JPH07509371A - 核酸配列の検出及び増幅のための方法，試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 核酸配列の検出及び増幅のための方法、試薬及びキット発明の分野 本発明は、デオキシリポ核酸（ｒＤＮＡＪ）およびリボ核酸（ｒＲＮＡＪ　）の 分析、所定の特異ＤＮＡおよび／またはＲＮＡヌクレオチド配列の存在の測定、 並びに、かかる配列の指数増幅（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ）に関する。

゛　発明の背景 特定の所定の配列を有する核酸分子の存在を検出することが可能であるというこ とは、法医学、医学、疫学および公衆衛生学のような種々の分野並びに疾病の予 知および診断において特に重要である。このようなことが可能であることは誤っ て個人が告訴されるようなことをなくし、あるいは過失のある当事者を浮かび上 がらせることにより犯罪捜査を援助することができる。これは、伝染病の原因ま たは腫瘍および組織のサンプルの特徴を識別することができるように、あるいは 血液製品の健全性を確保するのに利用することができる。

サンプルにおける特定の核酸配列の存在を検出する能力は、２つの個体が互いに 関連する可能性または個体が遺伝病に罹る可能性を予知するのに重要である。か かる能力はまた、飲料水、ミルクその他の食物の純度を測定する検定においても 使用することができる。

多くの重要なケースにおいては、所望の核酸配列は、サンプルに非常に低い、！ ！度で存在する。このような場合、検定感度が精巧な標識の使用によって高くな らない場合には、所望の分子の存在は検出を免れる可能性がある。検定感度は、 検出を観察者に報告しあるいは合図する態様を変えることにより高めることがで きる。かくして、例えば、検定感度は、検出可能標識が付された試薬を使用する ことにより高めることができる。種々のこのような標識がこのために使用されて おり、かかる標識には、酵素標識［クリルスキー（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ）等の米 国特許第４，５８１，３３３号］、放射性同位体標識［ファルコウ（Ｆａｌｋｏ ｗ）等の米国特許第４．３５．８，５３５号、バーニンガー（Ｂｅｒｎｉｎｇｅ ｒ）の米国特許第４，４４６，２３７号］、蛍光標識［アルバレラ（＾１ｂａｒ ｅｌｌａ）等のヨーロッパ特許第１４４９１４号］、化学標識［ジェルトン三相 （Ｓｈｅｌｄｏｎ　ｌ１ｊ）等の米国特許第４．５８２，７８９号、アルパレラ 等の米、国特許第４．５６３゜４１７号］、改質塩基［ミヨシ（Ｍｉｙｏｓｈｉ ）等のヨーロッパ特許第１１９４４８号］などが含まれる。

高度の検出可能標識試薬の使用により核酸検出検定の感度を改善することができ るが、かかる検定の感度は、検定により検出しようとする核酸が存在しない場合 に発生される背景信号を増加させる非特異反応に大いに関係がある実際的な問題 により制限された状態に置かれる。かくして、幾つかの用途の場合には、所望の 核酸分子の予想濃度は著しく低いので、上記した方法のいずれかによりこれを検 出ことは不可能となる。

核酸１度の感度の制限を克服する方法の１つに、検定を実施する前に検出しよう とする核酸分子を選択的に増幅仝せよつとする方法がある。精製された核酸フラ グメントを増幅することができる生体内組換えＤＮＡ方法が、以前から認識され ている［コーエン（Ｃｏｈｅｎ）等の米国特許第４，２３７，２２４号、ニュー ヨーク化、コールド・スプリング＋ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ）に所在するコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス（ ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）か ら発行された、ジェイーサムブルノク（Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等著の「モレ キュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）］　。一般的に は、かかる方法は、Ｄ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導 入、ベクターのクローン増幅および増幅された核酸フラグメントの回収に関連す る。

最近になって、生体外増幅方法が開発された。この方法の衝撃は驚異的なもので あり、かかる増幅なしには、上記した例示の分野のほとんどは、不可能あると考 えられる。か（して、ＤＮＡ増幅が拡がった領域のように、種々の増幅技術に関 する要求に変化が生じている。従って、極めて特定的な技術が特に当面の問題と してかつ継続して待望されている。

恐らく、これらの方法のうち最も広〈実施されている方法は、「ポリメラーゼ鎖 反応Ｊ　（”ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ”（”ＰＣ Ｒ″））である［ミュリス・ケイ（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、）らのｒｃｏｌｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　Ｊ第５１巻 、第２６３−２７３頁（１９８６年）、アーリノチ・エイチ（Ｅｒｌｉｃｈ　Ｉ （、）らのヨーロッパ特許第５０．４２４号、同第８４．７９６号、同第２５８ ，０１７号および同第２３７．３６２号、ミュリス・ケイのヨーロッパ特許第２ ０１．１８４号、ミュリス・ケイらの米国特許第４，６８３，２０２号、アーリ ノチ・エイチの米国特許第４．５８２，７８８号、並びにサイキ（Ｓａｉｋｉ、 　Ｒ，）らの米国特許第４．６８３．１９４号、本明細書においてはこれらの文 献を引用してその説明に代える］。

ＰＣＲは、特定の核酸配列の増幅されるべき領域と相補的な２つのオリゴヌクレ オチドプライマを使用して、この核酸の増幅を行なう。この方法は、所望の核酸 分子が予め精製されておらず、かつ、持寓のサンプルに単一コピーでのみ存在す る場合でも、この核酸分子の４度を選択的に増加させる。この方法は、−重鎮ま たは二重鎖ＤＮＡを増幅させるのに使用することができる。

この方法は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、一対のオリゴヌクレオチドプライ マの鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）依存伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を支配するもの である。プライマ伸長生成物は、次に、その後の複製工程の鋳型となる。

ＰＣＲ法の２つのオリゴヌクレオチドプライマの正確な性質は、この方法を成功 に導くうえで重要である。周知のように、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子は方向性を 有しており、これは分子の糖燐酸主鎖の５°　−〉３゛結合を介して授与される 。２つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、一方の分子の末端５°燐酸基と第２の分子 の末端３゛水酸基との間でのホスホジエステル結合の形成を介して互いに結合さ せることができる。核酸分子のポリメラーゼ依存増幅は、核酸分子の３゛　ヒド ロキシル端部に対する５゛　ヌクレオシド三リン酸の付加により進行する。かく して、ポリメラーゼの作用により核酸分子の３°末端の伸長が行なわれる。２つ のＰＣＲプライマのオリゴヌクレオチド配列は、これらが、増幅が所望される特 定の核酸分子の配列の側面に関連する配列と同じまたは相補的な配列を含むよう に選択される。即ち、「第１の」プライマのヌクレオチド配列は、所望の核酸分 子の配列に対して３′に位置するオリゴヌクレオチド配列に対するハイブリッド 形成を行なうことができるように選択され、一方、「第２の」プライマのヌクレ オチド配列は、所望の核酸分子の配列に対して５゛に存在するものと同じヌクレ オチド配列を含むように選択される。双方のプライマとも、酵素仲介核酸合成に 必要な３′　ヒドロキシル基を有する。

ＰＣＲ反応は、「第１の」プライマの伸長生成物が「第２の」プライマの配列と 相補的な配列を含み、かくして、「第２の」プライマの伸長生成物の鋳型として 作用するので、特定の核酸配列の指数増幅を行なわせることができる。同様に、 「第２の」プライマの伸長生成物は、必然的に、「第１の」プライマの配列と相 補的な配列を含み、かくして、「第１の」プライマの伸長生成物の形成の鋳型と して作用する。かくして、７〜イブリツド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ） 、重合および変性のサイクルを許容することにより、所望の核酸分子の１度を幾 何学的に高めることができる。

ＰＣＲ技術は、ポリヌクレオチド分子の増幅を迅速かつ広範に行なうことができ るので有用である［ミュリス・ケイ・ビー（Ｍｕｌｌｉｓ。

Ｋ、　Ｂ、　）等の「コールド・スプリング・／％−ノ＜−・クオンタンム・／ くイオロジー、第５１巻、第２６３−２７３頁（１９８６年）、サイキ・アール ・ケイ（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ，！［、）等のバイオ／テクノロジー（Ｂｉ。

／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３巻、第１００８−１０１２頁（１９８５年）、 ミュリス・ケイ・ビー等の「メ゛へ３１ズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔ、 　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　、第１５５巻、第３３５−３５０頁（１９８７年）、本 明細書においてはこれらの文献を引用してその説明（こ代えるコ。しかしながら 、ＰＣＨに関しては、幾つかの実際的な問題力（存在する。２つの鋳型に沿った 第１の外来配列は、プライマと１１イブリツドを形成することができ、か（して 、かかる非特定の／＼イブリッド形成により共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌ　ｉｆ　１ ｃａｔｉｏｎ）が行なわれる。増幅のレベルが高まるにつれ、かかる共増幅の程 度も高まる。更に、ＰＣＲは各初期の鋳型に関して数百万のコピーを容易に形成 することができるので、前の反応の最終生成物が他のサンプルに偶然に入り込み 、間違った正の結果（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ）を容易 に示す。更にまた、ＰＣＲは、単塩基（ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ）の変化を検出 することができず、即ち、プロトコールは「正常な」配列と対立遺伝子変異体配 列との区別を本質的に行なわない。

ＰＣＨの出現により、別の増幅方法が開発された。かかる代替法の１つに、「リ ガーゼ連鎖反応Ｊ　（”Ｌｉｇａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（”Ｌ ＣＲ”）がある［バラニー・エフ（Ｂａｒａｎｙ、　Ｆ、）のプロシーデイング ズ・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（アメリカ合衆国） 　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｄ、　Ｓｃｉ、　（ＩＪ、Ｓ、Ａ、）　、第 ８８巻、第１８９ないし１９３頁（１９９１年）］。ＬＣＲは、特定のターゲッ トを指数的に増幅させるのに二対のオリゴヌクレオチドプローブを使用する。各 対をなすオリゴヌクレオチドの配列は、この対がターゲットの同じ鎖（ｓｔｒａ ｎｄ）の隣接する配列に対してハイブリッド形成を行なうことができるように選 択される。かかるＩ＼イブリ・ラド形成により、鋳型依存リガーゼの基体が形成 される。か（して、ターゲットの「第１の」鎖に対する第１の対のオリゴヌクレ オチドの７％イブリッド形成により、オリゴヌクレオチドを互いに連結反応させ ることができる。第２の対のオリゴヌクレオチドの配列は、オリゴヌクレオチド がこの連結反応の生成物の隣接する配列に対して）１イブリツド形成を行なうこ とにより、連結反応の第２の鎖を形成することができるように選択される。第２ のストランドの連結反応生成物は、かくして、ターゲットの「第１の」配列と実 買上同−の配列を有する。

ＰＣＨの場合と同様に、得られた生成物は、その後のサイクルにおいて鋳型とし て作用し、所望の配列の指数増幅が得られる。有益なことに、ＬＣＲは、突然変 異、特に、単ヌクレオチド突然変異を検出するのに利用することができる。かく して、プライマは、ターゲットの分子が所定の突然変異部位を含みあるいは欠く 場合にのみ、互いに連結反応を行なうことができるように構成することができる 。

ＬＣＲに関する問題の１つに、当然のことであるが、手順が４つのオリゴヌクレ オチドと１つのりガーゼを必要とし、オリゴヌクレオチドの非特定の「プラント エンド連結反応」を行なう可能性があるという問題がある。かかる非特定の「プ ラントエンド連結反応」が起こると、オリゴヌクレオチドのターゲット非依存指 数増幅を引き起こす。これにより、高い背景信号即ち間違った正の結果を示すこ とになる。

かかる欠点は、幾つかの点においては、近接する（ａｄｊａｃｅｎｔ）が隣接は しない（ｎｏｎ−ａｂｕｔｔｉｎｇ）配列に対してハイブリッド形成を行なうオ リゴヌクレオチドを使用して対処することができる（ＰＣＴ出願Ｗ○９０１０１ ６０６９号）。ＬＣＲの場合と同様、２組のプライマの使用を必要とする。しか しながら、プライマは、ターゲット分子の非隣接配列に対してハイブリッド形成 を行なうように構成されているので、ハイブリッド形成生成物は、ハイブリッド 形成されたオリゴヌクレオチドを分離する「ギャップ」を含む。これらのギャッ プは、次に、（Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼにより仲介されるような）相補ｄＮＴＰ が充填され、あるいは別の対をなすオリゴヌクレオチドが充填される。かくして 、各サイクルの終点においては、各単鎖は、次のサイクルの際にターゲットとし て作用することができる補体を有し、所望の配列の指数増幅が得られる。

このプロトコールはターゲットが存在しない場合の非特定プラントエンド連結反 応のＬＣＲ問題を避けることができるが、単塩基突然変異変化を検出するＬＣＲ の能力によりこれを行なうとともに、「ギャップ」全体の配列を前もって知るこ とが必要となる。更に、この技術を使用する場合の重要な難点として、「ギャッ プ」がｄＮＴＰのサブセットだけをもって「修復する」（”ｒｅｐａｉｒ”）こ とができるようにオリゴヌクレオチドプライマを構成する必要があることが挙げ られる。即ち、ギャップは４つのｄＮＴＰの最大３つだけが反応容器に加えるこ とができるように、塩基の４つ全てから構成することはできない。

「オリゴヌクレオチド連結反応検定Ｊ　（”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　 Ｌｉｇａ−ｔｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ”）じ０ＬＡ−）［ランデグレン・：Ｌ　（Ｌ ａｎｄｅｇｒｅｎ。

Ｕ、）等のサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、第２４１巻、第１０７７−１０８ ０頁（１９８８年）〕は、ＬＣＲとある類似性を共有する。

ＯＬＡプロトコールは、ターゲットの単鎖の隣接する配列に対してハイブリッド を形成することができるように構成された２つのヌクレオチドを使用する。ＯＬ Ａは、ＬＣＲと同様、点変異の検出に特に適している。しかしながら、ＬＣＲと は異なり、ＯＬＡは、ターケノト配列の指数増幅ではなく「リニア」となる。か くして、ＯＬＡには、指数増幅を行なうことができないという問題がある。

二ノカーソン・ディー・エイ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ、　Ｄ、＾、）等は、ＰＣＲ とＯＬＡの属性を組み合わせた核酸検出検定を説明している［二・ソカーソン・ ディー・エイ等のプロシーデイングズ・イブ・ザ・ナシコナル・アカデミ−・イ ブ・サイエンス（アメリカ合衆国）、第８７巻、第８９２３−８９２７頁（１９ ９０年）〕。この方法においては、ＰＣＲはターゲットＤＮＡの指数増幅を行な うのに使用され、このＤＮＡは、次に、ＯＬＡを使用して検出される。かかる組 み合わせに関連する問題の１つに、複数のかつ別体をなす処理工程を必要とする ことに加えて、ＰＣＲとＯＬＡに関連する全ての問題を受け継ぐという問題があ る。

池の公知の核酸増幅処理には、転写ベースの増幅システムが含まれる［フォー・ ディー（ｌ［ｗｏｈ　Ｄ）等のプロシーデイングズ・イブ・ザ、ナショナル・ア カデミ−・イブ・サイエンス（アメリカ合衆国）、第８６巻、第１１７３頁（１ ９８９年）、ジンジエラス・ティー・アール（Ｇｉｎｇｅｒａｓ　Ｔ、Ｒ，）等 のＰＣＴ出１ｌＷＯ８８／１０３１５号（優先権・米国特許出願第０６４，１４ １号および第２０２．９７８号）］。得られる「ジ−オリゴヌクレオチド」の配 列を有する核酸の存在下での２つ（以上）のオリゴヌクレオチドの連結反応に基 づく方法もまた、公知である［ウー・ディー・ワイ（Ｗｕ、　Ｄ、Ｙ、）等のジ ェノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第４巻、第５６０頁（１９８９年）］。

ミラー・エイチ・アイ（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｈ，１，）等のＰＣＴ出願′（優先権 。

１９８８年１月２１日付出願の米国特許出願第１４６，４６２号）には、ターゲ ットの一重鎖ＤＮＡ　（”ｓ　ｓ　ＤＮＡ”）に対するプロモータ／プライマ配 列のノーイブリッド形成を行ない、次Ｌ１で、この配列の多くのＲＮＡコピーの 転写を行なうことによる核酸配列増幅法が開示されている。この方法はサイクル ではなく、即ち、新しい鋳型は得られたＲＮＡから得られなかった。

マレック・エル・ティー（Ｍａｌｅｋ、　Ｌ、？、）等の米国特許第５．１３０ ．２３８号およびディビー・ノー・（Ｄａｖｅｙ、　Ｃ，）等の（ヨーロッパ特 許出願公開第３２９，８２２号）には、−重鎖ＲＮＡ（”５ｓＲＮＡ”　）　、 ｓ　５ＤＮＡおよび二重鎖ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ）をサイクル合成することに関 する核酸増幅法が開示されている。この５ｓＲＮＡは、最初のプライマオリゴヌ クレオチドの最初の鋳型であり、オリゴヌクレオチドは逆転写酵素（ＲＮＡ−依 存ＤＮＡポリメラーゼ）により伸長される。次に、ＲＮＡは、リボヌクレアーゼ Ｈ（ＲＮａｓ　ｅＨ，ＤＮＡまたはＲＮＡとの二重体（ｄｕｐｌｅｘ）における Ｒ　Ｎ　Ａに特有のＲＮａｓｅ）の作用により、得られたＤＮＡ　：　ＲＮＡ二 重体から除去される。得られたｓ　５ＤＮＡは、第２のプライマ用の第２の鋳型 であり、このプライマもまた、その鋳型に対して、ＲＮＡポリメラーゼプロモー タ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）５′　対談プロモータの相同体の配列を 含む。このプライマは、次いで、［Ｅ、ｃ　ｏ　ｌ　ｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ の大きな「フレノウ」（”Ｋｌｅｎｏｗ”）フラグメントによって例示される］ ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて二重鎖ＤＮＡ　（ｒｄｓＤＮＡＪ　）分子 となり、この分子は、プライマ間に元のＲＮＡと同じ配列を有するとともに、一 端にプロモータ配列を更に有する。このプロモータ配列は、ＤＮＡの多数のＲＮ Ａコピーを形成するために適宜のＲＮＡポリメラーゼにより使用されることがで きる。次に、これらのコビニは再度サイクルに入１て、著しく迅速な増幅を行な うことができる。酵素を適宜選択することにより、この増幅は、各サイクルにお いて酵素を添加することなく等温で行なうことができる。この方法は、サイクル 性を有するので、出発配列をＤＮＡまたはＲＮＡの形態となるように選択するこ とができる。この方法の改良が、シュスター（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ）等により開発 され（米国特許第５．１６９，７６６号）、この米国特許には、マレック（米国 特許第５，１３０．２３８号）に教示されているプライマの伸長は必要ないと記 載されている。

これらの増幅処理はいずれも、サイクルの最終生成物が出発物質と機能的に同じ であるという原則によるものである。かくして、サイクルを繰り返すことにより 、核酸は指数的に増幅される。

制限エンドヌクレアーゼとりガーゼが制限部位の１つの鎖にヌクレオチド５゛　 −（α−千オ］　トリホスフェートを含有するターゲット分子の増幅を行なうの に使用される等昌増幅法が記載されて（する［ウォーカー・ノー・ティー（Ｗａ ｌｋｅｒ、　Ｇ、Ｔ、）等のプロシーデイングズ・イブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・イブ・サイエンス（アメリカ合衆国）、第８９巻、第３９２−３９６頁 （１９９２年）］。

熱サイクル操作を利用する方法［例えば、ＰＣＲまたウー・ディー・ワイ等のジ ェノミックス、第４巻、第５６０頁（ＩＬ８９年）］は、各サすクルにおいて１ つの生成物が各鋳型から形成されるので、サイクル当たり２倍の生成物という理 論的に最大の増加をもたらす。実際には、この増加は２倍よりも常に低０゜増幅 を更１こ緩慢にすることは、温度を変える場合に時間を要する。更に遅延力域加 わると、サイクルにおいて全ての分子が工程を終えるのＩこ十分な時間を許容す る必要がある。工程を終えた分子（よ、サイクルの次の工程に進む前に、該分子 のより緩慢な部分が仕上げを行なうのに待つ（”ｗａｉｔ”）ことをしなければ ならず、サイクルを短くすることは、より緩慢な（”ｓｌｏｗｅｒ”）分子によ り１サイクルの飛び越しを行なうことになり、増幅の指数が小さくなる。

転写工程、例えば、本発明、マレック・エル・ティー・等（米国特許第５，１３ ０．２３８号）またはディビー・シー等（ヨーロッパ特許出願公開第３２９．８ ２２号）の転写工程を含む方法は、各サイクルにおいて２倍を越える程度まで生 成物を増加させることができる。実際に、１００以上の転写体を１つの鋳型から 形成することができるので、１００以上の増加倍数が理論的には容易に得ること ができる。更にまた、全ての工程が同じ条件で行なわれる場合には、特定の工程 を終えたいずれの分子も、次の工程に進む前に「寺つ」必要がなくなる。かくし て、転写に基づくとともに、熱サイクル操作を必要としない増幅は、ＰＣＨのよ うな熱サイクル操作による増幅よりも遥かに迅速である。　□ 以上のように、種々の増幅方法が開発されているが、ターゲット分子の指数増幅 を仲介することができ、しかも単ヌクレオチド対立遺伝子変異を検出することが できる著しくターゲット依存性（ｔａｒｇｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）のある方 法が特に所望されている。本発明は、かかる方法を提供するものである。

発明の概要 本発明は、かくして、ターゲット分子に存在する所望の配列を増幅させる改良さ れた方法を提供するものである。この方法は、一般に、ターゲット分子に対して ブロッカ−オリゴヌクレオチド（Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅ）のハイブリッド形成に基づ（。ハイブリッド形成は、ブロッカ−オリゴヌ クレオチドがプライマオリゴヌクレオチドまたはターゲットに対して同様にハイ ブリッド形成されるプライマオリゴヌクレオチドの伸長生成物（ｅｘｔｅｎｓｉ ｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ）に隣接するように、プライマオリゴヌクレオチドを位置 決め即ち配置する。この配置の結果、プライマオリゴヌクレオチド（またはその 伸長生成物）およびブロッカ−オリゴヌクレオチドは互いに連結反応される。か かる連結反応により、ブロッカ−オリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成 を行なうことができるエンドラン（Ｅｎｄ−Ｒｕｎ）オリゴヌクレオチドのポリ メラーゼ仲介の（ｐｏｌｕｍｅｒａｓｅ−ａ＋ｅｄｉａｔｅｄ）鋳型依存性伸長 体の基体が得られる。エンドランオリゴヌクレオチドの伸長生成物はブライオマ オリゴヌクレオチドおよびブロッカ−オリゴヌクレオチド配列と相捕的であるの で、反応は、ターゲット分子のす旨数増幅を仲介することができる。有意なこと に、この方法は、単ヌクレオチドだけが異なる対立遺伝子変異体間で区別を行な うことができる。

詳細に説明すると、本発明によれば、 （Ａ）ターゲット核酸分子に対してブロッカ−オリゴヌクレオチドをハイブリッ ド形成することにより二重鎖核酸分子を形成する工程と、 （Ｂ）プライマオリゴヌクレオチドの３°末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）がハイブリ ッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端に隣接しまたはポリメ ラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長されてハイブリッド形成され たブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端に隣接することができるように二重 鎖核酸分子のターゲット核酸分子に対してプライマオリゴヌクレオチドをハイブ リッド形成する工程と、 （Ｃ）（１）ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３°末端が ハイブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５′末端に隣接する場 合には工程（Ｄ）を行なう工程と、または （２）ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３゛末端が、ハイ ブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５′末端に隣接しないこと により、ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３°末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長させて、ハイブリッド形成 されたブロックオリゴヌクレオチドの５°末端に隣接する３°末端を有するプラ イマ伸長生成物を形成する場合には、次に工程（Ｄ）を行なう工程と、 （Ｄ）工程（Ｃ）（１）のハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチド の隣接３°末端または工程（Ｃ）（２）のノーイブリッド形成されたプライマ伸 長生成物の隣接３゛末端をハイブリツド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチ ドの５°末端に対して連結反応させることによりプライマオリゴヌクレオチドま たはプライマ伸長生成物の配列およびブロックオリゴヌクレオチドの配列を有す る連結反応生成物を形成する工程と、 （Ｅ）連結反応生成物のブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列に対してエンドラ ンオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程と、 （Ｆ）ポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応においてハイブリッド形成さ れたエンドランオリゴヌクレオチドの３°末端を伸長してエンドラン伸長生成物 を形成することにより、ターゲット分子の１度を増幅させる工程とを備え、 前記工程（’Ａ　）と、前記工程（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）の群と、前記工程 （Ｅ）および（Ｆ）の群は互いに対して任意の順序で行なわれることを特徴とす るターゲット核酸分子の濃度を増幅させる方法が提供されている。

本発明によれば、 （Ｇ）エンドラン伸長生成物に対してブロッカ−オリゴヌクレオチドをハイブリ ッド形成させて二重鎖核酸分子を形成する工程と、（Ｈ）工程（Ｇ）の二重鎖核 酸分子のエンドラン伸長生成物に対してプライマオリゴヌクレオチドを／１イブ リ・ノド形成して、プライマオリゴヌクレオチドの３゛末端が／％イブリッド形 成されたプロ・７カーオリゴヌクレオチドの５°末端に隣接しまたはポリメラー ゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長されてハイブリ・ノド形成された ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接する二重鎖核酸分子を形成する 工程と、 （１）（１）工程（Ｈ）のハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチド の３゛末端がノ）イブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末 端に隣接する場合には、工程（Ｊ）を行なう工程と、または ゴヌクレオチドの３°末端がハイブリッド形成されたプロ・ンカーオリゴヌクレ オチドの５°末端に隣接しないことにより、ノーイブリッド形成されたプライマ オリゴヌクレオチドの３“末端をポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応に おいて伸長させて、ノ＼イブリ・ノド形成されたブロックオリゴヌクレオチドの ５′末端に隣接する３′末端を有するプライマ伸長生成物を形成する場合には、 次いで、工程（Ｊ）を行なう工程と、 （Ｊ）工程（Ｉ）（１）のハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチド の隣接３°末端または工程（Ｉ）（２）のハイブリッド形成されたプライマ伸長 生成物の隣接３゛末端をハイブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチド の５°末端に対して連結反応させることにより連結反応生成物を形成しかつ増幅 させる工程と、 （Ｋ）工程（Ｊ）の連結反応生成物のブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列に対 してエンドランオリゴヌクレオチドを／１イブリッド形成する工程と、 （Ｌ）ポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応においてノλイブリッド形成 されたエンドランオリゴヌクレオチドの３°末端を伸長することにより、エンド ラン伸長生成物を形成かつ増幅させる工程とを更に備える上記方法の例が提供さ れている。

本発明はまた、上記方法の例に関するもので、この例は、工程（Ｆ）の後に、 （Ｇ）エンドラン伸長生成物に対して第２のプロ・ｙカーオリゴヌクレオチドを ハイブリッド形成することにより、工程（Ａ）のブロッカ−オリゴヌクレオチド または工程（Ｂ）のプライマオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成することが できない部位に第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドがエンドラン伸長生成物に 対して７％イブリッド形成を１１なう二重鎖核酸分子を形成する工程と、（Ｈ） 二重鎖核酸分子のエンドラン伸長生成物に対して第２のプライマオリゴヌクレオ チドをハイブリッド形成して、第２のプライマオリゴヌクレオチドの３°末端が ハイブリッド形成された第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの５′末端に隣接 しまたはポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長されてハイブ リッド形成された第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接する二 重鎖核酸分子を形成する工程と、（１）（１）ハイブリッド形成された第２のプ ライマオリゴヌクレオチドの３°末端がハイブリッド形成された第２のブロッカ −オリゴヌクレオチドの５゛末端に隣接する場合には、工程（Ｊ）を行なう工程 と、または （２）ハイブリッド形成された第２のプライマオリゴヌクレオチドの３゛末端が ハイブリッド形成された第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接 しないことにより、ハイブリッド形成された第２のプライマオリゴヌクレオチド の３゛末端をポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長させて、 ノーイブリッド形成された第２のブロックオリゴヌクレオチドの５°末端に隣接 する３°末端を有する第２のプライマ伸長生成物を形成する場合には、次いで、 工程（Ｊ）を行なう工程と、（Ｊ）工程（Ｉ）（１）のハイブリッド形成された 第２のプライマオリゴヌクレオチドの隣接３°末端または工程（Ｉ）（２）のハ イブリッド形成された第２のプライマ伸長生成物の隣接３°末端をハイブリッド 形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に対して連結反応させるこ とにより、第２のプライマオリゴヌクレオチドまたは第２のプライマ伸長生成物 の配列および第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列を有する第２の連結反 応生成物を形成する工程と、 （Ｋ）第２の連結反応生成物の第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列に対 して第２のエンドランオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する工程と、 （Ｌ）ポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応においてハイブリッド形成さ れた第２のエンドランオリゴヌクレオチドの３゛末端を伸長して、エンドラン伸 長生成物を形成することによりターゲット分子の配列を増幅する工程を更に備え る。

上記した工程（Ｇ）ないしくＨ）の代わりに、本発明は、工程（Ｆ）の次に、 （Ｇ）連結反応生成物に対して第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドをハイブリ ッド形成することにより、工程（Ａ）のブロッカ−または工程（Ｂ）のプライマ オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成することができない部位に第２のブロッ カ−オリゴヌクレオチドが連結反応生成物に対してハイブリッド形成を行なう二 重鎖核酸分子を形成する工程と、 （Ｈ）二重鎖核酸分子の連結反応生成物に対して第２のプライマオリゴヌクレオ チドをハイブリッド形成して、前記第２のプライマオリゴヌクレオチドの３゛末 端がハイブリッド形成された第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に 隣接しまたはポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長されてハ イブリッド形成された第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接す る二重鎖核酸分子を形成する工程と、（，１）−（１）ハイブリッド形成された 第２のプライマオリゴヌクレオチドの３°末端がハイブリッド形成された箪２の ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接する場合には、工程（Ｊ）を行 なう工程と、または （２）ハイブリッド形成された第２のプライマオリゴヌクレオチドの３′末端が 、ハイブリッド形成された第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣 接しないことにより、ハイブリッド形成された第２のプライマオリゴヌクレオチ ドの３°末端をポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長させて 、ハイブリッド形成された第２のブロックオリゴヌクレオチドの前記５゛末端に 隣接する３′末端を有する第２のプライマ伸長生成物を形成する場合には、次い で、工程（Ｊ）を行なう工程と、（Ｊ）工程（Ｉ）（１）のハイブリッド形成さ れた第２のプライマオリゴヌクレオチドの隣接３゛末端または工程（Ｉ）（２） のハイブリッド形成された第２のプライマ伸長生成物の隣接３°末端をハイブリ ッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端に対して連結反応させ ることにより、第２のプライマオリゴヌクレオチドまたは第２のプライマ伸長生 成物の配列および第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列を有する第２の連 結反応生成物を形成する工程と、 （Ｉり）第２の連結反応生成物の第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列に 対して第２のエンドランオリゴヌクレオチドをノーイブリッド形成する工程と、 （Ｌ）ポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応においてノーイブリッド形成 された第２のエンドランオリゴヌクレオチドの３゛末端を伸長して、エンドラン 伸長生成物を形成することによりターゲット分子の配列を増幅する工程を更に備 える例を含む。

本発明はまた、所定のヌクレオチドがターゲット核酸分子の所定の部位に存在す るかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、連結反応を行なって連結反 応生成物を形成するブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびプライマオリゴヌクレ オチドの能力、伸長生成物を形成するプライマオリゴヌクレオチドの能力、伸長 生成物を形成するエンドランオリゴヌクレオチドの能力およびターゲット核酸分 子の部分に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのいずれかの能力に よるものとすることができる。ターゲット核酸分子の所定の部位は、ブロックオ リゴヌクレオチドの５゛端部に近接して位置しまたは隣接する部位、プライマオ リゴヌクレオチドの３°端部に近接して位置しまたは隣接する部位およびエンド ランオリゴヌクレオチドの３゛端部に近接しまたは隣接する位置を含む。

所定のヌクレオチドが存在するかどうかを決定する例は、（Ａ）ターゲット核酸 分子に対してブロッカ−オリゴヌクレオチドをハイブリッド形成して、ハイブリ ッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端ヌクレオチドがターゲ ット分子の所定の部位と対向しかつ所定のヌクレオチドと相捕的であるようにハ イブリッド形成されたブロックオリゴヌクレオチドの５°末端が配置された部分 的に二重鎖の核酸分子を形成する条件を提供する工程と、 （Ｂ）部分的に二重鎖の核酸分子のターゲット核酸分子に対してプライマオリゴ ヌクレオチドをハイブリッド形成して、プライマオリゴヌクレオチドの３′末端 がハイブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端に隣接しま たはポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長されてハイブリッ ド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端に隣接することができる 条件を提供する工程と、 （Ｃ）（１）プライマオリゴヌクレオチドの３゛末端がブロッカ−オリゴヌクレ オチドの５°末端に隣接する場合には、工程（Ｄ）を行なう工程と、または （２）プライマオリゴヌクレオチドの３°末端がブロッカ−オリゴヌクレオチド の５′末端に隣接せず、ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの ３゛末端がポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長されてハイ ブリッド形成されたプロ１カーオリゴヌクレオチドの５゛末端に隣接する３゛末 端を有するプライマ伸長生成物を形成する場合には、次に工程（Ｄ）を行なう工 程と、 （Ｄ）工程（Ｃ）（１）のハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチド の隣接する３°または工程（Ｃ）（２）のハイブリ７ド形成されたプライマ伸長 生成物の隣接する３゛端子およびハイブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌク レオチドの５°末端を、核酸連結反応を促進する条件においてリガーゼの存在下 で培養する工程と、 （Ｅ）工程（Ｄ）がプライマオリゴヌクレオチドまたはプライマ伸長生成物およ びブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列を有する連結反応生成物を形成しるかど うかを、−（１）培養基にエンドランオリゴヌクレオチドを供給しかつ核酸ハイ ブリッド形成およびポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長を行なわせるのに十 分な条件に培養基を保持する副工程と、（２）エンドランオリゴヌクレオチドが 伸長されてプライマオリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を含むかどうかを 決定する副工程とにより行なわれる検出操作により決定する工程とを備える。

本発明によれば、所定のヌクレオチドがターゲット核酸分子の所定の部位に存在 するかどうかを決定する他の方法が提供されており、この方法は、 （Ａ）ターゲット核酸分子に対してブロッカ−オリゴヌクレオチドをハイブリッ ド形成して、ハイブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端 ヌクレオチドがターゲット分子の所定の部位の３′に直接配置されたヌクレオチ ドにハイブリッド形成されるようにブロックオリゴヌクレオチドの５′末端が配 置された二重鎖核酸分子を形成する条件を提供する工程と、（Ｂ）部分的に二重 鎖の核酸分子のターゲット核酸分子に対してプライマオリゴヌクレオチドをハイ ブリッド形成して、プライマオリゴヌクレオチドの３゛末端がハイブリッド形成 されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接し、３°末端ヌクレオチ ドが所定のヌクレオチドと相補的となる条件を提供する工程と、（Ｃ）ハイブリ ッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの隣接する３°およびハイブリッド 形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端を、核酸連結反応を促進す る条件においてリガーゼの存在下で培養する工程と、 （Ｄ）工程（Ｃ）がプライマオリゴヌクレオチドおよびブロッカ−オリゴヌクレ オチドの配列を有する連結反応生成物を形成しるかどうかを、 （１）培養基にエンドランオリゴヌクレオチドを供給しかつ核酸ハイブリッド形 成およびポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長を行なわせるのに十分な条件に 培養基を保持する副工程と、（２）エンドランオリゴヌクレオチドが伸長されて プライマオリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を含むかどうかを決定する副 工程とにより行なわれる検出操作により決定する工程とを備える。

本発明はまた、エンドランオリゴヌクレオチドがプライマオリゴヌクレオチドの 配列と相補的な配列を含むように伸長されているかどうかの決定をエンドラン伸 長生成物を増幅させることにより行なう上記方法の例を含み、測定は、 （ａ）培養基に存在するエンドラン伸長生成物のいずれかに対してブロッカ−オ リゴヌクレオチドをハイブリッド形成することにより二重鎖核酸分子を形成する 副工程と、（ｂ）プライマオリゴヌクレオチドの３°末端がハイブリッド形成さ れたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端に隣接しまたはポリメラーゼ仲介 鋳型依存プライマ伸長反応において伸長されてハイブリ、ド形成された第２のブ ロッカ−オリゴヌクレオチドの５゜末端に隣接することができるように二重鎖核 酸分子のいずれかに対してプライマオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する 副工程と、 （ｃ）（１）ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３°末端が ハイブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５“末端に隣接する場 合には、工程（ｄ）を行なう副工程と、または （２）ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３°末端が、ハイ ブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端に隣接しないこと により、ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３゛末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長させて、ハイブリッド形成 されたブロックオリゴヌクレオチドの５°末端に隣接する３′末端を有するプラ イマ伸長生成物を形成する場合には、次に工程（ｄ）を行なう副工程と、 （ｄ）工程（ｃ）（１）のハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチド のいずれかの隣接３°末端または工程（ｃ）（２）のハイブリッド形成されたプ ライマ伸長生成物のいずれかの隣接３°末端をハイブリッド形成されたブロッカ −オリゴヌクレオチドのいずれかの５°末端に対して連結反応させることにより プライマオリゴヌクレオチドまたはプライマ伸長生成物の配列およびブロッカ− オリゴヌクレオチドの配列を有する連結反応生成物を形成する副工程と、 （ｅ）連結反応生成物のいずれかのブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列に対し てエンドランオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成する副工程と、 （ｆ）ポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応においてノ）イブリッド形成 されたエンドランオリゴヌクレオチドの３°末端を伸長することによりエンドラ ン伸長生成物を形成するとともに増幅させる副工程とを備える方法を使用して行 なう。

更に、本発明によれば、所定のヌクレオチドがターゲット核酸分子の所定の部位 に存在するかどうかを測定する方法が提供されており、この方法は、ポリメラー ゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長するエンドランオリゴヌクレオチ ドの能力による。この方法は、 （Ａ）ターゲット核酸分子と相補的な核酸配列に対してブロッカ−オリゴヌクレ オチドをハイブリッド形成することにより部分的に二重鎖の核酸を形成する工程 と、 （Ｂ）プライマオリゴヌクレオチドの３°末端がハイブリッド形成されたブロッ カ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接しまたはハイブリッド形成されたブロ ッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接するようにポリメラーゼ仲介鋳型依 存プライマ伸長反応において伸長されることができるように二重鎖核酸分子のタ ーゲット核酸分子に対して相補的な核酸配列に対してプライマオリゴヌクレオチ ドをハイブリッド形成する工程と、 （Ｃ）（１）ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３°末端が ハイブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端に隣接する場 合には工程（Ｄ）を行なう工程と、または （２）ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３°末端が、ハイ ブリッド形成されたプロ１カーオリゴヌクレオチドの５°末端に隣接しないこと により、ハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチドの３゛末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応において伸長させて、ハイブリッド形成 されたブロックオリゴヌクレオチドの５“末端に隣接する３′末端を有するプラ イマ伸長生成物を形成する場合には、次に工程（Ｄ）を行なう工程と、 （Ｄ）工程（Ｃ）’（１）のハイブリッド形成されたプライマオリゴヌクレオチ ドの隣接３°末端または工程（Ｃ）（２）のハイブリッド形成されたプライマ伸 長生成物の隣接３゛末端をハイブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチ ドの５°末端に対して連結反応させることによりプライマオリゴヌクレオチドま たはプライマ伸長生成物の配列およびブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列を有 する連結反応生成物を形成する工程と、（Ｅ）連結反応生成物のブロッカ−オリ ゴヌクレオチドの配列に対してエンドランオリゴヌクレオチドをハイブリッド形 成して、エンドランオリゴヌクレオチドの３゛末端が所定のヌクレオチドと相補 的であるとともに、エンドランオリゴヌクレオチドの３°末端ヌクレオチドがタ ーゲット分子の所定の部位に対向することができるようにする工程と、 （Ｆ）ポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応においてハイブリッド形成さ れたエンドランオリゴヌクレオチドの３°末端を伸長してエンドラン伸長生成物 を形成する条件を提供する工程と、（Ｇ）工程（Ｆ）によりエンドラン伸長生成 物が形成されたかどうかを検出することにより所定のヌクレオチドが所定の部位 に存在するかどうかを決定する工程とを備える。

本発明はまた、所定のヌクレオチドがターゲット核酸分子の所定の部位に存在す るかどうかを決定する別の方法を提供するものである。かかる検出方法は、プラ イマオリゴヌクレオチドがターゲット核酸分子に対してハイブリッド形成を行な いかっプライマ伸長生成物を形成する能力に依存することができる。かかる例は 、（Ａ）ターゲット核酸分子に対してブロッカ−オリゴヌクレオチドをハイブリ ッド形成して、部分的に二重鎖の核酸分子を形成する条件を提供する工程と、 （Ｂ）部分的に二重鎖の核酸分子のタープ・ソト核酸分子に対してプライマオリ ゴヌクレオチドを／Ｘイブリ・ソド形成して、プライマオリゴヌクレオチドの３ ゛末端をタープ・ソト分子の所定の部位と対向させる工程を提供する工程と、 （Ｃ）ポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマ伸長反応にお０てノ＼イブリッド形成 されたプライマオリゴヌクレオチドの３′末端を伸長してプライマ伸長生成物を 形成する条件を提供する工程と、（Ｄ）工程（Ｃ）によりプライマ伸長生成物が 形成された力１どうかを検出することにより所定のヌクレオチドが所定の部位１ こ存在するかどうかを決定する工程とを備え、該検出は（１）プライマ伸長生成 物と７％イブリッド形成されたブロッカ−オリゴヌクレオチドを核酸連結反応を 促進する条件（こおＬｌてリガーゼの存在下で培養する副工程と、（２）　工程 （１）によりプライマオリゴヌクレオチドイ中長生戎物とブロックオリゴヌクレ オチドの配列を有する連結反応生成物が形成されたかどうかを検出する副工程と １こよりマチなわれ、該検出は、 （ａ）エンドランオリゴヌクレオチドを培養基１こ供給するとともに、核酸のハ イブリツド形成とボＩＪメラーゼ（中介鋳型依存プライマ伸長を行なわせるのに 十分な条件（こ培養基を保持する工程と、 （ｂ）プライマオリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を含むようにエンドラ ンオリゴヌクレオチドカ（イ申長されｔニカ１どうかを決定する工程とにより行 なわれる。

本発明の特徴として、本明細書において教示されている方法は、先づ核酸の１度 を増幅させるのに使用することができ、次いで、同じく本明細書に教示されてい る、所定のヌクレオチドが増幅された核酸の所定の部位に存在するかどうかを測 定する方法が実施される。

本発明はまた、「キット」（”ｋｉｔ”）、特に、画成された核酸配列を有する 少なくとも１つの領域からなる少なくとも１つのターゲット配列を増幅させる試 薬を備えたキットに関するもので、このキットは、少なくとも１つのブロッカ− 成分と、少なくとも１つのプライマ成分と、少なくとも１つのエンドラン成分と を含む少なくとも１つの容器を備え、ブロッカ−成分は核酸配列の一部に対して ハイブリッド形成することができ、プライマ成分は核酸配列の別の部分に対して 形成することができ、エンドラン成分はブロッカ−成分の少なくとも一部と相補 的な配列からなる構成を備えている。

所要に応じて、キットは、エンドラン増幅を容易にするように構成された試薬、 酵素および／または緩衝剤を含むことができる。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の「ギャップレス」（“ｇａｐｌｅｓｓ”）ＥＲＡの例において 二重鎖ターゲット分子を増幅させるのに使用される「エンドランＪ　（”Ｅｎｄ −Ｒｕｎ”）　、ブロッカ−（”Ｂｌｏｃｋｅｒ”）およびプライマ（”Ｐｒｉ ｍｅｒ”）オリゴヌクレオチドの配置および特性を示す概略図である。この図に おいて、「エンドラン」、「ブロッカ−」および「プライマ」オリゴヌクレオチ ドは、Ａ、ＢおよびＣでそれぞれ示されている。

図２は、本発明の「ギャップ」（”ｇａｐ”）ＥＲＡの例において二重鎖ターゲ ット分子を増幅させるのに使用される「エンドラン」、「ブロッカ−」および「 プライマ」オリゴヌクレオチドの配置および特性を示す概略図である。

図３は、所望の二重鎖ターゲット分子を増幅するエンドラン増幅方法の「ギャッ プレスＪＥＲＡの例の使用を示す。オリゴヌクレオチドは、図１において定義さ れている通りである。

図４は、所望の二重鎖ターゲット分子を増幅させるためのエンドラン増幅方法の 「ギャップレスＪ　ＥＲＡの例の使用を示す。オリゴヌクレオチドは、図１にお いて定義されている通りである。

図５Ａは、−重鎮ターゲット分子に対して本発明の「ギャップレスＪ　ＥＲＡの 例において使用される「エンドラン」、「ブロッカ−」および「プライマ」オリ ゴヌクレオチドの配置および特性を示す概略図である。図５Ｂは、所望の一重鎖 ターゲット分子を増幅させるための「ギャップレスＪ　ＥＲＡの例に使用を示す 。図５０および図５Ｄは、エンドランオリゴヌクレオチドがブロッカ−およびプ ライマオリゴヌクレオチドの連結反応前に伸長される場合の一重鎖ターゲット分 子の増幅を示す。分子は、図１において定義されている通りである。

図６Ａは、−重鎖ターゲット分子に対して本発明の「ギャップ」Ｅｒ（Ａの例に おいて使用される「エンドラン」、「ブロッカ−」および「プライマ」オリゴヌ クレオチドの配置および特性を示す概略図である。ｌＮ６Ｂは、所望の一重鎖タ ーゲット分子を増幅させるための「ギャップＪ　ＥＲＡの例に使用を示す。図６ ０および図６Ｄは、エンドランオリゴヌクレオチドがブロッカ−およびプライマ オリゴヌクレオチドの連結反応前に伸長される場合の一重鎖ターゲツト分子の増 幅を示す。分子は、図１において定義されている通りである。

図７は、二重鎖ターゲット分子を増幅させるための本発明の「入子式Ｊ　（”ｎ ｅｓｔｅｄ−）　Ｅ　ＲＡの例（ｒＮＥＲＡＪ）の使用を示す。オレゴヌクレオ チドは、図１において定義されている通りである。

図８は、−重鎖ターゲット分子を増幅させるための本発明の「入子式Ｊ　ＥＲＡ の例の使用を示す。オレゴヌクレオチドは、図１において定義されている通りで ある。

図９は、本発明の「ループＪ　（”Ｌｏｏｐ”）　Ｅ　ＲＡの例（ｒＬＥＲＡＪ ）を示す概略図である。図９Ａは、ブロッカ−およびプライマオリゴヌクレオチ ドの鎖連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）を示す。図９Ｂは、ターゲット配列に対して ハイブリッド結合された図９Ａのループを示す概略図である。図９０は、図９Ａ のループの連結反応に供されたブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびプライマオ リゴヌクレオチドに沿ったエンドラン伸長反応を示す概略図である。図９Ｄは、 図９０から得られたターゲットを示す概略図である。

図１０は、ターゲットと、例■およびＩＩにおいて使用されるブロッカ−、プラ イマおよびエンドランオリゴヌクレオチドとの整合を示す概略図である。

図１１は、例■に記載のようにして行なわれた増幅反応の電気泳動の結果を示す 概略図である。レーンｌは、プライマオリゴヌクレオチド（Ｐｒ）、エンドラン オリゴヌクレオチド（ＥＲ）（ＥＲ）、ポリメラーゼ（Ｐ）およびリガーゼ（Ｌ ）は存在するが、プライマオリゴヌクレオチド（Ｂ）が存在しない状態でのＥＲ Ａ反応の結果を示す。レーン２は、ブロッカ−およびプライマオリゴヌクレオチ ド、ポリメラーゼ並びにリガーゼは存在するが、エンドランオリゴヌクレオチド が存在しない状態でのＥＲＡ反応の結果を示す。レーン３は、ブロッカ−、プラ イマ、エンドランオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼおよびリガーゼの全てが存 在する場合のＥＲＡ反応の結果を示す。レーン４は、ブロッカ−、プライマ、エ ンドランオリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼは存在するが、リガーゼが存在 しない場合のＥＲＡ反応の結果を示す。レーン５は、ブロッカ−、プライマおよ びエンドランオリゴヌクレオチドとりガーゼは存在するが、ポリメラーゼが存在 しない場合のＥＲＡ反応の結果を示す。

図１２は、１０−目Ｍ（図１２Ａ）または１０−”　Ｍ　（図１２Ｂ）のターゲ ット分子１度を使用してＩＰＩＪＩＩに記載のようにして行なわれた増幅反応の 電気泳動の結果を示す概略図である。レーンＭは、ゲルにおけるエンドランおよ びプライマオリゴヌクレオチドとターゲットとの相対的な位置を示す。ブロッカ −オリゴヌクレオチドの相対的位！は、レーン２に示されている。レーンＩは、 プライマの位置を示す。レーン２は、ブロッカ−およびプライマオリゴヌクレオ チド、ポリメラーゼ並びにリガーゼは存在するが、ランエンドオリゴヌクレオチ ドが存在しない状態でのＥＲＡ反応の結果を示す。レーン３は、プライマおよび エンドランオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ並びにリガーゼは存在するが、ブ ロッカ−オリゴヌクレオチドが存在しない状態でのＥＲＡ反応の結果を示す。レ ーン４は、ブロッカ−、プライマおよびエンドランオリゴヌクレオチド並びにポ リメラーゼは存在するが、リガーゼが存在しない状態でのＥＲＡ反応の結果を示 す。図５は、ブロッカ−、プライマおよびエンドランオリゴヌクレオチド、ポリ メラーゼ並びにリガーゼの全てが存在する場合のＥＲＡ反応の結果を示す。図６ は、ブロッカ−、プライマおよびエンドランオリゴヌクレオチド並びにリガーゼ は存在するが、ポリメラーゼが存在しない状態でのＥＲＡ反応の結果を示す。

図１３は、連結反応および伸長生成物における＊ｍプライマオリゴヌクレオチド および標識エンドランオリゴヌクレオチドの組み込みに及ぼすエンドランオリゴ ヌクレオチドの異なる３゛端部の影響を示す棒グラフ図である。エンドランオリ ゴヌクレオチドが１または２の塩基「オーバーハングＪ　（ｂａｓｅ″ｏｖｅｒ ｈａｎｇ”）を有する場合には、連結反応と伸長反応はいずれも、「プラント」 ３”エンドを有するエンドランオリゴヌクレオチドが利用される場合よりも、有 意に多い標識オリゴヌクレオチドを含む。

図１４は、単塩基区別（ｓｉｎｇｌｅ　ｂａｓｅ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏ ｎ）を行なうことができる本発明の増幅方法の能力を示す棒グラフ図である。結 果は、ＥＲＡ増幅の２０サイクル後は、野生型ターゲットオリゴヌクレオチドと 、野生型オリゴヌクレオチドとは単塩基が異なる突然変異ターゲットオリゴヌク レオチドとは明確に区別されることを示している。

図１５は、単塩基区別を行なうことができる本発明の増幅方法の能力を示す棒グ ラフ図である。反応は、データが４０ＥＲＡサイクルに関するものであることを 除き、図１４に関して行なわれた反応と同じである。

図１６は、組み込まれた標識オリゴヌクレオチドの程度およびＥＲＡ伸長生成物 に関する増幅の量に対して利用されるターゲットオリボヌクレオチドの濃度を示 すグラフ図である。データは、単遺伝子を検出するのに必要な１度の範囲にある ターゲット濃度が、増幅および伸長生成物を得るのに本発明において利用するこ とができることを示している。

図１７は、組み込まれたｗ識オリゴヌクレオチドの程度およびＥＲＡ伸長生成物 に関する増幅の量に対して利用されるターゲットオリゴヌクレオチドの１度を示 すグラフ図である。データは、単遺伝子を検出するのに必要な１度の範囲にある ターゲット１度が、増幅および連結反応生成物を得るのに本発明において利用す ることができることを示している。

特表千７−５０９３７１　（１７） い　の日 ■、核酸分子の増幅 本発明は、試料中に存在する所望の核酸分子を増幅するための方法−ｍ−“エン ドラン増幅”または”　ＥＲＡ”を提供する。それは、そういうものとして、特 定の所望の分子が試料中に存在するか決定するための手段および十分な量の前記 所望の分子を確保してその配列または構造解析を可能とする手段の両者を提供す る。

本方法を使用することによって産生できる分子類は、数個のヌクレオチド類から 数キロベースの範囲の長さを有することができる。

本発明の“所望の′分子類は、ある核酸分子の“標的”鎖の配列に“相補“であ るかまたは実質的に相補である配列を有しているといわれている。

本文で使用するように、２個の配列は、それらが逆平行二重鎖核酸構造を形成可 能であるならば互いに“ハイブリッド化”　（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）できるとい われている。２個の核酸分子類は、それらが十分に安定に互いにハイブリッド化 しそれらを少なくとも従来の“低緊縮”条件下で互いにアニールしたままにでき るならば、“相補″であるといわれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、ら、（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ　２ｎｄ 　Ｅｄｉｔｉｏｎ　Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）中）、およ びＨａｙｍｅｓ、　Ｂ、　Ｄ、ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚ ａｔｉｏｎ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ　ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｗ ａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ（１９８５）中）参照、両者ともに本文で参考として 引用した）。したがって、２個の相補分子類は、完全な相補性を示す必要はない が、実質的に配列が相補であり安定な二重鎖構造を形成可能である必要がある。

したがって、完全な相補性から逸脱することも、このような逸脱が二重鎖構造を 形成するためのハイブリッド形成を完全に排除するほど十分でなければ、許容で きる。

本発明の方法によって達成される“増幅”は、反応容器中に存在する所望の核酸 分子類量の増加を意味する。“実質的増幅”とは、約１００倍を超える増幅を称 している。

本発明の方法によって増幅可能な核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることが できる。前記配列が当初ＤＮＡとして存在している場合、このようなりＮＡは、 転写されるかまたは翻訳されるかのいずれも必要でない。したがって、本発明を 用いて、転写されるかまたは翻訳されるＤＮＡならびに非転写ＤＮＡまたは非翻 訳ＤＮＡを識別および／または増幅することができる。同様に、前記所望の配列 が当初ＲＮＡ分子中に存在する場合、このようなＲＮＡは、翻訳される必要がな い。

増幅できる分子として、全ての天然由来原核生物類（例えば、病原性または非病 原性の細菌類、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｃｌｏｓｔｒ ｉｄｉｕｍ　Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒ足１ｍ−−ＬＬＬ二且ユおよび呈１工ｅ　ｔ ｏｍＬｃｅｓ。

５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ　Ｃｈｌａｍ　ｄｉａ　 ：１／Ｉ　Ｃｏ　ｌａｓｍａ　ｓ真核生物ｇ１ｍ（たとえば、プロトシアおよび 寄生虫類、真菌類、酵母、高等植物類、下等および哺乳類およびヒトを含む高等 動物類）またはウィルスｇＩ（例えば、ヘルペスウィルス類、ＨＩＶ、インフル エンザウィルス、エプスタインバーウィルス、肝炎ウィルス、ボルオウイルス等 ）またはウィロイド核酸などが挙げられる。前記核酸分子は、また、化学的に合 成されたかまたは合成可能であるいかなる核酸分子であることもできる。したが って、前記核酸配列は、天然に観察されることもあれば観察されないこともある 。総じて、本発明の方法は、いかなる核酸分子も識別または増幅可能であり、増 幅される分子類がいかなる特定の配列または起源を有することも要しない。

増幅される核酸分子は二重鎖または一重鎖形態のいずれかであることができるが 、もし核酸が増幅反応の開始時点で二重鎖であれば、それは、好適には、最初に 処理して前記二重鎖を一重鎖または部分的−重鎖形態とする。加熱、またはアル カリ処理によって、または（ヘリカーゼ反応によるような）酵素的方法、または 結合タンパク質によって、二重鎖核酸を一重鎖または部分的−重鎖核酸にする方 法が公知である。この処理を達成する一般的方法は、Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、 ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａ ｌ　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏ、ｒｋ　（１９８９）中において、およびＨａｙｍｅｓ、Ｂ、 Ｄ、ら、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ａ　Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ　Ａ　・ｒｏａｃｈ　ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　 ＤＣ（１９８５）中）１こよって提供されており、これらの文献は、本文で参考 として引用している。

本発明が評価する試料の性質になんら制限を課さないことは重要である。このよ うな試料は、例えば、動物（ヒトまたはその他の哺乳類）または植物由来である ことができ、または、合成によって誘導することもできる。

特に、本発明を用いて、血液（および血清、血漿、血小板のような血液製剤）、 便、痰、粘液、血清、尿、唾液、涙液、生検試料、組織学組織試料類、ＰＡＰス メア類およびその他の腟スワブ類、皮膚擦過片、精液、奇胎、いぼ等に存在する 核酸分子類を識別しかつ増幅できる。同様に、それを用いて、植物組織中に存在 する核酸分子類を識別しかつ増幅することができる。

このような試料の核酸類は、全く未精製であるか、前記試料と本来結合している あらゆるその他の成分から部分的に精製されているかまたは完全に精製されてい るかもしれない。しかし、通常、試料を、そうでなければ核酸増幅に障害となる 外来性の物賀類を除去するような程度にまで処理するであろう。たとえば血清試 料について、核酸類の調製は、一般に、下記の段階からなる：血清を７０’Ｃで １時間、２５ｍＭ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ６，５）　、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび ０５％ＳＤＳ中２．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　 Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションする。この後に、下記の抽出が続く： フェノール抽出およびエーテル抽出である。この後に、エタノール沈澱が続く。

たとえば、Ｌａｒｚｕｌら、上−上ｅ　ｔｏｌ、５＋１９９−２０４（１９８７ ）参照。その他のプロトコールおよび技術も、指摘したように、上記精製のため に容易に利用できる。

また、本発明は同定および／または増幅される核酸配列の性質に全く制限を課し ていないので、本発明は、起源動物または植物によって産生されたものではある が疾患を示唆する配列類（ヘモグロビン組織病理をコードする遺伝子配列、また は新生物細胞によってのみまたは優先的に発現される発がん遺伝子産物）ならび に試料中に本来観察される（膵β細胞組織中のインシュリンｍ　ＲＮ　Ａ配列の ような）核酸分子類を識別可能である。さらに、本発明は、また、病原性細菌類 、かび類、真菌類またはウィルス念の遺伝子配列が組織試料中に存在するか決定 するために使用することができる。

本発明の方法は、従って、疾病の診断、または、農産物（牛乳、加工食品等）、 排水、飲用水、大気等の純度を検定するためならびにそれらの系統を確立しかつ それらを明らかにするために使用することができる。

増幅されるＲＮＡまたはＤＮＡ配列が、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素に よって増幅され、ＤＮＡ増幅産物を形成させるのが最適であるが、しかし、ＲＮ Ａ増幅産物を所望する態様において、ＲＮＡポリメラーゼを使用することもでき る。”ポリメラーゼ”とは、ヌクレオチド三リン酸類を取り込んで、もし核酸分 子が適切なテンプレート核酸分子にハイブリッド化するとその分子の３゛　ＯＨ 基を伸長できる酵素である。３“末端がポリメラーゼによって伸長できるオリゴ ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、“プライマー”　と称される。

ＤＮＡポリメラーゼ類は核酸分子類を５°→３゛方向に伸長させるので、従って 、それらは、相補プライマーの３°末端を１テンプレート依存性”に伸長させる 。用語“テンプレート依存性“とは、本文で使用したように、核酸の新たに合成 された鎖の配列が相補塩基対によって支配されるＲＮＡまたはＤＮＡの核酸合成 を称する。

このような反応において、標的分子は、プライマー伸長産物がテンプレートのそ れと相補であるようにプライマーの伸長のための“テンプレート”として作用す る。上記ポリメライゼーシツンは、通常、ヌクレオチド三リン酸（“ｄＮＴＰ” ）類、すなわち、デオキシアデノシン５°　−三リン酸（“ｄＡＴＰ“）、デオ キシシチジン５゛　−三リン酸（“ｄＣＴＰ”）、デオキシグアノシン５°　− 三リン酸（“ｄＧＴＰ”）、およびデオキシチミジン５°　−三リン酸（通常“ ＴＴＰ’と略されるが、−貫したものとするために、“ｄＴＴＰ”）の存在を必 要とする。塩基対、ポリメラーゼおよび鎖排除機能が所望の程度にまで増幅を進 行させない程の悪影響を及ぼさないとするならば、ヌクレオシド三リン酸アナロ グ類等（Ｐ　ｉ　ｃ　ｃｉｒｉｌｌｉ、Ｊ、Ａ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：３ ３−３７（１９９０））類を上記で特定したものと置換できるかまたは添加でき る。特に、デオキシイノシン三リン酸類（ｄｌ）およびチオキシウリジン三リン 酸（ｄＵＴＰ）を使用できる。

ポリメラーゼ酵素類については、本文で参考として引用したＷａｔｓｏｎ、Ｊ、 Ｄ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第４版、Ｗ、 Ａ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ社、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、ＣＡ　（１９８７）中および 類書でレビューされている。適切なりＮＡポリメラーゼ類の例として、”Ｋｌｅ ｎ。

Ｗ”ポリメラーゼとして一般的に公知である細菌Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラ ーゼ■のタンパク質分解大断片、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼエ、バクテ リオファージＴ７　ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

所望の場合、“熱安定酵素類”も使用できる。本文で使用したように、ｍ熱安定 酵素“とは、約５０°Ｃから約１００”Ｃの間の温度で反応を触媒できる酵素で ある。熱安定ポリメラーゼ類の例は、本文で参考として引用した欧州特許出願第 ０２５８０１７号に記載されている。熱安定“Ｔａｑ″ＤＮＡポリメラーゼは、 Ｃｅｔｕｓ社から入手可能である。

適切なＲＮＡポリメラーゼ類の例として、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＮＡポリメラーゼ、 Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。逆転写酵素類は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 、Ｊ、ら（Ｍｏｌｅｃｕ　ｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　°Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａ ｎｕａｌ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　（１９８９）中）によっておよびＮｏ。

ｎａｎ、　Ｋ、　Ｆ、ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ上Ｒ，１６：　１０３６６ 　（１９８Ｂ））によって、記載されている。

開示された方法の態様は、所望の配列の増幅を達成するため、連結反応事象を必 要としている。しかし、特定核酸配列の同定という目的のためには、試料物質の 非増幅も同様に重要な目標である。すなわち、たとえば特定の１個の塩基の突然 変異の識別のためには、標的配列の未変異体に相補性の配列を有する２個のオリ ゴヌクレオチド部分は、標的配列が塩基１個の変異を含んでいれば連結反応事象 を受けないであろう。したがって、先の非限定的実施例において、増幅がないこ とは、変異の存在の指標として見なすことができる。開示された本発明を用いて 、特に、標的配列の増幅および／または標的配列の存在の確認ができることが明 らかである。

所望の分子の増幅に必要な連結反応は、最も好適には、あるオリゴヌクレオチド の３°　ＯＨ末端を第２のオリゴヌクレオチドの５゛ＰＯ４末端に共有結合で結 合可能な“リガーゼ”酵素を用いるであろう。上記連結反応の反応速度は、もし 連結反応基質が二重鎖であるならば（同一ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡに両方 のオリゴヌクレオチドをハイブリッド化させることによってのように）、極めて 大きくなる。リガーゼは、２個のオリゴヌクレオチド類のそれぞれのターゲット 分子にハイブリッド化した時に隣接する末端を有していない前記オリゴヌクレオ チド類を結合できない。したがって、リガーゼは鎖中の“ニック”を“修復”可 能であるが、それは、“ギャップ”を“埋める”ことができない。別の態様では 、化学反応、光化学反応Ｃ例　光架橋反応：例えば、本文で参考として引用した ＰＣＴ持許出願　Ｗ０９０１０１０６９を参照）、熱化学、酸化還元反応等のよ うな非酵素的連結方法を用いることができる。

リガーゼが２個のヌクレオチド類の連結反応を媒介可能な反応速度系が、もし連 結される末端が標的分子に対して正確に塩基対を形成しているならば、極めて大 きくなることは、本発明の目的にとって好都合である。したがって、連結反応は ミスマツチした末端でも起こり得るが、このような連結反応の効率は、適切な塩 基対末端を有するオリゴヌクレオチド類のそれに比べて有意に小さい。好適なリ カーゼ類として、Ｅ、ｃｏｌｉリガーゼ、Ｔ４リガーゼ、およびＴ７リガーゼ（ Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）が 挙げられる。所望の場合、参考として引用したＰＣＴ持許出願　ＷＯ９１／１７ ２３９に記載されたもののような熱安定リガーゼ類を使用することができる。

本発明の増幅反応において使用される酵素類の全ては、本発明の増幅プロセスが 反応勧賞の添加のような条件のいかなる変更もなく単一反応容量で可能なように 、適切な緩衝液の存在下において併用可能である。

前記ＥＲＡ反応は、好適には約６．０乃至約９．０の間のｐＨを有する緩衝水溶 液中で行われるのが好適である。前記反応緩衝液は、前記ＥＲＡ反応の効率的か つ特異的循環を可能とする種々の成分類からなるのが好適である。特に好適な緩 衝溶液は、ｐＨ７，８の２０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸（“ ＴＲｌ５−ＨＣビ）である。添加物賀類も好適には前記反応緩衝液に添加される ；これらの物質類は、前記反応の循環が高効率（例、各サイクルで利用可能なタ ーゲットテンプレートの数をＸとした場合、ターゲットテンプレート当たりの産 物最大量であり、好適には２ｘを超え、さらに好適にはＸＹであり、最も好適に はおよそＸ！であり、Ｙは、１．０を超えるが約２未満である）および高特異性 （すなわち、“ポリメラーゼフィブリティ（忠実度）”を正しいヌクレオチドを 触媒的に取り込む酵素の選択性として定義し、かつ、リガーゼ活性がニック閉鎖 活性、例えば、ターゲット配列にハイブリッド化した時に互いに隣接する２個の 相補オリゴヌクレオチド部分を連結することに限定されているとして１リガーゼ フイデリテイ′が定義されている場合、リガーゼおよびポリメラーゼ酵素類のフ ィブリティの正確さ）であり；処理性を最大とし：前記酵素（類）の触媒安定性 が保持され：および反応安定性（すなわち、反応成分類が、溶液中で保持される ：非特異的活性が低下する；反応成分類の反応溶液表面への付着が最小となる等 ）が保持されるように、これらの物質類は選択される。本文で開示したＥＲＡプ ロトコールについて、下記の成分類および量（最終１度）がこれらの目標を達成 することが見いだされた；２０ｍＭ塩化カリウム；２．０ｍＭ塩化マグネシウム ；５．０ｍＭジチオスレイトール（”ＤＴＴ″）；５０μＭニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ″２）；５０μｇ／ｍｌウノ血清アルブミン；およ び非イオン性洗浄剤（例トリトンＸ　Ｉ　ＯＯ”ゝつ０．１％。これらの物質類 は、使用する具体的酵素類に応じて、容易に変更できかつ調整できる。当業者で あれば、こうした物質類の選択および最適化を容易にできると考えられる。

保存剤類等のようなその他の材料類は、前記反応緩衝液に適宜添加できる。２回 脱イオン処理した水を利用し反応緩衝液の所望の最終容量を達成することが最適 である。

典型的には、容器１度は約３０℃と約９０°Ｃの間、最も好適には約６５°Ｃに 保持される。熱変性を利用する際、温度は、変性段階でこれらの値を超えるかも 知れない。熱変性を（好適であるとして）利用する際、１度の循環範囲内にある 反応容器に温度制御環境を付与可能な熱サイクラ−類を利用するのが好適である 。例として、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　４８０”Ｘｌ　熱サイクラ−がある。

したがって、このプロセスは分子レベルで数段階を有しているが、撮作という点 から見れば、それは、単一段階を有していることになる。いったん反応物質類を 混合してしまえば、増幅反応が１個以上の成分類を枯渇させるまで、何かを追加 するとかまたは条件を変更する必要がない。この間、増幅される核酸配列が何倍 にも増加するであろう。増加の程度は、多くの目的にとって十分であろう。

しかし、いくつかの目的について、反応を新たな成分で反復し所望の高レベルの 増幅を達成しなければならないこともあるであろう。

■、　“ＥＲＡ”　：　“エンドラン増幅”反応本発明の方法は、その最も単純 な態様において、３個のオリゴヌクレオチドを用いて標的配列を増幅する。これ らのオリゴヌクレオチド類の第１および第２は、それらの配列が標的配列の一部 分に相補となるように、作製されている。第３のオリゴヌクレオチドは、それが 、第２のオリゴヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリッド化可能である ように作製されている。第１のオリゴヌクレオチド（図面で“Ｃ”とした）は、 “ブライマーオリゴヌクレオチド”と称する。第２のオリゴヌクレオチド（図面 で“Ｂ”とした）は、”ブロッカ−オリゴヌクレオチド”と称する。第３のオリ ゴヌクレオチド（図面で“Ａ“とした）は、エンドランオリゴヌクレオチド“プ ライマーと称する。これらのオリゴヌクレオチド類の性賀および構造は、下記で 詳細に検討した。もし所望であれば、１種を超えるブロッカ−オリゴヌクレオチ ド類、プライマーオリゴヌクレオチド類、および／またはエンドランオリゴヌク レオチド類を、もしこれらが異なる特定の核酸配列（類）を増幅可能であれば、 使用できる。

しかし、一般に、前記オリゴヌクレオチド類は、あらゆる合成、半合成または天 然の核酸断片、または、特異的に特定核酸配列に結合可能でかつ例えば伸長反応 または連結事象の基質として作用できるあらゆる化学物質からも構成される：化 学物質の例は、いわゆる“ペプチド核酸類”である（Ｅｇｈｏ　１ｍ、Ｍ、　ら 、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、１１４：１８９５−１８９７　（１９９２ ）、およびＮ１ｅｌｓｅｎ、Ｐ、Ｅ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５土：１４９７− １５００　（１９９１）参照；本文で参考として引用）。１個のオリゴヌクレオ チドは、典型的には、１５０個未満のヌクレオチド類および／または化学物質類 から構成される。前記核酸は、デオキシリボ核酸：デオキシリボ核酸の誘導体類 ；またはリボ核酸の誘導体類であることができる。

ブロッカ−、プライマーおよびエンドランオリゴヌクレオチド類は、例えば、Ｂ ｅａｕｃａｇｅ、Ｓ、　ら、工ｅｔｒａｈｅｄｒ１且Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２：１ ８５９−１８６２　（１９８１）に記載の方法類を用いて、いかなる適切な方法 を用いても調製できる。オリゴヌクレオチド物質類を製造可能な市販の機器類は 、これらが広く利用されかつ通常時間および費用が効率的であるので、好適であ る。規定されたオリゴヌクレオチド類を製造可能な機器類の例は、０ＬｒＧＯ１ ０００ＴＭ（Ｂｅ１０００Ｔ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＳ社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ 、ＣＡ）；Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ”（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａ ｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８７５０ＴＭ（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ 　Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ、ＣＡ）；およびＡＢＩ　ＰＣＲ Ｍａｔｅ”（ＡＢＥ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）であるが、これらに限定 されない。

前記オリゴヌクレオチド類のいかなるものもまたはすべてが、標識可能であり、 多くの目的のため、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが標識されるのが望ま しい。さらに、ｄＮＴＰ類も標識できる。ブロッカ−オリゴヌクレオチドが標識 される場合、ブロッカ−オリゴヌクレオチドがターゲットにハイブリッド化でき それによって、その３゛末端からの伸長が可能でな（なるように、標識体はその ３゛末端に結合できる；下記でその理論を述べるであろう。これとは別に、エン ドランオリゴヌクレオチドの５°末端を標識することもできる。標識プロトコー ルの例は、周知である；例えば、欧州特許第２９２１２８号参照。本文で参考と して引用。

上記標識体は、増幅産物の直接的、近位および間接的検出および／または捕獲の いずれかを促進できる。さらに、前記分子類の２種は、２種のオリゴヌクレオチ ド類のみが増幅反応で利用されるように一元的構造の一部であることができる。

本文で使用したように、直接的に検出可能なｍ識体は、直接的または基質（酵素 の場合）、光源（蛍光勧賞の場合）または光電子増倍管（放射性または化学発光 物質の場合）との相互作用を介してのいずれかで検出可能なシグナルをもたらす 。

好適な直接的標識体の例として、例えば、３２ｐ、　３８Ｓ、　＋２８１１’　 Ｈ，”Ｃを取り込んだオリゴヌクレオチド類の使用のような放射性同位元素標識 体が挙げられる。オリゴヌクレオチド類の直接的標識のための特に好適な手法は 、”末端標識”手法であり、それによって、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用 いて、前記オリゴヌクレオチドの５°末端に標識体を導入する（例　Ｒｉｃｈａ ｒｄｓ。

ｎ、　Ｃ，Ｃ，、Ｔｈｅ　Ｅｎｚ　ｍｅｓ、第１４巻、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｐａｒｔ　Ａ、Ｂｏｙｅｒ、Ｐ、Ｄ、４ｉ著、Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、２ ９９頁（１９８１）参照）。これとは別に、末端デオキシヌクレオチ゛トドラン スフェラーゼを用いて、提供された１群のチオキシヌクレオチド類を前記オリゴ ヌクレオチドの３゛末端に添加できる。また、単一ヌクレオチドの標識方法も使 用できる（例えば、Ｂｏ　Ｉ　ｌｕｍ、Ｆ、Ｊ、Ｔｈｅ−一旦−ｎｚｍｅｓ−１ 第１０巻、Ｂｏｙｅｒ、Ｐ、Ｄ、編著、Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ。

（１９７４）；Ｙｏｕｓａｆ、Ｓ、１．　ら、Ｇｅｎｅ２７　：　３０９（１９ ８４）：およびＷａｈ　Ｉ、Ｇ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃ ｉ、　ＵＳ　７６：３６８３−３６８７（１９７９）参照）。たとえば、［α” Ｐ］　ｄｄＡＴＰのような標識ｄｄＮＴＰ類もまた使用できる。

標的増幅が常に連続的ベースで実施されているとは限らない研究環境では、放射 性標識体の利用が好適であろう。たとえば、臨床状況のような非研究環境では、 上記標識体は、廃棄処理および放射性ｌ５Ｉｌｌ識体に連続的に被曝することに 関連したリスクという問題の故に好適ではないであろう。したがって、間接的標 識体がこれらの状況では好適であろう。間接的に検出可能な標識体はそれ自身の 中でおよびそれ自体で間接的信号をもたらすことはないが、それを用いて、間接 的検出可能な標識体を結合させたオリゴヌクレオチドを同定できる。ビオチン、 抗体類、酵素類、フェリチン、抗原類、ハプテン類等は、ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐまたは ｄｄＮＴＰに連結され、間接的に検出可能な標識体類の例を構成する。好適な非 放射性直接標識体類として、フルオレセイン−１１−ｄＵＴＰ　（Ｓ　ｉｍｍｏ ｎｄｓ、Ａ。

Ｃ０ら、ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、３７　：１５２７−１５２８　（１９９１）を 参照。本文で参考として引用）およびジゴキシゲニン−１１ｄＵＴＰ　（Ｍｕｈ 　Ｉ　ｅ　ｇｇｅ　ｒ、に、ら、Ｎｕｃ　Ｉ　ｅｏｓ　１ｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅｓ　８：１１６１−１１６３　（１９８９）参囮。本文で参考として引 用）が挙げられ、標識体類として使用できる。さらに、ハプテシ標識オリゴヌク レオチド類のような非放射性標識オリゴヌクレオチド類も使用できる（例えば、 Ａｄａｍｓ、Ｃ，Ｗ、、ＰＣＴ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｎ、ＷＯ９１／１９７ ２９参照）。これは、本文で参考として引用した。上記ハプテン１ｍ体を要する 検出体系には、ハブテンに対する抗体類を利用することが含まれ、前記抗体類は 標識されている。

ビオチンは、特に好適な間接的標識体であり、それによって、標識または不溶性 としたアビジン、ストレプトアビジン、抗ビオチン抗体類等を用いてビオチン化 核酸分子類の検出が達成される。また、ビオチン化分子類は、前記分子を不溶性 または固定化アビジンと接触させることによって非ビオチン化分子類から容易に 分離できる。

たとえば、この点に関して、ビオチン−１１−ｄＵＴＰは、ｄＴＴＰの代わりに 使用でき、または、ビオチン−１４−ｄＡＴＰは、ｄＡＴＰの代わりに使用でき る（Ｌａｎｇｅｒ、Ｐ、Ｐ、　丘、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ　７８：６８３３−６６３７　（１９８１）を二股五二皇且。本文で参考と して引用した）。ビオチン化ホスホルアミダイト類も同様に使用できる（Ｍｉｓ ｉｕｒａ、に、ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１８：４３４５−４３５４ 　（１９９０）”）。本文で参考として引用）。上記ホスホルアミダイト類は、 その合成の際に成長するオリゴヌクレオチド部分に沿って所望の位置でその正確 な取り込みを可能とする。

また、化学発光基質類も間接的標識体として使用できる。西洋わさびパーオキシ ダーゼじＨＰＲ”）、アルカリホスファターゼ（“ＡＰ”）等のような酵素類も 核酸類に直接的に架橋でき、使用できる（Ｒｅｎｚ、ＭおよびＫｕｒｚ、Ｃ，Ｎ ｕｃｌ、Ａｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、１２：３４３５−３４４４　（１９６４）参照。

本文で参考として引用）。ＨＲＰの基買であるルミナールおよびＡＰの基１１１ ｇ！である！換ジオキセタン類は、化学発光基賀類として利用できる。ＨＲＰｆ ｌ［Ｉｌプロトコールの例は、Ａｍｅ　ｒｓｈａｍ　（Ａｒ　ｌ　ｉｎｇｔｏｎ 　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）から入手可能なＥＣＬシステム である。

増幅産物の検出用の手段としてさらに、増幅産物に相補である核酸プローブ類の 利用が挙げられる。この種の検出のために、オリゴヌクレオチド部分の標識は必 要ではない。もし標的が存在すれば、その増幅の結果、標識核酸プローブを検出 に使用できるほど十分量の標的が生成するであろう。直接的または間接的に検出 可能な標識体からなる単一プローブ類が利用でき、または、直接的または間接的 に検出可能な１個の標識体および捕獲部分からなる多重プローブ類が利用できる 。たとえば、米国出願番号第０７１５７６．１３７号“標的核酸の検出のための 液相核酸ハイブリッド形成および固相捕獲、およびそのためのキッド参照。本文 で参考として引用。

直接的または間接的標識体の代わりに、近接標識体も使用できる。このような標 識体は、それとの相互作用によって第２の標識体の存在下でのみ信号を発する化 学部分である。通常、第１の近接標識体は、対応する第２の近位標識体と併用し て使用される。

反応物質分子類は、下記に記載の方法に従って用い、増幅産物を産生させる。典 型的には、増幅産物は二重鎖であり、所望の配列およびその補体から構成される 。ブロッカ−およびエンドランオリゴヌクレオチド類の配列に応じて、互いに完 璧に相補であるかまたは非相補性の領域を有する二重鎖分子類を産生ずることも 可能である。さらに、突出３°末端または突出５゛末端のいずれかを有する二重 鎖分子類を産生ずることも可能である。

いかなる相補核酸分子を産生ずることもなく、所望の配列を有する核酸を産生さ せることが望ましい場合、本発明の方法は、下記に記載したように、改良してこ のような一重鎖分子類のみを産生させることもできる。

Ａ０本発明の“ブライマーオリゴヌクレオチド”本発明の第１のオリゴヌクレオ チド、すなわち、“ブライマーオリゴヌクレオチド“は、プライマー分子であり 、従って、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能な３゛末端を有していなければ ならない。前記オリゴヌクレオチドは、約５個のヌクレオチド類から数百までの 範囲のいかなる長さであってもよい。好適には、ブライマーオリゴヌクレオチド は、１０個を超えるヌクレオチド類の長さを有しているであろうし、さらに好適 には、約１２−５０個のヌクレオチド類の長さを有しているであろう。ブライマ ーオリゴヌクレオチドの長さは、ブライマーオリゴヌクレオチドが標的分子にハ イブリッド化可能であるように十分でなければならない。

ブライマーオリゴヌクレオチドの配列は、それが予め定めた配列の標的分子に相 補であるように、選択する。この予め定めた配列は、先に決定された配列（遺伝 子、制御配列等）であることもできるし、または、仮説的配列（制限エンドヌク レアーゼ認識部位、このような部位の組み合わせ等）であることもできる。

好適には、前記標的配列は、遺伝的疾患と関連する遺伝子中のコード領域の一部 を形成しており、前記プライマーオリゴヌクレオチド配列は、その伸長が前記疾 患を特徴づけている遺伝的変異を含有する所望の配列を形成するように、選択さ れる。下記に記載したように、本発明のオリゴヌクレオチド類の配列を適切に制 御することによって、前記疾磨を有していない者の対応する配列とヌクレオチド １個しかその遺伝子配列が異ならない者における遺伝的疾患の診断または予測を 可能とする。

本発明のさらに基本的な態様において、本発明のブライマーオリゴヌクレオチド の配列は、本発明によ１て得られた増幅産物の末端１個の配列を決定する。した がって、もし、ブライマーオリゴヌクレオチドが所望の遺伝子配列に相補である ようにそれが選択されるならば、本発明の方法でその遺伝子配列の増幅が可能と なる。同様に、もし、ブライマーオリゴヌクレオチドが制限部位、制限部位組み 合わせ、プロモータ一部位、または制御タンパク質結合部位に相補であるならば 、その際には、本発明の方法でこれらの部位を含む標的配列の増幅が可能となる 。したがって、別の態様（“ブラインドＥＲＡ”）において、本発明の方法によ って、たとえば、さらに甲状腺ホルモン結合部位を含む全プロモーター配列順を 増幅できるようになる。

Ｂ　本発明の“ブロッカ−オリゴヌクレオチド”本発明の第２のオリゴヌクレオ チド、すなわち、“ブロッカ−オリゴヌクレオチド”はいかなる長さであっても よく、標的分子の一部に相補であるように選択される。本発明の実施に必須とい うわけではないが、本発明の１態様において、前記ブロッカ−（Ｂｌｏｃｋ）オ リゴヌクレオチドは、実質的にプライマーとして作用不可能である。したがって 、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの３′末端は、好適には゛ブロッキンググルー プを有するように改変されている。この目的を達成するいかなる化合物も、“ブ ロッキンググループとして作用できる。ブロッキンググループの例として、ビオ チン、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ”　）が挙げられ、ジデ オキシヌクレオチド三リン酸（−ｄｄＮＴＰｓ＠）は、また、“鎖終止”ｄｄＮ ＴＰｓと称されている。下記に記載のい（つかの好適な態様において、前記ブロ ッキンググループは、検出可能なように標識されている。さらに、例えば前記ブ ロッカ−オリゴヌクレオチドが“チューバック”反応を受けられるように、ブラ イマーオリゴヌクレオチドとの連結点まで“垂れ下がる（オーバーハング）”ブ ロッカ−オリゴヌクレオチドを使用することも可能である（たとえば、Ｈａ　ｌ 　Ｉ　ａｎｄら、Ｐｒｏｃ、　ａ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８ニア ２７６−７２８０　（１９９１）参照）。

前記ブロッカ−オリゴヌクレオチドは、好適には、ヌクレオチド約１０個から約 ４０個の間にある：さらに好適には、ヌクレオチド１５個から約３５個の間にあ る；最も好適には、ヌクレオチド約２３個である。しかし、前記ブロッカ−オリ ゴヌクレオチドは、長さがヌクレオチド２個分はど小さいこともある（３′末端 のヌクレオチドは、ブロッキング部分から構成される）；それゆえに、前記ブロ ッカ−オリゴヌクレオチドの長さは、研究者の実験上の必要および“Ｔｍ”が長 さの減少に伴い低下する（すなわち、優先的／％イブリッド形成が確保されない ）という認識に応じて、変化させることができる。“Ｔｍ”とは、核酸の２個の 鎖の間の塩基対の５０％が破壊される温度である。Ｔｍは、−重鎮ＤＮＡの長さ およびその塩基組成の関数である。一般的に、短いオリゴヌクレオチド部分（す なわち、ヌクレオチド約２５個未満）について、Ｔｍのおよその値（摂氏）は、 Ｇ／Ｃ塩基対の４倍プラスＡ／Ｔ塩基対の２倍（すなわち、４　（Ｇ／Ｃ）＋２ 　（Ａ／Ｔ））である。

これとは別に、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの長さおよび／または配列は、ブ ロッカ−オリゴヌクレオチドのＴｍが約３７６Ｃと約９８６０の間；さらに好適 には、約７０℃と約９０℃の間；最も好適には約８５℃であろう。

ブライマーオリゴヌクレオチド部分は、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの上流に （すなわち、ブライマーオリゴヌクレオチドの３゜末端が、ブロッカ−オリゴヌ クレオチドの５°末端に隣接するかまたは伸長して隣接できるような方向に、た だし両分子類が標的分子（の同−鎖）にハイブリッド化する場合）ハイブリッド 化するように設計されている。本発明のいくつかの態様において、ブロッカ−オ リゴヌクレオチドの５′末端は、ハイブリッド化した際にブロッカ−オリゴヌク レオチドの５°末端ヌクレオチドがもうひとつの核酸分子中の予め定めた部位に “対向”するように、設計されている。本文で使用したように、ハイブリッド化 したオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、前記２種のヌクレオチド類がハイブ リッド化産物中において互いに対向する（すなわち、それらが相補であるならば 、それらは互いに塩基対となっているように配置されている）ならば、もうひと つのヌクレオチドに“対向”するといわれている。ブロッカ−オリゴヌクレオチ ドの第２の機能は、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端以上に伸長しない ように“ブライマーオリゴヌクレオチド”を阻止することである。

ブロッカ−オリゴヌクレオチドのブロックされた３′末端は、増幅産物の１個の 鎖の３゛末端を規定する。ブロッカ−オリゴヌクレオチドの３゛末端は、典型的 には、標的分子にハイブリッド化可能であろう。しかし、エンドランオリゴヌク レオチドの５゛末端と同様に、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの３′末端は、こ のようなハイブリッド形成が可能である必要はない。したがって、これらの末端 のいずれかまたは両者は、制限部位、結合配列等のような他の所望の核酸配列類 を含有するように設計できる。

標的分子の配列が過去に決定されている場合、標的分子とハイブリッド化すると ブライマーオリゴヌクレオチドの３゛末端およびブロッカ−オリゴヌクレオチド の５′末端が隣接するように、プライマーおよびブロッカ−オリゴヌクレオチド 類を設計することが可能である。この態様において、連結事象は、プライマー伸 長反応を必要とせずにブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類の間で 起こり得る。

このようなＬｌユ土ユ互標的配列情報が必要でないことも重要である。したがっ て、前記標的配列は、部分的または全く明確にされていないこともある。この態 様において、前記プライマーおよびブロッカ−オリゴヌクレオチド類は、標的分 子とハイブリッド化するとブライマーオリゴヌクレオチドの３′末端およびブロ ッカ−オリゴヌクレオチドの５′末端が”ギャップ”　（これは、公知または非 公知の配列類または公知および非公知の配列類を含有できる）によって分離され るように、設計されている。このようなギャップは、長さがヌクレオチド約１個 から約１０，０００個である。このような態様において、連結反応は、もし“ギ ャップ°が満たされないならば好適にはポリメラーゼ媒介、テンプレート依存性 にブライマーオリゴヌクレオチドの３゛末端がこの末端がブロッカ−オリゴヌク レオチドの５゛末端に到達するまで伸長することによって起こり得る：この時点 で、ブロッカ−オリゴヌクレオチドと伸長したブライマーオリゴヌクレオチドの 連結事象が起こり得る。第１図（二重鎖標的）および第５図（−重鎮標的）は、 オリゴヌクレオチド類が隣接するＥＲＡｔ？様におけるブロッカ−およびプライ マーオリゴヌクレオチド類の相対的位置を示している。第２図（二重鎖標的）お よび第６図（−重Ｍｉ標的）は、オリゴヌクレオチド類がギャップによって離れ ているＥＲＡ態様におけるブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類の 相対的位置を示している。

所望の増幅をブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびブライマーオリゴヌクレオチ ド（またはその伸長産物）の連結反応に依存させるために、ブロッカ−オリゴヌ クレオチドは、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端がハイブリッド化可能 な部位を超えたある部位までブライマーオリゴヌクレオチドまたはそのプライマ ー伸長反応産物が伸長する前に、標的配列にハイブリッド化することが必須であ る。もしこのような事象のいずれか一方が最初に起これば、ハイブリッド化した ブライマーオリゴヌクレオチドは、そうでなければブロッカ−オリゴヌクレオチ ドがハイブリッド化したであろう標的領域に沿って伸長可能であり、連結事象が 存在しなければ、誤陽性検出および増幅が結果としてもたらされるであろう。

このシナリオを回避するため、ブライマーオリゴヌクレオチドの長さは、ブロッ カ−オリゴヌクレオチドの長さの約７５％未満であることが好適であり：さらに 好適には、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの長さの＃Ｊ６０％未鳩；最も好適に は、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの長さの約５０％未満である。ブライマーオ リゴヌクレオチドのＴｍは、ブロッカ−オリゴヌクレオチドのＴｍの約７５％未 満であることが好適であり；さらに好適には、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの Ｔｍの約６０％未満；最も好適には、ブロッカ−オリゴヌクレオチドのＴｍの約 ５０％未満である。ブライマーオリゴヌクレオチドがブロッカ−オリゴヌクレオ チドよりも確実に短かくなるようにすることによって、ブライマーオリゴヌクレ オチドのハイブリッド形成前にブロッカ−オリゴヌクレオチドのハイブリッド形 成が起こる確率が高くなる。ブライマーオリゴヌクレオチドより先にブロッカ− オリゴヌクレオチドを標的へハイブリッド形成させることという目的を満たす同 様の手法は、ブライマーオリゴヌクレオチドより先にブロッカ−オリゴヌクレオ チドを反応混合物に添加し前記部分類を連続的に添加することによる。これとは 別に、結合順序は、また、反応物質類の比率および／または濃度を変化させるこ とによって、制御可能であることに注意されたい。“ループＥＲＡ”　（下記で 説明）においては、Ｔｍおよび近接性を用いることによって優先的結合が行われ る。

当業者であれば、相補配列へのハイブリッド形成に比較してそのＴｍにとってよ り重要であるオリゴヌクレオチド部分の長さは、前記部分の相補配列へのハイブ リッド形成の”速度“を速めるために操作可能である。したがって、例えば、明 確な配列ＸおよびＹを有する２個の領域を有する標的配列があるとし、第１のオ リゴヌクレオチドが配列Ｘに対して相補な長さＸ゛を有し、かつ、第２のオリゴ ヌクレオチドが配列Ｙに対して相補な長さＹ゛を有しているとすると、前記第１ のオリゴヌクレオチドは、ｘ’　＞ｙ’　であるとして、第２のオリゴヌクレオ チドよりもより緊縮条件下で標的に“迅速１ご通常ハイブリッド化するであろう 。オリゴヌクレオチドハイブリッド形成のこうした面は、開示された増幅操作に とって効率的利用を容易にする。

Ｃ４本発明の“エンドランオリゴヌクレオチド”本発明の第３のオリゴヌクレオ チド、すなわち、“エンドラン”プライマーは、プライマー分子であり、従って 、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能な３′末端を有していなければならない 。

エンドランオリゴヌクレオチドの配列は、その３°末端がブロッカ−オリゴヌク レオチドの予め定められた配列に相補であるがまたはそれほど好適ではないがブ ライマーオリゴヌクレオチドの伸長によって制作された配列に相補であるように 、選択される。ブロッカ−オリゴヌクレオチドの予め定めた相補配列は、ブロッ カ−オリゴヌクレオチドの５°末端ヌクレオチドを含有するのが最適である：し かじ、内部配列も同様に適している。

エンドランオリゴヌクレオチドの相補３′末端配列は、エンドランオリゴヌクレ オチドの３゛末端配列とブロッカ−オリゴヌクレオチドの相補配列の間のハイブ リッド形成を可能とするように十分な長さにしなければならない。エンドランオ リゴヌクレオチドに対する唯一の制限として、その３°末端がブライマーオリゴ ヌクレオチドと実質的にハイブリッド化不可能であることが挙げられる。しかし 、好適には、エンドランオリゴヌクレオチドの３°末端は、前記２者が互いにハ イブリッド化した際にブロッカ−オリゴヌクレオチドの５′末端を超えて伸長し ない。第１図に示した本発明の態様において、および、連結事象が起こり得ない 状況において、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端を超えて伸長している ３′末端のエンドランオリゴヌクレ、オチドは、また、ブライマーオリゴヌクレ オチドの３°末端のある領域（又はその伸長産物）とハイブリッド化でき、それ 故に、ブライマーオリゴヌクレオチドに沿って伸長できた：第２図に示した本発 明の態様の場合、限定された標的がないのにもかかわらず非論理的ＰＣＲ反応が 起こり得、誤陽性結果を生じることになる。すなわち、この事象は、ブライマー オリゴヌクレオチドに対して伸長反応を“開始“させることができ、その結果、 エンドランオリゴヌクレオチドの“コピー“からなる産物が生成することになり 、もしエンドランオリゴヌクレオチドの３″末端が垂れ下がり（オーバーハング し）ブライマーオリゴヌクレオチドの３°末端にハイブリッド化するならば、プ ライマーおよびブロッカ−オリゴヌクレオチドの連結反応が特定標的の存在と無 関係に起き得るであろう。

エンドランオリゴヌクレオチドの長さは、従って、ブロッカ−オリゴヌクレオチ ドの長さ未満であるかまたはそれに等しいであろう。そのようなものとして、エ ンドランオリゴヌクレオチドの全長がブロッカ−オリゴヌクレオチドの長さの約 ５０％および約１００％の間にあることが好適でありニブロッカーオリゴヌクレ オチドの長さの約７５％および約９５％の間にあることがさらに好適であり、お よびブロッカ−オリゴヌクレオチドの長さの約８０％であることが最も好適であ る。これとは別に、エンドランオリゴヌクレオチドのＴｍがブロッカ−オリゴヌ クレオチドのＴｍの約５０％および約１００％の間にあることが好適でありニブ ロッカーオリゴヌクレオチドのＴｍの約７５％および約９５％の間にあることが さらに好適であり：およびブロッカ−オリゴヌクレオチドのＴｍの約８０％であ ることが最も好適である。さらに、エンドランオリゴヌクレオチドの３°末端が ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端と平滑であることも最も好適であり、 その結果、上述したようにエンドランの“オーバーハングという結果が効果的に 回避される。エンドランオリゴヌクレオチドの５°末端がブロッカ−オリゴヌク レオチドの５′末端と平滑になっている必要はない。

エンドランオリゴヌクレオチドの３°末端はブロッカ−オリゴヌクレオチドとハ イブリッド化可能でなければならないが、エンドランオリゴヌクレオチドの内部 または５°末端配列がブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列に対して同様に相補 的な関係にある必要はない。したがって、好適な管様において、エンドランオリ ゴヌクレオチドの全体がブロッカ−オリゴヌクレオチドにハイブリッド化可能で あろうし、また、別の態様では、エンドランオリゴヌクレオチドがブロッカ−オ リゴヌクレオチドに実質的にハイブリッド化不可能である内部または５゛末端配 列を有するように設計されるであろう。下記で詳細に説明するように、このよう な可能性は他の産物から増幅産物の１個の鎖を精製するための容易な手段を提供 するので、重要な利用性を有する。同様に、それによって、二重鎖増幅産物の両 方の鎖の配列を同時に推定可能である。

■　”エンドラン増幅゛反応の総論 下記の議論は二重鎖ＤＮＡ　（またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド類）の増幅を 参考として例示しているが、この議論は、ＲＮＡ、　−重鎖Ｄ　Ｎ　Ａまたは先 の核酸種類のいかなるものの混合物に対しても同等に適用できることを理解され たい。

本発明の“エンドラン増幅”　（“ＥＲＡ”）反応の最も単純な態様は、ブロッ カ−オリゴヌクレオチドが標的の相補配列にハイブリッド化するように、ブロッ カ−オリゴヌクレオチドの存在下において標的分子をインキュベーションするこ とからなる。これがなされた後、ブライマーオリゴヌクレオチドまたはエンドラ ンオリゴヌクレオチドのいずれかが添加可能である。標的配列鎖に対するオリゴ ヌクレオチドハイブリッド形成の最適な順序は下記のようである。

ブロッカ−オリゴヌクレオチド、次にエンドランオリゴヌクレオチド、次にブラ イマーオリゴヌクレオチドである。好適な態様として、ブロッカ−１次にブライ マーオリゴヌクレオチド、次にエンドランオリゴヌクレオチドおよびブロッカ− オリゴヌクレオチドまたはエンドランオリゴヌクレオチドおよびブライマーオリ ゴヌクレオチドという順序にすることもできる。ブロッカ−オリゴヌクレオチド が標的に対してハイブリッド化する最初のオリゴヌクレオチドであることが好ま しいことは明らかである。このような添加順序は、例示であり、本発明を全（限 定するものではない。未使用反応物質が反応から除去されない限り、全てのもの は増幅のその後のいずれの過程の各段階においてすぐに利用されるであろうとい うことは明らかである。もっとも、もし連続的添加がこのような増幅のその後の 過程において望まれるならば、未使用オリゴヌクレオチド類は、増幅サイクルの 完結時での反応から除去されるがまたは分離することができ、その後、増幅のそ の後の過程に所望の順序で再度添加できる。

反応容器内におけるブロッカ−オリゴヌクレオチドとブライマーオリゴヌクレオ チドとエンドランオリゴヌクレオチドとの比率は、＞＝Ｉ：ｌ：１であるのが最 も好適である。しかし、変更も可能である。好ましくは、ブロッカ−オリゴヌク レオチドは、プライマーオリゴヌクレオチドの濃度に等しいかまたはそれより高 い１度で存在すべきであり、例えば、１．５：１またはそれ以上である。したが って、プライマーオリゴヌクレオチドの量はブロッカ−オリゴヌクレオチドの量 を超えないことが最も好適である：このような状態は、ブロンカーオリゴヌクレ オチドより前の標的をハイブリッド化するためのブライマーヌクレオチドの傾向 を増大する可能性があり、下記で詳細に説明するが、回避しなければならない状 況である。エンドランオリゴヌクレオチドに対するブロッカ−オリゴヌクレオチ ドの比率は、ＥＲＡプロトコールに影響を及ぼすことな（、好適な比＞＝ｌ：１ から変更することもできる。回避しなければならない状況は、エンドランオリゴ ヌクレオチドによるブロッカ−オリゴヌクレオチドの滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ）であり、プライマーオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリッド化するとき にブロッカ−オリゴヌクレオチドが十分に利用されなくなる。この状況は、サイ クル時間、反応温度、Ｔｍ、オリゴヌクレオチドの長さ、標的の濃度を調節する ことによってまたはエンドランオリゴヌクレオチドに対するブロッカ−オリゴヌ クレオチドの比率を調節することによって、回避することができる。これらの要 因の内、エンドランオリゴヌクレオチドに対するブロッカ−オリゴヌクレオチド の比率を調節して、先の状況を回避するのが好適であり、その理由として、この 要因は、他と比較して、制御がより容易であることが挙げられる。好適には、こ の比率は、＞＝１：１である。

ハイブリッド化したブロッカ−オリゴヌクレオチドからハイブリッド化したプラ イマーオリゴヌクレオチドを分離するギャップがある場合、ｄＮＴＰｓとともに ポリメラーゼを添加して、プライマーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ媒介、 テンプレート依存性伸長を触媒化するために適した条件下に反応を保持する。ハ イブリッド化したブロッカ−オリゴヌクレオチドとハイブリッド化したプライマ ーオリゴヌクレオチドの間の“ギャップ”は、いかなるヌクレオチド長さのもの であることもできる。その長さが長ければ、十分な時間がプライマーオリゴヌク レオチドの伸長およびそのブロッカ−・オリゴヌクレオチドへの連結を可能にし 増幅サイクルのタイミングが確実に制御される。もっとも妥当な時間内に増幅産 物の産生を最大とするために、各増幅サイクルの時間を短縮することが一般的に 望ましいので、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末端とプライマーオリゴヌ クレオチドの３°末端の距離は、両者が標的にハイブリッド化した際に約２ｆ［ １乃至約１０，０００個の塩基であるのが好適であり、さらに約２個乃至約１， ０００個の塩基であるのがより好適であり、および約２個乃至約２００個の塩基 であるのが最も好適である。もちろん、１個を超えるプライマーオリゴヌクレオ チドを利用できること、すなわち、ギャップ内部において定義された配列の領域 にハイブリッド化する追加のプライマーオリゴヌクレオチド（類）も利用できる ことは、明らかである。指摘したように、いったんプライマーオリゴヌクレオチ ドが、その３°末端がブロッカ−オリゴヌクレオチドの５′末端に隣接するよう に伸長されれば、本発明は、前記２種のオリゴヌクレオチドの相互の連結を意図 することになる。

プライマーおよびブロッカ−オリゴヌクレオチド類が、標的へのハイブリッド形 成によって、それらのそれぞれの３′および５°末端が隣接し、次に、前記オリ ゴヌクレオチド類がプライマー伸長段階がなくても互いに連結できるようになる ように、設計されている。

この段階において反応条件は、鎖分離が起こるように、改変される。鎖分離は、 いかなる適切な変性方法を用いても達成できる：これらは、物理的、化学的また は酵素的手段の利用を含む。鎖分離の物理的手段は、核酸が完全に変性されるま で核酸を加熱することを含む、熱変性は、典型的には、約り０℃〜約１０５℃（ 好適には約９５℃）の間の温度を約１〜約ＩＯ分間（好適には約４−５分間）、 利用することを含む。鎮分離のその他の物理的方法は、二重鎖が配！されている 媒体のｐＨを変化させることを含む：ｐＨ変性は、典型的には、約１〜約ＩＯ分 間、約ｐＨ１１〜約ｐＨ１４のｐＨ範囲を利用することを含む。鎖分離の酵素的 方法は、ヘリカーゼ類またはへリカーゼ活性を有しかつＡＴＰ存在下において二 重鎖ＤＮＡを変性させると報告されている酵素Ｒｅ　ｃＡと称される酵素類の利 用に依存することが可能である。ヘリカーゼ類を核酸鎖から分離するために適し た反応条件は、Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｍ　ｏ ｎ　ｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ−影上立上立エヱエ第ＸＬＩＩＩ巻、”Ｄ　Ｎ　Ａ 　ｆＩ製および組換え（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７８）　、Ｂ、Ｋｕｈｎら、　”ＤＮＡ　ヘ リカーゼ類”、６３−６７頁に記載されている。本文で参考として引用。熱変性 を利用する（好適である）際、ＥＲＡプロトコールで利用する酵素類は、熱安定 酵素類に最も好適である。

もし連結反応が起これば、次に、ブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびプライマ ーオリゴヌクレオチド（またはその伸長産物）は共有結合し単一分子（すなわち 、“所望の分子“）となる。

指摘したように、配列がブロッカ−オリゴヌクレオチドの配列に相補であるエン ドランオリゴヌクレオチドは、３°末端を有している。それゆえ、プライマーオ リゴヌクレオチド（またはその伸長産物）およびブロッカ−オリゴヌクレオチド の連結から生じる単一分子は、エンドランオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ媒 介、テンプレート依存性伸長のテンプレートとして作用できる。これを達成する ため、反応条件は、鎖間ハイブリッド形成が起こり得るように改変される。

エンドランオリゴヌクレオチドの伸長は、配列が標的配列からなる分子を生み出 す。このようなものとして、ブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類 は、エンドラン伸長産物にハイブリッド化でき、新しい”所望の分子”を形成す る。

所望の分子の選択したレベルの増幅をもたらすために、上記に記載されたサイク ルは所望なだけ頻繁に繰り返してもよい。１段階の産物が他の基買となるので、 前記反応サイクルによって増幅媒介化は、所望の配列の対数増幅をもたらす。

したがって、本発明は、特に、例えば、遺伝的障害を示唆する公知または非公知 のいずれかの増幅配列類に有用である；特に、本発明は、ポリヌクレオチド配列 における単一塩基欠損の存在の決定に関する。さらに、本発明は、増幅産物の解 析（例　配列決定）を可能とする公知配列または部分的に非公知の配列を有する ポリヌクレオチド類の増幅に利用できる。

増幅反応を行った後、当該技術分野で公知の種々の技術のいかなるものも不当な 実験を行うことなく上記検出を可能とするかまたは容易にすることを適用しても よい。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを磁気微粒子ビーズまたは樹脂性支持体のよう な固体支持体に結合させ、標的配列によって決定されたＲＮＡ配列に相補のこの ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるＲＮＡ増幅産物の捕獲は、い（つかの状況にお いて特に好都合である。好適には、このオリゴヌクレオチド配列は増幅前に標的 を精製するために使用したいかなるオリゴヌクレオチドのそれとも重複していな い。このようにして形成したＲＮＡ　：ＤＮＡハイブリットは、抗体類（または その断片類）で検出されてもよい。好適には、ＲＮＡ　：　ＤＮＡへテロ２本鎖 を結合する標識化されてもよい。上記抗体類による結合の検出は、当該技術分野 で周知のい（つかの方法によって実施できる。

これとは別に、増幅された核酸は、当該技術分野で周知である、ゲル電気泳動、 ハイブリッド形成または前記二法の併用によって検出できる。当業者であれば、 本発明を改良して多くの検出法を取り入れることができることが明らかであろう 。

本発明の方法によって増幅された配列は、（例えば、ゲル電気泳動によって、カ ラムクロマトグラフィによって、アフィニティクロマトグラフィによって、ハイ ブリッド形成によってなど）精製でき、精製産物を含有する分画を本発明に従っ てさらに増幅に供することができる。

■、　“エンドラン増幅”反応を実施するための好適な一般的操作本発明の一般 的方法についての上述の総論によって、ある操作が特に好適であることが判明し た。

ブｏ　＝ｙシカ−プライマーおよびエンドランオリゴヌクレオチド類の好適な長 さおよびＴｍに関する一般的パラメータ類は、上記で詳細に開示した。特に好適 な態様では、長さくヌクレオチド類として）は下記のようである；ブロッカ−オ リゴヌクレオチド−２３ニプライマーオリゴヌクレオチド−１ｏ；エンドランオ リゴヌクレオチド−１８゜持に好適な態様において、Ｔｍ　（’Ｃ）は、下記の ようである；ブロッカ−オリゴヌクレオチド−８５ニプライマーオリゴヌクレオ チド−４５；エンドランオリゴヌクレオチド−７５゜本方法のブロッカ−オリゴ ヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチドおよびエンドランオリゴヌクレオ チドを同時に反応容器に添加することが、最も好適である。しかし、前記反応物 質類は、順次またはグループとして添加することもできる。前記オリゴヌクレオ チドを順番に添加すべき場合、下記の順番を採用するのが好適であるニブロッカ ー、エンドラン、プライマー；ブロッカ−およびプライマー、エンドラン；また は、ブロッカ−およびエンドラン、プライマー。これとは別に、反応容器（標的 配列からなる）を約４℃に保持するとｍ−当業者には明らかであるように、この 温度で、ハイブリッド形成および酵素活性が実質的におよび通常完全に予防され るので、前記部分をいかなる順序でもまたは単一混合物としてもオリゴヌクレオ チド部分の長さくおよび／またはＴｍ）は、標的が最初にブロッカ−オリゴヌク レオチド、次にプライマーオリゴヌクレオチドそして最後にエンドランオリゴヌ クレオチドとハイブリッド化する確率を高めるように設計されているので、前記 オリゴヌクレオチド類は、典型的には、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの濃度が プライマーオリゴヌクレオチドまたはエンドランオリゴヌクレオチドのそれに等 しいかまたはそれを超えるように添加される。各部分は、約１０ｎＭ　（ｎａｎ ｏｍｏ　１ａｒ）から約４００ｎＭの範囲の１度で存在する：好適には、約５０ ｎＭから約３００ｎＭ：最も好適には、約１１００ｎである。各反応のために使 用するプローブの最適員は、実施する増幅サイクルの数に応じて所望により変更 する。最適１度は、当業者が容易に決定できる。

一般的に、当業者には明らかであるように、緊縮条件は、温度、緩衝液（類）お よび関連パラメータ類に依存している：しかし、温度パラメータは、通常制御が 最も容易で、それ故に、変動させＥＲＡの性能を最適化するために利用できる好 適な緊縮パラメータである。攪摘したように、温度媒介緊縮に直接関連している のは、オリゴヌクレオチド長さである一一一シたがって、緊縮条件は、プライマ ーオリゴヌクレオチドより先にブロッカ−オリゴヌクレオチドを標的にハイブリ ッド化させかつ標的分子類を互いにハイブリッド化させるという目的に沿って、 当業者は容易に最適化できる。

プライマーおよびブロッカ−オリゴヌクレオチド類が互いに隣接するように設計 されていなければ、連結可能な基質が得られるまで、ポリメラーゼを用いてブロ ッカ−オリゴヌクレオチドの方向にプライマーを伸長させる。もしプライマーオ リゴヌクレオチドを伸長させることが必要であるならば、前記部分類が標的配列 と混合される前、その間またはその後において、好適には、ポリメラーゼ酵素が ｄＮＴＰｓと共に反応容器中に存在するであろう。最も好適には、前記ポリメラ ーゼ酵素は、熱安定ポリメラーゼ酵素である。最も好適な追加の段階は、既に標 的配列、ｄＮＴＰｓ、および反応物質オリゴヌクレオチド類を含有する反応容器 に、前記ポリメラーゼを混合することを必要とする。上記の連続的添加の代わり に、反応物質類全てを反応容器中で混合し、ハイブリッド形成および酵素活性を 実質的に予防するためにその温度を約４℃に保持する。

ＥＲＡの増幅段階は伸長事象ならびに連結事象に依存しているので、前記操作に おける次の段階は、標的にハイブリッド化したブロッカ−およびプライマーオリ ゴヌクレオチドの連結であるのが好適である。したがって、前記２種の分子類を 共有結合で架橋する手段は好適にはりガーゼ酵素であり、および最も好適には熱 安定リガーゼ酵素であるが、前記分子類が標的配列と混合される前、その間また はその後において反応容器中に存在する。最も好適には、前記リガーゼは、オリ ゴヌクレオチド部分が反応容器に添加された後でそれに添加される。

前記反応における次の好適な段階は、標的鎖または連結プロツカーープライマー オリゴヌクレオチドのいずれかに対してハイブリッド化したエンドランオリゴヌ クレオチドのポリメラーゼ媒介、テンプレート依存性伸長である。もしあるポリ メラーゼが先に反応容器に添加されていなければ、このようなポリメラーゼが、 上記で検討したポリメラーゼ添加に関する同一条件下で好適には添加される。

反応物質成分類を添加する最も好適な順序は、下記のようである、反応緩衝液： 標的配列；　ｄＮＴＰｓ　：オリゴヌクレオチド類；熱安定リガーゼ酵素；熱安 定ポリメラーゼ酵素。最も好適には、前記熱安定ポリメラーゼ酵素は、“ホット スタート″の後に添加され、すなわち、ポリメラーゼ酵素を反応容器に添加する 前に最初の“変性サイクル”を実施する。指摘したように、最も好適には、され らの成分類は、増幅プロセスの開始が望ましくなるまで、約４℃に保持される。

前記反応成分類は、反応容器に対して手動で添加でき、または、種々の反応成分 類を反応容器（類）に自動的に添加可能なロボットによる自動化ラボラトリステ ーションによって添加することもできる。特に好適なロボットによる自動化ラボ ラトリステーションは、ＢＩＯＭＥＫ”　１０００　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓ ｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｆｕｌ　Ｉｅｒｔｏｎ、ＣＡ）である。

もし最も好適であるが反応容器を４℃に保持したならば、反応成分類をｌ昆合し た後で、反応容器を“ホットスタート”に供する。すなわち、ポリメラーゼ酵素 の添加によるＥＲＡ開始前に標的配列を完璧に変性させるため、温度を約９５° Ｃまで約５分間、上昇させる。この後に、好適には、増幅サイクルが行われる。

いかなる特定のサイクルにおいても、少なくとも１回の連結事象が標的にハイブ リッド化したブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびブライマーオリゴヌクレオチ ドの間で起こることおよび標的にハイブリッド化したエンドランオリゴヌクレオ チドおよび／またはブロッカ−オリゴヌクレオチド−ブライマーオリゴヌクレオ チド−エンドランオリゴヌクレオチド連結産物が少なくとも１回伸長されること が望ましい一一一シかし、増幅は実質的に対数的であるので、このような事象の 回数は各サイクルの後で顕著に増加する。

１回のサイクルは、前記オリゴヌクレオチド類のそれらのそれぞれの標的類に対 するアニーリングおよびそれからの変性を必要とする。したがって、もし変性が 温度によって媒介されるならば（最も好適であるが）、前記サイクルは、反応容 器の温度を調整することによって制御される。もし熱安定性でない酵素類を利用 するならば、その際には鎖を変性させるために必要な温度が達成されるので、酵 素の酵素活性が破壊されることも実質的に可能である；したがって、酵素を各サ イクルの後に新たに添加することも必要である。熱安定酵素類が好適に利用され るのも主にこの理由からである。

各サイクル内部で利用される温度は、主に、オリゴヌクレオチド部分のＴｍに依 存している。長さが約６個乃至約１０個の塩基類のオリゴヌクレオチドは、約４ ０’ＣのＴｍを有しており、この温度で熱感受性（すなわち、熱安定性でない） 酵素類は活性である。しかし、より長いオリゴヌクレオチド類を使用すれば、そ のＴｍは上昇し、熱安定酵素類の使用または各サイクルの後に熱感受性酵素類の 添加を必要とする。最も好適なオリゴヌクレオチド長さについて（ブロッカ−オ リゴヌクレオチド−塩基２３個；ブライマーオリゴヌクレオチド−塩基ｌＯ個； エンドランオリゴヌクレオチド−塩基１８個）、各サイクルは、下記のパラメー タによって規定されるのが最も好適である＝９５℃−１分、７０’Ｃ−４分、４ ０”Ｃ−４分。

サイクル回数は、主に、研究者の必要に依存している。典型的には、約１０回乃 至約２０回の間のわずがのサイクルの後に検出可能な結果が得られる。しかし、 ２０回を超えるサイクルは、もし反応が反応容器中に存在するオリゴヌクレオチ ド類の１度、ｄＮＴＰｓおよび酵素によって限ホされなければ、利用することが できる。

適当数のサイクルを実施した後、反応を停止できる。これは、酵素を不活化する ことによって効率的に実施でき１、最も好適には、反応容器温度を４°Ｃまで低 下させることによって達成できる。しかし、例えば、ＥＤＴＡおよび尿素“停止 ”色素のようなその他の手法も使用できる。さらに、前記酵素類は、当業者に公 知の方法を用いて化学的に不活化でき、または、前記成分類は、たとえば、セフ ァデックス７Ｍカラム上で；ろ過によって；遠心分離によって：またはゲル電気 泳動によって分離できる。

あらゆる増幅プロトコールに関連する潜在的に致命的な問題として、汚染が挙げ られる；この問題は、特に、増幅プロトコールが診断目的のために使用されよう としている場合に重大となる。たとえば、反応容器１個による中等度の汚染であ っても、誤陽性結果を生じることがある：すなわち、第１の容器に存在している が第２の容器には存在していない所望の標的が、第１容器から第２容器に群善に 移ることがあるかも知れない：したがって、実際にその標的が最初第２の容器に 存在していないときに、その第２の容器は、所望の標的の増幅の証拠となるであ ろう。このような汚染の可能性を実質的に低下させるための種々の手法が提供さ れている。このような手法のひとつは、酵素ウランルーＮ−グリコシラーゼ（“ ＵＮＧ〒）使用を必要としている。ＵＮＧは、ウラシルからなるオリゴヌクレオ チド類がＵＮＧ存在下において効果的に分解されるように、ウラシルを分解する 。さらに、ＵＮＧは、熱（すなわち、約８０℃）によって不活化され得る。した がって、汚染に関する懸念が弱まった時に、反応混合物中でｄＴＴＰをＵＴＰで 置換し、増幅産物類がチミジンの代わりにウラシルを取り込むようにすることが 、好適な解決法である。第１容器中における標的の増幅の後に、ＵＮＧを第２容 器に添加する：もし第１容器由来のいかなる増幅産物であっても第２容器を汚染 しているならば、前記ＵＮＧは、汚染物貰を効果的に分解するであろう。その後 、第２容器を、前記容器を約８０℃まで加熱してそれによってＵＮＧを不活化す ることによって、“ホットスタートさせる。その後、ｄＮＴＰｓおよび／または 酵素類をＥＲＡプロトコール開始のために第２反応容器に添加できる。

Ｖ　本発明の例示的態様、およびそれらの好適な用途当業者であれば容易にわか るように、下記に例示した種々の態様１、　“ギャップなし“　ＥＲＡ “ギャップなし”ＥＲＩＦｔ様は、ハイブリッド化したブライマーオリゴヌクレ オチドの３゛末端がハイブリッド化したブロッカ−オリゴヌクレオチドの５゛末 端に直接隣接している（すなわち、隣あっている）場合である。この態様におい て、ブライマーオリゴヌクレオチドのテンプレート媒介伸長は必要でない。本発 明のこの面は、上述の一般的ＥＲＡ操作に従って実施され、かつ、第１図および 第３図（二重鎖核酸）および第５図（−重鎮核酸）中において、例示されている 。

ハイブリッド化したプライマーおよびブロッカ−オリゴヌクレオチド類はこの態 様において隣接していなければならないが、この態様の実施では、標的核酸配列 の少なくとも一部をＬズユ土ユに決定しておくことを必要としている。こうした 情報は、ブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類の配列を明確にする ために、必要である。ブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類は、必 ずしも、前記標的に沿つて完全にハイブリッド化するようには設計されていない ：むしろ、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端とプライマーオリゴヌクレ オチドの３゛末端が緊縮条件下でそれにハイブリッド化できるように、標的配列 に関する十分な詳細が、知られていなければならない。これとは別に、標的配列 は、開示されたプロセスで利用するために十分なオリゴヌクレオチド相補対を産 生可能であるだけの十分な量で単離できる。

本発明のこの態様は、特に、遺伝的変異または多型部位を識別するために適して いる。この点に関して、最も好適には、ブライマーオリゴヌクレオチドの配列が 、その３°末端ヌクレオチドが識別される“正常”または“変異”対立遺伝子の いずれかに対応するように、選択されるであろう。明らかであるように、もしブ ライマーオリゴヌクレオチドが“正常”塩基で終止していれば、この塩基は、そ の部位に変異を有するものから由来する標的配列に７％イブリッド化しないであ ろう。さらに、ＥＲＡによる増幅は、試料が“正常”なものから由来した場合に のみ起こるであろう。これとは逆に、“変異”塩基で終止するプライマーを用い て、または、イノシンのような“雑多な”塩基中において、もし試料が“変異“ 遺伝子配列から由来した場合にのみ増幅が起こるように、前記反応を改良するこ とも可能である。

２、　“ギャップ”　ＥＲＡ 上述のように、第２の好適な本発明の態様において、ブロッカ−およびプライマ ーオリゴヌクレオチド類が使用され、これは、標的分子にハイブリッド化すると １個乃至１０，０００個の塩基の間のギャップによって分離される。このギャッ プの存在は、最小量の配列情報しか得られない状況においてさえも本発明の態様 の利用を可能とする点で、重要である。特に、このギャップの配列は、知られて いないこともある；必要であることは、相補ブロッカ−およびプライマーオリゴ ヌクレオチド類が産生されるように、ギャップのいずれかの側のある一部（類） に関して十分に詳細が知られていなければならないことである。

本発明の“ギャップ”ＥＲＡ態様は、第２図および第４図に二重鎖核酸分子につ いて例示しており、第５図において一重鎖核酸分子について例示している。

本発明の“ギャップ”ＥＲＡ態様は、上述の一般的ＥＲＡ操作に従って実施され るが、長さがヌクレオチドで約２００個を超えるギャップについては、各サイク ルの反応時間を長くすることが好適である：好適には、各サイクルは、約１０分 よりも長く、すなわち、約１２−１５分よりも長い。こうした伸長の意図は、サ イクル効率を高めることにある。反応の時間的経過は、反応効率に影響を及ぼす ことなく可能な限り増幅速度を速めるために、好適には最小とする。

１０．０００個を超える塩基のギャップについて、１個以上の追加のブライマー オリゴヌクレオチドを使用することができる（上記追加プライマーオリゴヌクレ オチドは、“プライマー八〇、“プライマーＢ”、“プライマーＣ”等と称され る）。プライマーＡを使用する場合、これは、ギャップ（その配列が公知である かまたは部分的に知られている）の一部にハイブリッド化可能な配列を含有する ように設計される。そうして、もしギャップが極めて大きい（ヌクレオチド約１ ０，０００個よりも大きい）ならば、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端 に対してブライマーオリゴヌクレオチドのプライマーＡ（およびその他のあらゆ るプライマーオリゴヌクレオチド類）を介した伸長を容易にするために、ある部 位、好適にはキャップのおよそ中央部分（またはもし複数のプライマー類を使用 するならば種々の部位）にハイブリッド化させるためにプライマーＡ（または追 加のプライマーオリゴヌクレオチド種）を使用することが望まれる。連結すると 、ブライマーオリゴヌクレオチド、プライマーＡおよびブロッカ−オリゴヌクレ オチドは、互いに共有結合て連結するようになり、それによって、反応において エンドランオリゴヌクレオチドのためのテンプレートを形成する。“ギヤ・ツブ なし”ＥＲＡ態様の操作段階は、“ギャップＥＲＡに対しても等しく適用できる 。本発明の態様は、完全にまたは部分的に非公知の配列の領域（［）からなる標 的配列（類）の増幅に適しており、連結事象は、ブロッカ−オリゴヌクレオチド に直に隣接するところまでブライマーオリゴヌクレオチド（類）を伸長させた後 に起こり、伸長した時点で連結事象は起こり得る。

上述の検出方法は同様に本発明のこの態様に適用できるが、本発明のこの態様を 実施して前記オリゴヌクレオチド類のひとつ（また好適である。これによって、 反応容器からの“ブリング（ｐｕｌｌｉｎｇ）”アンブリコン（ａｍｐ　ｌ　ｉ 　ｃｏｎｓ）が可能となり、それによって、その配列決定が達成できる。

診断への応用については、本発明のこの態様は、１個以上の対立遺伝子を生じる 特異的変異に関連する種々の標識プローブ類を利用する機会を提供する。すなわ ち、遺伝子の特定領域内部に存在することが公知の種々の変異について、ブロッ カ−オリゴヌクレオチド（類）およびブライマーオリゴヌクレオチド（Ｈ”）は 、この領域に隣接するように設計できる。標的の増幅は、その後、明らかとなっ ていない変異のアンブリコンを生成するであろう。公知の変異配列類に関連する 特異的プローブ類を次に用いて、どのプローブが前記アンブリコンにハイブリッ ド化するかに応じて変異の確認が達成できるように、アンブリコンをスクリーニ ングするために利用できる。

本発明のこの態様は、また、遺伝的疾患に関連する遺伝子類の検出および増幅を 容易にするために利用できる。本発明の“ギャップなし”態様と異なり、この態 様においては、ブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類は、標的への ハイブリッド形成によって互いに直接隣接する必要はない。したがって、たとえ ば、本態様を、遺伝子の決定領域中における種々の突然変異変化に起因する種々 の対立遺伝子類（欠失、挿入、再転位、ならびに点突然変異）を特徴とする遺伝 的疾患の場合に用いることができ、前記ブロッカ−およびプライマーオリゴヌク レオチド類は、それらが、標的へのハイブリッド形成によってこの領域に隣接す るように、作製できる。

ブライマーオリゴヌクレオチドの伸長およびプライマー伸長産物へのブロッカ− の連結によって、多型部位に対応する標的配列をエンドランオリゴヌクレオチド が増幅できるようにする。その後、増幅産物は、配列決定されるか、またはプロ ーブ類（例えば、“ギャップ“領域中で起こり得る種々の突然変異のそれぞれに 関連する）を用いて増幅産物をスクリーニングし、どの変異が特定試料中に存在 するかまたはしないかを決定できる。

本発明のこの態様は、また、断片的配列情報のみが入手できるゲノムまたはｃＤ ＮＡ配列類を増幅するために理想的に適している。

この態様を用いて、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを増幅するためのひとつの方法は、発 現タンパク質のアミノ末端配列の知識のみを必要とする。この情報を用いて、こ のような配列をコードする（全てまたは小グループの）コドン類にハイブリッド 化可能なブロッカ−オリゴヌクレオチド、および前記ブロッカ−オリゴヌクレオ チドにハイブリッド化可能なエンドランオリゴヌクレオチドを決定することがで きる。この態様のブライマーオリゴヌクレオチド分子は、前記分子類が一緒にな って、特定コドン類で開始するタンパク質をコードするいかなるｃＤＮＡまたは ＤＮＡ配列も増幅するように、ポリ−子配列からなることができる。

３、　“ＮＥＲＡ”　−−−不スト化（Ｎｅｓｔｅｄ）”　ＥＲＡＥＲＡプロト コールの“ＮＥＲＡ“すなわち“不スト化（Ｎｅｓｔｅｄ）ＥＲＡ″態様は、“ ギャップ“ＥＲＡおよび“ギャップなし“ＥＲＡのハイブリッドである。ＮＥＲ Ａは、好適には、２段階増幅反応として実施される。第１段階は、“カイ−ギャ ップ（ｑｕａｓｉ−ｇａｐ）”、すなわち、配列が実質的に確認された領域を“ ギャップ”が含んでいる“カイ−ギャップ”を含む標的配列を増幅するように設 計されている。第２段階は、第１段階の反応物質分子類に関連して互いに隣接し てハイブリッド化する“ネスト化°ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび“不ス ト化”ブライマーオリゴヌクレオチドからなる分子類を最も好適には用いて、第 １段階の“カイ−ギャップ“を増幅するように設計されている。

したがって、ＮＥＲＡ態様は、偽増幅が（汚染、誤まったハイブリッド形成反応 またはその他の原因の故に）起こったかどうかを調べるためのプロトコールを提 供する。ＮＥＲＡプロトコールは、第７図において二重鎖標的分子類について略 図で示されており、第８図において一末鎖標的分子類について略図で示されてい る。

ＮＥＲＡの第１段階において、ブロッカ−、プライマー、およびエンドランオリ ゴヌクレオチド類は、“ギャップ゛ＥＲＡで説明したのと同一方法で使用される 。すなわち、ブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類は、ギャップに 隣接するように設計されており、ブライマーオリゴヌクレオチドは、それがブロ ッカ−オリゴヌクレオチドに隣接するように伸長され、前記分子類は、互いにリ ガーゼによって連結される。

本反応の第１段階の増幅産物は、本反応の第２段階の標的として用いられる。し たがって、第２段階において、ブロッカ−、プライマー、およびエンドランオリ ゴヌクレオチド類は、第１段階におけるそれらの相手に関して“不ストされてい る（入り子になっている）−と考えられる。第２段階反応物質類は、第１段階の 増幅産物と（特に、リガーゼおよびポリメラーゼ酵素類およびｄＮＴＰｓととも に）混合される。不ストされたブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド 類は、最初の標的のギャップの“充填（ｆ　ｉ　ｌ　１ｅｄ−ｉｎ）”部分とハ イブリッド化するように設計される。このような設計は、第１段階の偽（ｓｐｕ ｒｉｏｕｓ）増幅によって起こったいかなる問題も解決する。偽増幅は、もし、 例えば、第１段階ブロンカーおよびプライマーオリゴヌクレオチド類が非特異的 ”偽標的”領域に第１段階反応中にハイブリッド化したならば、第１段階で起こ るかも知れない。このようなことが起こった場合、前記の充填されたギャップは 、所望の“標的”ギャップに対応しないであろうし、従って、本反応の第２段階 の不ストされたプロ・ツカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド項によって増 幅できないであろう。したがって、二のＮＥＲＡｆｉ様は、偽増幅の可能性を低 下させる。

ＮＥＲＡ態様は、偽増幅の検出を容易にする。もし上記の偽増幅が全く起こらな いならば、すなわち、もし第１段階のブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレ オチド項が真の標的配列にハイブリッド化するならば、その際には、結果として 生成した増幅産物が第２段階の不ストされた反応物質の標的配列として作用でき 、従って、その反応によって増幅されるであろう。

一般的なＥＲＡ操作は、また、ＮＥＲＡ態様においても用いられる。を旨適しで あるが、“ギャップ”がＮＥＲＡに使用される間、第１段階の増幅産物の充填部 分とハイブリッド化できる不ストされたプロ１カー、プライマーおよびエンドラ ンオリゴヌクレオチドが産生できるように、ギャップ内部の配列は十分に明確に されていなければならないということを除いて、“ギャップ″ＥＲＡについて上 記で検討したこと、特性および特徴は、ＮＥＲＡの第１段階にも適用できる。

第１段階の好適な目的は第２段階のために十分な標的を産生ずることにあるので 、第１段階では標識化は必要でない一検出または捕獲は、明らかであるように、 これらのパラメータにおいてはそれ自体必要ではない。しかし、標識化は第２段 階について好適である。

第１段階で十分にサイクルさせた後（すなわち、約５−８０サイクルの間）、好 適には温度媒介によって（すなわち、温度を４℃まで低下させることによって） 本反応を停止させることができ、第２段階を開始させる。第１段階の増幅度物は 、反応容器中に存在するかも知れない未使用反応物質から分離する必要はない。

これは、対数増殖が起こった程には、反応容器に対する不ストされたブロッカ− オリゴヌクレオチド分類の添加が上記未使用反応物質と競合することはないであ ろうという理由による一一一前記ネストされた部分類は、定義されているように 、増幅産物に沿う領域にハイブリッド化するように設計されており、従って、緊 縮条件下では未使用反応物質に当然ハイブリッド化しない。しかし、第１段階の 増幅産物は、例えば、カラムクロマトグラフィ、生体特異的アフィニティ（例　 ビオチン−アビジン）、ゲル精製等によって未使用反応物質から分離可能である 。

ＮＥＲＡの第２段階は、“ギャップなし”ＥＲＡについて上記で検討したこと、 特性および特徴に従って実施される。指摘したように、第１段階の増幅産物は、 好適には標識されていない。これと対照的に、第２段階の増幅産物は、好適には 、上述のようにして、標識され、検出される。

４、　“ＬＥＲＡ”−“ループＥＲＡ 本発明の“ループＥＲＡ”すなわち“ＬＥＲＡ″態様は、先に記載のＥＲＡ態様 とは、ＬＥＲＡにおいてはブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類が 好適にはオリゴヌクレオチドブリッジによって互いに結合されている点において 、異なっている。さらに詳細には、前記ブリッジは、生成した分子が開放された 環状のすなわち″ループ”オリゴヌクレオチドとして定義されるように、ブロッ カ−オリゴヌクレオチドの３゛末端をブライマーオリゴヌクレオチドの５゛末端 に結合する。

ブロッカ−オリゴヌクレオチドのブライマーオリゴヌクレオチドへの結合は、高 緊縮条件下における前記ループのブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびブライマ ーオリゴヌクレオチド部分の標的配列に対するハイブリッド形成を妨害せずかつ 前記標的配列の対数増殖を妨害しないいかなる手段によっても達成できる。最も 好適には、結合は、“非特異的”ヌクレオチド類（すなわち、前記標的配列のい かなる領域との相補性も意図していない配列）によって達成される。このような 非特異的ヌクレオチド類の使用によって、前記オリゴヌクレオチド類の調製時に おいて前記ループの合成が可能となるのは好都合である。すなわち、ブロッカ− オリゴヌクレオチドおよびブライマーオリゴヌクレオチドの両者および非特異的 領域からなる１個のオリゴヌクレオチドが調製される。

ＬＥＲＡ態様は、第９図に例示されている。前記ループが一重鎖として合成でき るのが最も好適である：第９Ａ図に概略を示したように、前記ループのブロッカ −オリゴヌクレオチドおよびブライマーオリゴヌクレオチド領域が同定されてお り、点線は、非特異的領域（好適にはヌクレオチド）を示している。前記ループ のブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびブライマーオリゴヌクレオチド領域は、 上記で述べたブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類に機能的には等 価である。

前記ループのブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびブライマーオリゴヌクレオチ ド領域はブロッカ−オリゴヌクレオチド領域の５゛末端がブライマーオリゴヌク レオチド領域の３°末端に隣接するかまたはギャップがこれらの領域の間に生じ るように、標的にハイブリッド化可能でなければならないので、前記ループの非 特異的領域は、十分な長さとなっており、この要件と矛盾しないように、標的配 列に対してブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチド 領域がハイブリッド形成できるようになっていなければならない。第９Ｂ図は、 このようなハイブリッド形成を概略例示しており、明らかであるように、ブロッ カ−オリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチド領域が標的にハイ ブリッド化すると、開部分からなる”ループが形成される。

前記非特異的領域がヌクレオチド類のみから構成されているとき（最も好適であ る）、その長さは、好適には、塩基約４０個より長く、より好適には塩基約５０ 個よりも長い。たとえば、親水性脂肪族リンカ−類のような親水性の直鎖または 分校有機分子類のようなその他のリンカ−類を用いる時、塩基の数は対応して減 少する。非特異的領域の機能的意図は、（ａ）ブロッカ−オリゴヌクレオチド領 域のプライマーオリゴヌクレオチド領域への連結および（ｂ）ブロッカ−オリゴ ヌクレオチド領域およびプライマーオリゴヌクレオチド領域の標的配列上におけ るそれらのそれぞれの相補領域へのハイブリッド形成を可能とする十分な結合を 提供することにある。

標的の場合、連結事象またはブライマーオリゴヌクレオチドの伸長反応とそれに 引き続き連結事象が（標的および前記ループのブロッカ−オリゴヌクレオチドお よびブライマーオリゴヌクレオチド領域に関してもし適切であれば）起こる。こ の後に終結ループが標的から分離される。エンドランオリゴヌクレオチドはＥＲ Ａの一般的特性と矛盾することな（ブロッカ−オリゴヌクレオチドのある領域と 相補であるのが最も好適であるが、次に、前記の終結ループにハイブリッド化可 能であり、ポリメラーゼ媒介、テンプレート依存性の伸長反応において、ループ に沿って伸長される。第９Ｃ図は、エンドランオリゴヌクレオチドの終結ループ へのハイブリッド形成およびエンドランオリゴヌクレオチドの伸長を概略示して いる反応容器内部のりガーゼ酵素の存在がエンドランオリゴヌクレオチドの５゛ 末端とその伸長産物の３゛末端の連結事象を触媒でき、それによって、共有結合 で閉じられた二重鎖環状分子が生成できることは重要である。このような分子の 鎖は分離が困難であろうが、このような分子の形成は、標的分子の対数増幅を妨 害するかも知れない。この可能性を避けるため、エンドランオリゴヌクレオチド の５゛末端に連結ブロックプルーブを取り入れるのが好適である。もしこのよう なグループが存在すると、その際には、変性条件下において、伸長したエンドラ ンオリゴヌクレオチドは、前記ループのブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびブ ライマーオリゴヌクレオチド領域に対して相補領域からなるテンプレートして作 用し、それによって、対数増幅を容易にするであろう。

Ｌ　Ｅ　ＲＡは、また、標的が二重鎖分子である場合も使用できる。

さらに、エンドランオリゴヌクレオチドは、また、標的績のひとつのある部分と ハイブリッド化できるので、エンドランオリゴヌクレオチドのこの標的績に沿っ た伸長が起こる。

ＬＥＲＡのいくつかのサブ態様において、ループの非特異的ブリッジ領域を改変 して所望の特性を有する領域を取り込ませる。たとえば、前記ブリッジは、増幅 分子のクローニングまたは配列決定が容易となるように、１個以上の制限部位を 有することができる。このような制限部位は、共有結合閉鎖二重鎖環状分子類が 確実に形成しないようにするための代替え手段として、ブロッカ−オリゴヌクレ オチドの５゛末端に添加するのが望ましい前記ブロックグループを添加すること の代わりに、使用できる。前記ブリッジ領域は、生成した分子が例えばＲＮＡ５ 　ｅ　Ｈ，ＵＤＧおよびエンドヌクレアーゼＩＶによる分解を受け、エンドラン 伸長産物の３°および５゜末端が閉鎖ループを“開”とし、それによって、さら に増幅させるためにテンプレートを形成するように、修飾塩基類、特にデオキシ ウリジンまたはりボスクレオチド類を含有できる。熱安定ＲＮＡ５ｅＨを利用で きるのは好都合である。本文で参考として引用したＩｔａｙａら、Ｎｕｃ、Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、１９：４４４３−４４４９　（１９９１）参照。

前記非特異的ブリッジ領域は、また、種々の異なる機能的パラメータ類を取り込 むように設計できる。たとえば、ハイブリッド形成捕獲領域を、増幅産物の回収 率を上げるために、前記領域中に取り込ませることができる。

増幅産物が適切な宿主中に形質転換されるとクローニングによって復製できるよ うに、ブリッジ領域は、複製配列類の開始点（ｏｒｉ　ｇ　ｉ　ｎ）を含有でき る。このようなサブ態様において、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５′末端の ブロックは不必要である。前記ブリッジ領域は、また、遺伝子配列類、特に選択 可能なマーカー類をコードする遺伝子配列類を含有できる。

さらに別のサブ態様において、ブリッジ配列は、エンドランオリゴヌクレオチド が伸長すると、標的配列を転写可能な転写活性部位が生じるように、プロモータ またはプロト−プロモータ配列Ｒ（すなわち、補体がプロモータである配列）を 含有できる。好適な上記部位として、（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよびリボ ヌクレオチド三リン酸類の存在下において）転写を可能とするＴ７およびＳＦ３ 　ＲＮＡポリメラーゼ結合部位が挙げられる。このサブ態様において、エンドラ ン伸長産物の閉鎖は重要ではないので、ブロックグループは全く必要ではない。

ＲＮＡポリメラーゼ媒介転写によって形成された鎖は、例えば熱変性を必要とし ないでも前記ループから排除される。したがって、ＲＮＡポリメラーゼおよびリ ボヌクレオチド三リン酸類を添加することによって、たった１個の閉鎖ループか らもテンプレートの複数コピーが生じるであろう。これによって、さらに強い対 数増殖（すなわち、高べき乗での増幅）が起こることになる。さらに、ＲＮＡポ リメラーゼによって媒介された増幅鎖は変性を要せずして排除されるので、サイ クリング反応は、等温温度で、すなわち、約３７゜Ｃで実施できる。明らかであ ろうが、このことによって、非熱安定リガーゼおよびポリメラーゼの使用が可能 となり、熱循環の必要性が回避される。

ＲＮＡポリメラーゼ媒介ＬＥＲＡを使用する際、リガーゼおよび／またはＤＮＡ ポリメラーゼに対するＲＮＡポリメラーゼの比率は少なくとも約５＝１かそれ以 上であるのが好適である。さらに、デオキシリボヌクレオチド三リン酸類総量に 対するリボヌクレオチド三リン酸類総量の比率は好適には少なくとも約５＝１以 上である。

また、前記ブリッジ領域は、前記標的のクローニングまたは複数の配列決定を容 易にするため（ＰＣＴ特許出願、ＷＯ９２／２２６５０）、ａ工±またはＩ　ｏ ｘＰ部位類のような部位特異的組損え部位を含有できる（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ、Ｒ ら、：Ｌａｍｂｄａ　Ｕ、（Ｈｅｎｄｒｉｘ、Ｒら編著）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ Ｙ、２１１−２５０頁（１９８３）；Ｈｏｅｓｓ、Ｒ，ら、Ｌ−ｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、１旦：３３９８−３４０２　（１９８２）；５ａ ｕｅｒ、Ｂ、Ｌ、ら、ＵＳ特許第４゜９５９．３１７号。これらは本文で参考と して引用した）。

ＬＥＲＡｉ様は、“ギャップ”ＥＲＡまたは“ギャップなし”ＥＲＡと同様に用 いることができ、従って、遺伝的変異の同定および部分的に非公知の配列を有す る核酸分子類の増幅の両者のために使用できる。しかし、ＬＥＲＡ態様は、増幅 標的分子の最終的クローニングを行う増幅操作において特に好適であることは重 要である。

５　“対連結（ｔｗｉｎ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）”ＥＲＡ“対連結”ＥＲＡは、標 的分子中における複数の連結変異が検出できるように特に改良したＥＲＡ態様で ある。

本方法は、それが、さらにブロッカ−オリゴヌクレオチドを用いる点において池 のＥＲＡ方法と異なっている。この第２のブロッカ−オリゴヌクレオチドは、そ れが特定部位においてエンドランオリゴヌクレオチドの伸長を阻害できるような 位置および方向にある。

ＥＲＡにおける増幅のためにはブライマーオリゴヌクレオチドおよびブロッカ− オリゴヌクレオチドの連結が必要であるのと同様に、第２のブロッカ−オリゴヌ クレオチドの５゛末端のエンドラン伸長産物の３°末端への連結が、“対連結” ＥＲＡにおいてさらに必要となる。

連結反応は増幅産物を生じるために各鎖上で起こらなければならないので、本方 法を用いて標的配列中の２カ所の位置に存在するヌクレオチド類を識別できる。

したがって、増幅は、各ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５°末端ヌクレオチド の標的へのハイブリッド形成能力にかかっている。

この態様において、ブライマーオリゴヌクレオチドハイブリッド形成部位の内部 またはその近傍で１個の配列にハイブリッド化できるように、エンドランオリゴ ヌクレオチドのブロッカ−オリゴヌクレオチドを設計することが特に好適である 。

平滑、二重鎖オリゴヌクレオチド類の存在は、隣接平滑断端連結レベルを上昇さ せることができる。したがって、この態様を実施する際に、ブロックグループお よびオーバーハング類の使用が望ましい。

明らかであろうが、前記態様は、いずれかの鎖または両方の鎖について、プライ マーオリゴヌクレオチドまたはエンドランオリゴヌクレオチドおよびそれらのそ れぞれのブロッカ−オリゴヌクレオチドロッカー類が標的に隣接するかまたは標 的にハイブリッド化し“キャップを産生ずるように、構成されている。同様に、 プライマー類およびブロッカ−類のいずれかまたは両者は、互いに隣接して、“ ループ”ＥＲＡ反応を形成することもできる。同様に、“対連結”態様は、ＥＲ Ａの他のいかなる態様とも併用することができる。

６、　“逆”　ＥＲＡ はとんどの核酸増幅方法は、もし隣接配列情報が決定されさえすれば、遺伝子配 列の増幅を媒介する。多くの場合、標的分子の２カ所の領域に関する配列情報が 必要であるということは、増幅にとって克服しがたい障害となる。“逆”ＥＲＡ は、このような状況下において二重鎖ＤＮＡで使用できるＥＲＡの１つのバリエ ーションであり、標的配列の対数増殖を達成する。“逆”ＥＲＡは、従うて、“ 逆”ＰＣＲと同族である（米国特許第４，９９４，３７０号）。

“逆”ＥＲＡの実施に際して、標的分子の唯一の領域についてのみ過去の配列情 報が従って利用できる。好適には、この利用可能な配列情報を検討して、標的の 配列決定領域内部で切断不可の少なくとも１個の制限エンドヌクレアーゼの本質 を決定する。いったんこうした適切な酵素が同定されれば、それを用いて標的分 子を切断する。それによって生成した断片類全ては、平滑であるかまたは付着性 である末端を含有するであろう。各断片の末端が互いに連結でき、共を結合で閉 じられた二重鎖環状分子類を形成することが重要である。このような連結は、“ 逆”　ＥＲＡプロトコールにおける次の段階である。最も好適には、結果として 生成した共有結合で閉じられた二重鎖環状分子類に鎖排除が促進されるようにニ ックが入れられるであろう。上記鎖排除は、−重鎮閉鎖共有結合分子類が得られ るように、行われるのが最も好適である。

前記標的の配列決定領域を用いてプライマー、ブロッカ−およびエンドランオリ ゴヌクレオチドの配列を明確にする。“逆”ＥＲＡにおいて、ブロッカ−オリゴ ヌクレオチドは、ブライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッド化する部位の５ ゛に位置する部位にハイブリッド化する。したがって、先の態様を参考として、 ブロッカ−およびプライマーオリゴヌクレオチド類のそれぞれの部分を逆転させ る。

“逆”ＥＲＡにおいて、プライマーおよびブロッカ−オリゴヌクレオチド類は、 ハイブリッド化したブロッカ−オリゴヌクレオチドの３′末端がブライマーオリ ゴヌクレオチドの５°末端に隣接するように設計されている。このような方向に おいて、ポリメラーゼ媒介、テンプレート依存性ブライマーオリゴヌクレオチド の伸長の結果、環状標的分子を“取り囲む”伸長産物が生成することになる。

エンドランオリゴヌクレオチドは、それがブロッカ−オリゴヌクレオチドにハイ ブリッド化可能であるように設計されている。したがって、ＥＲＡ反応における 場合と同様、標的の対数増幅が達成される。

したがって“逆”ＥＲＡは、唯一の領域のみが配列決定された分子類を増幅する 能力を有している。ブロッカ−オリゴヌクレオチドの５′末端塩基を冬型部位に 配置することによって、“逆”ＥＲＡを用いである個人が特定遺伝子の”正常” または“変異”対立遺伝子を有するかどうかが決定できる。したがって、“逆“ ＥＲＡは、”ギャップなし“ＥＲＡと同様に用いて遺伝的疾患を診断できるであ ろう。

７、　“ブラインド”ＥＲＡ “ブラインド“ＥＲＡは、′ギャップ”ＥＲＡのバリエーションであり、特に、 研究および医学的利用に適している。“ブラインド”ＥＲＡは、プライマーおよ びブロッカ−オリゴヌクレオチド類の配列を用いて、試料中における“仮説的“ 標的配列の存在を検定する。その他のＥＲＡ態様においては標的分子をプライマ ー、ブロッカ−およびエンドランオリゴヌクレオチド類の配列を明らかにするた めに使用するのに対して、”ブラインド”　ＥＲＡにおいては、反応物質類を用 いて“所望の”標的分子を明確にすることを除いて、それは、“ギャップ”ＥＲ Ａと同様に実施される。明らかであろうが、本方法を用いて、あらゆる特徴群を 有する標的分子類を選択的に増幅できる。

したがって、例えば、ブライマーオリゴヌクレオチドが所望のＤＮＡ結合部位（ ホルモン受容体結合部位、プロモータ部位等）に結合可能でありかつブロッカ− オリゴヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはこのような部位の 組み合わせに結合可能であるように選択される場合、本方法は、結合部位および 制限部位を有することという基準を満足する全ての配列類を増幅できる。

８、　“固相”ＥＲＡ 上述のＥＲＡ反応は、溶液中で実施することもできる。しかし、これとは別に、 前記反応は、固体支持体に固定化した標的分子を用いて固相で実施することもで きる。また別に、プライマーオリゴヌクレオチドの５゛末端またはブロッカ−オ リゴヌクレオチドの３゜末端を固定化することもできる。

核酸類を固定化するための方法は、例えば、Ｒｕｔｈ、Ｊ、Ｌ。

（米国特許第４．９４８，８８２号）、Ｇｉｌｈａｍら（Ｊ、　Ａｍ−Ｃｈｅ、 Ｓｏｃ、　８６：４９８２　（１９６４））、Ｎ１ｃｋｅｒｓｏｎら（Ｐｒ　ｃ 、Ｎ　ｔｌ、Ａｃ　、Ｓｃ’　Ｓへｌｕユニ　８９２３−８９２７　（１９９０ ）およびＫｒｅｍｓｋｙら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 １５：３１３１−３１３９　（１９８７））によって、検討されている。

標的分子または反応物質を結合できる支持体材料は、いかなる固体支持体（ガラ ス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、 アミラーゼ、天然および改良セルロース類、ポリアクリルアミド類、アガロース 類、および磁鉄鉱類からも構成される。支持体の性質は、本発明の目的のために 、ある程度可溶性であるかまたは不溶性であるかのいずれであってもよい。

支持体材料は、実質的にいかなる可能な構造的外形であってもよい。したがって 、支持体外形は、ビーズにおけるような球状、または、試験管内表面および棒の 外表面のような円筒状であることができる。これとは別に、前記表面は、紙、試 験紙等のように平坦であることもできる。

９、　“ＥＲＡ配列決定” ＥＲＡ反応は、標的分子の配列を決定するための用途に特に適している。持に、 本発明は、ＤＮＡ配列決定法の“サンが一法”としても公知である“ジテオキシ 媒介チェーンターミネーション法”（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ ｌ、９４：４４１　（１９７５））ならびに″マクサムーギルバート化学分解法 ”　（Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ ｉ人と、ユ４　：　５６０　（１９７７））の両者の使用を容易にする。

両者ともに本文で参考として引用した。

Ａ、ジデオキシ配列決定法の適用 ＤＮＡ配列決定のジデオキシ媒介すなわち“サンガー”チェーンターミネーショ ン法においては、ＤＮＡ分子の配列が、配列決定しようとしている核酸分子（す なわち、“標的”）にハイブリッド化したオリゴヌクレオチドブライマーの伸長 によって得られる。最も単純なＱ：！１ｉにおいて、４つの別々のプライマー伸 長反応が実施される。各反応は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、およびＡ、 Ｔ。

ＣまたはＧヌクレオチド三リン酸の２°、３゛　ジデオキシ誘導体の存在下で実 施される。ジデオキシヌクレオチドの取り込みによって、伸長反応が終結するこ とになる。ジデオキシ誘導体類はそれらの対応する従来のヌクレオチド三すン酸 アナログ頴よりも低濃度で存在するので、前ｉｉ：４種の反応のそれぞれの正味 の結果は、本反応に使用した特定のジデオキシ誘導体でそれぞれが終結するネス ト化オリゴヌクレオチド類群を産生ずることである。前記伸長反応のそれぞれの 反応生成物を電気泳動に供することによって、伸長プライマーの配列に容易に翻 訳可能な１群の４種の”ラダー類”を得ることが可能である。

最近、データ回収率を太き（高めたジデオキシ配列決定法の改良方法が開発され た。持に、標識化が異なるジデオキシヌクレオチド類を用いることによって、上 述の別個の配列決定反応を実施する必要性が回避された。蛍光標識ジデオキシヌ クレオチド誘導体類を使用することによって、標的のヌクレオチド配列決定を推 定するプロセスを全自動化することが可能である。配列決定技術のこのような進 歩については、たとえばＰｒｏｂｅｒ、Ｍ　ら、Ｓｃユニも」−ε」−２３８： ３３６−３４０　（１９８７）によって記載されている。

本文で参考として引用）。　本発明は、増幅産物の鎖を分離するために行わなけ ればならない操作を簡素化することによって、ジデオキシ配列決定方法を容易に している。

多重ＤＮＡ配列決定法は、決定すべき配列が２個の異なる、予め定められたオリ ゴヌクレオチド”タッグ類”に隣接するように、それぞれ異なるベクター中で構 築されたＤＮＡライブラリを用いている。

反応生成物のプールを次に配列決定ゲルにのせ、前記ＤＮＡ試料中のオリゴヌク レオチド類をゲル電気泳動を用いて分離する。このようにして得られたＤＮＡパ ターン類は、その後、ゲルからナイロン膜上に電気的に移動させ、ＵＶ光線を用 いて前記膜に架橋させる。

ゲルの各レーンは多くの異なるＤＮＡ分子類の配列決定による反応生成物を含有 しているので、各レーンは、配列情報の複数の重複するラダーを含有している。

それぞれの各ラダーは、しかし、特定タッグに対する標識プローブを膜に結合し たＤＮＡにハイブリッド化させることによって、別々に可視化できる。したがっ て、異なるプローブで繰り返し膜をブロービングすることによって、各標的分子 の配列を確認できる。

本発明の用いて、多重配列決定の適用を容易にできる。この点に関して、プライ マーおよびブロッカ−オリゴヌクレオチド類（またはそれらの補体類）は、多重 解析方法を使用できるようにするための“タッグ類”として機能できる。

Ｂ、マクサム−ギルバート配列決定法への適用ＤＮＡ配列決定のマクサム−ギル バート法は、分解的方法である。この操作において、ＤＮＡ断片はｌ末端におい て標識され特に４種の別個の化学反応で切断され、そのそれぞれは、特定塩基（ ＧまたはＣ）においておよび特定種類の塩基（Ａ／Ｇ、Ｃ／ＴまたはＡｒｃ）に おいて、前記ＤＮＡ分子に特異的である。上述のジブオキ／方法においてと同様 、この反応の効果は、配列決定中のＤＮＡ分子の長さに沿って特定塩基の位置に よって長さが決定される１群のネスト化分子類を産生ずる。ホスト化反応産物類 は、次に、電気泳動によって分解され、配列を推定する。

ｌＯ１増幅検出系における“ＥＲＡ”の使用本文で説明したＥＲＡ反応は、ＤＮ ＡまたはＲＮＡが化学的または物理的に付着した実質的にいかなるものも検出す るための増幅可能検出系での使用に極めて適している。ＥＲＡを用いてＤＮＡま たはＲＮＡの存在または不在を決定できる。ｌ態様において、ＥＲＡを診断およ び法医学適用における抗原類の検出を伴う技術において利用する。本発明のこの 態様において、二元的に特異的なリンカ−分子を用いて、標的ＤＮＡ分子を抗原 −抗体複合体に結合させる。

したがって、標的分子を改良してビオチン化ヌクレオチド類を含有させた場合、 前記リンカ−のＤＮＡ結合部分は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ま たはビオチン結合タンパク質から構成できる。前記リンカ−の抗原−抗体結合部 分は、抗体（複合体の抗原または抗体のいずれかに反応性）または結合タンパク 質から構成できる。上記抗体類は、ポリクローナル、モノクローナル、または合 成したもの（すなわち、組換えまたは合成方法による）であることができる。抗 体断片類（ＦａｂまたはＦ　（ａｂ）’断片類等）も代わりに使用できる。

この態様において、本発明は、抗原−抗体複合体の検出を容易にする。このこと は、標的ＤＮＡ分子およびリンカ−分子存在下において抗原−抗体複合体をイン キュベーションすることによって、達成される。好適には、これらの分子種の内 のひとつがマイクロタイタープレート、ディツプスティック、メンブレン、紙等 のような固体支持体に、未結合標的ＤＮＡが結合標的ＤＮＡから容易に分離され るように固定化されるであろう。

次に本発明の方法を用いて、前記抗原−抗体複合体と連結されているかまたは会 合しているいかなる標的分子も増幅できる。いかなる増幅標的分子の検出も、従 って、抗原−抗体複合体の存在を示唆している。ＰＣＲを抗原−抗体複合体の検 出に使用することは、５ａｎｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：１２０−１２２（ １９９２）。本文で参考として引用）によって報告されている。

本発明は、“キット”のような製品を含んでいる。上記キット類は、典型的には 、明確にされた核酸配列を有する領域少なくとも１個からなる少なくとも１個の 標的配列の増幅のために、試薬類（オリゴヌクレオチド類を含む）、酵素類、緩 ′ｆＬ液等を含有するように改良できる。好適なキットは、少なくとも１個のブ ロッカ−オリゴヌクレオチド；少なくとも１個のブライマーオリゴヌクレオチド ：および少なくとも１個のエンドランオリゴヌクレオチドを含有する少な（とも １個の容器からなる。これらの分子類は、１個以上の組のブロッカ−、プライマ ーおよびエンドランオリゴヌクレオチド類からなるであろうし、そこでは、１組 のオリゴヌクレオチド類のブロッカ−オリゴヌクレオチドはある標的核酸配列の ある部分（すなわち、ある領域またはオリゴヌクレオチドサブセット）にハイブ リッド化可能であり、この組のブライマーオリゴヌクレオチドは同一標的核酸配 列の異なる部分にハイブリッド化可能であり、およびその奢且のエンドランオリ ゴヌクレオチドはこの組のブロッカ−オリゴヌクレオチドの少なくとも１部分に 相補な配列からなる。

１態様において、前記キットは、その試薬類、酵素類または緩衝液類のそれぞれ または一部のための別々の容器類を含むであろう。

好適には、前記キットのオリゴヌクレオチド類の一部または全部は、混合されて いるであろう。ブロッカ−、プライマーおよびエンドランオリゴヌクレオチド類 の全ては、実際に、単一の容器中に存在できる。

明らかな核酸配列を有する少なくとも１個の領域からなる少なくとも１個の標的 配列の増幅のための試薬類からなる特に好適なキットは、少なくとも１個の容器 からなるキットであろう。この容器は、少なくとも１個ブロッカ一部分；少な（ とも１個のプライマー部分、および少なくとも１個のエンドラン部分から構成さ れ、そこでは、ブロッカ一部分は核酸配列のある部分にハイブリッド化可能であ り、プライマー部分は前記核酸配列の異なる部分にハイブリッド化可能であり、 およびエンドラン部分は前記ブロッカ一部分の少なくとも１部分に相補な配列か らなる。

前記キットに適宜含めることができる緩衝液類は、その他の反応を犠牲にしても ある特定反応（連結またはポリメライゼーション）を最適化するために、特殊な ものとすることもできる。これとは別に、前記緩衝液類は、１群の酵素反応（連 結およびポリメライゼーション）を最適化するために、設計できる。上記緩衝液 類は、希釈し所望の緩衝性が得られるように、濃縮された形態であることもでき る。好適なキットにおいては、前記オリゴヌクレオチド類を含有する容器はまた 緩衝液を含有する。別の態様では、前記容器は、水または適切な緩衝液で再構成 できる凍結乾燥形態で前記オリゴヌクレオチド類を含有できる。サブ態様では、 上記容器は、また、水による再構成で緩衝溶液が得られるように、塩類または凍 結乾燥緩衝液を含有できる。

前記キットは、さらに、ポリメラーゼおよび／またはりガーゼ酵素類、説明書等 を含有できる。

本発明の別の態様では、少なくとも１種の適切な緩衝液および本発明の伸長、ハ イブリッド形成および連結反応を最適化するための添加剤を適宜含むキットが提 供される。このようなキットは、当業者が本文で記載のＥＲＡ方法類を実施する ための適切な緩衝液類、酵素類、および添加剤類を全てまたは一部提供し、ブロ ッカ−、プライマーおよびエンドランオリゴヌクレオチド類を合成するかまたは そうでなければ入手しようとする当業者にとって特に適切である。バッファーキ ット類は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸のような適切な緩衝液を１ 種、濃縮、凍結乾燥、または希釈形態で含有できる。キット類は、適宜、緩衝液 および酵素類、塩化カリウム、塩化マグネシウム、ニコチンアミドアデニンジヌ クレオチド、ウシ血清アルブミンおよび非イオン性洗浄剤のような添加剤類を含 有できる。

本発明を以上、全体的に説明した、また、説明上爪した以下の例により本発明が さらに容易に理解されようが、以下の例は、特に断らない限り、本発明を限定す ることを意図するものではない。

皿上 ＥＲＡ、「標的」分子およびプライマーを示すため、ブロッカ−およびエンド− ランオリゴヌクレオチドをつくった。標的に対するブロッカ−、プライマーおよ びエンド−ランオリゴヌクレオチド部分の概略アライメントは、図１０に示しで ある。

オリゴヌクレオチド部分（ブロッカ−、プライマーおよびエンド−ラン）ノ合成 と一本鎖標的を、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、（Ｆｕ ｌ　１ｅｒｔｏｎ、ＣＡ）ホスホラミント（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ ）（製品番号Ａ：３３８２３１：　Ｃ：３３８２３２：　Ｇ：３３８２３３；　 Ｔ：３３８２３４）を用いてＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　（Ｕｐｓａｌｌａ、 　Ｓｗｅｄｅｎ）　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ■とＤＮＡ合成装置で行った 。合成、脱保護および切断については、製造者の指示に従った。ｄＮＴＰは、Ｇ ｅｎｅＡｍｐ■　ＰＣＲ試薬キット（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｔ、Ｎｏ 、Ｎ８０１−００５５）から得た。以下の手順のすべてで、すべての薬品は、少 なくともＡＣＳグレードであった。

生じた配列は次のようであった： 標的（配列番号１） ＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧブロッカ−（配列番号２） ＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧ、、Ｇブロッカ−オリゴヌク レオチドの３′末端が１．、ＧＴＰの添加により封鎖された；ブロッカ−オリゴ ヌクレオチドは、ＥＲＡ反応の間２４モノマー単位であった。

プライマー（配列番号３） ＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧ エンド−ラン（配列番号４） ＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧプライマーおよびエンド−ランオリゴヌ クレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、ら（Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕユａｒ　Ｃム ユ辷」＋Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９））に記載のプロ トコールに従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび７”Ｐ　ＡＴＰ（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ）を用いて標識した。反応条件を変えて、標識化反応を３７℃で１時間 行い、さらに、０．５Ｍの「冷Ｊ　ＡＴＰ　（すなわち、非放射性）の添加を行 い、冷ＰＯ，を含んだ放射性ＰＯ６を組み入れないすべてのキナーゼ化末端を確 実にした。ブロッカ−オリゴヌクレオチドは、「冷Ｊ　５’　−ＰＯ，末端を含 んでいた。

各成分は、ハイブリッド化と酵素活性を防ぐために氷上（４°Ｃ）の反応容器中 でまず混合した。

まず、１０ｘの反応緩衝液の５μｍを、５００μｌの容器に加え、さらに、ｌμ ｌの標的配列を加えた（これは、２０μｌの全溶液中で５０ｎＭの最終１度を与 えた）。その後、４つのｄＮＴＰのそれぞれを加え、２０μｌ全溶液中でｄＡＴ ＰＳｄＴＴＰＳｄＣＴＰおよびｄＧＴＰのそれぞれに対して２００μＭの最終１ 度を達成した。この混合物に１ｍしたオリゴヌクレオチド部分を加え、２０μｌ の全溶ｌ夜中で２００ｎＭブロッカーオリゴヌクレオチド、２００　ｎＭプライ マーオリゴヌクレオチドおよび１５０ｎＭエンドーランオリゴヌクレオチドの最 終１度が達成されるようにした。

さらに、ＡＭＰＬ　ＩＧＡＳＥ”熱安定性ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ 　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ。

Ｗｌ、　ＣＡＴ、Ｎｏ、ＡＯＯＩＯｏ、　５０００単位；「ｌ単位が、バクテリ オファージラムダＤＮＡの１マイクログラム中の１立１部位の５０％の結合を標 準５０μ１反応で４５℃で１分で触媒する」。酵素は、６５℃で４８時間の規定 半減期、９５℃で１時間の規定半減期を有する）の１単位を加えてから、Ａｍｐ ｌｉＴａｑ＠　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌ ｋ、Ｃｔ、、Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｎ８０１−００６０）の１単位を加えた。次に十分 な二重（ｄｏｕｂｌｅ）脱イオン水を加えて、最終容量２０μｌとした。最終容 量１．０ｍ１（二重蒸留水により調整）中の１０ｘ反応緩衝液濃厚物中の化合物 の濃度は、次のようであワた：１００ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン 塩酸（ｒＴｒｉｓ−ＨＣＩＪ、ｐＨ７，８；５００ｍＭ塩化カリウム；１５０ｍ Ｍ塩化マグネシウム；２５ｍＭ　ＮＡＤ”　；および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラ チン（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、　Ｓ　ｔ、　Ｌｏｕ　ｉｓ、ＭＯ，、Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｇ ２５００）。

成分を混合した後、反応容器は、製造者の指示によりＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ 　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　４８０”上で５分間９５℃に加熱した。次に 、各サイクルを次のパラメーター有するようにして２０サイクル行った：９５℃ −１分間；７５℃−４分間、４５℃−４分間。２０サイクル後、３μｌ尿素「停 止（ｓｔ。

ｐ・）」染料（５０％尿素、１％キンレンシアノール、１％ブロムフェノールブ ルー１．２ｘＴＢＥ）を加えて、それぞれの反応容器から得られた１０μｌアリ コートを分離し、反応容器を次に４℃に保ってから分析した。

反応容器を１０分間沸騰させてから、電気泳動スラブゲル（１５％アクリルアミ ドアミド、Ｉ　ｘＴＢＥと７Ｍ尿素中の１９：１アクリルゲル：ビス−アクリル アミド）に負荷（ｌｏａｄ）した。２５０ボルト（５０ｍＡ）で２時間、電気泳 動を行った。その後電気泳動したアリコートを、９０分間、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏ ＭＡＴＴｌ　ＡＲＸ線フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ、’　Ｒｏｃｈｅ ｓｔｅｒ、　Ｎ、Ｙ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１６５−１５１２）に暴露（ｅｘｐ ｏｓｅ）Ｌ／た。

図１１は、上記の実験から得たアリコートの電気泳動の結果の写真による再現を 示す。図１１のレーン３の露出（ｅｘｐｏｓｅ）した暗色のバンドから明らかな ように、ＥＲＡプロトコールは、標的配列の増幅をもたらし、標的配列の増幅へ の独特で実行可能なアプローチを与えることがわかった。有意的には、２つのバ ンドが、レーン３にあることがわかり、１つは、いわゆる「延長生成物（ｅｘｔ ｅｎｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ）Ｊの増幅からもたらされるものであり、１つは いわゆる「結合反応」の増幅からのものである。そのようなバンドは、エンド− ランオリゴヌクレオチドが、ブロッカ−オリゴヌクレオチドよりも「短い」ので 、それぞれ識別でき、よって、エンド−ラン延長生成物が、ブロッカ−およびブ ライマーオリゴヌクレオチドの結合からもたらされる増幅された生成物よりも「 短い」増幅された生成物をもたらすことになる。

ＥＲＡプロトコールの有効・性をさらに評価するために、いくつかの対間実験を 、上記のＥＲＡ反応と共同して行った。

第１の対照は、上記の標的、ブライマーオリゴヌクレオチドおよびエンド−ラン オリゴヌクレオチド反応体を用いたが、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの不在下 で行った。したがって、反応は、ブロッカ−オリゴヌクレオチドとブライマーオ リゴヌクレオチド延長生成物との結合が増幅プロトコールに影響する程度を判断 する。

対照として、上記の手順を、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの不在下でｉテっだ 。そのような条件下で、増幅は、ＥＲＡではなくＰＣＲを介して起こる。この実 験の結果は、図１１のレーンｌに示しである。ＰＣＨの特徴として、増幅生成物 の鎖は、同じ大きさである。ＰＣＲ増幅が起こったという事実は、ＥＲＡ増幅が 、異なる方法により成立されたのであり、ＰＣＨによる疑似的な干渉によったの ではないことを証明する。

よって、これらの結果は、（プライマー、ブロッカ−およびエンド−ランオリゴ ヌクレオチドの存在下で）ＥＲＡにより成立される増幅がＰＣＲでないことを示 す。

追加の対照として、上記のＥＲＡ手順を、リガーゼの不在下で行った。この対照 の目的は、ブロッカ−オリゴヌクレオチドの置換を通じて起こるＰＣＲから増幅 がもたらされないことを証明することである。図１１のレーン４は、この実験の 結果を示す。結果は、予想されるように、リガーゼの不在下で、ブロッカ−およ びブライマーオリゴヌクレオチドが、互いに共有結合することができず、標的配 列の増幅が起こらなかったことの予測を確認する。これは、結合の事象なしで（ および−末鎖標的の使用のため）、エンド−ランオリゴヌクレオチドの延長を支 持し得る鋳型（ｔ　ｅｍｐ　Ｉ　ａ　ｔ　ｅ）が増幅されないからである。

追加の対照として、ＥＲＡプロトコールを、エンド−ランオリゴヌクレオチドの 不在下で行った。この対照は、エンド−ランオリゴヌクレオチドが、標的の１数 的な増幅を得るのに必要とされるか否かを調べる。図１１のレーン２は、エンド −ランオリゴヌクレオチドの不在下で、標的配列の直線的な増幅のみが得られる ことを示している。持に、ただ一つの鎖（ブライマーオリゴヌクレオチド−ブロ ッカ−オリゴヌクレオチド１りが増幅される。この対照は、エンド−ランオリゴ ヌクレオチドの不在下で、直線的な「オリゴヌクレオチド結合検定（ａｓｓａｙ ）Ｊが得られることを証明する。

図１１のレーン５は、ＥＲＡ反応が、ＤＮＡポリメラーゼの不在下で行われる追 加の対照の結果を与えている。明らかなように、直線的な増幅だけが起こった。

図１１のレーン２および５は、ＥＲＡプロトコールが、部分のすべてが利用され るのでなければ、指数的な増幅をもたらさないことをさらに証明する。ＯＬＡ対 照を与えたレーン２は、予想されるように、標的配列の直線的な増幅（たとえば 、オートラジオグラフのバンドの相対的な大きさと密度に基づいて）を証明する 。ＯＬＡは、ただ２つの「プライマー」とリガーゼ酵素が利用され、指数的な増 幅をもたらさない。しかしながら、エンド−ランオリゴヌクレオチドが、ポリメ ラーゼの不在下で、反応容器に加えられた時でも（レーン５）、得られるバンド は、レーン２のそれと本質的に同じである。

匠土土 標的分子を増幅するＥＲＡの能力をさらに評価するために、例■に記載した標的 、プライマー、ブロッカ−およびエンド−ランオリゴヌクレオチドを用いて追加 の一連の実験を行った。

この一連の実験で、標的１度は、例■で用いたものより１０００倍または１．０ ００，０００倍低くした。例Ｉでは、標的濃度は、約１０−’Ｍ（すなわち、１ ０１！分子／サンプル）であった。例ＩＩでは、標的ｔａ度約１０−”　Ｍ　（ すなわち１０＠分子／サンプル）およびＩ　ＣＭ”　Ｍ　（Ｉ　Ｏ’分子／サン プル）を使用した。これらの濃度は、ヒトのサンプル中の単一遺伝子を検出する のに必要な範囲内であるように選択された。

例ＩＩについて、標的、プライマーおよびエンド−ランオリゴヌクレオチドは、 例Ｉのようにして合成した。ブロッカ−オリゴヌクレオチドは、Ｂｉｏｓｅａｒ ｃｈ　８７５０”　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ 　（ＭｉｌｌｉｇｅｎＢｉｏｓｅａｒｃｈ、　Ｓａｍ　Ｒａ、ｆａｅｌ、　ＣＡ ）を用いて合成し、例■に定めたブロッカ−オリゴヌクレオチドをその３°　− 末端にビオチン分子を含むようにして生成させた。３°　−ビオチン−ＯＮ　Ｃ ＰＧカラム（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ、　Ｉ　ｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌ ｔｏ、　ＣＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　５２２５−１）をブロッカ−オリゴヌクレ オチド合成に対して用いた。

ＥＲＡは、例！のようにして行い、しかし、ポリメラーゼ酵素は、Ａｍｐｌｉｔ ａｑ＠　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、　５ｔｏｆｆｅｌ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ 　（エキソヌクレアーゼ欠損変種（ｅｘｏｎｕｌｃｌｅａｓｅ　ｄｅｆｉｃｉｅ ｎｔ　ｖｅｒｓｉ。

ｎ））（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃａｔ、Ｎｏ、Ｎ８０８−００３８）であ った。最終容ｊ１１．ｏｍｌ（二重蒸留水により調節）中の１０ｘ反応緩衝液濃 厚物中の成分の濃度はは、次のようであた：２００ｍＭ　ＴＲｌ５−ＨＣＩ、ｐ Ｈ７，８；　２００ｍＭ塩化カリウム；　２５ｍＭ塩化アンモニウム；　２０ｍ Ｍ塩化マグネシウム；　５０ｍＭジチオスレチオール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔ ｉｏｌ）：　５００μＭ　ＮＡＤ−：　５００μｇ／ｍｇウシ血清アルブミン： および１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ｏｏｉＭＸ−１ｏｏｉ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、７ ６８７８）。

エンド−ランとプライマーオリゴヌクレオチドを例Ｉのようにして標識し、ブロ ッカ−オリゴヌクレオチドを、例Ｉのエンド−ランおよびブライマーオリゴヌク レオチドについて記載したように標識した（すなわち、放射性ラベルを、ブロッ カ−オリゴヌクレオチドに組み入れた）。

各種の成分は、ハイブリッド化および非特異的ハイブリッド化を実質的に防ぐた め、水上（４℃）の反応容器中でまず混合した。

まず、１０ｘ反応緩衝液の５μｌを、５００μｌの容器に加え、さらに、標的配 列（５０μｌ全溶液中の最終標的配列１度：２０ピコモラー）の１．ＯｎＭ原液 ｌμｌまたは標的配列（５０μｌ全溶液中の最終標的配列濃度、２０フエントモ ラー）の１．０９Ｍ原液の１μｌを添加した。その後、４つのｄＮＴＰのそれぞ れを、加え　′て、５０μｍの全溶液中でのｄＡＴＰＳｄＴＴＰＳｄＣＴＰおよ びｄＧＴＰのそれぞれに対し２００μＭの最終１度を達成した。この混合物にｉ ｊｌｍしたオリゴヌクレオチド部分を加え、１２０ｎＭブロッカーオリゴヌクレ オチド、４０ｎＭプライマーオリゴヌクレオチドおよび４０ｎＭエンドーランオ リゴヌクレオチド（３：　ｌ　：　１のブロッカ−ニプライマー・エンド−ラン ）を５０μｌの全溶液に含む最終、！度を達成させた。これに、上記のりガーゼ 酵素ＩＯ単位を加え、さらに、十分な二重脱イオン水を加えて４９μｍの容量と した。

成分を混合した後、反応容器を上記の熱サイクラ−（ｔ　ｈ　ｅ　ｒｍａｌ　ｃ ｙｃｌｅｒ）上で５分間９５℃に加熱し、標的とオリゴヌクレオチド部分の完全 な変性を達成した。さらに、２単位（ｌμｌ）の上記のポリメラーゼ酵素を反応 容器に加えた。次に各サイクルが次のパラメーターを有するようにして４０サイ クル行った：９５℃−１分間：　７０℃−４分間＝　４０°Ｃ−４分間。

４０サイクル後、３μｌの「停止」染料（例１．Ｌに記載したごときもの）を、 セクションＩ１．Ｇ−Ｉの反応容器のそれぞれから得た個々の１０μｍのアリコ ートへ加えた。その後、アリコートを１０分間沸騰させてから、電気泳動スラブ ゲルに負荷した。電気泳動を行い、例■のように露出（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を得 た・図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ濃度１０−”Ｍまたは１０−”１Ｍで 存在する時でも標的分子を検出するＥＲＡの能力を説明する。図１２Ａおよび図 １２Ｂのレーン５は、標的配列のエンド−ラン増幅が得られることを説明する。

最も重要なことには、図１２Ｂは、関心のもたれる遺伝子についてのものと同様 の濃度で存在する標的配列の検出と増幅とが、開示のＥＲＡプロトコールを用い て達成され得ることを明示する。

観察された増幅が、ＥＲＡ反応に起因することを保証するように各種の対照を行 った。特に、ＰＣＲ増幅が起こるかどうか決めるため、リガーゼの不在下で反応 を行った。図１２Ａおよび１２Ｂのレーン４は、「リガーゼなしＪ　ＥＲＡ対照 反応の結果を明示し、結合の不在下でブロッカ−とプライマーオリゴヌクレオチ ドが、互いに共有結合できなかったことと標的配列の増幅が起こらなかったこと を示している。

例■のように、ＰＣＲプロトコールを用いた標的配列の増幅は、図１２ＡとＢの レーン３の結果から明白であり；また、すべての条件が、それぞれのプロトコー ルに対して実質的に同じであるので、レーン３の結果は、使用したパラメータが 標的配列のＰＣＲ増幅を妨害しなかったことを示す。

また、例Ｉに示した結果と一致して、直線的増幅（１つの鎖の）だけが、ポリメ ラーゼの不在下で観察された（図１２Ａと１２Ｂ。

レーン６）。

レーンＭは、エンド−ランオリゴヌクレオチド、ブライマーオリゴヌクレオチド および標的から生じる露出を与える。レーン１は、ブライマーオリゴヌクレオチ ドの位置を示している。ブロッカ−オリゴヌクレオチドの位置はレーン２に示さ れている。

丑上土上 以下は、ＥＲＡ反応システムが、ある種熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの機能的特 性を示すようにしたエンド−ランオリゴヌクレオチドを組み入れる本発明の好ま しい例の説明である。さらに特定的には、延長の間、編集エキソヌクレアーゼ活 性に欠ける熱安定性Ｄ’ＮＡポリメラーゼが、二本鎖分子の３゛平滑末端への余 分な塩基の非鋳型指示添加（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄａｄ ｄｉｔｉｏｎ）を起こすとして知られる。この非鋳型指示添加を示す延長生成物 の９０％を越えるうちで、添加はｄＡＴＰのそれである。この非鋳型指示添加が 、ＥＲＡ反応システムで起こると、エンド−ランオリゴヌクレオチドと結合生成 物との間に３°末端不整合（ｍｉ　ｓｍａ　ｔ　ａｈ）があるであろう。Ａ：Ｇ 不整合は、ＤＮＡポリメラーゼにより良好に延長されないので、正味の効果は、 ＥＲＡ反応の効率の減少である。

以下の説明で、ＥＲＡ反応は、プロツカーオリゴヌ・クレオチドの５゛末端を越 えて延長するｌまたは２塩基「オーバーハング」（ｂａｓｅ　ｏｖｅｒｈａｎｇ ”）を有するエンド−ランオリゴヌクレオチドを用いて行われる。このエンドラ ンオリゴヌクレオチドが、ブロッカ−オリゴヌクレオチドとハイブリッド化する と、得られる部分的二本鎖分子は、３′末端オーバーハングを有する。ノンギャ ップド（ｎｏｎ−ｇａｐｐｅｄ）ＥＲＡシステムの場合、オーバーハングは、ブ ライマーオリゴヌクレオチドの３°末端を補足する。下記のように、これは、Ｄ ＮＡポリメラーゼにょるｄＮＴＰの非鋳型指示添加を排除する。

二本鎖標的オリゴヌクレオチド、ブライマーオリゴヌクレオチド、プロ７カーオ リゴヌクレオチドおよびエンドランオリゴヌクレオチドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　ｏｆ　Ｕｐｓａｌｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎから入手できるＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅ ｓｉｚｅｒとＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ上で 合成された。ホスホラミント（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

Ｉｎｃ、　ｏｆ　Ｆｌｌｅｒｔｏｎ、　ＣＡからの製品番号Ａ：３３８２３１、 Ｃ１３８２３２、Ｇ：３３８２３３、Ｔ：３３８２３４）を合成で用いた。ｄＮ ＴＰは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、　２７−２０３５ により提供されるｐＨ７，５の水中で２゛デオキシヌクレオシド５゛−トリホス フェートの１００ｍＭストックス（５ｔｏｃｋｓ）の超純粋ｄＮＴＰセットから 得た。合成、脱保護および切断について製造者の指示に従った。使用したすべて の薬品は、少なくともＡＣＳグレードであった。標的オリゴヌクレオチド、ブラ イマーオリゴヌクレオチド、ブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびエンドランオ リゴヌクレオチドは、次のようであった。

標的（配列番号５） ＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧ標的（配列番号６） ＣＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣ ＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣプライマー（配列番号３） ＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧ ブロッカ−（配列番号７） ＰＯ，−ＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧ−ビ チオン エンド−ラン（「平ｆｆ１（ｂｌｕｎｔ）Ｊ）（配列番号４）ＧＴＴＧＣＧＣＡ ＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧニット−ラン（ｒ＋ＩＪ）（配列番号８）ＧＴＴＧＣＧＣ ＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣエンド−ラン（ｒ＋２Ｊ）（配列番号９）ＧＴＴＧＣ ＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧプライマーオリゴヌクレオチドおよびエンドラ ンオリゴヌクレオチドを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ ゜ｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）に記載のプロトコールに従い、Ａｍ ｅｒｓｈａｍから購入した［γ”Ｐ］　ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼを用いて標識した。ブロッカ−オリゴヌクレオチドは、Ｃ１ｏｎｔｅｃｈｏ ｆ　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　５２１０−３）から購 入した５°　−ホスフェート−ＯＮを用いて合成中に組み入れた「冷（ｃｏｌｄ ）Ｊ　５’　ＰＯ，末端を含んでいた。

３つの別個の増幅反応を行った。第１の反応は、エンドランオリゴヌクレオチド 配列番号４を用い、第２と東３反応は、エンドランオリゴヌクレオチド配列番号 ８とエンドランオリゴヌクレオチド配列番号９をそれぞれ用いた。各反応につい て、上記の１０ｘ反応緩衝液２，５μＬを、２００μＬ容器に加え、さらに、標 的オリゴヌクレオチド（配列番号５および配列番号６）ｌμＬを加えた。これに より、２５μＬの全溶液に含む４０９Ｍ最終ｔａ度が得られた。この混合物に、 プライマーおよびエンドランオリゴヌクレオチドの４０ｎＭの最終＋４９度をも たらす標識したブライマーオリゴヌクレオチドとエンドランオリゴヌクレオチド を加えた。ブロッカ−オリゴヌクレオチドは、８００　ｎＭの最終１度で加えた 。４つのｄＮＴＰは、最終ａＫ２００μＭ（’）ｄ　ＡＴ　Ｐ、　ｄ　Ｇ　Ｔ　 Ｐ、　ｄ　ＣＴ　ＰオＪ：ヒｄＴＴＰのそれぞれに加えた。さらに、２μｇのヒ ト胎ＭＩ　Ｄ　Ｎ　Ａを加えて、反応混合物の複雑性（ｃｏｍｐ　ｌ　ｅｘ　ｉ 　ｔ　ｙ）を増した。

次に、４ｏ単位のＴａｇ　ＤＮＡリガーゼおよび２５単位のＡｍｐｌｉ−’Ｔａ ｇ　ＤＮＡポリメラーゼ、５ｔｏｆｆｅｌフラグメント　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ ｍｅｒｙ　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｎ８０８　−００３８）を反応容器に加えた。

成分を混合した後、反応容器をＰｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ９６００熱サイクラ− 中で５す間９５℃に加熱した。次に、２．５μＬの１０ｘ塩化マグネシウム溶液 を加えて最終濃度１５ｍＭとすることにより反応を開始させた。反応は、各サイ クルが次のパラメータを有するようにして４０サイクル行った：９５°Ｃで３０ 分間；５５℃で３０分間。４０サイクルの後、反応の１０μＬアリコートを、５ ０％尿素、１％キシレンシアツール、１％ブロモフェノールブルー、０．２ｘ　 ＴＢＥを含む等しい容量の「停止Ｊ染料と混合した。サンプルを１０分間沸騰さ せてから、電気泳動スラブゲルに負荷した。ゲルは、７Ｍ尿素およびｌｘ　ＴＢ Ｅ中に含む１５％ポリアクリルアミド、１９：ｌアクリルアミド：ビス−アクリ ルアミドから得た。電気泳動は、２５０ポルト（５０ｍＡ）を用いて２時間行っ た。電気泳動スラブは、９０分間、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ＯＭＡＴＡＲｘ−線フイル ムに暴露した。Ｘ−線フイルムは、ＲｏＣｈｅｓｔｅｒ　Ｎ、Ｙ　のＥａｓｔｍ ａｎ　Ｋｏｄａｋにより供給されＣａｔ　Ｎｏ、　１６５−１５１２として市場 に出されている。

反応の結合部分および反応の延長部分からもたらされる個々の反応生成物は、暴 露された電気泳動ゲルから切り取られ、シンチレーノヨ／計数法を用いて定量し た。図１３に示すように、結合と延長の増幅信号は、３°末端が、ｌまたは２塩 基オバーハングを含むエンドランオリゴヌクレオチドの使用により有意的に増強 される。結合対延長生成物の相対的生成は、反応混合物中に与えられるリガーセ 対ポリメラーゼの量に基づいている。相対的反応効率の概算は、９０％のプライ マー延長の試みを完結し、４０％のすべてのニック結合（ｎｉｃｋ　ｌｉｇａｔ ｉｏｎ）の試みを好首尾としてＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡリガーゼよりもより 効率的であることを示唆する。

非鋳型指示ｄＡＴＰ添加に対する基賀としてのブロッカ−オリゴヌクレオチド／ ブライマーオリゴヌクレオチド延長生成物にアニル化され（ａｎｎｅａｌｅｄ） 、３’オーバーハングを有するエンドランオリゴヌクレオチドの部分的二本鎖分 子を、エキソヌクレアーゼ不足Ａｍｐｌｉ−Ｔａｇ　ＤＮＡポリメラーゼ、５ｔ ｏｆｆｅｌフラグメントが認識しないことをデータは証明している。このように 、エンドランオリゴヌクレオチドは、増幅反応の過程で限定的でない。さらに、 プライマーダイマー形成の可能性は、ＥＲＡ反応にツイテの高い底温度（ｂｏｔ ｔｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（５５℃）の維持とブロッカ−オリゴヌクレ オチドの存在により除去される。

躬」二！ 標的オリゴヌクレオチドの単一塩基変化を区別する（標的オリゴヌクレオチドの 単一塩基の存在または不在を決定する）ための本発明のプロセスの能力を証明す るため、２種の二本鎖標的オリゴヌクレオチド（それぞれの二本鎖標的オリゴヌ クレオチドは単一塩基対だけ互いに異なっている）をつくった。同様に、プライ マーオリゴヌクレオチド、ブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびエンドランオリ ゴヌクレオチドをそれぞれの反応用としてつくった。

すべてのオリゴヌクレオチドを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｏｆ　Ｕｐｓａｌｌａ、 　Ｓｗｅｄｅｎから入手できるＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒおよびＰｈａｒ ｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓ　ｅｍｂ　ｌ　ｅ　ｒで合成した。Ｂｅ ｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、　ｏｆ　Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、 ＣＡから購入したホスホラミシト（生成物Ｎｏ、ｓ　Ａ：３３８２３１％Ｃ：３ ３８２３２、Ｇ：３３８２３３、Ｔ：３３８２３４）を合成で用いた。

ｄＮＴＰは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ。

２７−２０３５により提供されるｐＨ７，５の水に含むようにした２゛　デオキ シヌクレオノド５°　−トリホスフェートの１００ｍＭストックスの超純粋ｄＮ ＴＰセットから得た。合成、脱保護および切断について製造者の指示に従った。

すべての薬品は、少なくともＡＣＳグレードであった。合成された標的オリゴヌ クレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、ブロッカ−オリゴヌクレオチドお よびエンドランオリゴヌクレオチドは、次のようであった。

野生型標的（配列番号５） ＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧ野生型標的（配列番号６） ＣＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴ　ＣＡ　Ｇ 　Ｇ　ＣＴ　Ｇ　ＣＧ　ＣＡ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｇ 　Ｇ　Ｇ　Ｃ突然変異標的（配列番号１０） ＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＡＡＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＣ，ＧＧ突然変異標的（配列番号１１） ＣＣＧＧＡＡＡＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＴ　ＣＡ　Ｇ 　Ｇ　ＣＴ　Ｇ　ＣＧ　ＣＡ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｇ 　Ｇ　Ｇ　Ｃ野生型プライマー（配列番号３） ＧＣＧＣＧＡＴＴＣＧ 突然変異プライマー（配列番号１２） ＧＣＧＣＣＡＴＴＣＣ ブロッカ−（配列番号７） ＰＯ，−ＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧ−ビ オチン 野生型エンド−ラン（配列番号８） ＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣ突然変異エンド−ラン（配列番号１３ ）ＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧブライマーオリゴヌクレオチドおよ びエンドランオリゴヌクレオチドを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　ｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　）（ａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）に記載のプロトコールに 従いＡｍｅｒｓｈａｍから購入した［γ”Ｐ］　ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオ チドキナーゼを用いて標識した。ブロンカーオリゴヌクレオチドは、Ｃ１ｏｎｔ ｅｃｈ　。

ｆ　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　５２１０−３）から購 入した５°　−ホスフェート−ＯＮを用いて合成中に組み入れた「冷」５°　Ｐ Ｏ，末端を含んだ。

２組の反応を行った。１つは、野生型標的オリゴヌクレオチド、野生型ブライマ ーオリゴヌクレオチドおよび野生型エンドランオリゴヌクレオチドを用い、２つ めは、突然変異標的オリゴヌクレオチド、突然変異ブライマーオリゴヌクレオチ ドおよび突然変異エンドランオリゴヌクレオチドを用いた。それぞれの反応につ し）で、反応体と酵素活性との間の／％イブリッド化を最小限とするために、上 記の１０ｘ反応緩衝液２，５μＬを４℃に保持した２００μＬ容器（こ加えた。

次に、１μしの標的オリゴヌクレオチド、標識したブライマーオリゴヌクレオチ ド、標識したエンドランオリゴヌクレオチドおよびブロッカ−オリゴヌクレオチ ドを４℃混合物に加えた。反応混合物の複雑性を増すために、ｌμｇのヒト胎！ ＤＮＡも加えた。

次に、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ、 　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２０８から購入したＴａｑ　ＤＮＡリガーゼ２０単位を冷 反応容器に加えた。（Ｔ　ａ　ｑ　ＤＮＡリガーゼの１単位は、４５℃で１５分 間で５０μＬの全反応容量中のＢｓｔＥＬＬ消化済バクテリオファージラムダＤ ＮＡの１マイクログラムの１２−ｂｐ付着末端の５０％の結合を触媒する。）Ｎ ｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｃａｔ、Ｎｏ、　２５９）からのＤｅ 、ｅｐ　Ｖｅｎｔ　（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ５単位を、反応容器に移し た。十分な二重脱イオン水を加えて、最終審ｊ１２５μＬとした。標的配列の最 終１度は、４０９Ｍであり、ブライマーオリゴヌクレオチドとエンドランオリゴ ヌクレオチドの最終濃度は、それぞれ２００　ｎＭであった。ブロッカ−オリゴ ヌクレオチドは８００　ｎＭの１度で存在した。１．ＯｍＬの容量に調節したこ のサンプルに用いた１０ｘ反応緩衝液ｌＩ度は、次の成分１度を有していた：２ ００ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）、ｐＨ ７，８；　］０００ｍＭ塩化カリウム：１００Ｍ硫酸アンモニウム：　２０ｍＭ 硫酸マグネシウム。

２ｍＭ　ＮＡＤ−；　１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００゜反応容器温度は、４℃ から９５℃に上げ、製造者の指示によりＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｔｈｅｒｍ ａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　９６００上で５分間保った。反応を開始させるため、４つ のｄＮＴＰを加えてｌｏｘ原液からｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴ Ｐのそれぞれの２００ＭＭの最終１度にした。各サイクルを次に示すようにして ４０サイクル行った：各すイクルは、９５℃３０秒間と５５°Ｃ３０秒間。２０ サイクル後と４０サイクル後、反応の１０μＬアリコートを、例ＩＩＩに用いた 「停止染料」の等しい容量と混合した。サンプルは、１０分間沸騰させてから、 電気泳動スラブゲルに負荷してから、例ＩＩＩに記載したようにゲル電気泳動に より分析（ｒｅｓｏｌｖｅ）した。

反応の結合部分および反応の延長部分から得られる個々の反応生成物は、暴露し た電気泳動ゲルから切り取り、シンチレーション計数法を用いて定態した。図１ ４および１５に示した棒グラフは、野生型オリゴヌクレオチドおよび突然変異オ リゴヌクレオチドを、野生型標的および突然変異標的に２０サイクルおよび４０ サイクルでそれぞれ組み入れた相対的な量を示す。

図１４および１５は、それぞれの標的の組に対する優れた区別がオリゴヌクレオ チドの各組に得られることを明白に証明する。２０サイクルＥＲＡ反応の終わり に、オリゴヌクレオチドの正しい組を持って５０＠を越える高い平均組み入れが 得られ、４０サイクルの後に、３−５＠大きい組み入れが、オリゴヌクレオチド の正しい組に対して観察される。このように、野生型ブライマーオリゴヌクレオ チド、野生型エンドランオリゴヌクレオチドおよびプロッカーオリコヌクレオチ ドの組み合わせが、ＥＲＡ反応の野生型標的ＤＮＡ配列を増幅する。同様に、突 然変異ブライマーオリゴヌクレオチド、突然変異エンドランオリゴヌクレオチド およびブロッカ−オリゴヌクレオチドが、突然変異標的配列を増幅する。

伝ヱ 有意的に小さな濃度で標的オリゴヌクレオチド配列を増幅するための本発明のプ ロセスの能力をさらに評価するため、標的オリゴヌクレオチドの増幅を、１０− 口Ｍ　（１０’分子／サンプル）がらｌＯ−”　Ｍ　（ｔｏ’分子／サンプル） の範囲の標的オリゴヌクレオチド配列を用いて行った。これらの濃度は、ヒトサ ンプルのうちの単一遺伝子を検出するのに必要な範囲内であるようにして選択し た。

これらの実験に用いた標的オリゴヌクレオチド配列、ブライマーオリゴヌクレオ チド、ブロッカ−オリゴヌクレオチドおよびエンドランオリゴヌクレオチドは、 それぞれ配列番号５．６．７および８であった。オリゴヌクレオチドは、例■■ ■に記載したようにして準備した。

ブライマーオリゴヌクレオチドおよびエンドランオリゴヌクレオチドは、Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａ、ｂｏ ｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ、ｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ Ｙ　（１９８９）に記載のプロトコールに従いＡｍｅｒｓｈａｍから購入した［ ７”Ｐ］　ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識した。ブロ ッカ−オリゴヌクレオチドは、Ｃ１，ｏｎｔｅｃｈ　。

ｆ　Ｐａ１ｏ、ＡＩｔｏ、　ＣＡ　（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　５２１０−３）から購 入した５°　−ホスフェート　ＯＮを用いて合成中に組み入れた「冷Ｊ　５’　 ＰＯ，末端を含んだ。

ＥＲＡ反応のそれぞれを例ＩＩＩのように行った。最終容量ｌ。

Ｏｍ　Ｌに希釈したｌｏｘ反応緩衝液濃厚物中の成分の濃度は次のようであった ：２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，８；　２００ｍＭ塩化カリウム：　 ５０ｍＭ塩化アンモニウム；　５０ｍＭジチオスレチオール；　５００μＭ　Ｎ ＡＤ゛　；　５００μｇ／ｍＬウン血清アルブミン：および１％Ｔｒｉｔｏｎ　 Ｘ−１００６調べたＥＲＡ反応のそれぞれについて、ｌｏｘ反応緩衝液２．５μ Ｌを２００μＬ容器に加え、次に、適当量の標的オリゴヌクレオチドを加えた。

反応容器を４℃に保った。次に、標識したプライマーオリゴヌクレオチドおよび 標識したエンドランオリゴヌクレオチドを加えて、それぞれ４０ｎＭの最終反応 の１度とし１、ブロッカ−オリゴヌクレオチドを加えて６００　ｎＭの最終濃度 とした。次に、２μｇのヒト胎盤ＤＮＡを４つのｄＮＴＰ　（それぞれ１度２０ ０μＭを有していた）と共に加えた。最後に、３０単位のＴａｇ　ＤＮＡリガー ゼと２．５単位の５ｔｏｆｆｅｌ　ＤＮＡポリメラーゼを加えた。

反応容器は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ中で５ 分間９５℃加熱して、完全な変性を達成した。次に、ＥＲＡ反応を、１０ｘ塩化 マグネシウムストツク２．５μＬの添加により開始させた。反応は、例ＩＩＩに 記載したように４０サイクル進めた。

組み入れたオリゴヌクレオチドの計数（ｃｏｕｎｔｓ）（ＣＰＭ）に対する標的 濃度のプロット（ｐｌｏｔ）また増幅の量に対する標的１度のプロットを、延長 反応と結合反応についてそれぞれ図１６および図１７に示した。これらのプロッ トは、極めて低い１度での標的核酸を延長し結合するＥＲＡ増幅反応の能力を明 らかに説明する。

本発明を、その特定の具体例と共に説明したが、さらに変更を行うことが可能で あり、本出願は、本発明の原理を一般的に用いる本発明の変化、用途または適用 を範囲に入れることを意図するものであり、また本発明が関与し上記し添付のク レームの本質的な特徴に当てはまる分野で公知であり通常行われる範囲の本発明 の開示から逸脱しない本発明の変化、用途または適用を範囲に入れることを意図 することが理解されよう。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人（発明者）：ベツクマン　インスツルメンツ　インコーホレーテッ ド アダムス、クレイグ　ダブリュ。

ダニエルズ、ディピッド　ダブリュ。

（ｉｉ）発明の名称；核酸配列の検出及び増幅のための方法、試薬及びキット （ｉ　ｉ　ｉ）　配列の数＝１３ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）受信人：ベックマン　インスツルメンツ　インコーホレーテッド （Ｂ）通り：ハーバー　ポルバード　２５００（Ｃ）市：フラートン ＣＤ）州：カリフォルニア （Ｅ１国：アメリカ合衆国 ＣＦ）郵便番号：　９２６３４ （ｖ）コンピューター判読形態： （Ａ）ミゾイウムタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター＋ＩＢＭ　 ｐｃ　コンノ（−チブル（Ｃ）オペレーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／Ｍ Ｓ−Ｄ。

（Ｄ）ソフトウェア・パテントイン　リリース　＄１．Ｏ。

バージョン　＃１．２５ （ｖｉ）現在の出願のデータ： （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ （Ｂ）出願日：１９９２年８月４日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願のデータ： （Ａ）出願番号：Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７／９２５．０５９（Ｂ）已願臼：１９９ ２年８月４日 （Ｃ）出願番号：Ｕ、ｓ、ｓ、Ｎ、０８１０６８．３９３（Ｄ）出願日：１９９ ３年５月２７日 （ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名二ヘンリー、ジャニス　シー。

（Ｂ）登録番号：３４，３４７ （Ｃ）参照／名簿番号：　１２８Ｄ−１２６Ｂ（Ｌｘ）電気通信情報： （Ａ）電話：　（７１４）７７３−６９７１（Ｂ）ファックス：　（７１４）７ ７３−７９３６（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１：（ｉ）配列の持（ ！！！： （Ａ）配列の長さ：５０　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本須 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍ　ｉ　ｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボ セテイカル：Ｙｅｓ（ｉｖ）アンチセンス、Ｎ。

（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：００口ｗ：ｅｘ　ＡＯＩＩＧＴ’！’ ＧＣＧＣｘｃ＝λλ丁ＣＧＣＣλＡ丁ＧＯＣＧ　ＣＴｒτ０ＣＣＴＧＧ　５０（ ２）配列番号（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ）：２：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２３　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木組 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイポセティカ ル：Ｙｅｓ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ ）：３：（１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：ｌＯ塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木組 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイボセティカ ル：Ｙｅｓ （ｉｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＧＣＧＣＣＡＴｒＣＧ　ＬＯ （２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：４：（ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ＝１８　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木組 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉ　ｃ）（ｉ　ｉ　Ｎハイボセテ ィカル：Ｙｅｓ（ｉｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：ＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣ口ｍ１Ｇ　１Ｍ （２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：５：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ＝５７　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木組 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイポセテイカ ル・Ｙｅｓ （ｉ　ｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ａｃｃｃＴｒｃｃｚ　ＡＣＡｍｃｃｃ 　ＡＧＣＣ％％ＡＴＧ　ＧＣ紮πＧＯＯＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧ　ＴｒＴＣＣＧＧ 　５７（２）配列番号（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ）：６：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５７　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数・一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセテ ィカル：Ｙｅｓ（ｉｖ）アンチセンス：Ｎ。

（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：Ｃ：ＧＧＡＡＡ　にλＧＧＣλＡＡＧ 　ａｃｅこＡＴτＣＳご　こλττＣλＣａＣ丁　６０口こλＡＣＭＴＴＧＧＧ ＭＧＧＧＣ５７（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）ニア：（１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　３１　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木組 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種ＷＩ：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセ ティカル：Ｙｅｓ（ｉ　ｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア：？Ｏ，−ＣＣＡＴ’ｒｅＡＧＧＣ’！ ’ＧＣＧＣＩＩＪＬＣＴＧ　ＴｒＧＧＧＡＡＧＧＧ−ビオチン（２）配列番号（ ＳＥＱ　より　Ｎｏ）：８：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木組 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉ　ｃ）（ｉｉｉ）ハイボセテ ィカル：Ｙｅｓ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｘ　ｉ　）配列：ＳＥＱ　ｒｐ　ＮＯ：８：ＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡ ＴＧＧＣ１９（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：９：（１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０　塩基対 （Ｂ）２列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本川 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティ カル：Ｙｅｓ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：ＣｒｒｒＧｃｃＯｒａｅ　Ｃ−仝ｖ１ ℃Ｑ（Ｑ（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｌｏ：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５７　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本紙 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ ィカル：Ｙｅｓ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌＯ：（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ）：１１：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５７　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）ｊｌの数ニ一本紙 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセ ティカル：Ｙｅｓ（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：（２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ）：１２：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：ｌＯ塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本紙 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉｉｉ）ハイボセティカ ル：Ｙｅｓ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：ＧＣＧＣＣＡＴｒＣＣ （２）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１３：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９　塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本紙 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセテ ィカル：Ｙｅｓ（ｉｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３二ｃ’ｒｒｃｃｃｃｘ；ｃ　ＣＴＧＭ ＴＧＧＧ３′５１ ５“□３′ ５“□３・ ５’　３’ ３’　５ｉ ５’　３’ ３′５・ ３’　５’ ５・　３・　５゛ 領域　領域 Ｆｉｇ、　９Ａ Ｆｉｇ、　９Ｄ Ｍ１２３４５６　Ｍ１２３４５６ エンド−ランオリゴヌクレオチドの３゛末端ターゲツトテンプレート ターゲット濃度（モル数） ターゲット濃度（モル数） フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＣＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎ。

、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標的核酸分子の濃度を増幅する方法において、次の各段階：（Ａ）ブロッカ ーオリゴヌクレオチドを該標的核酸分子とハイブリッド化させて二本鎖核酸分子 を形成させる段階、（Ｂ）該二本鎖核酸分子の該標的核酸分子にプライマーオリ ゴヌクレオチドをハイブリッド化させて該プライマーオリゴヌクレオチドの３′ 末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接す るか、またはポリメラーゼー仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長されて該 ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接しうる段階 、（Ｃ）（１）該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末 端が、該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣接 した時、段階（Ｄ）を行うか、または該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌ クレ（２）オチドの該３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレ オチドの該５′末端に隣接せず該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオ チドの該３′末端がポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長され るようにし、よって、３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレ オチドの該末端５′に隣接しているプライマー伸長反応生成物を形成させて、段 階（Ｄ）を行う、 （Ｄ）段階（Ｃ）（１）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチド の該隣接３′末端または段階（Ｃ）（２）の該ハイブリッド化したプライマー伸 長生成物の該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチ ドの該５′末端に結合させ、よって該プライマーオリゴヌクレオチドまたは該プ ライマー伸長生成物の配列および該ブロッカーオリゴヌクレオチドの配列を有す る結合生成物を形成させる段階、 （Ｅ）エンドーランオリゴヌクレオチドを該結合生成物の該ブロッカーオリゴヌ クレオチドの該配列とハイブリッド化させる段階および （Ｆ）該ハイブリッド化したエンドーランオリゴヌクレオチドの３′末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させてエンドーラン伸長生成 物を形成させ、よって該標的分子の濃度を増幅する段階を含み、該段階（Ａ）、 段階（Ｂ）と、（Ｃ）と、（Ｄ）とからなる該群および段階（Ｅ）と（Ｆ）とか らなる該群は、相互に関していずれの順序で行ってもよいことを特徴とする標的 核酸分子の濃度を増幅する方法。 ２．該各段階がひき続き順序立って行われる請求項１の方法。 ３．段階（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）とからなる該群が、段階（Ｅ）と（Ｆ）とから なる該群の前に行われる請求項１の方法。 ４．段階（Ｅ）と（Ｆ）とからなる該群が、段階（Ｂ）と（Ｃ）と（Ｄ）とから なる該群の前に行われる請求項１の方法。 ５．該標的核酸分子が、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である請求項１の方法。 ６．該標的核酸分子が、二本鎖ＲＮＡ分子であり、該二本鎖分子の第１の鎖が段 階（Ｄ）の該結合生成物の形成により増幅され、そして第２の鎖が、段階（Ｆ） の該エンドーラン伸長生成物の形成により増幅される請求項１の方法。 ７．該ブロッカーオリゴヌクレオチドの３′末端と該プライマーオリゴヌクレオ チドの５′末端とが一緒につながれる請求項１の方法。 ８．段階（Ｂ）で、該プライマーオリゴヌクレオチドが、３′末端を有していて 該二本鎖核酸分子の該標的核酸分子とハイブリッド化されると、該ハイブリッド 化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接する請求項１の方法。 ９．段階（Ｂ）で、該プライマーオリゴヌクレオチドが、３′末端を有していて 該二本鎖核酸分子の該標的核酸分子とハイブリッド化されるとポリメラーゼ仲介 鋳型依存プライマー伸長反応で伸長され得て、該ブロッカーオリゴヌクレオチド の５′末端に隣接する請求項１の方法。 １０．該方法が、さらに、次の各段階：（Ｇ）ブロッカーオリゴヌクレオチドを エンドーラン伸長生成物とハイブリッド化させて二本鎖核酸分子を形成させる段 階、 （Ｈ）プライマーオリゴヌクレオチドを段階（Ｇ）の該二本鎖核酸分子の該エン ドーラン伸長生成物とハイブリッド化させて二本鎖核酸分子を形成させ、該プラ イマーオリゴヌクレオチドの３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴ ヌクレオチドの５′末端に隣接するか、またはポリメラーゼ仲介鋳型依存プライ マー伸長反応中で該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末 端に隣接しうるようにする段階、（Ｉ）（１）段階（Ｈ）のハイブリッド化した プライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端が、該ハイブリッド化したブロッカ ーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣接した時、段階（Ｊ）を行うか、または （２）段階（Ｈ）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３ ′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣 接せず該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端がポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長されるようにし、よって、３ ′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該末端５′に隣 接しているプライマー伸長反応生成物を形成させて、段階（Ｊ）を行う、（Ｊ） 段階（Ｉ）（１）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該隣 接３′末端または段階（Ｉ）（２）の該ハイブリッド化したプライマー伸長生成 物の該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該 ５′末端に結合させ、よって該結合生成物を形成させかつ増幅させる段階、 （Ｋ）エンドーランオリゴヌクレオチドを段階（Ｊ）の該結合生成物の該ブロッ カーオリゴヌクレオチドの該配列とハイブリッド化させる段階および （Ｌ）該ハイブリッド化したエンドーランオリゴヌクレオチドの３′末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させ、よってエンドーラン伸 長生成物を形成させかつ増幅させる段階 を含む請求項１０の方法。 １１．段階（Ｇ）−（Ｌ）のシーケンスが少なくとも１回繰り返される請求項１ ０の方法。 １２．該方法が、さらに、次の各段階：（Ｇ）第２のブロッカーオリゴヌクレオ チドを該エンド−ラン伸長生成物とハイブリッド化させて二本鎖核酸分子を形成 させる段階であって、該第２のブロッカーオリゴヌクレオチドは、段階（Ａ）の 該ブロッカーまたは段階（Ｂ）の該プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッ ド化できない部位で該エンドーラン伸長生成物にハイブリッド化する段階、 （Ｈ）該二本鎖核酸分子の該エンドーラン伸長生成物に第２のプライマーオリゴ ヌクレオチドをハイブリッド化させて該第２のプライマーオリゴヌクレオチドの ３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣 接するか、またはポリメラーゼー仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長して 該ハイブリッド化した第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接し うる段階、 （Ｉ）（１）該ハイブリッド化した第２のプライマーオリゴヌクレオチドの該３ ′末端が、該ハイブリッド化した第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′ 末端に隣接した時、段階（Ｊ）を行うか、または （２）該ハイブリッド化した第２のプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端 が該ハイブリッド化した第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣 接せず該ハイブリッド化した第２のプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端 がポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長されるようにし、よっ て、３′末端が該ハイブリッド化した第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの該 末端３′に隣接している第２のプライマー伸長反応生成物を形成させて、段階（ Ｊ）を行う、 （Ｊ）段階（Ｉ）（１）の該ハイブリッド化した第２のプライマーオリゴヌクレ オチドの該隣接３′末端または段階（Ｉ）（２）の該ハイブリッド化した第２の プライマー伸長生成物の該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッカーオリ ゴヌクレオチドの該５′末端に結合させ、よって該第２のプライマーオリゴヌク レオチドまたは該第２のプライマー伸長生成物の配列および該第２のブロッカー オリゴヌクレオチドの配列を有する結合生成物を形成させる段階、 （Ｋ）第２のエンドーランオリゴヌクレオチドを該第２の結合生成物の該第２の ブロッカーオリゴヌクレオチドの該配列とハイブリッド化させる段階および （Ｌ）該ハイブリッド化した第２のエンドーランオリゴヌクレオチドの３′末端 をポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させて第２のエンドー ラン伸長生成物を形成させ、よって該標的分子の該配列の濃度を増幅する段階 を含む請求項９の方法。 １３．該方法が、さらに、次の各段階：（Ｇ）第２のブロッカーオリゴヌクレオ チドを該結合生成物とハイブリッド化させて二本鎖核酸分子を形成させる段階で あって、該第２のブロッカーオリゴヌクレオチドは、段階（Ａ）の該ブロッカー または段階（Ｂ）の該プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリッド化できない 部位で該結合生成物にハイブリッド化する段階、（Ｈ）該二本鎖核酸分子の該結 合生成物に第２のプライマーオリゴヌクレオチドをハイブリッド化させて該第２ のプライマーオリゴヌクレオチドの３′末端が該ハイブリッド化したブロッカー オリゴヌクレオチドの５′末端に隣接するか、またはポリメラーゼー仲介鋳型依 存プライマー伸長反応中で伸長して該ハイブリッド化した第２のブロッカーオリ ゴヌクレオチドの５′末端に隣接しうる段階、 （Ｉ）（１）該ハイブリッド化した第２のプライマーオリゴヌクレオチドの該３ ′末端が、該ハイブリッド化した第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′ 末端に隣接した時、段階（Ｊ）を行うか、または （２）該ハイブリッド化した第２のプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端 が該ハイブリッド化した第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣 接せず該ハイブリッド化した第２のプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端 がポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長されるようにし、よっ て、３′末端が該ハイブリッド化した第２のブロッカーオリゴヌクレオチドの該 末端５′に隣接している第２のプライマー伸長反応生成物を形成させて、段階（ Ｊ）を行う、 （Ｊ）段階（Ｉ）（１）の該ハイブリッド化した第２のプライマーオリゴヌクレ オチドの該隣接３′末端または段階（Ｉ）（２）の該ハイブリッド化した第２の プライマー伸長生成物の該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッカーオリ ゴヌクレオチドの該５′末端に結合させ、よって該第２のプライマーオリゴヌク レオチドまたは該第２のプライマー伸長生成物の配列および該第２のブロッカー オリゴヌクレオチドの配列を有する結合生成物を形成させる段階、 （Ｋ）第２のエンドーランオリゴヌクレオチドを該第２の結合生成物の該第２の ブロッカーオリゴヌクレオチドの該配列とハイブリッド化させる段階および （Ｌ）該ハイブリッド化した第２のエンドーランオリゴヌクレオチドの３′末端 をポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させて第２のエンド− ラン伸長生成物を形成させ、よって該標的分子の該配列の濃度を増幅する段階 を含む請求項９の方法。 １４．段階（Ｇ）−（Ｌ）のシーケンスが少なくとも１回繰り返される請求項１ ２の方法。 １５．選択されたヌクレオチドが標的核酸分子の所定部位に存在するかどうか測 定する方法において、次の各段階：（Ａ）ブロッカーオリゴヌクレオチドを該標 的核酸分子にハイブリッド化させ二本鎖核酸分子を形成させる条件を与える段階 であり、該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端は、そ の５′末端ヌクレオチドが該標的分子の該所定部位に対向しかつ該選択されたヌ クレオチドと相補的であるように位置される段階、（Ｂ）プライマーオリゴヌク レオチドを該二本鎖核酸分子の該標的核酸分子とハイブリッド化させ該プライマ ーオリゴヌクレオチドの３′末端が隣接するかまたはポリメラーゼ仲介鋳型依存 プライマー伸長反応中で伸長されて該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌク レオチドの５′末端に隣接され得る条件を与える段階、（Ｃ）（１）該プライマ ーオリゴヌクレオチドの３′末端が該ブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末 端に隣接する場合に段階（Ｄ）を行うかまたは該（２）プライマーオリゴヌクレ オチドの該３′末端が、該ブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣接し ないで、該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端をポ リメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させ、よって３′末端が該 ブロッカーオリゴヌクレオチドの該末端５′に隣接しているブライマー伸長反応 生成物を形成させている場合に、段階（Ｄ）を行う、 （Ｄ）段階（Ｃ）（１）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチド の該隣接３′末端または段階（Ｃ）（２）の該ハイブリッド化したプライマー伸 長生成物の該隣接３′末端および該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレ オチドの該５′末端を、核酸結合を促す条件下でリガーゼの存在下で温置する段 階、（Ｅ）段階（Ｄ）が該ブロッカーオリゴヌクレオチドおよび該プライマー伸 長生成物または該プライマーオリゴヌクレオチドの配列を有する結合生成物の形 成をもたらすかどうか検出することにより該所定部位に該選択されたヌクレオチ ドが存在するかどうか測定する段階であって、該結合生成物の形成が、所定部位 でヌクレオチドにハイブリッド化する該ブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末 端ヌクレオチドの能力に依存し、該検出が次の（１）と（２）の副段階により達 成される段階、（１）エンドーランオリゴヌクレオチドを該温置にふし、該温置 を核酸ハイブリッド化とポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長が起こるのに 十分な条件下に保つ段階および （２）該エンドーランオリゴヌクレオチドが伸長されて、該プライマーオリゴヌ クレオチドの配列を相補する配列を含むかとうか測定する段階、を含むことを特 徴とする測定方法。 １６．該標的核酸分子が、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である請求項１５の方 法。 １７．段階（Ｂ）で、該プライマーオリゴヌクレオチドが、３′末端を有し、該 ３′末端が該二本鎖核酸分子の該標的核酸分子にハイブリッド化されると、該ハ イブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接する請求項１ ５の方法。 １８．段階（Ｂ）で、該プライマーオリゴヌクレオチドが、３′末端を有し、該 ３′末端が、該二本鎖核酸分子の該標的核酸分子にハイブリッド化されると、ポ リメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応で伸長されて該ブロッカーオリゴヌ クレオチドの５′末端に隣接され得る請求項１５の方法。 １９．段階（Ｅ）（２）で、該エンドーランオリゴヌクレオチドが、伸長されて 該プライマーオリゴヌクレオチドの配列と相補する配列を含むかどうかの該測定 が、次の副段階（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）： （ａ）該ブロッカーオリゴヌクレオチドを温置中に存在する該エンドーラン伸長 生成物のいずれかにハイブリッド化して二本鎖核酸分子を形成する段階、 （ｂ）該二本鎖核酸分子のエンドーラン伸長生成物に該プライマーオリゴヌクレ オチドをハイブリッド化させて該プライマーオリゴヌクレオチドの３′末端が該 ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接するか、ま たはポリメラーゼー仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長して該ハイブリッ ド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接しうる段階、（ｃ）（ １）該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端が、該ハ イブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣接した時、段 階（ｄ）を行うか、または（２）該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレ オチドの該３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該 ５′末端に隣接せず該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３ ′末端がポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長されるようにし 、よって、３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該 末端５′に隣接しているプライマー伸長反応生成物を形成させて、段階（ｄ）を 行う、 （ｄ）段階（ｃ）（１）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチド のいずれかの該隣接３′末端または段階（ｃ）（２）の該ハイブリッド化したプ ライマー伸長生成物のいずれかの該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッ カーオリゴヌクレオチドのいずれかの該５′末端に結合させ、よって該プライマ ーオリゴヌクレオチドまたは該プライマー伸長生成物の配列および該ブロッカー オリゴヌクレオチドの配列を有する結合生成物を形成させる段階、 （ｅ）該エンドーランオリゴヌクレオチドを該結合生成物のいずれかの該ブロッ カーオリゴヌクレオチドの該配列とハイブリッド化させる段階および （ｆ）該ハイブリッド化したエンドーランオリゴヌクレオチドの３′末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させて該エンドーラン伸長生 成物を形成させかつ増幅させる段階、 を含んでなる方法を用いるエンドーラン伸長生成物を増幅することにより行われ る請求項１５の方法。 ２０．副段階（ａ）−（ｆ）のシーケンスが少なくとも１回繰り返される請求項 １９の方法。 ２１．該所定部位が、多型座である請求項１５の方法。 ２２．該ブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端ヌクレオチドが、該部位が 遺伝突然変異を含んでいる場合だけ、所定の部位にハイブリッド化し得る請求項 １５の方法。 ２３．段階（Ａ）を行うに先立って、該標的核酸の濃度が、請求項１の方法にし たがって増幅される請求項１５の方法。 ２４．選択されたヌクレオチドが標的核酸分子の所定部位に存在するかどうか測 定する方法において、次の各段階：（Ａ）ブロッカーオリゴヌクレオチドを該標 的核酸分子にハイブリッド化させ二本鎖核酸分子を形成させる条件を与える段階 であり、該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端は、そ の５′末端ヌクレオチドが該標的分子の該所定部位の３′に近接する位置のヌク レオチドにハイブリッド化されるように位置決めされる段階、 （Ｂ）プライマーオリゴヌクレオチドを該部分的二本鎖核酸分子の該標的核酸分 子とハイブリッド化させ該プライマーオリゴヌクレオチドの３′末端が該ハイブ リッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接する条件を与える 段階であり、３′末端ヌクレオチドが該選択されたヌクレオチドを相補する段階 、 （Ｃ）該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該隣接３′末端お よび該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端を、核酸 結合を促す条件下でリガーゼの存在下で温置する段階、（Ｄ）段階（Ｃ）が該ブ ロッカーオリゴヌクレオチドおよび該プライマー伸長生成物または該プライマー オリゴヌクレオチドの配列を有する結合生成物の形成をもたらすかどうか検出す ることにより所定部位に該選択されたヌクレオチドが存在するかどうか測定する 段階であって、該結合生成物の形成が、所定部位でヌクレオチドにハイブリッド 化する該プライマーオリゴヌクレオチドの３′末端ヌクレオチドの能力に依存し 、該検出が次の（１）と（２）の副段階により達成される段階、 （１）エンドーランオリゴヌクレオチドを該温置にふし、該温置を核酸ハイブリ ッド化とポリメラーゼ仲介鋳型依存ブライマー伸長が起こるのに十分な条件下に 保つ段階および （２）該ニンドーランオリゴヌクレオチドが伸長されて、該ブライマーオリゴヌ クレオチドの配列を相補する配列を含むかどうか測定する段階、 を含むことを特徴とする測定方法。 ２５．該標的核酸分子が、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である請求項２４の方 法。 ２６．段階（Ｄ）（２）で、該エンドーランオリゴヌクレオチドが、延長されて 、該プライマーオリゴヌクレオチドの配列を補足する配列を含むようになるかど うかの該測定が、次の各副段階：（ａ）該ブロッカーオリゴヌクレオチドを温置 中に存在する該エンドーラン延長生成物のいずれかにハイブリッド化して二本鎖 核酸分子を形成する段階、 （ｂ）プライマーオリゴヌクレオチドを該二本鎖核酸分子のいずれかのエンドー ラン延長生成物にハイブリッド化させこのプライマーオリゴヌクレオチドの３′ 末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接す るか、またはポリメラーゼ−仲介鋳型依存ブライマー伸長反応中で伸長して該ハ イブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接しうる段階、 （ｃ）（１）段階（ｂ）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチド の該３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末 端に隣接した時、段階（ｄ）を行うか、または （２）段階（ｂ）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３ ′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣 接せず該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端がポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長されるようにし、よって、３ ′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該末端５′に隣 接しているプライマー伸長反応生成物を形成させて、段階（ｄ）を行う、（ｄ） 段階（ｃ）（１）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドのいず れかの該隣接３′末端または段階（ｃ）（２）の該ハイブリッド化したプライマ ー伸長生成物のいずれかの該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッカーオ リゴヌクレオチドのいずれかの該５′末端に結合させ、よってこれらのプライマ ーオリゴヌクレオチドまたは該プライマー伸長生成物の配列および該ブロッカー オリゴヌクレオチドの配列を有する結合生成物を形成させる段階、 （ｅ）該エンドーランオリゴヌクレオチドを該結合生成物のいずれかの該ブロッ カーオリゴヌクレオチドの該配列とハイブリッド化させる段階および （ｆ）該ハイブリッド化したエンドーランオリゴヌクレオチドの３′末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させて該エンドーラン伸長生 成物を形成させかつ増幅する段階、 を含んでなる方法を用いてエンドーラン伸長生成物または結合生成物を増幅する ことにより行われる請求項２４の方法。 ２７．副段階（ａ）−（ｂ）のシーケンスが少なくとも１回繰り返される請求項 ２６の方法。 ２８．該所定部位が、多型座である請求項２４の方法。 ２９．段階（Ｂ）の該プライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端ヌクレオチド が、該部位が遺伝突然変異を含んでいるときのみ該所定部位にハイブリッド化し 得る請求項２４の方法。 ３０．段階（Ａ）を行うのに先立って、該標的核酸の濃度が請求項１の方法にし たがって増幅される請求項２４の方法。 ３１．選択されたヌクレオチドが標的核酸分子の所定部位に存在しているかどう か測定する方法において、次の各段階：（Ａ）核標的核酸分子を補足する核酸配 列にブロッカーオリゴヌクレオチドをハイブリッド化し、よって、二本鎖核酸分 子を形成させる段階、 （Ｂ）該二本鎖核酸分子の該標的核酸分子を補足する該核酸配列にプライマーオ リゴヌクレオチドをハイブリッド化させて該プライマーオリゴヌクレオチドの３ ′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接 するが、またはポリメラーゼ−仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長して該 ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接しうる段階 、 （Ｃ）（１）該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端 が、該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣接し た時、段階（Ｄ）を行うが、または（２）該ハイブリッド化したプライマーオリ ゴヌクレオチドの該３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオ チドの該５′末端に隣接せず該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチ ドの該３′末端がポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長される ようにし、よって、３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオ チドの該末端５′に隣接しているプライマー伸長反応生成物を形成させて、段階 （Ｄ）を行う、 （Ｄ）段階（Ｃ）（１）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチド の該隣接３′末端または段階（Ｃ）（２）の該ハイブリッド化したプライマー伸 長生成物の該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチ ドの該５′末端に結合させ、よって該プライマーオリゴヌクレオチドまたは該プ ライマー伸長生成物の配列および該ブロッカーオリゴヌクレオチドの配列を有す る結合生成物を形成させる段階、 （Ｅ）エンドーランオリゴヌクレオチドを該結合生成物の該ブロッカーオリゴヌ クレオチドの該配列にハイブリッド化させる段階であり、該エンドーランオリゴ ヌクレオチドの３′末端が、該選択されたヌクレオチドを補足し、該エンドーラ ンオリゴヌクレオチドの該３′末端ヌクレオチドが、該標的分子の該所定部位に 対向し得る段階、（Ｆ）ポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で該ハ イブリッド化したエンドーランオリゴヌクレオチドの３末端を伸長させてエンド ーラン伸長生成物を形成させる条件を与える段階、 （Ｇ）段階（Ｆ）がエンドーラン伸長生成物の形成をもたらすかどうか検出する ことにより該所定部位に該選択されたヌクレオチドが存在するかどうか測定する 段階、を含むことを特徴とする測定方法。 ３２．段階（Ｆ）が該プライマーオリゴヌクレオチドの配列を補足する配列を含 むエンドーラン伸長生成物の形成をもたらすかどうか行う段階（Ｇ）での測定を 、次の各副段階：（ａ）該ブロッカーオリゴヌクレオチドを温置中に存在する該 エンドーラン伸長生成物のいずれかにハイブリッド化して二本鎖核酸分子を形成 する段階、 （ｂ）プライマーオリゴヌクレオチドを該二本鎖核酸分子のいずれかのエンド− ラン伸長生成物にハイブリッド化させこのプライマーオリゴヌクレオチドの３′ 末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接す るか、またはポリメラーゼ−仲介鋳型依存ブライマー伸長反応中で伸長して該ハ イブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接しうる段階、 （ｃ）（３）段階（ｂ）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチド の該３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末 端に隣接した時、段階（ｄ）を行うか、または （４）段階（ｂ）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３ ′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣 接せず該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端がポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長されるようにし、よって、３ ′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該末端５′に隣 接しているプライマー伸長反応生成物を形成させて、段階（ｄ）を行う、（ｄ） 段階（ｃ）（１）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドのいず れかの該隣接３′末端または段階（ｃ）（２）の該ハイブリッド化したプライマ ー伸長生成物のいずれかの該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッカーオ リゴヌクレオチドのいずれかの該５′末端に緒合させ、よってこれらのプライマ ーオリゴヌクレオチドまたは該プライマー伸長生成物の配列および該ブロッカー オリゴヌクレオチドの配列を有する結合生成物を形成させる段階、 （ｅ）該エンドーランオリゴヌクレオチドを該結合生成物のいずれかの該ブロッ カーオリゴヌクレオチドの該配列とハイブリッド化させる段階および （ｆ）該ハイブリッド化したエンド−ランオリゴヌクレオチドの３′末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させて該エンドーラン伸長生 成物を形成させかつ増幅する段階、 を含んでなる方法を用いてエンドーラン伸長生成物を増幅して行う請求項３１の 方法。 ３３．段階（Ａ）を行うに先立って、請求項１の方法にしたがって該標的核酸の 濃度を増幅する請求項３１の方法。 ３４．選択されたヌクレオチドが、標的核酸分子の所定部位に存在するかとうか 測定する方法であって、次の各段階：（Ａ）ブロッカーオリゴヌクレオチドを該 標的核酸分子にハイブリッド化させ部分的二本鎖核酸分子を形成させる条件を与 える段階、 （Ｂ）プライマーオリゴヌクレオチドを該部分的二本鎖核酸分子の該標的核酸分 子とハイブリッド化させる段階であり、該プライマーオリゴヌクレオチドの３′ 末端が該標的分子の該所定部位に対向する段階、 （Ｃ）該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させてプライマー伸長生成物 を形成する条件を与える段階、 （Ｄ）段階（Ｃ）がプライマー伸長生成物の形成をもたらすかどうか検出するこ とにより該所定部位に該選択されたヌクレオチドが存在するかどうか測定する段 階であって、該検出が次の（１）と（２）の副段階により達成される段階、 （１）プライマー伸長生成物と該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオ チドの該５′末端とを核酸結合を促進する条件下でリガーゼの存在下で温置する 段階、 （２）段階（１）が、該ブロックオリゴヌクレオチドおよび該ブライマーオリゴ ヌクレオチド伸長生成物の配列を有する結合生成物の形成をもたらすかどうか検 出する段階であって、該検出が次の段階： （ａ）エンドーランオリゴヌクレオチドを該温置にふし、該温置を核酸ハイブリ ッド化とポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長とが起こるのに充分な条件に 保つ段階、（ｂ）該エンドーランオリゴヌクレオチドが、該プライマーオリゴヌ クレオチドの配列を相補する配列を含むように伸長されるかどうか測定する段階 、 を含む段階、 を含むことを特徴とする測定方法。 ３５．該エンドーランオリゴヌクレオチドが、該プライマーオリゴヌクレオチド の配列を相補する配列を含むように伸長されるかとうかの該測定が段階（ｂ）で 、次の各副段階：（ａ）該ブロッカーオリゴヌクレオチドを温置中に存在する該 エンドーラン伸長生成物のいずれかにハイブリッド化して二本鎖核酸分子を形成 する段階、 （ｂ）該プライマーオリゴヌクレオチドを該二本鎖核酸分子のいずれかのエンド ーラン伸長生成物にハイブリッド化させ該プライマーオリゴヌクレオチドの３′ 末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接す るか、またはポリメラーゼ−仲介鋳型依存ブライマー伸長反応中で伸長して該ハ イブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの５′末端に隣接しうる段階、 （ｃ）（１）該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチドの該３′末端 が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチドの該５′末端に隣接した 時、段階（ｄ）を行うか、または（２）該ハイブリッド化したプライマーオリゴ ヌクレオチドの該３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチ ドの該５′末端に隣接せず該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチド の該３′末端がポリメラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中に伸長されるよ うにし、よって、３′末端が該ハイブリッド化したブロッカーオリゴヌクレオチ ドの該末端５′に隣接しているプライマー伸長反応生成物を形成させて、段階（ ｄ）を行う、 （ｄ）段階（ｃ）（１）の該ハイブリッド化したプライマーオリゴヌクレオチド のいずれかの該隣接３′末端または段階（ｃ）（２）の該ハイブリッド化したプ ライマー伸長生成物のいずれかの該隣接３′末端を該ハイブリッド化したブロッ カーオリゴヌクレオチドのいずれかの該５′末端に結合させ、よって該プライマ ーオリゴヌクレオチドまたは該プライマー伸長生成物の配列および該ブロッカー オリゴヌクレオチドの配列を有する結合生成物を形成させる段階、 （ｅ）該エンドーランオリゴヌクレオチドを該結合生成物のいずれかの該ブロッ カーオリゴヌクレオチドの該配列にハイブリッド化する段階および （ｆ）該ハイブリッド化したエンドーランオリゴヌクレオチドの３′末端をポリ メラーゼ仲介鋳型依存プライマー伸長反応中で伸長させて該エンドーラン伸長生 成物を形成させかつ増幅する段階、 を含んでなる方法を用いてエンドーラン伸長生成物を増幅して行う請求項３４の 方法。 ３６．段階（Ａ）を行うに先立って、請求項１の方法にしたがって該標的核酸の 濃度を増幅する請求項３５の方法。 ３７．定められた核酸配列を有する少なくとも１つの領域を含む少なくとも１つ の標的配列の増幅のための試薬を含んでなるキットであって、該キットが、少な くとも１つのブロッカー部分を含む少なくとも１つの容器、少なくとも１つのプ ライマー部分および少なくとも１つのエンドーラン部分を含み、ブロッカー部分 が、核酸配列の一部にハイブリッド化し得るものであり、プライマー部分が、核 酸配列の異なる部分にハイブリッド化し得るものであり、そしてエンドーラン部 分が、ブロッカー部分の少なくとも一部を相補する配列を含むことを特徴とする キット。 ３８．該増幅に対して緩衝能力を与え得る少なくとも１つの緩衝液をさらに含む 請求項３７のキット。 ３９．塩化カリウム、塩化マグネシウム、ジチオスレイトール、ニコチンアミド アデニンジヌクレオチド、ウシ血清アルブミン、非イオン洗浄剤およびヌクレオ チドトリホスフェートからなる群から選択された添加物をさらに含む請求項３７ のキット。 ４０．ポリメラーゼおよびリガーゼからなる群から選択された少なくとも１種の 酵素をさらに含んでいる請求項３７のキット。 ４１．請求項１のハイブリッド化段階、伸長段階および結合段階に対して緩衝能 力を与え得る少なくとも１種の緩衝化合物を含むことを特徴とするキット。 ４２．緩衝化合物が、トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸である請求項４ １のキット。 ４３．塩化カリウム、塩化マグネシウム、ジチオスレイトール、ニコチンアミド アデニンジヌクレオチド、ウシ血清アルブミンおよび非イオン洗浄剤からなる群 から選択された添加物をさらに含む請求項４２のキット。 ４４．該エンドーランオリゴヌクレオチドが、該ブロッカーオリゴヌクレオチド の該配列にハイブリッド化された時に３′末端が、該ブロッカーオリゴヌクレオ チドの５′末端を越えて伸長するように３′末端を有している請求項１のプロセ ス。 ４５．該３′末端が、少なくとも１つの塩基だけ、該ブロッカーオリゴヌクレオ チドの５′末端を越えて伸長している請求項４４のプロセス。 ４６．該エンドーランオリゴヌクレオチドが、該ブロッカーオリゴヌクレオチド 配列の一部への該エンドーランオリゴヌクレオチドの核酸ハイブリッド化を許容 する条件下でハイブリッド化される時に３′末端が、該ブロッカーオリゴヌクレ オチドの５′末端を越えて伸長するように３′末端を有している請求項１５のプ ロセスし。 ４７．該エンドーランオリゴヌクレオチドが、該ブロッカーオリゴヌクレオチド 配列の一部への該エンドーランオリゴヌクレオチドの核酸ハイブリッド化を許容 する条件下でハイブリッド化される時に３′末端が、該ブロッカーオリゴヌクレ オチドの５′末端を越えて伸長するように３′末端を有している請求項２４のプ ロセス。 ４８．該エンドーランオリゴヌクレオチドが、該ブロッカーオリゴヌクレオチド 配列の一部への該エンドーランオリゴヌクレオチドの核酸ハイブリッド化を許容 する条件下でハイブリッド化される時に３′末端が、該ブロッカーオリゴヌクレ オチドの５′末端を越えて伸長するように３′末端を有している請求項３１のプ ロセス。