される核酸の鎖長およびヌクレオチド組成によって定まるが、標準的には短い オリゴヌクレオチドでは約８５℃、主として温度および核酸鎖長によって定まる 時間では約１０５℃の範囲で、短いオリゴヌクレオチドで標準的に約０．２５分 間、長いＤＮＡ片では４．０分間である。一層高温でも、緩衝塩濃度および／ま たは核酸のＧＣ構成を増大させることによって耐えられ得る。好ましくは酵素は 、約９０〜１００℃でも不可逆的に変性されない。この発明の熱安定酵素は、酵 素が機能する最適温度を有しており、その温度は約４５℃以上、恐らくは５０〜 ９０℃、最適には６０〜８０℃である。 遺伝病における１カ所だけの塩基対配列の違いを検出するための好熱性リガーゼ によるＤＮＡ増幅方法において、好熱性リガーゼ配列のクローニング、およびこ の酵素の使用に関して、さらに徹底的に完全な理解を得るため、以下に図面およ び実施例を挙げて説明する。これらは単にこの発明を説明するためのものであっ て、この発明の範囲を制限する目的をもつものではない。 第１図はプラスミドｐＤＺ１およびｐＤＺ７を図示したものである。 第２図はこの発明のりガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のフローチャートを示す。 第３図は、この発明のＬＤＲおよびＬＣＲ増幅条件下におけるサーマス・アクア チカスの好熱性リガーゼの特異性を説明するオートラジオグラムである。 第４図は、さまざまな標的濃度におけるＬＣＲ増幅を説明するオートラジオグラ ムである。 第５図は、ヒトゲノムＤＮＡを使用したβグロビン対立遺伝子の検出を説明する オートラジオグラムである。 第６図は、この発明によるオリゴヌクレオチド定量に基づくエリザ（ＥＬＩＳＡ ）の概略図である。 第７図は、この発明による熱安定リガーゼの５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミド ゲル電気泳動のさまざまな精製段階における写真による説明である。 第８図は、この発明による熱安定リガーゼの５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミド ゲル電気泳動のさまざまな精製段階における第２の写真による説明である。 第９図は、この発明によって調製した３種のクローンを図示したものである。 第７図で、レーンＡおよびＧはマーカータンパク質を表わす（分子量はｋｄで示 す）。Ｂは誘導後の全細胞、Ｃは音波処理後の粗上清、Ｄは熱処理後、プールし たＤＥＡＥ流動を示し、ＥおよびＦはホスホセルロース・クロマトグラフィー後 の画分２３および２４を示す。第８図で、レーンＡおよびＨはマーカータンパク 質を表わす（分子量はｋｄで示す）。Ｂは誘導後の全細胞、Ｃは音波処理後の粗 上清、Ｄは熱処理後、プールしたＤＥＡＥ流動を示し、Ｅはホスホセルロース・ クロマトグラフィー後の画分２３、ＦはＮＡＤの存在なしでリガーゼ緩衝液中で ニック処理したＤＮＡとインキュベートした画分２３、Ｇはニック処理したＤＮ Ａの存在なしでリガーゼ緩衝液中でＮＡＤとインキュベートした画分２３を示す 。第８図で、高分子量側のりガーゼ（約８１ｋｄ）はアデニル化された形である が、低分子量側のりガーゼ（約７８ｋｄ）はアデニル化されない形である。 第１図に示したプラスミドを、ブダペスト条約の寄託規則に基づき収集機関へ寄 託して受入れられた。プラスミドｐＤＺ１は宿主細菌（エシェリキア・コリＡＫ ５３株）へ組込み、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへ寄託して 、ＡＴＣＣ６８３０７の収集番号が与えられた。プラスミドｐＤＺ７は宿主細菌 （エシェリキア・コリＡＫ５３株）へ組込み、アメリカン・タイプ・カルチャ− ・コレクションへ寄託して、ＡＴＣＣ６８３０８の収集番号が与えられた。 ほかの方法も用い得るが、一般にこの発明による好熱性リガーゼの生産は、標準 的に下記の手順を含む組換え手段によって行なわれ得る。 まず成熟（ここで用いたこの用語はすべての突然変異タンパク質を含む）酵素を 暗号化し、または制御された条件下で、その活性を破壊されない追加的な配列ま たは切断可能な追加的な配列へ融合し、活性タンパク質を生じる好熱性リガーゼ の融合体を暗号化しているＤＮＡを得る。その配列がイントロンによって中断さ れないなら、この配列は任意の宿主で発現するのに好適である。ただし配列は切 断および回収可能な形であるべきである。ＰＣＲ手法を用いて、例えば酵素を・ 暗号化している大部分のＤＮＡ配列を増幅し得、したがって「切断」した形で回 収し得る。 ついで切断し、または回収した暗号配列を複製可能な発現ベクター内の好適な制 御配列とともに実施可能な連鎖で配置し、これを使用して好適な宿主を形質転換 する。ついで形質転換した宿主を好適な条件下で培養して組換え体好熱性リガー ゼの生産を実施し、リガーゼを単離し、既知の手段により精製する。 上記の手順は、それぞれ種々の態様で達成され得る。例えば所望の暗号配列をゲ ノム断片から入手し得、好適な宿主でこれを直接使用し得る。好適なレプリコン および制御配列を使用して多くの宿主で実施可能な発現ベクターのための組立て 物を作成する。普通では入手し得な（ても、好適なベクターへ挿入し、切断可能 な遺伝子を提供し得るように好適な制限部位を暗号配列の末端へ付加し得る。 制御配列、発現ベクター、および形質転換の方法は、遺伝子を発現するのに使用 する宿主細胞の種類によって変わる。一般に細菌宿主が最も効果的で、組換えタ ンパク質の生産に都合がよく、したがってこの発明の好熱性リガーゼの発現に好 ましい。ただし酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞のようなその他の宿主も 、都合がよければ同様に使用し得る。この発明の目的には、ある宿生細胞の供給 源は、任意の他の入手可能で好適な宿生細胞の供給源と対応物であるとみなし得 る。 実施例１ サーマス・アクアチカスＨＢＳ株の増殖およびＤＮＡの単離サーマス・サーモフ ィラスＨ８８株（ＡＴＣＣＮｏ、２７６３４）からＤＮＡを単離した。この株は 最近サーマス・アクアナカスＨ８８株と再分類された［アーカイブ・オフ・マイ クロバイオロジー、１１７巻、１８９頁（１９７８年）参照Ｊ０ 温浴振とう器でＴＡＢブロス（１リットル辺り、バクト［商標〕−トリプトン５ ｇ、酵母抽出物３ｇ、ＮａＣ１２ｇ、デキストロース１ｇ含有、ＮａＯＨでｐＨ ７゜２〜７．５に調節）［ニュークレイツク・アシッズ・リサーチ、６７９５〜 ６８０４頁（１９８１年）参照］中で細胞を７５℃で１夜増殖し、遠心によって 回収し、８００１１の培地から３．１ｇ（湿潤重量）を得た。細胞を５０ｍＭＥ ＤＴＡおよび卵白リゾチーム１５ｍ１を含有する５０１ｎＭトリス緩衝液（ｐＨ ８，０）　１５１１１に再浮遊させた。１０％（重量／容量）ドデシル硫酸ナト リウム２ｍｌを添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、−５０℃で凍結、 ３７℃で融解するサイクルを２回反復することにより、再浮遊細胞を溶解した。 水溶液を等容量の水性フェノール（あらかじめホウ酸ナトリウムでｐＨ７，５に 平衡化）、ついでフェノール／クロロホルム、最後にクロロホルムで逐次抽出し た核酸を９５％エタノール２容量と混合し、−５０℃へ１５分間冷却し、遠心に よってペレット化することによりこれを沈殿させた。上清を除き、ベレットを乾 燥したのち、核酸をＴＥ緩衝液［１＋Ｍ　ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ）リスＨ ＣＩ（ｐＨ８，０）］　１ａ＋１へ再浮遊させた。浮遊液各１ｍｌにＲＮアーゼ Ａ１００ａｇを添加することにより、ＲＮＡを消化し、混合物を３７℃で１時間 インキュベートした。 ３Ｍ酢酸ナトリウム１／１０容量および１００％エタノール３容量の添加により 、ＤＮＡを沈殿させ、−５０℃で１５分間冷却し、遠心によってペレット化し、 ７０％エタノールで洗浄し、最後に２ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＴＥ緩衝液に再浮 遊させた。 上記の実施例で利用したＤＮＡはサーマス・アクアチカスから単離したが、生じ たこの発明に必要な性質を有する好熱性リガーゼは、他のサーマス種、またはそ の他の好熱性細菌、ファージ、またはウィルスから単離したＤＮＡを最初の供給 源としてもよい。 サーマス・アクアナカスＨ８８株から単離したＤＮＡは、制限エンドヌクレアー ゼＴａｑＩ（その認識配列はＴＣＧＡ）またはＥｃｏＲＩ（その認識配列はＧＡ ＡＴＴＣ）によって切断できない。ある配列を切断できないことは、アデニン残 基のＮ６位における保護メチル化のためである［Ｈ，Ｏ，スミスおよびＳ、Ｖ、 ケリー、ｒＤＮＡ・メチレーション、バイオケミストリー・アンド・バイオロジ カル・シグニフィカンス」、シージン、シーグーおよびリグズ編、３９〜７１頁 、スプリング・フェアラグ社、ニューヨーク（１９８７年）参照コ。これまでの 研究者らは、Ｇ−６ＭｅＡＮＴＣおよびＣＴＧＣ−６ＭｅＡＧの形のアデニンメ チル化ＤＮＡを制限するｍｒｒと呼ばれる遺伝子があることを報告している［ジ ャーナル・オフ・バクテリオロジー、１６９巻、３２４３頁（１９８７年）参照 Ｊ。Ｔａｑｌ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼのクローニングにおいて 、数種のエシェリキア・コリ株が、本来（ただし間違って）　、ｍｒｒ遺伝子に よる影響であるＴＣＧＡメチル化ＤＮＡを制限することが判っている［ジーン、 ５６巻、１３頁（１９８７年）、およびニュークレイツク・アシツズ・リサーチ 、１５巻、９７８１頁（１９８７年）参照］。最近、コーネル・ユニバージティ ー・メジカル・カレッジで行なわれた研究で、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡを制限す るタンパク質を暗号化したｍｒｒ以外にも、追加的な遺伝子が存在することが明 らかになった。簡単に説明すると、ｍｒｒ遺伝子を破壊するＴａ２　（Ｋｒｎリ トランスポゾンを含んでいる株［ジャーナル・オフ・バクテリオロジー、１６９ 巻、３２４３頁（１９８７年）参照］をエシェリキア・コリの数種の株へのＫｍ ”マーカー導入に使用すると、生じた株はｍｒｒ−（ｍｒｒタンパク質欠損）遺 伝子型へ転換した［Ｊ、Ｈ，ミラー、「エキスベリメンツ・イン・モレキュラー ・ジェネティックス」、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１２０ １〜２０５頁（１９７２年）］。これらの形質導入株は何れもＴａｑメチラーゼ 遺伝子に抵抗できなく、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡの制限に関わる第２の遺伝子が あることを示している。即ち、この発明の構成に第１に必要な必要条件の一つ（ この発明以前には明らかでなかった）は、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡを強く制限し ないエシェリキア・コリ株の選択であった。 この発明では、Ｔａｑメチラーゼ遺伝子に抵抗でき、Ｔｎｌｏ（Ｔｅｌｌ）トラ ンスポゾンを含んでいるエシェリキア・コリのＲＲＩ株の誘導体をｌｉｇｔｓ　 ７株［Ｎ３０９８、ウィルソンおよびマーレイ、ジャーナル・オプ・モレキュラ ー・バイオロジー（１９７９年）、およびジャーナル・オフ・モレキュラー・バ イオロジー、７７巻、５３１頁（１９７３年）参照］へ導入し、エシェリキア・ コリＡＫ７６株を作り出した。この株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クションへ寄託し、ＡＴＣＣ５５０３２の収集番号が与えられた。この株は温度 感受性リガーゼ遺伝子を含んでおり、したがって４２℃で発育できない。この株 はＴａｑメチラーゼ遺伝子、およびその他のメチル化ＤＮＡ、特にサーマス・ア クアチカスから単離したＤＮＡに抵抗できる。またこの株は温度感受性リガーゼ 遺伝子をもっているから、４２℃での増殖について選別することにより、機能的 なサーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子のクローニングのための宿主として 使用することができた。 サーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子のクローニングは、ウィルソンおよび マーレイが報告したのと類似の陽性選択手法に基づいて実施した。その方法は好 適なベクターへ挿入したサーマス・アクアチカスＤＮＡのライブラリーを組立て ることである。ついでこれらのライブラリーを、サーマス・アクアチカスＤＮＡ のメチル化を制限しないＡＫ７６株のようなｌｉｇｔｓ　７エシエリキア・コリ 株へ形質転換により導入した。ついでこれらの細胞を非許容温度（即ち、４２℃ ）で発育させた。任意の生存株は、（ｉ）ｆｉｇ“表現型への復帰変異株、（ｉ ｉ）欠損エシェリキア・コリ・リガーゼ遺伝子生産物の発現を増大させる第２の 部位復帰変異株、（ｆｆｉ）欠損エシェリキア・コリ・リガーゼ遺伝子生産物の 発現を増大させるサーマス・アクアチカスＤＮＡのクローン片、または（ｔｖ） サーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子を含んでいるサーマス・アクアチカス ＤＮＡのクローン片であり得る。 所望の最後の別法を実施するには、（１）全体のりガーゼ遺伝子をクローン化し 、（ｉｉ）エシェリキア・コリでサーマス・アクアチカス・リガーゼを発現する 機能のため、内在性の制御配列、または外来性ベクター制御配列の何れかをアミ ン末端へ十分に近接させ、リガーゼ遺伝子をエシェリキア・コリ内で適切に発現 できる正しい方向でクローン化し、（ｆｆｉ）サーマス・アクアチカス・リポソ ーム結合部位がエシェリキア・コリで作動し、（ν）サーマス・アクアチカス・ リガーゼが４２℃でも十分に活性で、合成量が、エシェリキア・コリ内で他の操 作で妨害されず、リガーゼ機能を十分に補足できることが必要である。 この発明で使用する好適なライブラリーの組立てには、所望の制御配列を含んで いる通常のベクター、標準的な制限エンドヌクレレアーゼ、およびライゲーショ ン技術を利用する。精製したプラスミドＤＮＡ、サーマス・アクアナカスＤＮＡ 配列、またはこの発明で使用するために合成したオリゴヌクレオチドを切断し、 作り替え、通常の技術により、所望の形で再びライゲーションする。 この発明で使用する好適なベクターの選択は、これまでに存在し、使用された多 数のベクターのうちから１つのベクターを単に選別するだけのことではない。 ｐＵＣプラスミドの高コピー数の誘導体［例えばＣ，ヤニツシュ・ベクタら、ジ ーン、３３巻、１０３頁（１９８５年）、またはＪ、ビエイラら、ジーン、１９ 巻、２５９頁（１９８２年）参照］は４２℃で発育させると、実際には若干不安 定である。ｐＢＲ３２２の誘導体ｐＦＢ１．２．１３．１４、および１５［Ｆ。 バラニー、プロン〜ディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サ イエンシズ・オフ・ザ・ＵＳＡ、８２巻、４２０２頁（１９８５年）参照コのよ うな低コピー数のプラスミドはりガーゼ欠損を補足するのに十分な酵素を生産し 得ない。この発明を構成するため、３組の異なったベクターを使用して１８組の 異なったライブラリーを組立てた。その他のベクターも利用し得るが、ベクター ｐＴＺ　１８Ｒ［Ｄ、Ａ、ミードら、プロティン・エンジニアリング、１巻、６ ７頁（１９８６年）参照］から効果的なりローンが誘導された。 一般に当業界で広く知られている条件下で、これらの商業的に入手可能な制限酵 素の製造業者が規定している個々の指示にしたがい、下記の実施例で一層詳細に 説明したように、好適な制限酵素でＤＮＡを処理することにより部位特異的なり ＮＡ切断を実施する。一般に緩衝液約２０μｍ中で酵素２〜１０単位によりプラ スミドまたはＤＮＡ配列約１μｇを切断する。時間および温度の両者の変化には 耐えられるが、約３７℃で約１〜２時間のインキュベーション時間が好ましい。 各インキュベーションののち、フェノール／クロロホルムで抽出することによっ てタンパク質を除去し、さらに抽出を実施し得る。エタノール沈殿によって核酸 を回収する。所望により標準的な手法を使用するポリアクリルアミドまたはアガ ロースゲル電気泳動によって、切断した断片のサイズ分離を実施し得る。 実施例２ 部位特異的切断 商業的に入手可能な制限エンドヌクレアーゼを使用して、標準的な緩衝液中でプ ラスミドおよびサーマス・アクアチカスＤＮＡの両者の部位特異的切断を実施し た。 一般に好適な制限エンドヌクレアーゼ２０〜１００単位を添加し、混合物を３７ ℃で１〜２時間インキュベートすることにより、プラスミドまたはサーマス・ア クアナカスＤＮＡ約１０μｇを緩衝液１００μｍ中で切断した。 各インキュベーションののち、タンパク質をフェノール（２Ｘ）　、ｎ−ブタノ ール（２×）で逐次抽出することによって除去し、エタノール沈殿により核酸を 回収した。 所望の暗号配列および制御配列を含んでいる好適なベクターの組立てには、通常 のライゲーションおよび制限技術を用いる。簡単に説明すると、単離したプラス ミド、ＤＮＡ配列、または合成したオリゴヌクレオチドを切断し、作り替え、所 望の形で再びライゲーションする。 実施例２で概略を説明した方法で用いる特異的なライブラリーの切断に利用する 制限エンドヌクレアーゼは、ＢａｍＨＩ、５ａｃＩ、ＫｐｎＩ　ｃ、八ｓｐ７１ ８）　、Ｐｓｔｌ、ＨｉｎｄＩＨ，およびＳｍａＩであるが、ただし池のエンド ヌクレアーゼ、または例えば５ａｕｌｌｌＡによる部分消化も使用できる。アデ ノノンメチル化のために、共通的に利用される制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉ　５ＳａｌＩ、またはＸｈｏｌは、サーマス・アクアナカスＨ８８株からのＤ ＮＡがこれらの酵素によって切断できなかったので使用しなかった。 実施例２で概略を説明した方法によって得られた５′突出部を含んだ制限断片は 、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在で、５０１１３１）リス緩衝液（ ｐＨ７、６）　［５０ＩＩＩＭ　ＮａｃＬ　１０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１，ＯｍＭ ＤＴＴおよび５０〜１００ｄデオキシヌクレオチド三リン酸含有］中、３７℃で 約１５〜３０分間のインキュベーション時間を用いて、ＤＮＡポリメラーゼＩラ ージ（クレノー断片）処理により平滑末端化し得る。クレノー断片は５′粘着末 端で作用する。３′突出部が生じたら、緑豆ヌクレアーゼで切取って修復する。 クレノーで処理したのち、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノ ールで沈殿させる。ついで好適な条件下に８１ヌクレアーゼで処理すると、任意 の１本練部分の加水分解を生じる。これらの通常の操作は任意の断片をベクター 内の部位（平滑末端）へクローニングするのに使用し得る。 実施例３ ベクター組立て ベクター組立てでは、直線化したベクターをホスファターゼ酵素（別法として別 の近似した制限エンドヌクレアーゼ）で普通に処理し、挿入ＤＮＡの存在なしで ベクターが再循環するのを防ぐ。例えばＢａｍＨＩ（５°突出部）または５ａｃ ｌ（３゛突出）ＤＮＡ　（９μｇ）の試料を、５０１１ＭトリスＭＣＩ緩衝液（ ｐＨ８，０）［１０ｍＭ　ＭｇＣ１，および６ＩＩＭメルカプトエタノール含有 １１５０ｇｌ中、Ｎａ’″の存在でウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ 、２２単位）で、３７℃、１５分間処理し、ついで５０℃で３０分間インキュベ ートして、５′または３゛突出の何れかからリン酸基を除いた。別法として１０ １１ＭトリスＨＣＩ　１５０＋＋１溶液中、細菌性アルカリホスファターゼ（Ｂ ＡＰ、１０単位）をＮａ”およびＭｇ″パの存在で使用し、６０℃で約１時間イ ンキュベートしてもよい。ついでＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを添加して２価カチオ ンをキレートし、６５℃で１５分間加熱することにより、ＣＩＡＰを変性し得る 。ＣＩＡＰまたはＢＡＰのどちらのタンパク質でも、フェノール（２Ｘ）　、ｎ −ブタノール（２Ｘ）で逐次抽出し、エタノール沈殿により核酸を抽出する。 挿入体ＤＮＡの存在または存在なしで、ベクターを再連結したときに生じる形質 転換体数を比較することにより、ホスファターゼ段階の効果を検定する。挿入体 ＤＮＡが存在すると、形質転換体が１０〜１００倍多い標準的な結果により、ベ クターＤＮＡが適正にホスファターゼ処理されたことが判る。 実施例４ ライゲーション 前記のようにして作成した直線化し、ホスファターゼ処理したベクター１〜２μ ｇを使用して３０−１００μｍ容量でライゲーションを実施した。５０ＩＩＭト リスＨＣ１緩衝液（ｐＨ８，０）［１０ｍＭＭｇＣｌ□、１ｉｌｉＥＤＴＡ、１ ｄＡＴＰ、６ＩＩＩＭメルカプトエタノール、およびＴ４リガーゼ３〜７（ワイ ス）単位含有］中で、サーマス・アクアチカスＤＮＡ　２〜４μｇを４℃または １５℃の何れかで１夜インキユベートすることにより、制限エンドヌクレアーゼ で切断し、ベクターと同一の末端を生じた。ライゲーションしたのち、ＥＤＴＡ を加えて溶液を６５℃で１５分間加熱することにより、Ｔ４リガーゼを不活性化 し、エタノール沈殿によって核酸を回収した。 ライゲーション混合物を通常の形質転換方法によってエシェリキア・コリＲＲ１ 株、ＡＫ５３株、またはＡＫ７６株（最後の株はｌｉｇ＋表現型の迅速陽性選別 に好適である）のような好適な宿主へ導入した［ハナハン、ジャーナル・オフ・ モレキュラー・バイオロジー、１６６巻、３２４３頁（１９８７年）参照コ。ア ンピシリン（または使用したプラスミドによって、テトラサイクリンまたはカナ マイシンのような他の薬剤）を含有するプレート上に植付けることにより、形質 転操体を選別した。ｊｉｇ”表現型陽性の選別にはＡＫ７６形質転換体を０．２ ％マルトース、Ｑ、　２ｍｇ／＋ｍｌ　Ｉ　ＰＴＧ　（ｌａｃプロモーターを誘 導する）　、５０　ｕｇ／Ｉ＋＋１アンビンリン（プラスミド含何細胞を選別す る）を含有するＳＯＢプＩノート（加圧前にＮａＯＨでｐＨ７，５に調節し、つ いでＩＭ　ＭｇＳＯ４２０１１１を添加した蒸留水１リノｈル中、バクト（商標 ）−トリプトン２０ｇ、バクト（商標）−酵母抽出物５ｇ５ＮａＣ１０，５ｇ、 バクト（商標）−寒天１６ｇ含有溶液を加圧滅菌して調製）上に植付け、４２℃ 〜４２．５℃で１夜増殖させた。 ライブラリーのサイズは約５０００〜２７０００クローンであった。細菌染色体 が約２０００〜４０００キロ塩基を含んでおり、平均挿入体が５〜１０ｋｂであ る全般的判定が得られれば、数組のライブラリーが重複したクローンを含んでい ることが判る。 通常の手法を用いて６組のライブラリーから混合プラスミド生産物を作成し［メ ソッズ・イン・エンジモロジー、１００巻、２４３頁（１９８３年）参照］、こ れを新たなＡＫ７６細胞へ導入した。各ライブラリーから形質転換体を６枚のＳ ＯＢプレートへ植付け（各プレートは３００００〜７００００個のクローンを接 種された）、４２℃でインキュベートした。１組のライブラリーは１プレート当 たり極めて小型のコロニー１１〜１９個を生じた。残りのライブラリーはときお り大型のコロニーを生じた。 個々のクローンを拾い、通常の技術を用いてプラスミドＤＮＡを作成し［アナリ ティカル・バイオケミストリー、１１４巻、１９３頁（１９８１年）参照］、制 限消化によって分析した。１２個の小型のコロニーはいずれもｐＴＺ１８ＲのＢ ａｍＨ１部位内に部位−ン化した２個のＢａｍＨＩ断片（それぞれ１，８および ２゜１　ｋｂ）を含む６．８ｋｂのプラスミドを生産した。ｐＤＺＩと命名した そのようなプラスミドの１つを第１図に示した。もとのライブラリー（５２００ クローン）から逆算して、すべてのｐＤＺ１プラスミドは単一のクローンに由来 したと考えられる。大型のコロニーはちとのベクターのサイズに近似したプラス ミドを含んでいた。したがってこれらの大型のコロニーは、恐らく単にアンピシ リン耐性を付与するなんらかのプラスミドを含む染色体１ｉｇｔｓ７遺伝子の復 帰変位体であろう。 プラスミドｐＤＺｌをＡＫ７６細胞へ再び形質転換し、実施例４で報告したよう にマルトース、ＩＰＴＧ、およびアンピシリンを含有するＳＯＢプレーシーで４ ２℃で選別して、再び小型のコロニーを得た。アンピシリンを含有するトリプト ン酵母寒天上に新しい形質転換体を植付けると、コロニーを生じなかった。この 結果は、プラスミド樹立中にｌａｃフロモーターを誘導することが、遺伝的欠損 を補足するサーマス・アクアチカス・リガーゼの十分量の生産に必要であること を示唆している。プラスミドがＡＫ７６細胞で樹立したら、そのようなりローン をアンピシリン含有トリプトン酵母寒天上へ画線接種し、４２℃で増殖させると 、極めて小型のコロニーが得られる。 ｐＤＺｌをＢａｍＨＩで消化し、これを再ライゲーションすると、断片が混乱す る。そのようなライゲーション混合物をＡＫ７６へ形質転換し、３７℃（即ち、 非選択条件下）で接種し、４２℃（即ち、選択条件下）で接種したものと比較す ると、非選択条件下の方が１０００倍多いコロニーを生産した。初めのｐＤＺ　 １プラスミドでは、選択条件下より非選択条件下の方が僅かに２倍だけ多いコロ ニーを生産した。この知見は、両断片の存在およびそれらをクローン化する方向 が、サーマス・アクアチカス・リガーゼの適切な発現に必要であることを強く示 唆している。 ｐＤＺｌは数ケ所の５ａｃＩおよびＳ＋ａ１部位を含んでいるが、Ｐｓｔ　Ｉ　 ％Ｋｐｎ　１またはＨｉｎｄＩ１１部位はただ１ケ所（ベクター誘導）しか含ん でいない。即ち、多数のりガーゼのクローンがＰｓｔＩ、ＫｐｎｌまたはＨｉｎ ｄＩＩＩ消化ライブラリーから単離されたであろうと予想された。しかしＢａｍ Ｈ１部分消化ライブラリーからは１個のりガーゼのクローンしか誘導されなかっ た。なぜこのことが起こるのかは明らかでないが、考えられる一つの説明として 、他のクローンは、プラスミド樹立中に十分なりガーゼタンパク質を発現するり ガーゼ遺伝子の開始点と十分に近接したｌａｃプロモーター制御要素を保有して いなかったと推測される。 上記のこの発明のサーマス・アクアチカス・リガーゼのクローニングによって、 当業者は追加的な研究により、原核、古細菌、真核、またはファージ起原の何れ であれ、任意の好熱性または熱安定リガーゼをクローン化することができるであ ろう。したがってそのようなりガーゼのクローニングはこの発明の範囲に包含さ れる。 そのようなりローニングへの追加的な研究は、例えば、（ｉ）サーマス・アクア チカスＤＮＡをｒｅｄ−λベクターへクローニングし、ＡＫ７６のようなＩｉｇ ｔｓ７株で３９℃でプラークを生成する組換えファージλの生産能についてスク リーニングする［生としてジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー、１ ３２巻、４７１頁（１９７９年）に全般的に報告されたように］、（ｉｆ）リガ ーゼ遺伝子の部分を発現するλｇｔｌｌファージの利用、ついで精製したサーマ ス・アクアチカス・リガーゼに対して発生させた抗体でスクリーニングし、陽性 のλｇｔｌＩクローンを使用して、他のプラスミドまたはファージ・ライブラリ ーへハイブリッド形成することにより、主としてサーマス・アクアチカス・ポリ メラーゼのクローニングで報告したように完全鎖長の遺伝子を同定し得る［ジャ ーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー、２６４巻、６４２７頁（１９８ ９年）参照］、（ｆｆｉ）リガーゼＤＮＡ配列に基づいて、ハイブリッド形成し 、多くの種で、他の熱安定リガーゼを暗号化した配列を同定し、検索することを 助けるプローブを作成できる。したがってサーマス・アクアチカス・リガーゼか ら少なくとも５個のアミノ酸を暗号化したＤＮＡの部分を、ＰＣＲ手法を用いて 複製し、増幅することができ、変性した形、即ち１本鎖の形をプローブとして使 用して、好熱性または熱安定リガーゼを暗号化した追加的なりＮＡを検索し得る 。別法として少なくとも５個のアミノ酸を暗号化しているオリゴヌクレオチド・ プローブを合成し、これらを使用して、好熱性または熱安定リガーゼを暗号化し た追加的なりＮＡを検索し得る。 少なくとも５個のアミノ酸を暗号化しているＤＮＡの１部の選別は、オリゴヌク レオチドがゲノム内で唯一の相補的な配列を見出すためにもつべき統計的に最小 の鎖長以上である１５個の核酸塩基を含んでいる部分に基づいている。ただしそ れよりも僅かに小さい（エシェリキア・コリにおける最小数は例えば１２個であ り、４個のアミノ酸の暗号化を許容し得る最小の部分を示している）か、または 大きい（一層高等な動物での最小数は１９個程度であり、少なくとも７個のアミ ノ酸を暗号化している部分が必要であり得ることを示している）［オリゴヌクレ オチズ：アンチセンス・インヒビターズ・オフ・ジーン・エキスプレッション、 １２巻、１３７〜１４０頁、マツクミラン・プレス社、ロンドン（１９８９年） 参照３部分が、類似の結果を得るのに使用され得る。ただし種間に対応する部分 でヌクレオチド配列間に明瞭な対合はあり得ないから、約１５個のヌクレオチド を含んでいるオリゴマーは、偽陽性をなくすのに十分な緊縮条件下でハイブリダ イゼーションを達成するための好ましい最小単位である。５個のアミノ酸を暗号 化している配列であれば、そのようなプローブ生成のために十分な情報を供給し 得るであろう。 これを例示すれば、サーマス・アクアチカス・リガーゼとエシェリキア・コリの アミノ酸配列を比較すると、アミノ酸３４−４０　（Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ）の間に統計的に許容し得る水準で同一性が見 出される。好ましい６アミノ酸配列を使用し、ＧＡ（Ｃ／Ｔ）−ＧＣ（Ｇ／Ａ／ Ｔ／Ｃ）−ＧＡ（Ｇ／Ａ）−ＴＡ（Ｃ／Ｔ）−ＧＡ（Ｃ／Ｔ）−（Ｃ／Ａ）Ｇ（ Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）−（Ｃ／Ｔ）Ｔの形の縮重プローブを上記のりガーゼの確認お よび検索に使用できた。この発明のサーモフィラス・リガーゼとエシェリキア・ コリ・リガーゼの間の配列同一性の区域は、下記の位置でアミノ酸を含んでいる 。 １９９〜２１０　１２ ２１２〜２１９　８ ６２０〜６２４　５ 総合的に、この発明のりガーゼに含まれている６７６個のアミノ酸のうちで、サ ーモフィラス・リガーゼおよびエシェリキア・コリ・リガーゼの百分率類似性は ６６％であり、百分率同一性は４７％である。 クローン化し、適切な方向をもった遺伝子からの過剰生産株の組立ては、技術上 、通常の方法を用いることにより達成され得る。そのような組立ての一般的な原 理は、遺伝子の効果的な転写および翻訳に影響を与えることができる配列を遺伝 子の開始コドンに極めて近接して配置することである。遺伝子を作動させるため 効果的に使用された多くのプロモーターシステム（リポソーム結合部位［プロシ ーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・オフ ・ザ・ＵＳＡ、７８巻、５５４３頁（１９８１年）］を含む）があり、例えばｌ ａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター［ジーン、２０巻、２３１頁（１９８２ 年）］、λファージＰＬプロモーター［ネーチャー、２９２巻、１２８頁（１９ ８１年）］、ｔａｃ融合プロモーター［プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・オフ・ザ・ＵＳＡ１８０巻、２１頁（ １９８３年）コ、およびＴ７フアージ・プロモータープロシーディングズ・オフ ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシズ・オフ・ザ・ＵＳＡ、８２ 巻、１０７４頁（１９８５年）］等がある。 プラスミドｐＤＺ１は、開始ベクターに存在するｌａｃおよびＴ７ブラスミドの 両者から下流でサーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子を含んでいる。Ｂａ１ ３１［ニュークレイツク・アシッズ・リサーチ、５巻、１４４５頁（１９７８年 ）参照］およびＥｘｏＩＩＩおよび緑豆またはＳｌヌクレアーゼ［メソッズ・イ ン・エンジモロジー、１５５巻、１５６頁（１９８７年）参照］を含み、プロモ ーターおよび遺伝子間の過剰のＤＮＡ配列を除去する幾つかの方法がある。しか しこの例の場合は、サーマス・アクアチヵス・りが−ゼ遺伝子のアミノ末端を２ つのプロモーターへさらに接近させるため、実施例Ｖで報告したようにさらに一 層簡単な方法を使用した。 実施例５ （プロモーターおよび遺伝子間からの過剰なりＮＡの除去）プラスミドｐＤＺ１ を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰＩ（Ｇ　ＣＧＣ）により不規則に線形化し、 フレノウまたは別法としてＣｖｉＪ　Ｉ（ＰｕＧ　ＣＰいにより平滑末端化した ［ｒＤＮＡ・アンド・プロティン・エンジニアリング・テクニクス」１：２９（ １９８８）参照］。 ＤＮＡをフェノール（２ｘ）、ｎ−ブタノール（２ｘ）による連続抽出により精 製し、核酸をエタノール沈澱により回収した。次いで、これらの不規則に線形化 されたプラスミドを、２つのプロモーターの下流にあるポリリンカ一部位を直接 開裂するＡｓｐ７１８により処理し、フレノウにより平滑末端化した。生成した フラグメントを低融点アガロース中での電気泳動により分離し、連続したスライ ス（完全長線形および漸進的に小さくなるＤＮＡフラグメント）を切り取り、Ｄ ＮＡを回収した。続いてＤＮＡフラグメントを平滑末端ライゲーションにより再 び環状にした。これは、１０ミリモルのＭｇＣｌ２．１ミリモルのＥＤＴＡ、１ ミリモルのＡＴＰ、６ミリモルのメルカプトエタノールおよび３〜７バイス単位 のＴ４リガーゼを含む５０ミリモルのトリスＨＣＩ（ｐＨ８，０）緩衝液１００ μｍ中４℃で一夜のインキュベーションを要した。ライゲーション後、ＥＤＴＡ を加え、Ｔリガーゼを加熱（６５℃で１５分間）により不活化し、核酸をエタノ ール沈澱により回収した。 製造されたライゲーション混合物を、慣用的技術を用いてＡＫ７６細胞へ導入し 、前述の麦芽糖、ＩＰＴＧおよびアンピシリンを含むＳＯＢプレート上４２℃で ｌｉｇ＋表現型を選択した。 先の試験結果に基づくと、プロモーターおよびテルムス・アクアティクス・リガ ーゼ遺伝子の出発点間に欠失を含むプラスミドは、これらの条件下で生存能力を 付与することが予想される。ベクター（プロモーター領域）またはりガーゼ遺伝 子の本質的部分を欠失すると、当然生存能力は付与されない。従って、個々のク ローンを抜粋し、慣用的方法［「アナリティカル・バイオケミストリー」、１１ ４：１９３（１９８１）参照］を用いてプラスミドＤＮＡを製造し、制限消化に より分析した。この試験結果から、プラスミドｐＤＺ２、ｐＤＺ３、ｐＤＺ６お よびｐＤＺ７は、１．８ｋｂのＢａＩＩＩＨＩフラグメントを欠き、代わりに各 々１．３．１．４．１．２または１．２ｋｂのフラグメントを含むことが見出さ れた。これらのプラスミドは全て、適切な平滑末端充填およびライゲーションか ら予想される通りＡｓｐ７１８部位を再作製した。慣用的技術［「ヌクレイツク ・アシッズ・リサーチ」、１３：１１０３（１９８５）、および「プロティン・ エンジニアリング」、１：６４（１９８６）参照］を用いてこれらのプラスミド から１本鎖ＤＮＡを製造し、普遍的「リバースプライマー」オリゴヌクレオチド ５’ｄ（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ）３’およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ［「プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステープ・オフ・アメリ カ」、８４：４７６７（１９８７）参照］を用いてこれらの配列決定をした。 ＤＮＡ配列の分析結果は２つのＡＴＧ開始コドンを示しており、第１の転写解読 枠は長さ３コドンであり、第２のりガーゼＤＮＡ配列は長い解読枠を与えている 。第１図と結びつけると、プラスミドｐＤＺ６およびｐＤＺ７に由来するこの配 列（部分的リガーゼＤＮＡ配列を含む）は次の通りである。 −Ｍ　シじ工　瓦］■ ＣＭゴＡスχｍ ｔｈａｎｒｏｐＭｌｉｃ　ｌｉｇａｓｅｆｆ；　ＡＣＣＣ１℃ＣＭ　Ｃ１；＜　 （ｆｆ；　Ａｆｆ；　ＡＡＧαｉ　ＧＩＡ　ＮＣｍ　’ＩＴＡ　（Ｉ；Ｇ　ｃ、 ｈ℃ｃｃｍαＣ’ＩＸ：：（Ｘ：：ＡＡＣ’ＩＸ：：αＣＩＸ：　、＋ＩＸ：Ｈ Ｇ１℃ＣＴＧ（ｆｆＣ＆α℃ｃ；＜　ｚ　’ｒｃｅ　ｃ；＜α：ｌＣＧｌ＜Ｔｆ 　（ＥＫαｉ　ｃｍ’　ｅｒｒ　ｑ　ｚ　Ｃ１℃ＭＧ％　ＣＩｍｒ　Ｇｉｎ　Ｃ ＆α℃−℃α℃ＧＣσＣＡＡＡ　ＡＧＣαＤＧＩＣ’Ｉｍ（ＩｎＡＣＣＣＩＴ　 ＣＡＧ　ＧｒＧαＤ　ＧＯ：、　Ａｃｔα：’ｒ　’ｔｗｃｘαＥ　ＡＯ：　’ １１’［α℃α℃ＣＭ　ＣＧＣＣＡＣＣＯ：：　ＡＣＣＱＺ　Ａｌ　’ＩＡＣＴ ＣＣ％　Ｃ＆　ＡＡＣαＩ：　ＴＩＴ　ＡＡＣＣＩＴ　ＧＡＣＧＫ；Ｃｍ℃ＡＡ Ｇ　α℃’ｒｒｒ　ｚ　ｃ；＜αＥＡＴＡＧ！Ｑ（Ｉ６α℃０ぢαＤ　ＣＧＧ　 ＡＡＧ　（ｆｆ　ＣＣＣＴＫ：　ＧＯ：　！　ＡＣＣＧｒＧ　％　ＣＸＩ：　Ａ ＡＧ　２　Ｇ！ＩＣα：２１；　ＣＴｒ　ＴＣＣＱチＡ７１１ＣＣ１℃’Ｉ！　 ’ＩＸ：　Ｃ＆ＣＭαｂｃｘ　Ｃ１℃Ｑ℃ｘα逼α℃Ｎ℃α：Ｘ：　ＧＧＧＧｆ αＤＧＡＧσＩＧ（ｍＧｌ（％σ［１’ＣＡｆｆ：　ＣＡＧＭＣＣｒＣｍＡＣＣ Ａ！　ＱＩ：ｆｆＡｌｕ　ＣＣＧＡＣＧＡＧＧ　ＣＴＣＡＡＧＣｍＧＩＧα刀Ｇ ６α℃ａ℃％σ［０ＣＧ：、ＧｆＤ（％ＧＩＣ’ＩＸ：Ａｌα工：　ＡＴＡ　ｚ αｎ　’ＩＴＣ（？１℃α美口１℃ＡＡＣＧＩＩＩＧ　Ｇ？６　Ｃ’ＩＩＧ　ｆ ：％　（＆　ＣＧＧ　Ｃｍ　Ｃ＆　ＡＧＧにｃ　’ｔ”ｃＡＡＡＡＡＣα７Ｎ石 Ｎ四α刀０工！χ℃苅πＩ：　ＴｒＡ　、７１ｉｆ１４　（フＡＭＡ　ＧＡＣＣ ＣＣｎ　ＡＴＣＡＯＩ：　（ｍ　ＡＡＧ　Ｏｆ　（ｍ　Ｃ１℃ＫＧＧＣＣＡＣＣ ＴＴＣ’ＩＸ：　ＧＣＣ’ＩＴＡα逼０丁α℃０℃ｃｘｚ　σあｍｘＧＡＡｃｗ 　ω℃Ｇ）Ｓ　ＡＯ：　ＣＡＧ　Ｔｒｒ　ＧＣＣＣ１℃０℃ＣＡＣ’Ｉ１ｍ　Ｃ ｍ℃ＡＡＧｃｗＭＡｍｒｃαＩ：　ＧｒＧ（＆　ＣＡＣα℃χα℃α工置ズ℃σ Ｓα石α℃Ｇ色αηω℃（＆α℃σ℃πｃＣＸ；ＧＡＣπ石σ℃ＭＧＭＧα処α 追α刀口丁αＩＴＩＴＧＡＧα］りＣαｂｃｚｃｚｃ；ｚＭＧｃｚＧＡＣｃ；＜ σ［Ｔ　ＧＣＣＣＴＩ’π刀α追ＧＡＧｃｒＣα℃πＣに℃α℃α℃α℃α℃α 工ビロ℃α℃に℃ＧＣＣχＡＡＧｆｆα℃α工Ｇｌ＋４　（、＜　、％　（＄　 ＡＣＣα追σコア℃χＧｒＧｃｘ　ＴｒｃＣＡＧ　ｃｘ　ｃｗ　ｃｅｃ　ＡＯ： 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Ｃ’ｘα石ａ℃ａ℃％α℃α追に℃αＤ　ＡＡＧ　ＡＡＧＧＣＧ　Ｇ１６　（＆ 　Ｃ１℃ｚ　’ｍｘ本発明の熱安定リガーゼの核酸配列は下記アミノ酸配列に対 応する。 Ｆ’ｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＡｓｐＡｓｎ　′Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＶａｌＴｙｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａ ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉａｕａｌ この転写解読枠（耐熱性リガーゼ）の最初の６０アミノ酸の翻訳は、エシェリヒ ア・コリ・リガーゼに対して５０％を越える相同性を示すことから（「モレキュ ラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ什ンクスＪ、２０４：１（１９８６）参照 ）、この長い転写解読枠はテルムス・アクアティクス遺伝子の開始を表すことが 示唆される。ＢａｍＨＩフラグメントによる遺伝子結果から、このリガーゼのサ イズは４００ないし１１００アミノ酸長であるという結論に到達し得る。精製蛋 白質は、約７９０００の分子量を有することが報告されており［「ジャーナル・ オフ・）くイオロジカル・ケミストリー」、２５９：１００４１（１９８４）参 照］、これは本発明において見出された遺伝子結果の限界内に含まれる。クロー ンｐＤＺ７が機能的テルムス・アクアティクス・リガーゼを生産しくすなわち、 それが遺伝子を完全な状態でコードする）、アミノ末端のＤＮＡ配列が与えられ ると、文献に記載された手動的またはオートメーション化された方法を用いて［ 例えば、「プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サ イエンシーズ」、８４：４７６７（１９８７）、ｒプロシーディンゲス・オフ・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシーズ」、８６　：４０７６（１ ９８９）、「サイエンス」、２３９：４８７（１９８７）、「ネイチャー」、３ ２１：６７４（１９８６）、「ノくイオテクニクスＪ、８：１８４（１９９０） 、ｒプロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエン シーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オフ・アメリカ」、８５：５６１ ０（１９８８）、および「プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オフ・アメ リカ」、８５：９４３６（１９８８）参照］、遺伝子の全ＤＮＡ配列が決定され た。 バイオテクノロジー研究における熟練者であれば誰でも知っている方法を用Ｌ％ て、プラスミドｐＤＺ２、ｐＤＺ３、ｐＤＺ６またはｐＤＺ７を使用することに より、さらに別の過剰生産性ベクターが構築され得る。この場合、上記のプロモ ーターおよびリポソーム結合部位の使用が含まれ得る。例えば、プラスミドｐＤ Ｚ７（第１図参照）では、その特有のＡｓｐ７１８部位が線形化され得、テルム ス・アクアティクス・リガーゼ遺伝子の正面の過剰ヌクレオチドは、上記のＢａ １３１またはＥｘｏＩＩＩおよびムング・ビーンの組み合わせまたはＳ１ヌクレ アーゼの使用によりＡＴＧ開始コドン近くでトリミングされ得る。次いで、これ は、同様の方法で生成された天然機能付与性配列（プロモーターおよび翻訳開始 配列）へ、またはこの目的のために製造された合成機能付与性配列により平滑末 端ライゲーションされ得る。さらに、テルムス・アクアティクス遺伝子に対して 外部または内部にある配列を修飾することにより、転写または翻訳を阻止し得る 潜在的ＲＮＡ構造が除去され得る。これらの方法は、可溶性エシェリヒア・コリ 蛋白質の３０％を越える割合にまで耐熱性制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩの過 剰生産に作用することが先に報告されている［「ジーン」、６５：１６６（１９ ８８）参照］。別法として、合成オリゴヌクレオチドは、テルムス・アクアティ クス・リガーゼ遺伝子の開始点が、ＰＣＲ方法を用いて機能付与性配列へ直接融 合される形で合成され得る［例えば、「バイオテクニクス」、８：１７８（１９ ９０）、「ジーン」、７７：５１（１９８９）、および「ヌクレイツク・アシッ ズ・リサーチ」、１７：７２３（１９８９）参照コ。 先行配列から、アミノ酸残基３１−３３をコードするヌクレオチドに対応するＢ ｇｌ　ＩＩ部位の存在することが判る。この情報により、最適なシャイン−ダル ガノ配列を伴う強力なプロモーターは、ＰＣＲを用いてこの遺伝子の正面に挿入 され得る。２つの小さな注意点、（１）全遺伝子（３ｋｂ、高いＧＣ含有率）を ＰＣＲコピーする試みは必ずしも成功するわけではなかったこと、および（２） プラスミドｐＤＺ７は、リガーゼ遺伝子内に一つずつ、２つのＢａｍＨＩおよび Ｂｇｌｌｒ部位を有していたことを考慮する必要がある。 プラスミドｐＤＺ７をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩにより部分消化し、正確なサ イズの小さい方の線形フラグメントを電気泳動により完全長線形フラグメントか ら分離し、切り取り、前記と同様に精製した。ＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌＮは同 じオーバーハング（５’ＧＡＴＣ）を製造するため、線形フラグメントはＴ４リ ガーゼにより再び環状にされ、形質転換によりエシェリヒア・コリ株ＡＫ５３へ 導入され得た。幾つかのクローンでは０．５ｋｂのＢａｍＨＩ　／　ＢｇｌＩＩ フラグメントを欠失した結果、５．７ｋｂのプラスミドが生成され、その−クロ ーンはｐＤＺ１２と命名された。合成オリゴヌクレオチド＃６６、＃７８、＃８ ５および＃９４を合成し、ＰＣＲを用いて、リガーゼ遺伝子の出発点に対しｐｈ ｏ　Ａプロモーター［プラスミドｐＦＢＴ６４から、「ジーン」、５６：１３（ １９８７）参照］およびリポソーム結合性配列を融合させた［「バイオテクニク ス」、８：１７８（１９９０）、「ジーン」、７７：５１（１９８９）、「ジー ン」、７７：６１（１９８９）、および「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチＪ 、１７：７２３（１９８９）参照］。これらのクローンは図９に描かれており、 次の通りである。 ＃６６　１９量体；ＰｖｕＩＩ部位〜Ｔ７プロモーターないしｐｈｏＡプロモー ター、プラスミドｐＦＢ７６４の上部鎖（Ｔａｑｌエンドヌクレアーゼ遺伝子の 指示）＝５’　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　ＡＡＴ　ＴＡＡ　Ｔ　３’＃ ７８　３２量体：テルムス・リガーゼ遺伝子の出発点に相補的な５′末端、ｐｈ ｏＡプロモーターのシャイン−ダルガノ側に相補的な３′末端、プラスミドｐＦ ＢＴ６４の上部鎖： ５゛ω＾ＧＧＧ　ＴＣＡ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＣＣＡＴ　ＧＴＡ　Ｃ ＡＡ　ＡＴ　３’＃８５　３３量体：ｐｈｏＡプロモーターのシャイン−ダルガ ノ側に相補的な５゛末端、テルムス・リガーゼ遺伝子の出発点に相補的な３゛末 端、プラスミドｐＤＺ７の上部鎖（リガーゼ遺伝子の指示）： ５°ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＡＡ 　ＧＡＧ　ＧＣＧ　３’＃９４　１８量体；リガーゼ遺伝子のアミノ酸残基４０ 〜３５の非翻訳鎖に対応するプラスミドｐＤＺ７の上部鎖、アミノ酸残基３３〜 ３１にあるＢｇｌＩＩ部位の下流： ５’　ＡＡＧ　ＣＣＧ　ＧＴＣＧＴＡ　ＣＴＣＧＧＣ３’簡単に述べると、これ は、単一反応管中、４００ｎｇのプライマー＃６６および＃７８を、１００μｌ のＰＣＲ緩衝液中ｄＡＴＰ、ｃＣＴＰ、ｃＧＴＰおよびｄＴＴＰを各々５０マイ クロモル、および２．５単位のＡ＋ｐｌｉｔａｑを含む２００ｎｇのＰｓｔ１／ ＰｖｕＩＩ消化ｐＦＢＴ６４に加え、製造者（シータス、エモリービル、カリフ ォルニア）のプロトコールに従い９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３ 分間１サイクル当たり３秒伸ばしなから２５サイクル循環させることにより行な われた。第２の反応管は、同じ反応緩衝液および酵素中、４００ｎｇのプライマ ー＃８５および＃９４．２００ｎｇのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＤＺ７を含 んでおり、これを上記と同様にインキュベーションした。これらの反応の生成物 は、ゲル電気泳動で分析された通り正確な長さであることが示された。第３の反 応管は、各生成物から２μｍ１同じ反応緩衝液および酵素中４００ｎｇのプライ マー＃６６および＃９４を含んでおり、これを上記と同様にインキュベーション した。２生成物間の重複部分が組み合わせた長さの融合生成物のＰＣＲ合成を可 能にするようにプライマーを設計した。生成したフラグメントをフェノール、ｎ −ブタノールおよびエタノールで抽出し、沈澱によりＴａｑポリメラーゼを除去 した。ＰＣＲフラグメント生成物を、上記と同様ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで 処理し、低融点アガロース中で電気泳動させ、精製した。同時に、ｐＤＺ１２か らの２．７ｋｂＰｓｔ　Ｉ　−ＢｇＩＩＩリガーゼ遺伝子含有フラグメントおよ びｐＦＢＴ６４からの２．４ｋｂＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　β〜ラクタマーゼ 遺伝子および開始点含有フラグメントを精製した。３フラグメントを全て３方向 ライゲーシヨンで合わせ、形質転換によりエシェリヒア・コリ株ＡＫ５３へ導入 した。幾つかのクローンは、ｐｈｏＡプロモーター制御下でリガーゼを過剰生産 する５、５ｋｂプラスミドを含んでいた。それらのうちの−プラスミドをｐＤＺ １３と命名した。 可溶性エシェリヒア・コリ蛋白質の３０％を越える割合に達する耐熱性制限エン ドヌクレアーゼＴａｑｌの過剰生産において報告された試験では「「ジーン」、 ６５：１６６（１９８８）参照コ、β−ラクタマーゼ遺伝子を逆にすることによ り、ｐｈＯＡプロモーターとは反対方向で転写が行なわれる場合、エンドヌクレ アーゼ収率は幾分優れていることが認められた。本発明に従いリガーゼ遺伝子を 伴う類似構造を作製するため、プラスミドｐＦＢＬＴ６９（逆配向でβ−ラクタ マーゼを含む）からの２．３ｋｂＰｓｔ　Ｉ−ＰｖｕＩＩフラグメントを、プラ スミドｐＤＺ１３の３．２ｋｂＰｓｔ　Ｉ−ＰｖｕＩＩリガーゼ遺伝子含有フラ グメントにライゲージコンした。このライゲーション混合物をエシェリヒア・コ リ株ＡＫ５３へ形質転換し、幾つかの形質転換体を制限消化物により分析すると 、β−ラクタマーゼ遺伝子の配向が確認された。それらのうちの−クローンをｐ ＤＺ１５と命名した。ｐＤＺ１５におけるリガーゼの生産性は、ｐＤＺ１３と比 べて少しも優れていない場合でも、同程度には良好である。リガーゼ酵素はプロ テアーゼに対して幾分感受性を示すと思われるため、誘導後細胞を９時間だけ生 長させるべきである。リガーゼ遺伝子の蛋白質加水分解生成物はまだ熱安定性リ ガーゼ活性を有し得る（これはＴａｑポリメラーゼに関して立証された）。 耐熱性蛋白質は、実質的に修飾され、依然として本発明での使用に充分な活性を 保持し得る。例えば、Ｔａｑポリメラーゼのアミノ末端における暗号化配列の約 ３分の１の欠失により、ポリメラーゼ活性で活性を示す遺伝子産物が生成される ことが示された［「ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリーＪ、２６ ４：６４２７（１９８９）参照］。別法として、アミノ酸をアミノ末端（＋７） 、カルボキシ末端（＋３８）または内部のある位置（＋２から＋３４まで）に付 加した場合、別の耐熱性蛋白質、制限エンドヌクレアーゼＴａｑｌは、本質的に 充分な活性を保持することが示された［「ジーン去６５：１６６（１９８８）参 照コ。すなわち、動性を破壊することなく行なわれ得る。さらに、これらの配列 をコードするＤＮＡの利用可能性により、コドン配列を修飾して同じくリガーゼ 活性を有する突然変異蛋白質形態を生成させる機会が提供される。それらの置換 または他の改変の結果、本発明の範囲内に含まれるＤＮＡによりコードされるア ミノ酸配列を有する新規蛋白質が生成される。 また、他のライゲーション蛋白質は、これらの実施例で立証されている通り本発 明方法により分離され得る。異なるセルラインは、本発明の製造法で使用される テルムス・アクアティクスＨ８８株から分離されたものとは異なる物理特性を有 するリガーゼを製造するものと予想され得る。さらに、酵素またはその前駆体が 遺伝子的多形性または細胞仲介による修飾を呈することから変形が存在し得る。 さらに、そうして分離されたりガーゼのアミノ酸配列は、遺伝子技術により修飾 され、改変された生物活性および特性を有するリガーゼを製造し得る。次いで、 生成したＤＮＡ配列は、テルムス・アクアティクスＨＢ８リガーゼと実質的に同 じアミノ酸配列を有するが、それより高または低レベルの活性を呈する蛋白質を コードし得る可能性がある。それらのライゲーション蛋白質もまた当然本発明の 範囲内に含まれるものと考えるべきである。 実施例６ （リガーゼ酵素の精製） プラスミドｐＤＺ６およびｐＧｌ）１−２（ラムダＰＬプロモーターの後ろにＴ ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含み、温度感受性ラムダ・レブレッザーＣＩ　５ ８７の制御下にある）［「プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オフ・アメ リカ」、８２：１．０７４（１９８５）およびアメリカ合衆国特許４７９５６９ ９参照］を含むエシェリヒア・コリ細胞ＡＫ５３を、両プラスミドの持続を確実 にするため５０ｇｇ／１１のアンピシリンおよび５０ｇｇ／ｍｌのカナマイシン を含むＴＹプレートにおいて３２℃で一夜生長させた。新鮮なコロニーを、ｐＨ ７，６で６ｇのＮａＣ１，２５ｇのバクト（商標）トリプトン、７．５ｇの酵母 抽出物、１ｇのグルコース、１．６ｇのカゼインアミノ酸加水分解物、５０ｇｇ ／ｍｌのカナマイシンおよび５０ｇｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ミリモル のトリスＨＣＩ緩衝液１リットルに再懸濁し、２ＱＱｒｐｍで振動している２リ ツトルのフラスコ中３２℃で生長させた。Ｏ，Ｄ、　（光学密度）６．。が０． ８ないし１．０間に到達すると、細胞を３０〜４０分間４２℃にシフトすること により、Ｔ７ポリメラーゼの合成を誘導した。メタノールに溶かした２０ａ＋ｇ ／ｍｌのリファンピシン５ｍｌを加えて最終濃度を１００μｇ／ａ＋１にするこ とにより、エシェリヒア・コリ蛋白質のそれ以上の合成を阻止した。これらの条 件下では、Ｔ７プロモーターの後ろの遺伝子のみが当然転写され、従って翻訳さ れる。細胞を４２℃でさらに５時間インキュベージタンした。 別法として、プラスミドｐＤ　Ｚ　１５　（ｐｈｏＡプロモーター制御下にある リガーゼ）を含むエシェリヒア・コリ細胞ＡＫ５３を、５０ｇｇ／ｍｌのアンピ シリンを含有するＴＹプレートにおいて３７℃で一夜生長させた。新鮮なコロニ ーを、５０ｇｇ／ｍｌのアンビンリンを含む強化ブロス５Ｑｍｌに再懸濁し、Ｇ ７６ベンチトツプシエーカー中２０Ｏｒｐｍで振動している５００ｓｌのフラス コにおいて３７℃で生長させた。Ｏ，Ｄ、ｓｏｏが０．６５ないし０，８５に達 すると、２０ｍ１を０．２ミリモルＫ　２　ＨＰ　Ｏ４含有ＭＯＰＳ培地［「ジ ャーナル・オフ・バクテリオロジー」、１１９・７３６（１９７４）参照］１リ ットル中へ希釈することにより、ｐｈｏＡプロモーターを誘導した。細胞を、さ らに９時間Ｇ２５フロアシエーカー中２０　Ｑ　ｒｐ＋ｍで振動している２リツ トルのフラスコにおいて３７℃で生長させた。 インキュベーション後、細胞を水中で冷やし、遠心分離（５０００ｒｐｍで１５ 分間）により採取し、２０ｍ１の水に再懸濁し、３５＋１の遠心分離管に移し、 再遠心分離（７０００ｒｐｍで６分間）し、蛋白質分離の準備ができるまで沈澱 物を凍結させた。解凍後、沈澱物を、１０ミリモルの２−メルカプトエタノール および０゜１５ミリモルのＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ（ｐＨ７，６で１ミリモルの ＥＤＴＡを含む２０ミリモルのトリスＨＣＩ緩衝液）２０ｍｌに再懸濁した。音 波処理（４℃５０％パワーで５×１分間）後、溶液を３９０００　Ｘｇで６０分 間の遠心分離にかけた。 ９２５００ダルトンの分子量と定められたホスホリラーゼＢ標準と比較すると、 この酵素は７５０００〜８５０００ダルトンの推定分子量を有していた。 別法として、ｐＤＺ１５誘導細胞２リットルを、上記と同様に採取し、音波処理 し、屑を遠心分離により一掃した。 上清（４０１１１）を３００ミリモルのＫＣＩに加え、５ｍ１ＤＥＡＥセフアセ ル・カラムに通し、０．３モルＫＣＩ含有緩衝液Ａ７０ｉ１を用いて外来ＤＮＡ を除去した。 リガーゼ含有フロースルー・フラクションを合わせ、６５℃で２０分間処理する ことにより、エンドまたはエキソヌクレアーゼを含む多くのエシェリヒア・コリ 酵素の不可逆的熱変性を誘発した。次いで、変性した蛋白質を１５分間３９００ ０Ｘｇの遠心分離により除去し、室温で３０分間等容量の飽和（ＮＨ，）２ＳＯ ，を加えることによりリガーゼ酵素を上清から沈澱させた。臨床用遠心機中８０ ００ｒｐＩでの遠心分離により硫酸アンモニウム沈澱物を回収し、４ｍｌの蒸留 水に再懸濁した。試料を緩衝液Ａ、次いで５０ミリモルＫＣＩ含有緩衝液八に対 して透析した。透析された蛋白質溶液を、５０ミリモルＫＣＩ含有緩衝液Ａで平 衡状態にした４Ｑｍｌホスホセルロース・カラムに適用した。同緩衝液８０ｒｌ ｌにより洗浄後、緩衝液Ａ巾ＫＣＩ（０，０５−０，５モ刀、）の１２０＋ｍｌ −次勾配によりカラムを溶離した。酵素は、０２５〜０４３５モルのＫ　Ｃ１か らより鋭いピークとして溶離した。この蛋白質は、見かけ上の分子量約８１００ ０（アデニル化形態）および７８ｏｏｏｃ非アデニル化形態）の２つの帯とし、 で移動し、５ＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのモニターによる と純度約９８−９９％である。６５℃で３０分間ＮＡＤ不含有（非アデニル化形 態が生じる）のニックさけ精液ＤＮＡ２５ｕｇを含むリガーゼ緩衝液１、または １０ミリモルのＮＡＤを含む（アデニル化形態が生じる）リガーゼ緩衝液中１５ ０１１ｇの蛋白質をインキコベーションすることにより、これら２形態は互いに 変換され得る。１ミリモルのＥＤＴＡ、２ミリモルのジチオトレイトール（ＤＴ Ｔ）および２００μｇ、’＋１の牛血清アルブミン（フラクション５）を含む１ ００％グリセリン中２０ミリモルのトリスＨＣＩ（ｐＨ８，０）等容量を加え（ 最終グリセリン濃度は５０％である）、酵素を一７０℃または一２０℃で貯蔵し た。２リツトルの細胞から、１マイクロリツトル当たり６２５ニツク・クロージ ング単位で、１６■１の貯蔵緩衝液中６ｍｇのりガーゼの最終収量が得られた。 これは、合計１０００００００単位の酵素、および１６６６６６７単位／■ｇの 比活性に対応する。 耐熱性蛋白質は、それらの中温性対応物質よりも疎水性が幾分高くなる傾向を示 すことが知られているため、非イオン性デタージエントまたは他の安定剤の添加 は、長期貯蔵に有用であり得る。従って、貯蔵緩衝液は、追加成分、例えばグリ セリン（５０％）、しょ糖（２５％）、プロテアーゼ阻害剤（０，５−１，０ミ リモルのＰＭＳＦ、１０−７モルのペプスタチンＡ）、塩（ＫＣＩ好ましくは１ ００−５００ミリモル）、ＥＤＴＡ（０，１−１，０ミリモル）、牛血清アルブ ミン（１００−５００μ／１１１）、ゼラチン、ジチオトレイトール（１−１０ ミリモル）およびメルカプトエタノール（１−１０ミリモル）を含み得る。さら に、貯蔵緩衝液は少なくとも１種の非イオン性ポリマー性デタージエントを含む のが好ましい。それらのデタージェントを一部列挙した場合、エトキシル化脂肪 族アルコールエーテルおよびラウリルエーテル類、エトキシル化アルキルフェノ ール類、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、さらに特定すればトリ トンＸ−１００、ＮＰ−４０およびトウィーン２０がＯ，Ｊ、−０，５％容量／ 容量で含まれる。 リガーゼ活性について検定するためには、基質の溶融温度（Ｔｍ）により歪曲さ れない方法を使用することが重要である。例えば、４塩基突出末端ライゲーシヨ ンは、Ｔ４リガーゼに最適な温度（３７℃である）よりもかなり低く、確実には 耐熱性リガーゼの最適温度よりも下の低温、例えば４℃で最も有効である。一貫 性を示すべき一検定方法は、環状プラスミドがデオキシリボヌクレアーゼＩによ り幾つかの箇所で不規則にニックされるニック−クロージング検定である。リガ ーゼがこれらの全ニックを閉じ、共有結合的閉環状ＤＮＡを生成させる能力は、 臭化エチジウム含有アガロースゲル中での電気泳動によって開環状ＤＮＡからニ ック環状を分離することにより検定され得る。例えば、プラスミドｐＵＣ４ＫＩ ＸＸの共有結合的閉環状形態［「ジーン」、３７：１１１（１９８５）参照］は 、同緩衝液中１５０Ｖで１．５時間実施された、０．２モルのグリシンＮａＯＨ ，ｐＨ８，５，０，１ミリモルのＥＤＴＡおよび１ｇｇ／ａ＋１の臭化エチジウ ムを含む１％アガロースゲル電気泳動において線形態よりも迅速に、モしてニッ ク形態よりもかなり迅速に移動する。 実施例７ （好熱性リガーゼ分析） ニックをもつｐＵｃ４“ＫＩＸＸ　ＤＮＡを、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭＥ ＤＴＡおよび６ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリスＨＣＩ　ｐＨ８ ，０緩衝液５０μｌ中ＤＮＡ５μｇに希釈直後の１μｍ／ｍｌ　ＤＮアーゼ３μ ｍを加えて製造した。混合物を室温で５分間インキュベートし、ＤＮアーゼは６ ５℃１０分間の熱で失活させ、試料を使用するまで一２０℃で凍結し保管した。 それらの条件下、ＤＮＡの約９０％は、ニックをもつ環状であり、約５％は直線 状および５％は共有結合で閉じた環状であった。 上記で製造した好熱性リガーゼを、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１ ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮＡＤ、１０ｍＭジチオスレイトールを含む２０ｍ ＭトリスＨＣｌｐＨ７，６緩衝液２０μｌ中に入れたニックをもつｐＵＣ４ＫＩ ＸＸＯ３５μｇにリガーゼの段階希釈を加え、鉱油１滴で液面を覆い、６５℃１ ５分間インキュベートして分析した。対照として、Ｔ４リガーゼを１０ｍＭ　Ｍ ｇＣ１□、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＡＴＰ、６ｍＭメルカプトエタノールを 含む５０ｍＭトリスＨＣＩ　ｐＨ８，０緩衝液０．５μｇにリガーゼの段階希釈 を加え、３７℃１５分間インキュベートして分析した。 反応を０．２Ｍ　ＥＤＴＡ、５０％グリセリン、１％ＳＤＳおよび０．１％ブロ ムフェノールブルーを含む４μｍ終止緩衝液を加えて終結させ、生成物を上記の ゲル電気泳動法により分析した。 リガーゼの１ニツククロージングユニツトを、緩衝液および時間についての上記 の実施例の記載の条件下でニックをもつｐＵｃ４ＫＩＸＸ　ＤＮＡ０．５μｇを 環化するが別のりガーゼの添加がさらにＤＮＡを環化しないリガーゼの量と定義 する。 最縮小製造法として、プラスミドｐＤ　Ｚ　１５　（ｐｈｏＡプロモーター制御 下、とあるリガーゼ）を含むエシェリキア・コリ細胞ＡＫ５３を５０μｇ／ｍ＋ でアンピシリンを含むＴＹプレシー上で一夜３７℃で発育させた。新鮮なコロニ ーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む強化ブイヨン５ｍ、ｌ中に懸濁し、成育 させた。ＯｌＤ、５５０が０．６５〜０．８５に達したとき、０．１２ｍ１を０ 　、２　ｒｎ　Ｍ　Ｋ　ｘ　ＨＰ　Ｏａを含むＭＯＰＳ培地５ｒｎｌ中に希釈し 、ｐｈｏＡプロモーターを誘発した。細胞を一夜３７℃でインキュベートした（ インキュベーション延長後に起こる蛋白分解に注意し、誘発された細胞が成育し 過ぎないようにする）。細胞を１．５ｍｌ超遠心分離管中に採取し、１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡおよび１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭトリスＨＣＩ　 ｐＨ７，６緩衝液領３ｍｌ中で懸濁し、２Ｘ１０秒音波処理した。遠心分離（１ ２０００ｒｐｍ／分）により破片を除去した後、上清を６５℃２０分間処理し、 エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを含む複数のエシェリキア・コリ 酵素を非可逆的に熱変性した。熱変性残分を遠心分離により除去し、上清を上記 と同様に分析した。上清１ｍｌは約６２５ニツククロージングユニツトの活性を 含有した。 上記の実施例に記載のＴ、アクアティクスリガーゼ製品および市販品のＴ４リガ ーゼは約１２５ニツククロージングユニツト／ｍｌを含むことを示した。従って 、本発明の製造法は、Ｔ、アクアティクスを過剰に製造するエシェリキア・コＩ Ｊ１１から、約１０００００　（８００Ｘ１２５）ニッククロージングユニット の酵素を精製した。 上記により製造された好熱性リガーゼは、ＤＮＡを増幅すると共にＤＮＡ配列中 単一塩基置換を識別する分析法として特に有効である多（の有益な性質を有する 。それらに使用される本リガーゼの唯−最も重要な性質は、リガーゼが熱変性／ 再生サイクルを反復する間活性を維持するので、リガーゼを繰返し添加する必要 がなくＤＮＡ増幅をもたらすということである。さらに、本発明のりガーゼはＴ ｍ温度６５℃でまたはその付近で複合ゲノムにおいて独自性を確かにするのに十 分な長さのオリゴヌクレオチドを連結し、また正確に相補的なオリゴヌクレオチ ド配列と単一塩基ミスマツチオリゴヌクレオチド配列を正確に識別する。 リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）と称する好熱性リガーゼＤＮＡ配列のクローニング の結果として発展した２つの製造のより簡便な方法において、２種のオリゴヌク レオチドプローブを１方の３°末端が他方の５′末端にすぐに隣接するように熱 変性ＤＮＡにハイブリダイズする。各々がヒトゲノム中その独特な位置に選択的 にハイブリダイズするように十分に長いオリゴヌクレオチドが選択される。好熱 性リガーゼは、連結のヌクレオチドが標的に対して完全に相補的であるならばつ いで２種のオリゴヌクレオチド間で共有結合のリン酸二エステル結合を形成する 。 ニッククロージング反応の特異性は、それらの標的の２種のオリゴヌクレオチド のＴｍまたはその付近で連結することにより著しく増大する。即ち、連結点での 単一塩基ミスマツチが不完全な二重らせんを形成するだけでなく、比較的高い温 度でのハイブリッドを不安定にする。従って、好熱性リガーゼは、正確な塩基対 を作ったオリゴヌクレオチドを有効に連結し、不完全マツチ配列の存在下でほぼ ０のバックグランド連結を与える。ＬＤＲを使用すると、連結反応で得られた化 合物の量は反復される熱サイクルにより直線的に増加し得る。 本発明の好熱性リガーゼ連鎖反応において、両端は共にハイブリダイゼーション の標的として役立つ。反射鏡に相補的な２種のオリゴヌクオチドを更に使用する と、１サイクルの連結生成物は、第２図において一般的に示されるように連結の 次ぎのサイクルの標的となる。各隣接オリゴヌクレオチド対において、特徴的な ヌクレオチドは連結点の３′末端側にある。従って、相補的なオリゴヌクオチド が異常な標的独立連結をすることはＴｍ付近の温度の使用、および単一塩基３′ 突出部の有利なまたは乏しい連結効果を利用することにより回避される。連結鎖 反応をすると、熱サイクルの反復により生成物を指数的に増加し得る。 好熱性リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）の能力を試験するために、ヒトβグロビンを コード化する遺伝子を初期モデル系として選択し、本発明の技術を試験した。 従来の研究から、正常β８対立遺伝子と鎌状β５遺伝子はβグロビン遺伝子の６ 番目のコドンにおいて２番目のヌクレオチド１個がＡ→Ｔに塩基転換し、第１表 に記載のヘモグロビリンβ鎖中グルタミン酸残基がバリンへ変化した点で異なる ことが明らかにされている。 下記の第１表のつづきにおいて、それらの慣用される５′→３°配向で上記の部 分に掲げるオリゴヌクレオチドの配列を示す。 配列　配列　大きさ ７ｍ １０１　ＧＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡ　２３　６６１０２ Ｇ″ｍ　ＣＡＴＧ　ＧＴＧ　ＣＡＣＣＴＧ　ＡＣＴ　ＣＣＴ　ＧＴ　２５　６６ １０３　ＧＴｒｒＩＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧ　２７　６ ４１０４　ＣＴＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴ　２４　６８１ ０５　ＣＴｒｒＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡ　２６　６８１ ０６ＣＴＴｒＴｒＧＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴｒＣＴＣＣＣ２８６６１０ ７ＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＴｒＡＣＴＧＣＣ２２７０１０９ＣＡＧＧＡＧ ＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴ　２２　７０各対立遺伝子にユニークな３′ ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを、５゛末端の長さが異なるように合成 した（第１表、参照）。不変系である３２ｐ放射能標識化隣接オリゴヌクレオチ ドへ連結すると、個々の生成物をポリアクリルアミド変性ゲルで分離し、オート ラジオグラフィーで検出することができた。オートラジオグラフィーによる最初 の発見に基づき、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドを捕獲のために５′ビオ チニル化し、変異系オリゴヌクレオチドをジゴキシゲニンで３′に継いだ自動、 非放射性検出反応法を使用して配列分析を行った。 ついでアルカリホスファターゼに抱合された抗ジゴキゲニンおよび酵素の比色性 基質を使用してＥＬＩ　ＳＡ型式で視覚化した。 第１表に記載のように、ヌクレオチド配列およびβ８およびβ５グロビン遺伝子 を検出するのに使用される対応するオリゴヌクレオチドの翻訳された配列を記載 する。オリゴヌクレオチド１０１および１０４はβ８標的を検出し、同時に１０ ２および１０５は、標識化オリゴヌクレオチド１０７および１０４にそれぞれ連 結すると、β５標的を検出する。オリゴヌクレオチド１０３および１０６は、β １またはβ５グロビン遺伝子標的をそれぞれ使用してＧ：ＴまたはＧ：Ａおよび Ｃ：ＡまたはＣ：Ｔのミスマツチ連結の効率を分析するために設計された。種々 の生成物を変性したポリアクリルアミドゲルで分離したとき、様々な生成物を容 易に識別させるためにオリゴヌクレオチドは僅かに長さを変えて設計された。標 的配列に非相補的な末端は「リポータ−グループ」であると考え得ることができ る。 従って、オリゴヌクレオチド１０７へのオリゴヌクレオチド１０１．１０２また は１０３の連結は、それぞれ４５．４７または４９ヌクレオチドの長さを与える 。 相補鎖ではオリゴヌクレオチド１０９へのオリゴヌクレオチド１０４．１０５ま たは１０６の連結は、それぞれ４６．４８または５０のヌクレオチドの長さを与 える。オリゴヌクレオチドは計算Ｔｍ値が連結温度と同じかまたはそれより僅か に高い６６〜７０℃になるように設計された。 連結生成物を検出するために、オリゴヌクレオチド１０７および１０９は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼを使用して３！Ｐおよび以下の実施例に記載のように 一３！ｐで５′末端を標識した。 実施例８ （放射性標識化） オリゴヌクレオチド１０７（０，１Ｉｇ）を２０ｍＭトリシン、１０ｍＭ　Ｍｇ Ｃ１□、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭジチオスレイオトール、および［”Ｐ］ 　ＡＴＰを含むｐＨｓ、ｏの３０ｒｎＭ）リスＨＣＩ緩衝液２０μｍ中Ｔ４ポリ ヌクレオチドキナーゼ１５ユニットを加えて５°末端に標識した。３７℃で４５ 分間インキュベーション後、非標識化ＡＴＰを１ｍＭに加えて、インキュベージ コンをさらに２分間３７℃で行った。反応は０．５Ｍ　ＥＤＴＡｏ、５μｍを加 えて終結し、キナーゼを６５℃１０分間熱不活化した。取り込まれない！２ｐ標 識をＴＥ緩衝液でまえもって平衡化しセファデックスＧ−２５でクロマトグラフ にかけて除去した。 特異的活性はオリゴヌクレオチド７Ｘ１０’〜１０Ｘ１０’ｃｐｍ／μｇの範囲 であった。 相補的対ミスマツチ標的に対する本発明のＴ、アクアチフス好熱性リガーゼ特異 性をＬＤＲおよびＬＣＲ両条件で比較した（第３図および以下の第１Ｉ図、参照 ）。ＬＤＲ系において、２種の隣接したオリゴヌクレオチドを変性標的ＤＮＡお よびリガーゼとインキュベートし、そこで非標識化オリゴヌクレオチドの最終ヌ クレオチドを標的ＤＮＡに対して相補性またはミスマツチした。オリゴヌクレオ チドを末端の長さが僅かに異なるように設計し、様々な生成物の識別を容易にさ せ、変性ゲルで分離できるようにした。従って、以前に開示されたように、標識 化オリゴヌクレオチド１０７に対するオリゴヌクレオチド１０１　（β１対立遺 伝子）、１０２　（βＳ）または１０３の連結は各々４５．４７または４９ヌク レオチドの長さを与える。相補的な鎖において、標識化オリゴヌクレオチド１０ ９に対するオリゴヌクレオチド１０４（β４対立遺伝子）、１０５（βＳ）また は１０６の連結は各々４６．４８または５０ヌクレオチドの長さを与える。オリ ゴヌクレオチドを連結温度またはそれより僅かに高い６６℃〜７０℃の計算Ｔｍ 値をもつように設計した。従って、完全な相補性（Ａ：Ｔ）で標的ＤＮＡにハイ ブリダイズする２種のオリゴヌクレオチドの連結の特異性は、各々可能なミスマ ツチ（Ａ：ＡＳＴＮＴ、Ｇ：ＡｌＧＥＴ、Ｃ：Ａ、またはＣ：Ｔ）と直接的に比 較され得た。β８またはβ５グロビン遺伝子標的の存在下におけるそれらのオリ ゴヌクレオチドの連結の特異性を測定する方法を以下の実施例と同様に決定した 。 実施例９ （好熱性リガーゼの特異性の測定） 標識化オリゴヌクレオチド（２０００００ｃｐｍ；０．２８ｎｇ；４０フ工ムト モル）および非標識化オリゴヌクレオチド（２７ｎｇ；　４０フ工ムトモル）を ｐＨ７，６で１００ｍＭ　ＫＣＬ　１０ｍＭＭｇＣｌ４．１ｍＭ　ＥＤＴＡｌｌ ｏｍＭＮＡＤ、ｌＱｍＭジチオスレイトール、４μｇサケ精子ＤＮＡ、および好 熱性リガーゼ１５ニツククロージングユニツトを含む２０ｍＭ）リスＨＣＩ緩衝 液１０μｍ中標的ＤＮＡの存在下に、鉱油１滴で液面を覆ってインキュベートし た。反応物を９４℃１分間、ついで４分間インキュベートし、このサイクルを５ 〜３０回反復した。反応をＥＤＴＡ　（１０ｍＭ）、キシレンシアツール（０， ２％）およびブロモフェノールブルー（０，２％）を含むギ酸８μｍを加えて終 結した。試料（４μｌ）をゲルに入れる（４００００　ｅｐｍ／　１ａｎｅ）前 に煮沸させて熱変性した。 生成物を、試料を８グループに分け、ゲル中で移動させ、ついで次ぎのセットを 入れるという電気泳動により分離し、それによって第３図のオートラジオグラム の右側のややゆっくりとした移動性のバンドが明らかになった。電気泳動はｐＨ ８，９の１００ｍＭトリスホウ酸緩衝液および１ｍＭ　ＥＤＴＡ中７Ｍ尿素を含 む１０％ポリアクルリルアミドゲル中２時間６０Ｗの一定電力で行った。 １０分間１０％酢酸に浸し、ついで５分間水に浸して尿素を除去後、ゲルをワッ トマン紙３ｒｎｍで乾燥し、−夜−７０℃でコダックＸＡＲ−５フィルムで（デ ュポンクロネック照明と増強スリーンを使用または使用しないで）オートラジオ グラムにかけた。２０サイクルからのバンドをゲルから切除し、放射能を分析し た。 結果を第２表に示す。 第２表 実施例９および第３図に記載された２０サイクルＬＤＲおよび３０サイクルＩ。 ＣＲ実験からの相補性およびミスマνチＬＤＲおよびＬＣＲバンドの定量は、ゲ ルから切除し、放射能を分析した。生成物のパーセント＝生成物バンドｃｐｍ／ 出発オリゴヌクレオチドバンドＣｐｎ〕。ミスマツチ／相補性パーセント；ミス マツチオリゴヌクレオチドバンドｃｐｍ／同じ標的ＤＮＡを使用したときの相補 性オリゴヌクレオチドバンドｅｐｍであり、ノイズ／シグナル比の示標を与える 。ＬＤＲ増幅は６ＸｌＯ”標的分子または】フェムトモルを使用して行った：Ｌ ＣＲ増幅は６Ｘ１０’標的分子または１０アトモルを使用して行った。 ＬＣＲ このように、ＬＤＲ検定において、好熱性Ｔ、アクアティクスリガーゼが、全て の可能な不適正塩基対に対する不適正オリゴヌクレオチド配列から相補的配列を 判別することが示された。競合的及び個別的ライゲーション実験（相異なる塩濃 度において）の両方において、最低の場合の不適正ライゲーションは１．５ない し１．０％（第２表、ＧＥＴ及びＴ：Ｔを参照されたい）、一方他の場合は０゜ ４％ないしく０．１％（第２表、Ａ：Ａ、ＣＡＴ、Ｇ：Ａ及びＣ：Ａ）の生成物 が相補的塩基対（Ａ　：　Ｔ）と共に形成された。これは大ａｍの中温生物Ｔ４ リガーゼ［シーン７６巻２４５頁（１９８９）参照コについての報告（放射活性 検出を使用）より実質上良好である。 一連のＬＣＲ増幅／検出実験において、２つの隣接するオリゴヌクレオチドを、 変性した標的ＤＮＡ及びリガーゼ、並びに相補的な組のオリゴヌクレオチドとイ ンキュベートした。これらの条件の下では、非標識診断オリゴヌクレオチドの３ ゛ヌクレオチドは、標的ＤＮＡと相補的または不適合のいずれかであるが、標識 されていない対応物とは常に相補的である（即ち１０１及び１０４に対するＡ： Ｔ、１０２及び１０５に対するＴ　：　Ａ、並びに１０３及び１０６に対するＧ ：Ｃ）。したがって、不適正オリゴヌクレオチドの最初の「正しくない」ライゲ ーションは、正しいライゲーションと同じ効率で順次増幅される。試料は、非標 識オリゴヌクレオチドの対（β８対立遺伝子特異的１０１及び１０４、β３対立 遺伝子特異的１０２及び１０５、または１０３及び１０６）を、標識オリゴヌク レオチドの相補的且つ隣接する対、１０７及び１０９と共に含んでいた。これら の標識及び非標識オリゴヌクレオチドを、リガーゼ及び１０アットモルの標的Ｄ ＮＡ（ＬＤＲに対するより１００倍少ない標的ＤＮＡ）の存在下で実施例９のよ うに２０または３０サイクルインキユベートした。得られたバンドを第３図の左 部分及び第２表の下半分に示す。 第３図及び第２表でわかるように、本発明に係る好熱性リガーゼは、ＬＣＲ検定 における全ての可能な不適正塩基対に対する不適正オリゴヌクレオチド配列から 相補的配列を判別することができた。競合及び個々のライゲーション実験の両方 において、より悪い場合の不適正ライゲーションは１．３％ないし０．６％（Ｇ ：Ｔ、Ｃ：Ａ及びＡＨＡＳＴＮＴ）、一方他の場合は＜０．２％ＣＴ：Ｔ、Ａ： Ａ及びＧ：Ａ、Ｃ：Ｔ）の生成物が相補的塩基対（Ａ：Ｔ、Ｔ：Ａ）と共に形成 された。このように、本発明に係る好熱性リガーゼを用いるＬＣＲは、高い信号 −雑音比で単一の塩基不適合を増幅し且つ検出できる唯一の方法である［ゲノミ クス第４巻５６０頁（１９８９）参照コ。したがって、ＬＣＲを利用することに より、β１及びβ３間に存在するような単一の塩基不適合間の差異を検出するこ とができ、また、この検定の結果を正常な、キャリアの、または罹患している患 者の診断として使用することができる。 ＫＣｌ１００ｍＭの代わりに１５０ｍＭを含む緩衝液を使用して上記一連の実験 全体を反復すると、結果は第３図及び第２表に作表されたものと本質的に同一で あって、ＬＤＨに対する不適正オリゴヌクレオチドのライゲーションは正確に相 補的な生成物の０．６％ないしく０．３％の範囲、ＬＣＲに対しては１．７％な いしく０．３％の範囲であった。このように、適合及び不適合オリゴヌクレオチ ド間の鋭敏な判別は、塩の条件に決定的に依存する訳ではないように思われる。 別法として、ホスファターゼに基づく別の方法を使用することもできる。ＬＣＲ またはＬＤＲ反応は、鉱油の下で１０μｌ容で実施できる。ここに細菌性アルカ リホスファターゼ（ＢＡＰ）０．５単位を含有する１０ｍＭ）リスＨＣＩ（ｐＨ ７，６）５０μｌ及び１０ｍＭ　ＭｇＣ１，を加え、６５℃で２時間インキュベ ーションを続けた（リガーゼ酵素はこの条件下で死滅しないことに留意されたい ）。 共有結合で連結されるようになったオリゴヌクレオチドの５°末端の標識はもは やＢＡＰに対する感受性を持たない。担体としての１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理 鮭精子ＤＮＡ２０μｌの添加によりライゲーション産物を一燐酸塩から分離し、 ５０％ＴＣＡ２０μｌで沈澱化する。１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後上清 を除去すると、ペレット対ベレット＋上清の割合は、形成された生成物の百分率 を与える。同様の検定をＴａｑｌエンドヌクレアーゼを用いて使用すると、正及 び負の対照に対する実験誤差は１−２％前後である。 本発明に係る好熱性リガーゼの使用により、中温生物のりガーゼに対してめられ る塩及び酵素の濃度の注意深い滴定の必要性が回避できる。この一連の実験から のデータを以下の第３表に示す。 第３表 実施例９に記載され第３図に示される２０サイクルのＬＤＲ及び３０サイクルの ＬＣＲ実験からの、ＫＣＩ濃度１００及び１５０ｍＭにおける相補的及び不適正 ＬＤＲ及びＬＣＲバンドの定量。ＬＤＲ増幅は６ｘｌＯ’標的分子または１フ工 ムトモルを用いて実施した。ＬＣＲ増幅は６Ｘ１０’標的分子または１０アット モルを用いて実施した。不適正／相補的は、雑音対信号比の指標を与える。 ＬＤＲ オリゴ塩基：　形成された生成物（％）　不適正／相補的（％）標的塩基　［Ｋ Ｃ１］　（ｍＭ）　［ＫＣｌ１　（ｍＭ）Ａ：Ｔ　２１．５　２３．２ ＴＥＡ　１３．２　１７．２ Ｔ：Ａ　１７．９　１２．８ Ａ：Ｔ　１２．４　１１．７ ＡＨＡ　＜０．１　＜１２　＜０．４　＜０．３７ＮＴ　Ｏ，１２０，２１０， ７０，３ＴＮＴ　Ｏ，１６０，３０１，００，６ＡＨＡ　＜０．１　＜０．２　 ＜０．４　＜１３ＧＥＴ　Ｏ，３００，２５１，４０，４Ｃ：Ｔ　＜０．１　＜ ０．２　＜０．４　＜０．３Ｇ：Ａ　＜Ｑ、　１　領２５　＜０．４　０．４Ｃ 二Ａ　＜０．１　０．２０　＜０．４　０．３ＣＲ Ａ：Ｔ、Ｔ：Ａ　４１．４　１４．２ Ｔ：Ａ、Ａ：Ｔ　１０．４　１８．５ Ａ：Ａ％Ｔ：Ｔ　Ｏ，４５０，０９１，１０，６Ｔ：ＴＳＡ：Ａ　＜０．０５　 ＜０．０５　＜０．２　領　３Ｇ：Ｔ、Ｃ：Ａ　Ｏ，５１０，２４１，３１，７ ０：Ａ、Ｃ：Ｔ　＜０．０５＜０．１　＜０．２　＜０．７ＬＣＲ及びＬＤＲの 特異性を、同一の標識オリゴヌクレオチドに対するライゲーションについての直 接的競合においてβ１及びβ５特異的両ヌクレオチドを使用して試験した。１フ 工ムトモルないし１アットモルの範囲の標的ＤＮＡ　（β１、β３、及びβ１及 びβ５の等モル比物）を使用する時、好熱性リガーゼは各場合において正しい生 成物を特異的に形成し、ただ一つの標的対立遺伝子が存在する場合はバックグラ ウンドである正しくないライゲーション生成物は観察されなかった。）しかしな がら、β５特異的生成物の形成効率はβ６生成物の形成より幾分低く、２０サイ クルの増幅の後、放射活性用に切り取った生成物を検定することにより定量した このβ３特異的生成物はβ１特異的生成物のおよそ部分の−であった。 よって、各々の標的配列の対立遺伝子の相対的初期濃度を定量するために、二つ のオリゴヌクレオチドを区別をつけて標識する（例えば蛍光原子団を用いて）、 直接的競合検定は、各々の対立遺伝子を注意深く滴定する必要がある。 さらに、アットモル以下の量の標的ＤＮＡを用いるＬＣＲＤＮＡ増幅の特異性を 調べた。管当り１００アットモル（６ｘｌＯ’分子）から１分子以下までの範囲 の標的ＤＮＡの存在下におけるＬＣＲＤＮＡ増幅の程度を調べた。反応物を２０ または３０サイクルインキユベートし、生成物を第４図および以下の第４表に示 されるように分離、定量した。 第４表 ＬＣＲ増幅の定量。３０サイクルのＬＣＲ実験からのバンドをゲルから切り取り 、放射活性について検定した。標的が高濃度の場合、ＤＮＡ増幅は２０サイクル 後に本質上完結した。ゲルのこの部分から３０サイクルのバンドをやや不正確に 切り取ったことが、おそらく１００％を超える生成物形成値の原因である。生成 物形成の百分率＝生成物のバンドにおけるｃｐｍ／出発オリゴヌクレオチドのバ ンドにおけるｃｐｍ０増幅＝形成された生成物の分子の数／標的分子の数。 標的分子　形成された生成物（％）　増幅６ｘｌＯ’　１３４ ２ｘｌＯ’　９６ ６ｘｌＯ’　１０７ ２ｘｌＯ’　７８ ６Ｘ１０’　８５ ２ｘｌＯ’　４８　５．８ｘｌＯ’ ６ｘｌＯ’　２５　１．０ｘｌＯ’ ２ｘｌＯ’　４．５　５．４ｘｌＯ’ ６ｘｌＯ”　２．３　９．２ｘｌＯ’ ２ｘｌＯ’　０．３６　４．３ｘｌＯ’６ｘｌＯ”　０．１８　７．２ｘｌＯ’ ２ｘｌＯ”　０．１４　１．７ｘｌＯ’６０　＜０．０５ ２０　＜０．　０５ 第４図に示されるように、標的の不在下では、担体の鮭精子ＤＮＡ　（４μｇ） が存在する場合、バックグラウンドの信号は検出されなかった。最初の標的濃度 が高い場合ＤＮＡ増幅は２０サイクル後に本質上完結したが、最初の標的濃度が 低い場合には、実質的により多くの生成物が、さらなる増幅サイクルで形成され る。これらの条件の下では、最初の標的ＤＮＡ２００分子が３０サイクル後に容 易に検出できるであろう。 この酵素の熱安定性は第４図で容易に明らかとなっている。２０サイクル後に形 成された生成物の量を３０サイクル後に形成された量と比較することにより、低 濃度の標的ＤＮＡの下では、追加の生成物がより多いサイクルの後に形成される ことが明らかである（特に２ｘｌＯ’ないし２ｘｌＯ”標的ＤＮＡ分子）。換言 すると、この酵素は９４℃１分間に続く６５℃４分間を２０サイクル行なった後 にも尚活性を有している。 このようにＴ、アクアティクスリガーゼは、ＤＮＡを変性させる温度、即ち約１ ０５℃で約０．２５分間ないし約４分間の範囲に繰り返し暴露させた後、約５０ ℃ないし約８５℃の範囲の温度において、相補的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズした 二つの隣接するオリゴヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒する 能力を保持している。 故に、ＬＣＲを用いる既知のヌクレオチド配列の核酸被験物質の特異的増幅は、 （１）標的配列の核酸に対し相補的且つモル過剰であって、その隣接するオリゴ ヌクレオチドの連結部において該標的配列核酸との不適合が無い、二つの隣接す るオリゴヌクレオチド；　（２）標的配列の核酸に対し相補的且つモル過剰であ って、この隣接するオリゴヌクレオチドの第二組の連結部において該標的配列核 酸との不適合が無い、第一組の隣接するオリゴヌクレオチドに相補的な第二組の 隣接するオリゴヌクレオチド；　（３）約５０℃ないし約１０５℃の温度に付す 時、不可逆的な変性をせず、その触媒能を失わない熱安定性リガーゼ：及び、（ ４）ＤＮＡを変性させる第一の温度（約９０℃ないし約１０５℃の範囲）及びハ イブリダイゼーション／ライゲーションをさせる第二の温度（約５０℃ないし約 ８５℃）からなる反復する温度サイクルにこのリガーゼ混合物を付すこと、を必 要とする。上記のβ９グロビン対立遺伝子の増幅の場合、構成因子は、（１）オ リゴヌクレオチド１０１及び１０７；（２）オリゴヌクレオチド１０４及び１０ ９：（３）　Ｔ、アクアティクスリガーゼ；及び（４）９４℃１分間、続いて６ ５℃４分間の温度サイクル３０回、であった。 第４図において、４５及び４６ヌクレオチドのバンドはコード化及び相補的β１ グロビンオリゴヌクレオチドのライゲーション産物に対応している。より低い分 子量の産物は、最初のライゲーション反応に存在する除去オリゴヌクレオチドの ライゲーションに相当する。試料は８個の群でロードしたため、オートラジオグ ラムの右側はゆっくりとした移動が現われている。 リガーゼが相補的及び不適正オリゴヌクレオチドを判別する能力をさらに試験す るため、Ｇ−Ｔ及びＣ−Ａ不適合を与えるオリゴヌクレオチドの存在下及び不在 下で、以下の実施例に従ってＬＣＲ実験を実施したが、この実施例はＤＮＡ増幅 を示すのみならず実施例９に見いだされる酵素の熱安定性を支持するものである 。 実施例１０ 実験の一組は非標識１０１及び１０４オリゴヌクレオチド各４０ｆモルを含み、 第二組はさらに４０ｆモルの非標識１０３及び１０６オリゴヌクレオチドを有し ていた。どちらの組も標識１０７及び１０９各４０ｆモルを含んでいた。標識さ れたオリゴヌクレオチド（２０００００ｃｐｍ；２８ｎｇ；４０ｆモル）及び非 標識オリゴヌクレオチドｃ、２７ｎｇ：４０ｆモル）を、標的ＤＮＡ、即ち１０ ０アットモル（６ｘｌＯ’分子）ないし０．０１アットモル（６ｘ　１０”分子 ）の範囲のＴａｑＩ消化β１またはβ５グロビンプラスミドの存在下でインキュ ベートした。インキュページａンは、１００　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　！、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮＡＤ、１０ｍＭジチオトレイトール、４μｇの鮭精子 ＤＮＡ、及び１５ニック閉鎖単位のＴ、アクアティクスリガーゼを含む２０ｍＭ トリスＨＣＩ（ｐＨ７，６）１０μｌ中で実施し、鉱油−滴で覆った。反応物は ９４℃で１分間、次に６５℃で４分間インキュベートし、このサイクルを２０ま たは３０回反復した。 得られた試料を電気泳動し、クロネックス強化スクリーンを用いて一夜ゲルオー トラジオグラフィーに付し、バンドを計数した。オートラジオグラフィー処理し たゲルからのバンドを図４に示し、ＬＣＲ増幅の定量を以下の第Ｖ表に作表した 。 第５表 不適正競合分子の存在下及び不在下におけるＬＣＲ増幅の定量。 相補的オリゴヌクレオチド　相補的及び不適正オリゴヌクレオチド（ｌｏｔ、１ ０４）　（１０１，１０４及び１０３．１０６）（Ａ：Ｔ、Ｔ：＾）　（Ａ：Ｔ 、Ｔ：Ａ及びＧ：Ｔ、Ｃ：Ａ）標的分子　形成され　増幅　形成され　増幅　不 適正／相補的２ｘｌＯ’　９３　９５　１．８ ６ｘｌＯ’　１０２　９３　０．５ ２ｘｌＯ’　９０　６７　０．５ ６ｘｌＯ’　５１　４６ ２ｘ１０５３１　３．７ｘｌＯ’　２３　２ＪｘＬＯ’６ｘｌＯ’　１７　６． ｌ１ｌｘｌＯ’　９．３　３．７ｘｌＯ’２ｘｌ（１’　８．６　１．０ｘｌＯ ｓ２．９　３．５ｘｌＯ’６ｘｌＯ’　３．２　１．３ｘｌＯ’　０．８　３． ４ｘｌＯ’高い標的濃度においては、充分な不適正生成物が産生、視覚化され（ 図４のように）、不適正生成物の量は相補的生成物の１．８％ないし０．５％の 範囲である。過剰の不適正標的ＤＮＡの使用（β４グロビンの代わりに管当り６ ｘｌＯ’分子のβ３グロビンＤＮＡ）はわずか２．１％及び１．５％の生成物を 与えるのみであった。同じ量の生成物が、３０００ないし１００００倍少ない相 補的標的ＤＮＡを使用する時に形成され得る。これに基づくと、正しく対になっ たライゲーション生成物からの信号は、競合または個別的ＬＣＲライゲージＪン 条件の下では不適正生成物の５０ないし５００倍大きい。 低い標的濃度においては、ＤＮＡ増幅の程度は３．７ｘｌＯ’ないし１．７ｘ１ ０５の範囲であった（第４表及び第５表参照）。ライゲーションの効率が各サイ クルで同一であると仮定すると、サイクル当りの平均増幅は４０及び５０％の間 である。 熱論、サイクル当りの効率は、緩衝剤の条件、酵素濃度、または温度サイクルの 回数及び温度を変えることにより向上させ得る可能性があり、これらは全て当業 者の能力の範囲内にある。例えば、好熱性リガーゼ（及び他のりガーゼ）のライ ゲーション効率が、ＮＨ４Ｃｌ５ＨＥＰＥＳ、スペルミジンのようなポリアミン 類、またはポリエチレングリコールの使用といったような緩衝剤の組成を変える ことにより向上させ得るということが示されている［ジャーナル・オフ・バイオ ロジカル・ケミストリー２５９巻１００４１頁（１９８４Ｌ及びジャーナル・オ フ・バイオケミストリー１００巻１２３頁（１９８６）参照］。現在使用されて いる緩衝剤中の各成分の量を変え、モして１またはそれ以上の成分を補足しまた は上に列挙した化学的及び生物学的成分（但しこれらに限定されない）と交換す る事は、当業者にとっては容易なＬＣＲ改良方法の一つである。さらに当業者は サイクル回数及び温度を容易に変えることができる。例えば、後の時点において 、存在する標的の大多数は前のＬＣＲ反応からのオリゴヌクレオチド生成物であ る。これらのオリゴヌクレオチドは短く（好ましくは４０ないし６０量体である がこれに限定されない）、より速やかに融解し、より迅速な循環を可能とする。 本発明において、成功したりガーゼ鎖反応は、９４℃０．５分間、続いて６５℃ ２分間の循環条件下で（好ましいりガーゼ鎖反応条件では９４℃で１分間の半分 の時間、そして６５℃で４分間の循環時間）３０及び４０サイクルで完了した。 ライゲーション温度及びＤＮＡ変性温度は共に実際の程度、持続時間、及び反復 されるサイクルの回数の点で変えることができる。最適の条件は、完全に相補的 な標的ＤＮＡの存在下で形成される生成物の量を最大とし、一方正適正な標的Ｄ ＮＡの存在下または相補的標的ＤＮＡの不在下で形成される正しくない生成物の 量を最小としなくてはならない。 これらの発見を利用して、臨床上の試料中の特異的オリゴヌクレオチド配列を検 出する方法が開発された。試料の供給源は核酸を含む任意の材料または物質であ ってよい。この核酸は天然に存在する核酸である必要はなく、化学的、酵素的、 または生物学的手段により合成されることができ、また、天然に存在するプリン 類及びピリミジン類以外を有することができる。臨床的試料の供給源は細胞また は非細胞であってよく、また、血液、血清、血漿、乳汁、便、膿、掻爬組織、洗 液、尿等のような生理学的媒質から導かれ得る。さらに、この試料は、新生物細 胞、リンパ球（例えばＴ細胞またはＢ細胞、単球、好中球等）のような−組のま たは１サブセツトの細胞に関連していてよく：ウイルス、細菌、マイコプラズマ 、真菌、原生動物等を含む病原体を包含し；構造物等、またはメツセンジャーＲ ＮＡ１）ランスファーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、ウィルス等のようなＲＮＡを 含み得：そして構造遺伝子、非翻訳領域、調節領域、イントロン、エクソン等を 含み得る。加えて、この検出は非常に様々な目的、例えば植物または動物種にお ける可能性あるまたは実際の病態の診断、並びに病原体の組（セット）またはサ ブセットの検出、遺伝子工学の監視等のような目的のためのものであり得る。　 このような本発明が使用できる（そして前もってＰＣＲ増幅を行なう必要の無い 、血液試料からの直接的ＬＣＲ対立遺伝子検出の実行可能性を明白に証明してい る）一つの方法は、例えば、ヒトゲノムＤＮＡにおけるβグロビン対立遺伝子の 検出において具現される。高レベルのＤＮＡ増幅に基づき、正常（β１βＡ）、 キャリア（β１βｇ）、及び錐状赤血球（β３β３）のヒトから採集した血液か らＤＮＡの対立遺伝子特異的ＬＣＲ検出を調べ、これをより詳細に以下の実施例 に記載する。 実施例１１ （ヒトゲノムＤＮＡにおけるβグロビン対立遺伝子の検出）全血０．５ｍｌから ヒトゲノムＤＮＡを単離した［ＰＣＲテクノロジー、ＨｌＡ、アーリッヒ編、ス トックトン・プレス（１９８９）、３６頁参照コ。全血（０，５ｍ１）を同容量 のリシス緩衝液（１０ｍＭ）リスＨＣＩ、ｐＨ７，６，５ｍＭ　Ｍｇｃｌ、及び ０．３２Ｍシュクロース含有）と混合した。短時間の遠心（エツベンドルフ卓上 遠心機中１２００Ｏｒｐｍで１分間）の後、上清０．１５ないし０゜２ｍｌ及び ゆるくペレット化した核を残して上清を極めて注意深（除去した。このベレット を、さらに０．５ｍｌのリンス緩衝液中に攪拌しつつ再懸濁し、上記のように核 をペレット化し、上清を除去した。この工程を、上清が透明または僅かに桃色と なるまで３回または４回繰り返した。最後の上清を除いた後（やはり約０．１５ ないし０．２ｍｌを残す）、非イオン性洗浄剤を含むＬＣＲＤＮＡ緩衝液０．２ ５ｍ１　（２ｍＭ　ＥＤＴＡ及び非イオン性洗浄剤ＮＰ４０及びトウビーン２０ 各０．４５％を含有する２０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ７，６）を加えた。過剰の ＲＮＡがあればそれを４ｍｇ／ｍｌの熱処理ＲＮアーゼＡ２μｌの添加により３ ７℃で１５分間消化した。蛋白があればそれを１０ｍｇ／ｍ＋の新たに作成した プロテイナーゼに５μｌの添加及び５０℃で１ないし２時間のインキュベーショ ンによって消化した。プロテイナーゼＫ及びＲＮＮアーゼをフェノール、フェノ ール／クロロホルム、クロロホルム、ｎ−ブタノール（２ｘ）による連続的抽出 により除去し、エタノールを用いた沈澱化により核酸を回収した。試料はＬＣＲ 検定への使用前に５分間煮沸した。 単離された各々のヒトゲノムＤＮＡを二つの反応混合物、即ち一方は正常なβ１ 対立遺伝子の存在を試験し、二つ目は錐状β５対立遺伝子の存在を試験する反応 混合物中で試験した。第一の反応混合物は、β６試験オリゴヌクレオチド１０１ 及び１０４（各々０．２７ｎｇまたは４０ｆモル）、標識されたオリゴヌクレオ チド（１０７及び１０９　；　２０００００ｃｐｍ　（各々Ｑ、２８ｎｇまたは ４０ｆ（−ルＬ　１００ｍＭ　ＫＣＩ、１０　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　ｔ、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮＡＤ、１０ｍＭジチオトレイトール、及び１５ニック 閉鎖単位のＴ。 アクアティクスリガーゼを含有する２０ｍＭトリスＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，６） １０μｍに入れたゲノムＤＮＡ　（血液１０μｌ、または約６ｘｌＯ’の凝集さ せた細胞に相当）を含み、鉱油−滴で覆った。第二の反応混合物は、β５試験オ リゴヌクレオチド１０２及び１０５（各々０．２７ｎｇまたは４０ｆモル）、標 識されたオリゴヌクレオチド１０７及び１０９　（２０００００ｃｐｍまたは各 々０゜２８ｎｇまたは４０ｆ（−ル）　、１００ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｍｇ Ｃ１ｚ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮＡＤ、１０ｍＭジチオトレイトール、 及び１５ニック閉鎖単位のＴ、アクアティクスリガーゼを含有する２０ｍＭ１− リスＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，６）１（ｂｚｌに入れたゲノムＤＮＡ　（血液１０ μｌ、または約６ｘ１０４の凝集させた細胞に相当）を含み、鉱油−滴で覆った 。 両反応混合物を９４℃で１分間、次いで６５℃で４分間インキュベートし、この サイクルを２０ないし３０回反復した。ＥＤＴＡ　（１０ｍＭ）　、キシレンシ アツール（０，２％）、及びブロムフェノールブルー（０，２％）を含有するホ ルムアミド８μｌの添加により反応を停止させた。 試料（４μｍ）はロード（４００００ｃｐｍ／列）前に３分間煮沸することによ り変性させた。電気泳動を、１００ｍＭ）リスはう酸（ｐＨ８，９）の緩衝液中 ７Ｍ尿素及び１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０％ポリアクリルアミドゲルにおいて、 ６０ワツトの一定電力で２時間行なった。尿素を除去（１０％酢酸に１０分間浸 漬し、次いで水に５分間浸漬）した後、ゲルをファツトマンの３ｍｍ濾紙上で乾 燥し、デュポン・クロネックス強化スクリーンを用いてコダックＸＡＲ−５フィ ルム上で一７０℃で一夜オートラジオグラフィーに付した。ヌクレオチド４５及 び４６、または４７及び４８のライゲーション生成物が、それぞれβ６またはβ ３グロビン遺伝子の存在を示す。プラスミド由来の標的ＤＮＡについて言及した ように、ライゲーション（故に検出）の効率は、β６特異的オリゴヌクレオチド よりβ３の方が幾分低い。 第５図は、前述の実施例に従って作成されたヒトゲノムＤＮＡ中のβグロビン対 立遺伝子の検出を示すオートラジオグラムである。ヌクレオチド４５及び４６、 または４７及び４８のライゲーション生成物は各々β１またはβ５グロビン遺伝 子の存在を表わす。このように、血液１０μｌに相当する標的ＤＮＡにより、対 立遺伝子特異的ＬＣＲを用いてβ６及びβ３対立遺伝子が容易に検出できる。 故に、既知の正常なヌクレオチド配列を有する、及び該配列中の少なくとも一つ の標的ヌクレオチド位置に既知の変異を有する可能性のある、生物学的に誘導さ れた核酸被験物質の検出の成功は、（１）互いに相補的であり、標的配列の核酸 に対し相補的である二組の隣接するオリゴヌクレオチドを含む第一の反応混合物 （ここで、その隣接するオリゴヌクレオチドの結合部において、変異標的配列核 酸に対しては少なくとも一つの不適正塩基対があるが、正常な標的配列核酸には ない）；　（２）互いに相補的であり、標的配列の核酸に対し相補的である二組 の隣接するオリゴヌクレオチドを含む第二の反応混合物（ここで、その隣接する オリゴヌクレオチドの結合部において、正常な標的配列ＤＮＡに対しては少なく とも一つの不適正塩基対があるが、変異標的配列核酸にはない）；　（３）約５ ０℃ないし約１０５℃の温度に付す時に不可逆的に変性せずその酵素的能力を失 わない熱安定性リガーゼ；及び（４）これらのりガーゼ混合物を、ＤＮＡを変性 させる第一の温度（約９０℃ないし約１０５℃の範囲）、及びハイブリダイゼー ション／ライゲーションを可能にする第二の温度（約５０℃ないし約８５℃の範 囲）（これは各反応混合物中の隣接するオリゴヌクレオチドが或いは共有結合に より連結するようにもさせ得る）からなる反復する温度サイクルに付す事：　（ ５）被験物質及び結合していない被験オリゴヌクレオチドがあればそれを、共有 結合により結合したオリゴヌクレオチド生成物（もし形成されていれば）から分 離する事；及び（６）各反応混合物中の共有結合により結合したオリゴヌクレオ チドの存在または不在を検出する事（それにより、第一の反応混合物中の共有結 合により結合したオリゴヌクレオチド生成物の存在は正常な標的配列の存在を表 わし、そして第二の反応混合物中の共有結合により結合したオリゴヌクレオチド 生成物の存在は変異標的配列の存在を表わす）を必要とする。上に述べたβ１及 びβ５グロビン対立遺伝子の検出において、構成成分は、（１）オリゴヌクレオ チド１０１．１０４．１０７及び１０９：（２）オリゴヌクレオチド１０２．１ ０５．１０７及び１０９　：　（３）Ｔ、アクアティクスリガーゼ；　（４）９ ４℃１分間、続いて６５℃４分間の３０温度サイクル；　（５）４５％ホルムア ミド中で煮沸することによる核酸の変性及び配列決定用ゲル上に分離する事：及 び（６）ゲルのオートラジオグラフィーである。 この事は、ＰＣＲ増幅を必要としない本発明による血液試料からの直接的ＬＣＲ 対立遺伝子検出の実行可能性を明確に立証するものである。 プラスミド由来の標的ＤＮＡについて述べたように、ライゲーションの効率（及 び、故に検出）はβ６特異的オリゴヌクレオチドよりβ５に対する方が幾分低い 。 ３０サイクルの増幅の後、放射活性用に切り取った生成物の検定により定量され たβ５特異的生成物はβ６特異的生成物のおよそ部分の−であった。この相違は 、ライゲーション連結部における正確なヌクレオチド配列の作用であるか、また はＬＣＲ実験に用いられた特定のオリゴヌクレオチド（異なった５°尾を有する ）の作用であり得る。しかしながら、それでも尚本発明は、二つのオリゴヌクレ オチドが区別されて標識されている（例えば蛍光原子団によって、またはこの場 合は異なった長さの尾によって）場合の、反応混合物中のいずれかの対立遺伝子 の存在または不在を決定するための直接的競合検定を可能にする。−膜化した形 式において、本発明に係る方法は、隣接するオリゴヌクレオチドの連結部におい て少なくとも一つの不適正塩基対を変異標的配列核酸に対して含むが正常な標的 配列核酸に対しては含まないオリゴヌクレオチドの組を、−組の標識により標識 し、そして、隣接するオリゴヌクレオチドの連結部において少なくとも一つの不 適正塩基対を正常な標的配列核酸に対して含むが変異標的配列核酸に対しては含 まないオリゴヌクレオチドを、別の標識により標識する場合、同一容器内の二つ の対立遺伝子の検定を可能にする。 比較し得る非放射活性検定においては、第６図に示されるように、最小限二つの オリゴヌクレオチドプローブを合成し、ライゲージコン検定の特定の機能のため に修飾する。一つのプローブは、ライゲーションに従うオリゴヌクレオチドの捕 捉を可能にするフックを含んでいる。このようなフックの一例はビオチンであり 、これは適当な支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンにより捕捉 されることができる。他のプローブはリポータ−基を有する。放射性同位体また は非放射活性の両方の様々なリポータ−基が入手でき、且つ発蛍光団または発光 原子団のように本発明に係る検定に使用することができるが、現在好ましいすポ ーターはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）に参加し得るリポータ−である。 より詳細には、第６図が、ビオチニル化された（Ｂ）及びジゴキシゲニン標識さ れた（Ｄ）オリゴヌクレオチドかりガーゼ（矢印）の存在下でＤＮＡ標的とハイ ブリダイズする、ＥＬＩＳＡを基礎とするオリゴヌクレオチドライゲーション検 定の概略化した図式を示している。ビオチニル化されたオリゴヌクレオチドは、 微量定量プレートのウェル内部に被プされたストレプトアビジン（ＳＡ）上に捕 捉される。このウェルを洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去し、アルカリ ホスファターゼ（ＡＰ）に結合させた抗ジゴキシゲニン抗体（Ｄ）をウェルに加 える。インキュベーション及び洗浄サイクルの後、アルカリホスファターゼ基質 （Ｓ）を加え、ジゴキシゲニンを着色生成物の生成により検出する。 本発明に係る非放射標識検定は、幾つかの工程、即ち（１）ＤＮＡ標的の調製； 　（２）修飾オリゴヌクレオチドプローブの変性及びハイブリダイゼーシヨン； （３）ライゲーション：　（４）ビオチニル化プローブの捕捉；　（５）遊離の 非ビオチニル化オリゴヌクレオチド及び標的を除去するための洗浄：　（６）ア ルカリホスファターゼに結合させた抗ジゴキシゲニン抗体の添加；　（７）結合 していない抗体を除去するための洗浄：　（８）アルカリホスファターゼ基質の 添加：及び（９）分光光度法による分析、から成り立っている。以下のフローチ ャートに、本発明に係る非放射標識検定を実施する一般的手順（これは改良バイ オメック１０００ワークステーション機器上で自動化されている）を詳説する： 増幅された標的ＤＮＡ Ｔ４リガーゼ検出　Ｔａｑリガーゼ検出０．３Ｎ　ＮａＯＨ４５μＩ　Ｏ，ＩＮ 　ＫＯＨ４５μｍの添加により残留するＴａｑポリメラーゼを変性０．３Ｎ　Ｈ Ｃｌ４５μＩ　Ｏ，ＩＮ　ＨＣｌ４５μｍの添加により標的ＤＮＡを再生 微量定量プレートにウェル当り１０μｍの増幅された標的を分注ＤＮＡ標的にビ オチニル化及びリポータ−オリゴヌクレオチドを添加（１０μｍの２Ｘライゲ一 シヨンミツクス中各オリゴヌクレオチド２００ｆモル）ライゲーションミックス ：　ライゲーションミックス：ビオチニル化オリゴ２００ｆモル　ビオチニル化 オリゴ２００　ｆモルリポータ−オリゴ２００ｆモル　リポータ−オリゴ２００ 　ｆモル１００ｍＭ　ト！Ｊ　スＨＣ１、ｐＨ７，５１００ｍＭトリスＨｃ１、 ｐＨ７，５２０ｍＭ　ＭｇＣ１□　２０ｍＭ　ＭｇＣ１゜１０ｍＭ　ＤＴＴ　１ ０ｍＭ　ＤＴＴ ２ｍＭ　ＡＴＰ　２ｍＭ　ＡＴＰ ２ｍＭスペルミジン　２ｍＭスペルミジン５０％ホルムアミド　２ｍＭ　ＮＡＤ ｌｏｏｍＭ　Ｋ　ＣＩ Ｔａｑリガーゼ ９３℃で２分間標的オリゴヌクレオチドミックスを変性室温に冷却し、　６０− ６８℃に冷却し１５分間ライゲ２００ｍＭ　ＮａＣ１−ジョン（変性及びライゲ ーションエ５３ｍＭ）リスＨＣＩ、ｐＨ７，５呈を反復して増幅）１０ｍＭ　Ｍ ｇＣｌ２ ５ｍＭ　ＤＴＴ １ｍＭ　ＡＴＰ １ｍＭスペルミジン 中のＴ４リガーゼ５μｌを添加 室温（２５℃）で１５分間ライゲージコンライゲーション反応を停止し、０．３ Ｎ　ＮａＯＨ１０μｌの添加により生成物室温で３０分間ビオチニル化オリゴヌ クレオチドを捕捉を洗浄 り及び０．０５％トウイーン中３０μｍ／ウェル抗体をリポータ−に結合させる ためプレートを室温で３０分間インキュベーション プレートを０．０５％トウイーン中１００ｍＭ）リスＭＣＩ　（ｐＨ７，５）　 、１５０ｍＭ　ＮａＣ１で洗浄して非結合抗体を除去基質を添加 適当な比色、化学ルミネセンス、または蛍光産物についてプレートを読み取るこ の検定を開始するのに必要なゲノム配列は、ＬＣＲ，３ＳＲ１及びＰＣＲを含む 幾つかの異なった方法によって増幅することができる。本発明者等は、ＰｃＲ増 幅を使用して、以下の第６表に列挙される訴訟検定のプライマーのためのＤＮＡ 標的を取得した。 第６表 （増幅プライマーの組の配列） 標的遺伝子　増幅プライマー ＤＮＡ５μｍ（ゲノムＤＮＡについては２ｎｇ／μＪまたはこれに代わる供給源 からの処理試料５μ］）を、０．０５Ｕ／μｌのＴａｃ２ポリメラーゼ、５０ｍ ＭＫＣｌ、２５ｍＭ）リスＭＣＩ緩衝液（ｐＨ８，３）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ ２．２００ｕｇ／ｍｌのゼラチン、０．　１％トリトンＸ−１００、及び各々１ ゜５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰＳｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含有するＰＣＲ緩衝液 中で、増幅すべきＤＮＡ領域に特異的な一対のプライマーオリゴヌクレオチド（ 各々０，５μＭ）と混合することにより、ＤＮＡ増幅を実施した。この試料を軽 鉱油６０μｍで覆い、９３℃で５分間標的を変性させ、そして９３℃２０秒間、 ５５℃４０秒間、及び７２℃１分間より成るサイクルに４０回付した。温度循環 に続き、この試料を１０分間７２℃に付してＤＮＡ試料の伸長を完結させた。 オリゴヌクレオチドをこのライゲーション検定における特定の機能のために合成 し修飾する。この検定は最小限二つの修飾オリゴヌクレオチドを必要とする。 一方のオリゴヌクレオチドは、ライゲーションに従うオリゴヌクレオチドの捕捉 を可能にするフックを有する。この−例は、ストレプトアビジンまたはアビジン 支持体上に捕捉され得るビオチニル化オリゴヌクレオチドである。他方のオリゴ ヌクレオチドはリポータ−基を有し、これは、発蛍光団リポータ−の場合、異な った発光スペクトルを有する多数のリポータ−を容易に単一の検定に組み入れる ことができる。 ＥＬＩＳＡを基礎とする系のためには、遺伝子の対立遺伝子型を判別するプロー ブを５″ビオチン基をもって合成する。リポータ−プローブは酵素的または化学 的に５°−ホスホリル化し、ハブテンジゴキシゲニンによって標識する。オリゴ ヌクレオチド５００ｐＭを、１３ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７，０）　、１ ｍＭ　ＣｏＣ１，，０，１ｍＭ　ＤＴＴ、５ｎＭジゴキシゲニンｄＵＴＰ、０゜ ０５μＭ　ｄＡＴＰ、及び酵素ターミナルトランスフェラーゼ１００単位（総容 量２０μｍ）中で３７℃で１時間テーリングする事により、ハブテンをリポータ −プローブの３′末端に付加する。標識後、３Ｍ酢酸ナトリウム２μｌ及び酵母 ｔ−ＲＮＡ　（１ｍｇ／ｍ１）Ｉμ＋及び９５％エタノール６０μｌを加える。 オリゴヌクレオチドを４℃で５分間沈澱化し、次いで６５００ｘｇで５分間の遠 心によって集める。ペレットを蒸留水２０μｌに再懸濁し、この工程を反復する 。 この沈澱化は、結合していない過剰のジゴキシゲニンを標識されたプローブから 除去する。３種の病理学的状態についての対立遺伝子を判別するオリゴヌクレオ チドの例を以下の第７表に示す。 第７表 ＜ＥＬＩＳＡ検出のためのオリゴヌクレオチド例の配列）標的遺伝子　検出され た　ビオチニル化　標識された（Ｌ）ブラ遺伝子の型　プライマー　イマー βグロビン　βＡ　８ｌ−ＡＴＧｔＸｒＧＣＮＸ：ｒＧＩｃｒｃＭＧＡＣＴＧ 嚢胞性線維症　非５０８　Ｂ１−ＡＴＴＭＡ蕉ＭｘｆＴＱＡＴＣＴｒ゛ｎ＝にゴ Ｔ〔ｒ「「ＴＣ工γＬへ７ＧＡＴＧ６Ａ丁５０８　８２−Ａαス゛口“ＡＡＡ（ 迎鴇虹ＡＴＣＡＴ前記のフローチャートに含まれる手順を使用して幾つかの実験 を実施し、発色の後４９０ｍＮの波長においてデータを分光光度的に得た。この ような試験についての典型的な結果を以下の第８表に作表した。 第８表 （Ｔａｑリガーゼを用いた自動化ライゲーション反応からの分光光度的データ） 増幅されたゲノム　ライゲーションプライマーミックスＤＮＡ標的の由来　ＢＩ ＋Ｌ　Ｂ２＋Ｌβ’　０．０４±０．０３　１．８５±０．０３アルフア、−ア ンチトリプシン Ｍ　１．８５±０．１５　領０３±０．０１Ｚ　Ｏ，０３±０．０３　１．４７ ±０．０７嚢胞性線維症 ｎｏｎ−５０８１，３３±０．２０　０．０２±０．０１５０８　領０１±０． ０１　１．６６±０．１６Ｔ４またはＴａｑリガーゼのいずれかについて比較可 能な検出レベルが得られた。さらに、他の幾つかの疾病関連多形性について幾つ かのライゲーション反応を実施し、同様の結果を得た。加えて、ヒトＴ細胞レセ プター塵における８つの異なった多形性を調べ、類似の検出結果を得た。故に本 発明は、単一の塩基の置換、ＤＮＡ欠失または挿入、またはＤＮＡ翻訳からなる ＤＮＡ多形性の分析に一般に適用可能であると思われる。 さらに、幾つかのアルカリホスファターゼ基質が、感受性化学ルミネセント基質 （１０アットモル検出）を含む本発明のＥＩＩＳＡ検定に使用できる。この検定 のフォーマットは、適当な微量定量フォーマットにおいて読み取ることのできる 、発蛍光団のような他のリポータ−フォーマットに対して容易に適合する。適当 な発蛍光団フォーマットを組み入れることにより、例えばライゲーションによる 複合分析が可能となる。この計画において、異なった対立遺伝子及び／または異 なった遺伝子を判別するオリゴヌクレオチドが単一の検定で評価できる。さらに 、直列のライゲーション検定（鎖状態のオリゴヌクレオチドのライゲーション） を、主要組織適合複合体遺伝子に存在するような間隔の密なりＮＡ多形性の評価 に使用することもまた可能である。特に上に述べた検定に対するこのような修飾 は、充分本発明の範囲内にあると考えられる。 本発明は、広範囲のＤＮＡ診断スクリーニングに使用できる。例えば、係るＤＮ Ａ診断スクリーニングは以下の要約に従ったスクリーニングを包含し得るが、本 発明の範囲をこれに限定する事を意図する訳ではない：Ａ、伝染性疾患 １、ウィルス疾患：ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＰＶ、Ｈ５Ｖ、ＣＭＶ、　肝炎（非Ａ。 非Ｂ） （ｉ）血液及び組織スクリーニング （ｉｉ）迅速な同定 （ｉｆｆ）過去の！露から慢性の感染を識別（ｉｖ）混合感染中の耐性菌株を識 別 ２、細菌疾患：マイコバクテリア、梅毒、クラミジア、レジオネラ、カンピロバ クタ−、ニューモノシティス、リステリア、ライム、癩（ｉ）ゆっ（りと増殖す る微生物の迅速な同定（ｉｉ）免疫不全患者の同定 （ｉｉｉ）食物汚染の試験 ３、寄生虫疾患：マラリア、トリバノソーム、リーシュマニア（ｉ）「第三世界 」の血液疾患の迅速な同定（ｉｉ）旅行者及び軍隊のスクリーニングＢ、遺伝疾 患 １、単対立遺伝子疾患：嚢胞性線維症、デュシェン筋ジストロフィー、鎌状赤血 球貧血、β−地中海貧血、血友病Ａ１ゴーシェー、テイサックス、アルスハイマ ー、神経線維種度 ２、癌：網膜芽細胞腫、ウィルス疾患、大腸癌、乳癌、腫瘍遺伝子、腫瘍抑制因 子 ３　複対立遺伝子疾患　冠動脈心疾患、糖尿病、高血圧、精神分裂病、繰を病、 アルコール中毒 （ｉ）疾病素因 （ｉｉ）予防的医薬、運動、食餌 （ｉｉｉ）遺伝的スクリーニングおよびカウンセリング（ｉｖ）遺伝子治療 Ｃ０遺伝学的同定 １、人間：ＨＬＡ分類、法医学 （ｉ）組織移植 （ｉｉ）遺伝子連鎖分析 （ｉｉｉ）ヒトゲノムプログラム （ｉｖ）行方不明の子供の肯定的同定 ２、動物：馬、乳牛、畜生、家庭の愛玩動物（ｉ）純粋な遺伝的形質 （ｉｆ）血統の確認 （ｉｆｆ）動物の肯定的同定 ３、植物１種 （ｉ）遺伝的多様性の保証 （ｉｉ）干ばつ及び病気に対する耐性種の同定このように本発明者等は本発明の 好ましい態様を説明及び記載してきたが、この発明は変化及び修飾を施すことが でき、故に本発明者等は開示された正確な用語に制限されることを望まず、本発 明を様々な用途及び条件に適合させるためになされるこのような変化および変更 を利用することを望むということが理解されるべきである。したがってこのよう な変化および変更は、正しくは同等物の範囲全体の中にあるよう、そして故に以 下の請求項の範囲内にあるよう、意図されている。 本発明の属する、または本発明が最も密接に関連する分野における通常の知識を 有するいかなる者も本発明を作成及び使用できるよう、本発明及び方法及びこれ を作成及び使用する工捏を、このように完全な、明快な、簡潔な且つ正確な用語 で記載してきた ＦＩＧ、　１ Ｑつ ロコ Ａ　日　ＣＤＥＦＧ ＦＩＧ、　９ 要約書 この発明は、サーマス・アクアチカスＨＢ８株からの好熱性ＤＮＡリガーゼの遺 伝子のクローニング、および種々の核酸試料中で、ヌクレオチドの特異的な配列 、より詳細にはそれらの試料中に１つだけの核酸塩基対の変化、即ち、欠失、挿 入、または転移を含んでいる核酸配列の標準配列との違いを特徴とするＤＮＡ配 列を含んでいるヌクレオチドの特異的な配列を検出するこのリガーゼの用途に関 する。 悶ａ！Ｉｌ査報告 ｐＣＴ／ＵＳ９１１０２９６Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＡＴＣＣ５５０３２と命名された細胞系ＡＫ７６。 ２．ｐＤＺ１から選ばれ、ＡＴＣＣ６８３０７と命名されたプラスミド、および ｐＤＺ７から選ばれ、ＡＴＣＣ６８３０８と命名されたプラスミド。 ３．本質的に好熱性サーマス・アクアチカスＨＢ８株リガーゼ酵素を暗号化して いるＤＮＡ配列を含むそのような配列へ高度緊縮下にハイブリッド形成する、単 離され精製されたＤＮＡ断片または核酸配列。 ４．核酸配列 【配列があります】 を有する熱安定リガーゼを暗号化している部分配列を含む、そのような断片へ高 度緊縮下にハイブリッド形成する、単離され精製されたＤＮＡ断片または核酸配 列。 ５．（１）サーマス・アクアチカスＨＢ８リガーゼ、（２）サーマス・アクアチ カスＨＢ８リガーゼ中の６連続アミノ酸残基に対応する少なくとも６連続アミノ 酸残基を有する熱安定リガーゼ、および（３）リガーゼまたはその断片のアミノ 酸配列中で、アミノ酸残基を挿入し、置換し、または欠失したサーマス・アクア チカスＨＢ８リガーゼまたはその断片のリガーゼ活性を有する変異体を含んだ群 から選ばれた、熱安定リガーゼを暗号化しているＤＮＡ配列を含んでいる発現ベ クター。 ６．約５０℃〜約８５℃の温度で２本鎖ＤＮＡ中の１本鎖切断部位でリン酸ジエ ステル結合の生成を触媒し、９０℃〜約１０５℃の温度へ上昇しても、不可逆的 に変性されず、その触媒能を失わない単離され精製されたポリペプチド。 ７．アミノ酸配列 【配列があります】 を有する単離され精製されたポリペプチド。 ８．ポリペプチドが、約５０℃〜約８５℃の温度で２本鎖ＤＮＡ中の１本鎖切断 部位でリン酸ジエステル結合の生成を触媒し、約９０℃〜約１０５℃の温度で処 理しても、不可逆的に変性されず、その触媒能を失わないサーマス・アクアチカ ス・リガーゼの発現を暗号化しているベクターで形質転換された組換え体生物か ら単離され精製されたポリペプチド。 ９．約５０℃〜約８５℃の温度で、ＤＮＡの相補鎖ヘハイブリッド形成された２ つの隣接オリゴヌクレオチド間でリン酸ジエステルの生成を触媒する、単離され 精製されたリガーゼ。 １０．約５０℃〜約８５℃の温度で相補的なＰＮＡの標的配列へ２つの隣接オリ ゴヌクレオチドをハイブリダイズするライゲーションを触媒し、そのライゲーシ ョンで生成した生産物が隣接オリゴヌクレオチドの接合部で１つの塩基ミスマッ チがある場合の約５０〜約５００倍以上である単離され精製されたリガーゼ。 １１．約０．２５分間〜約４分間、約９０℃〜約１０５℃の温度へ反復して予熱 したのち、約５０℃〜約８５℃の温度でＤＮＡの相補鎖ヘハイブリッド形成され た２つの隣接オリゴヌクレオチドの間でリン酸ジエステルの生成を触媒する触媒 能を保有する単離され精製されたリガーゼ。 １２．約５０℃〜約８５℃の温度でＤＮＡの相補鎖ヘハイブリッド形成された２ つの隣接オリゴヌクレオチドの間でリン酸ジエステルの生成を触媒する触媒能を 保有し、約０．２５分間〜約４分間、約９０℃〜約１０５℃の温度へ反復して予 熱したのち、そのライゲーションで生成した生産物が隣接オリゴヌクレオチドの 接合部で１つの塩基ミスマッチがある場合の約５０〜約５００倍以上である単離 され精製されたリガーゼ。 １３．（１）標的配列核酸に対して棺桶的で、モル過剰にある２つの隣接オリゴ ヌクレオチドの第１の組合わせを含み、隣接オリゴヌクレオチドの接合部で標的 配列ＤＮＡに対してはミスマッチをさらにもたない反応混合物を提供し、（２） 約５０℃〜約１０５℃の温度へ上昇しても、不可逆的に変性されず、その触媒能 を失わない熱安定リガーゼを提供し、（３）リガーゼ混合物を、約９０℃〜約１ ０５℃の第１の温度範囲、および約５０℃〜約８５℃の第２の温度範囲を含む少 なくとも２つの温度サイクルへ加えることを含む 既知のヌクレオチド配列からなる核酸試験物質を増幅する方法。 １４．（１）標的配列核酸に対して相補的な２つの隣接オリゴヌクレオチドを含 む反応混合物を提供し、ここでこれらのオリゴヌクレオチドは、隣接ヌクレオチ ドの接合部で変異標的配列核酸に対して少なくとも１つのミスマッチ塩基対を有 するが、正常な標的核酸配列に対しては有せず、（２）標的配列核酸に対して相 補的な２つの隣接オリゴヌクレオチドを含み、隣接ヌクレオチドの接合部で正常 な標的配列核酸に対して少なくとも１つのミスマッチ塩基対を有するが、変異標 的配列核酸に対しては有しない反応混合物を提供し、（３）第１および第２の各 反応混合物を、５０℃〜約１０５℃の温度へ加熱しても不可逆的に変性されず、 触媒能を失わない熱安定リガーゼを提供し、（４）各リガーゼ混合物を、それぞ れ約９０℃〜約１０５℃の第１の温度、および約５０℃〜約８５℃の第２の温度 を含む少なくとも１温度サイクルに付し、（５）各反応混合物中で、隣接オリゴ ヌクレオチドが可能な共有結合を作るようにさせ、 （６）各反応混合物中で、可能な共有結合をしたオリゴヌクレオチドから試験物 質および未結合オリゴヌクレオチドを分離し、（７）各反応混合物中で、共有結 合したオリゴヌクレオチド生産物の存在、または存在しないことを検出し、 ここで第１の反応混合物では、共有結合したオリゴヌクレオチドの存在が正常な 配列の存在を示し、第２の混合物では、共有結合したオリゴヌクレオチドの存在 が変異配列の存在を示していることを含む配列中に、少なくとも１標的ヌクレオ チドの位置で既知の正常なヌクレオチド配列および可能性ある既知の突然変異を 有する、生物に由来する核酸試験物質を検出する方法。 １５．（１）標的配列核酸と相補的な２つの隣接オリゴヌクレオチドを含み、こ こで１オリゴヌクレオチドが標識され、隣接オリゴヌクレオチドの接合部で、突 然変異標的配列核酸に対して少なくとも１つのミスマッチ塩基対があるが、正常 な標的配列核酸に対してはない第１の反応混合物を収約する容器、（２）標的配 列核酸と棺桶的な２つの隣接オリゴヌクレオチドを含み、ここで１オリゴヌクレ オチドは標識され、正常な標的配列核酸に対して少なくとも１つのミスマッチ塩 基対があるが、突然変異標的配列核酸に対してはない第２の反応混合物を収納す る容器、 （３）５０℃〜約１０５℃の温度へ加熱しても、不可逆的に変性されず、その触 媒能を失わない熱安定リガーゼ を含んだキットである、配列中に、少なくとも１標的ヌクレオチド位置で既知の 正常なヌクレオチド配列および可能性ある既知の突然変異を有する、生物に由来 するＤＮＡまたはＲＮＡ試験物質を検定するキット。